KR100635454B1 - 안티센스 텔로머라제를 생산하는 아데노바이러스 및 이를이용한 배아줄기세포로부터 조혈모세포의 분화 유도 및증식 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조혈모세포의 자가갱신(self-renewal)과 관련이 있는 텔로머라제 효소 활성의 억제가 가능한 안티센스를 생산하는 아데노바이러스 및 이를 조혈모세포 분화, 증식 촉진에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 조혈모세포를 비롯한 줄기세포에서 자가갱신을 위하여 필수적인 텔로머라제의 활성 억제가 가능한 아데노바이러스 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-OA는 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 면역세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있다

Description

안티센스 텔로머라제를 생산하는 아데노바이러스 및 이를 이용한 배아줄기세포로부터 조혈모세포의 분화 유도 및 증식 방법{Adenovirus vector producing antisense telomerase and the methods for proliferation and differentiation of hematopoietic stem cell from human embryonic stem cells}

도 1a은 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-OA의 유전자 지도이다.

도 1b는 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-OA의 제조과정을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 얻은 아데노바이러스 클론 Ad-OA를 감염시킨 293 세포주에서 안티센스의 발현양상을 돗 블럿 (dot-blot)으로 분석한 결과이다.

도 3은 본 발명의 아데노바이러스 클론들에 증식성 재조합 변이 바이러스 (RCV) 존재하는지 여부를 239 DNA와 아데노바이러스 DNA를 사용한 중합효소 연쇄반응 (PCR) 으로 확인한 결과이다.

도 4는 본 발명의 아데노바이러스 클론이 해당 목적 부위인 hTR 부위를 선택적으로 제거하는지 여부를 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)으로 확인한 결과이다.

도 5a, b는 조혈모세포 체외 배양시 Ad-OA에 의한 분화, 증식 촉진 효과를 라이트(Wright) 염색법으로 측정한 결과로서, 도 5a는 Control group이고, 도 5b는 Study group (Treated with Ad-OA)이다.

도 6은 Ad-OA에 의한 조혈모세포에서의 텔로머라제 활성 억제 효과를 텔로미어 반복 중합 연쇄 반응 (telomeric repeat amplification protocol; TRAP)으로 측정한 결과이다.

도 7a는 Ad-OA 감염된 조혈모세포와 감염되지 않은 조혈모세포에서 Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)을 통하여 아포토시스의 정도를 측정한 결과이다.

도 7b는 Ad-OA 감염된 인간 배아줄기세포와 감염되지 않은 인간 배아줄기세포에서 Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)을 통하여 아포토시스의 정도를 측정한 결과이다.

도 8은 Ad-OA 감염된 조혈모세포와 감염되지 않은 조혈모세포에서 세포 분화, 증식과 관련된 유전자인 Cyclin D (도 8a) 및 Cyclin E (도 8b)의 발현 정도를 시험한 결과이다.

도 9는 Ad-OA 감염된 배아줄기세포와 감염되지 않은 배아줄기세포에서 조혈모세포로의 분화유도 마커인 CD34+45- 세포 수를 측정한 결과로서, 도 9a는 Control group의 FACS 데이타이고, 도 9b는 Study group (Treated with Ad-OA)의 FACS 데이터이고, 도 9b는 양자의 비교 그래프이다.

본 발명은 조혈모세포의 자가갱신(self-renewal)과 관련이 있는 텔로머라제 효소 활성의 억제가 가능한 안티센스를 생산하는 아데노바이러스 및 이를 조혈모세포 분화, 증식 촉진에 사용하는 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 조혈모세포를 비롯한 줄기세포에서 자가갱신을 위하여 필수적인 텔로머라제의 활성 억제가 가능한 아데노 바이러스 벡터와 그의 응용방법에 관한 것으로서, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-OA는 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 면역세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있다

텔로미어 (telomere)는 진핵 생물의 염색체 말단에 존재하는 특이 구조로 짧은 DNA 조각 (척추 동물의 경우 TTAGGG)이 100 kb 이상 반복되는 형태를 띠고 있다. 이들은 단백질과 결합된 형태로 여러 가지 기능을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 텔로머라제 는 1) 염색체 끝 사이의 재결합, 융합 (interchromosomal fusion), 붕괴를 막아 염색체를 보호하고 2) 체세포 또는 생식 세포 분열 시 염색체 이동을 도우며 3) 직선을 이루는 진핵 세포 염색체에서 자연적으로 일어나는 말단복제 문제 (end-replication problem)을 막는 역할을 한다. 즉, 복제의 끝 무렵 지체가닥 (lagging strand) DNA 합성 시 제거되는 RNA 시발체 (primer) 부분을 DNA 복제 효소가 합성 할 수 없어 그 부위는 영구히 사라지는데 텔로미어 가 있음으로 해서 손상되지 않고 보존된다는 설명이다. 생식 세포에서는 텔로머라제라는 효소가 존재해 TTAGGG 반복 부위를 염색체 끝에 계속 합성하는데 비해 체세포에서는 이러 한 텔로머라제 활성이 없어서 매 세포주기 마다 텔로미어가 짧아져 결국은 사멸하게 된다 (David et al., 1997). 4) 텔로머라제 는 리보단백질(riboprotein)로 텔로머라제 자체의 RNA 부위를 주형으로 해서 기존의 텔로미어의 3 끝에 텔로미어를 연결시키는 역할을 한다. 즉, 텔로머라제는 염색체의 복제 및 보호에 중요한 역할을 하고 있기 때문에, 특히 세포의 불멸화에 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며 조혈모세포를 비롯한 모든 줄기세포(stem cell) 뿐만 아니라 대략 80-95 %의 암세포에서 텔로머라제 활성이 관찰된다 (Feng et al., 1997) 따라서 텔로머라제 활성의 억제를 항암 치료에 이용하고자 하는 연구가 전세계적으로 활발히 진행 중이다. 즉, Bisoffi (Bisoffi et al., 1998) 등에 의하면 악성신경교종 (malignant glioma; MG) 세포에 hTR (human telomoerase RNA component)에 대한 안티센스 벡터를 세포 감염 시키자 MG 세포의 많은 부분이 세포 사멸하거나 분화를 일으켰으며, 시스플라틴 (cisplatin) 등의 항암제에 대해 더 민감하게 반응했다. 이 외에도 레트로바이러스의 역전사 효소 저해제를 암세포에 처리하자 텔로머라제 활성의 저해 및 세포 사멸 효과를 보았으며 hTR에 대한 여러 펩타이드 핵산 및 안티센스 소중합체 처리 시에도 같은 효과를 보았다 (Bhaswati et al., 1998, A.I.Glukhov et al., 1998). 텔로머라제 활성과 세포내의 다른 여러 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 이나 발암 유전자 (oncogenes) 사이의 관계는 아직까지 명확하게 밝혀진 것이 없으나 최근 논문에 의하면 c-myc의 발현을 저해시키자 텔로머라제 활성도 감소하였고 정상 p53이 텔로미어 길이를 줄여 세포 사멸을 유도한다는 사실이 밝혀진 상태이다 (Kohtaro et al., 1997). 그러나, 텔로머라제 활성의 억제를 조혈모세포를 비롯한 줄기세포 분야, 특히 배아줄기세포에 적용한 연구는 매우 드물어, 이에 관련된 국내외 연구를 찾아볼 수 없는 상태이다.

상보적 안티센스를 이용한 항암 요법의 이론은 매우 간단하다. 즉, 제거하고자 하는 목적 유전자 mRNA를 상보적인 안티센스 이용해 작용하지 못하게 하는 것이다. 이러한 안티센스 분자를 이용하는 방법에는 합성 안티센스 소중합체 (antisense oligomer)를 이용하는 방법과 발현 안티센스 시퀀스 (expressed antisense sequence)를 이용하는 방법이 있다. 그러나 합성 안티센스 소중합체의 경우 1) 제작상의 어려움, 2) 핵산가수분해효소 (nuclease)에 의한 분해, 3) 효율적인 세포 내 전달 방법의 부재 등 많은 문제점을 가지고 있다 (Scanlon et al., 1995). 따라서 발현 안티센스 시퀀스를 이용한 방법에 많은 관심이 모아지고 있다 (Lee et al., 1996; Steiner et al., 1998). 이 방법의 원리는 목적 mRNA의 cDNA 일부를 진핵 세포 유전자 표현 벡터에 안티센스 방향으로 클로닝시켜 상보적 RNA 시퀀스를 발현케 함으로써 특정 유전자의 표현을 억제 시키는 방법이다.

이에, 본 발명자들은 상기 발현 안티센스 시퀀스 방법을 이용하여 만들어진 안티센스 텔로머라제를 생산하는 아데노바이러스가 조혈모세포의 분화/증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 면역세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있음을 발견하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 증식된 아데노바이러스 클론 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아데노바이러스 클론의 조혈모세포의 분화, 증식 촉진 또는 인간 배아줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화 유도를 위한 유전자 요법에의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바이러스의 증식에 관여하는 E1 유전자를 제거하고 서열번호 1의 6 내지 26번째 염기서열을 갖는 안티센스 텔로머라제 DNA를 포함하여 세포 내에서 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.

본 발명은 텔로머라제 활성을 발현 안티센스 시퀀스를 이용하여 억제시켜 텔로머라제가 중요한 역할을 하는 조혈모세포의 자가갱신을 억제시킴으로써 조혈모세포의 분화, 증식을 촉진시키는 효과를 얻는 것이 목적이다. 텔로머라제는 크게 RNA 주형 부위 (hTR)와 역전사 효소의 활성을 갖는 hTERT 부위로 이루어진다. 현재까지의 연구 결과로는 텔로머라제의 RNA 주형 부위 (hTR) 를 억제 시켰을 때 가장 큰 효과를 본 것으로 보고되고 있다. 또한 Kondo 등에 의하면 텔로머라제 mRNA를 MFOLD 프로그램을 사용해 분석한 결과 가장 개방된 부위 (94~76 레지듀)를 합성 올리고머로 억제 시킬 경우 암세포의 사멸 유도 효과를 본 것으로 보고하고 있다 (Kondo et al., 1998).

아데노바이러스(Adenovirus)는 DNA 바이러스로서, 게놈 DNA 의 크기는 약 36kbp 이며 그 게놈에 바이러스가 증식하는데 필수적인 유전자인 E1 유전자 부위와 바이러스가 패키징되는데 필수적인 유전자 등이 포함되어 있다. 이러한 아데노바이러스가 유전자 요법에 이용되기 위해서는 바이러스가 체내에서 스스로 증식하여 온몸에 감염됨으로써 또 다른 질병이 유발되지 않도록 바이러스 증식에 사용되는 유전자를 제거하여야 한다. 따라서, 아데노바이러스 게놈 중에 바이러스가 증식하는데 관여하는 E1 유전자 부위를 제거하면 바이러스가 스스로 정상 세포에서 증식할 수 없어 아데노바이러스를 유전자 요법에 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 아데노바이러스 벡터에서 바이러스 증식에 관여하는 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 서열번호 1의 6 내지 26번째 염기서열을 포함하는 텔로머라제 개방 hTR 부위에 대한 안티센스 텔로머라제 DNA를 삽입하여, 여기서 전사된 mRNA (이하, '안티센스 텔로머라제'라 함)에 의한 텔로머라제 활성을 억제시키는 바이러스 벡터를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 상기 안티센스 아데노바이러스 발현 벡터를 만들기 위해 두 시발체 (서열번호 1, 서열번호 2)를 상보적으로 합성하여 안티센스 DNA를 준비하였으며, 두 시발체 끝에는 제한 효소 자리를 넣어 아데노바이러스 벡터로의 클로닝을 용이하게 하였다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 안티센스 텔로머라제 DNA가 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus, CMV)의 최전 프로모터(immediate early promoter), 다클로닝 부위 (multiple cloning site) 및 시미언바이러스 (Simian virus 40, SV) 40의 후 아데닌다중화 (late polyadenylation) 신호로 구성되는 발현 카세트에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제공한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 상기 안티센스 텔로머라제 DNA가 서열번호 1 및 2의 시발체들을 합성후 상보 결합하여 생성하고, 이를 상기 발현 카세트의 다클로닝부위내 BamHI 및 HindIII 제한부위에 삽입되어 이루어진 것을 특징으로 하는 도 1a의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-OA를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 헬퍼 아데노바이러스 벡터와 함께 패키징 세포에 공동형질감염(cotranspection)한 후 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 pJM17와 함께 293세포에 공동형질감염한 후 증식시켜 얻은 것을 특징으로 하는 수탁번호 (KCCM 10312)의 아데노바이러스 클론 Ad-OA를 제공한다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 이용하여 아데노바이러스를 대량으로 얻기 위하여, 아데노바이러스가 패키징될 수 있는 세포주를 상기 발현 벡터로 형질감염시킨다(transfection). 구체적으로 패키징 세포주로 인간 태아 신장 유래의 293 세포를 이용하는데, 293 세포는 그의 염색체 DNA 에 아데노바이러스의 E1 유전자 부위를 포함하고 있어 E1a 유전자를 계속적으로 발현하고 세포에 E1a 단백질을 제공한다. 아데노바이러스의 게놈 DNA 은 크기가 약 36kbp 정도로 매우 커서 이의 유전자를 조작하는데 큰 어려움이 있으므로 아데노바이러스 발현 벡터에는 아데노바이러스 전체 DNA 가 아닌 일부 DNA 만을 포함시킨 다음 헬퍼 아데노바이러스 벡터를 사용하여 E1을 제외하고 아데노바이러스 증식에 필요한 트랜스-작용 (trans- acting) 유전자 및 단백질을 공급한다. 따라서, 본 발명은 아데노바이러스 발현 벡터로부터 세포내에서 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론를 제조하기 위하여 E1 영역에 pBR322 삽입체를 갖는 완전한 아데노바이러스-5 게놈을 포함하는 헬퍼 아데노바이러스 벡터 pJM17 (Microbix Biosystems 사, 토론토, 캐나다) 등을 이용한다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포에 상기 헬퍼 아데노바이러스 벡터와 함께 주입하면 상기 아데노바이러스 발현 벡터가 대량으로 증식되고 동시에 아데노바이러스가 패키징되는데 필요한 유전자도 발현된다. 보통 한 개의 293 세포에서 약 1만개의 아데노바이러스 입자가 만들어지며 이렇게 세포내에 축적된 바이러스는 세포를 물리적으로 파쇄하고 원심 분리함으로써 순수하고 용이하게 정제될 수 있다.

본 발명은 세포내에서 안티센스 텔로머라제를 생산하여 조혈모 세포의 분화, 증식 촉진을 위한 유전자 요법에 사용될 수 있는 아데노바이러스 클론을 제공함에 그 목적이 있다. 구체적으로 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 패키징 세포 (293세포)에서 증식시켜 증식성 재조합 변이바이러스(RCV)가 포함되지 않은 아데노바이러스 클론을 제공한다. 이 때, 아데노바이러스가 증식하는데 필요한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 모체 벡터로는 아데노바이러스 벡터 pJM17 을 사용하였고, 패키징 세포로는 293 세포를 사용하였다. 본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론을 Ad-OA로 명명하고 이를 2001년 8월 29일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM 10312).

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 헬퍼 바이러스 벡터와 함께 패키징 세포에 공동형질감염 (cotranspection)하여 아데노바이러스 클론을 증식시키는 단계 및 상기 아데노바이러스 클론 중 안티센스 텔로머라제의 발현하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 아데노바이러스 클론의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 발현 안티센스 특이 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 안티센스 텔로머라제의 발현하는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론 중 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 클론을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법을 제공한다.

더 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 3 및 4 의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1A 시발체 또는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법을 제공한다.

유전자 요법에 사용되는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위해서는 상기 아데노바이러스 클론 제조 과정에서 돌발적으로 생성되는 증식성 재조합 변이 바이러스(RCV)를 해결하는 것이 중요하다. 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV- OA 는 E1 유전자 부위가 안티센스 텔로머라제를 발현하는 발현 카세트로 대체되어 이로부터 만들어진 바이러스는 293 세포가 아닌 정상 세포에서는 스스로 증식할 수 없다. 그러나 상기 293 세포에서 패키징 과정 중에 적지 않은 빈도로 RCV 가 생성되게 되는데 이는 293 세포가 갖고 있는 아데노바이러스 DNA와 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 간에 동일한 염기 서열이 존재하여 상동 재조합(homologous recombination)이라는 기전에 의하여 서로 그 내부 부위가 교환되기 때문이다.

구체적으로 상기 아데노바이러스 발현 벡터로 형질전환된 293 세포의 경우에서 상기 상동 재조합에 의하여 안티센스 텔로머라제 DNA를 포함하는 발현 벡터가 293 세포내의 아데노바이러스 DNA 인 E1 유전자 부위로 치환되어 결과적으로 E1 유전자를 포함하는 새로운 바이러스 DNA 가 만들어지며 이로부터 패키징되는 바이러스는 E1a 단백질이 없는 정상 세포에서도 증식하게 된다. 이렇게 생성된 RCV 가 포함된 바이러스는 바이러스에 의한 감염증을 유발하므로 임상적으로 유전자 요법에 절대로 사용될 수 없고 임상에 사용되는 바이러스는 반드시 RCV 실험에서 음성 결과가 나와야 한다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 아데노바이러스 클론 중 목적부위 hTR의 선택 특이적 제거 활성을 갖는 클론을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법을 제공한다.

더 바람직하게는, 본 발명은 서열번호 9 및 11 의 염기 서열을 갖는 hTR 특이 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 목적부위 hTR의 선택 특이적 제거 활성을 갖는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 클론을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포의 분화, 증식 촉진을 위한 유전자 요법용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 클론을 유효성분으로 함유하는 인간 배아줄기세포로부터 조혈모세포의 분화 유도를 위한유전자 요법용 조성물을 제공한다.

본 발명의 유전자요법용 조성물은 본 발명의 유효성분인 아데노바이러스 클론 외에 생물제제에 통상 사용되는 안정화제 및 담체, 기타 보조 활성성분 등을 더 포함할 수 있으며, 조혈모세포의 분화, 증식을 촉진하기 위해 액제의 형태로 인간 배아줄기세포나 인체에서 분리된 조혈모 세포에 세포외(ex-vivo)로 투여되거나 주사제 형태로 인체에 직접 투여될 수 있다. 이 때 세포에 투여될 아데노바이러스 클론 입자의 적정 수는 원하는 분화, 증식의 정도에 따라 다르나 바람직하게는 세포당 1X10⁹~1X10¹² pfu (plaque forming unit) 정도이다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 아데노바이러스 클론을 숙주세포에 형질감염시켜 얻어지는 형질감염세포를 제공한다.

본 발명에서, 숙주세포는 아데노바이러스로 형질감염될 수 있는 어떤 세포도 가능하며, 바이러스 증식을 위한 293 세포나 유전자요법의 대상이 되는 표적세포일수 있다.

바람직하게는, 본 발명은 상기 숙주세포가 인간의 배아줄기세포 또는 인체에서 분리된(ex vivo) 조혈모 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염세포를 제공한다.

본 발명은 상기 아데노바이러스 클론을 배아줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화, 증식을 촉진시키는 용도를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 아데노바이러스 클론은 특히 세포 치료에 필요한 세포생산 및 인공 혈액의 생산에 매우 유용하게 응용될 수 있다

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 안티센스 텔로머라제를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 아데노바이러스를 제조하기 위하여, 아데노바이러스의 게놈 DNA에서 E1 유전자 부위를 제거하고 그 자리에 안티센스 텔로머라제 DNA를 포함하는 발현 카세트를 대신 삽입함으로써 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조한다.

구체적으로, 본 발명은 아데노바이러스 타입 5 에서 E1 유전자 부위를 제거한 나머지 유전자를 포함하고 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)의 최전 프로모터(immediate early promoter), 다클로닝 부위(multiple cloning site) 및 시미언바이러스 40(simian virus, SV40)의 후 아데닌다중화(late polyadenylation) 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMVp(A)를 이용한다. 안티센스 텔로머라제는 두 시발체 (서열번호 1, 2)를 합성 후 상보 결합시켜 발현 벡터 p△ACMVp(A)의 다클로닝 부위의 Bam HI 및 Hind III 제한효소 부위에 삽입하고 안티센스 텔로머라제를 발현할 수 있는 발현 벡터 p△ACMV-OA를 제조 하였다 (도 1a 참조).

또한, 본 발명은 상기 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-OA를 헬퍼 아데노바이러스 벡터 pJM17와 함께 패키징 세포인 293세포에 공동형질감염한 후 증식시켜 아데노바이러스 클론 Ad-OA를 제조하였다 (도 1b 참조).

본 발명은 안티센스 텔로머라제 발현여부를 조사하기 위하여, 상기 아데노바이러스 클론을 분리하여 서열 번호 1을 이용하여 돗 블럿을 시행하여 293 세포에서 안티센스 텔로머라제가 발현함을 확인하였다 (도 2 참조).

또한 상기 아데노바이러스 클론에 존재하는 증식성 재조합 변이 바이러스 (RCV)를 분석하기 위하여, RCV가 아데노바이러스 발현 벡터에는 없는 E1 유전자 부위를 포함한다는 사실에 기초하여 본 발명의 아데노바이러스 타입 5 의 E1A 유전자 부위 및 E1B 유전자 부위가 존재하는가를 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 확인하였다 (도 3 참조). 이 때 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1A 시발체 그리고 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1B 시발체를 이용한다 (서열표 3, 서열표 4 및 서열표 5, 서열표 6 참조). 그 결과, 각각 752bp 및 1818bp 크기의 DNA 절편이 주형으로 사용한 바이러스 DNA에 존재하지 않음을 확인하였다. 그 결과 안티센스 텔로머라제를 293 세포내에서 생산할 수 있고 RCV를 생산하지 않는 아데노바이러스 클론을 선별하여 이를 Ad-OA로 명명하였다. 본 발명의 아데노바이러스 클론을 2001년 년 8월 29일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM 10312). 상기 바이러스는 안티센스 시퀀스를 생산하며 목적 부위인 hTR을 선택적으로 제거함을 역전사 효소-중합효소 연쇄반응으로 확인하였다 (도 4 참조).

본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-OA 가 조혈모세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (cell exclusion assay)으로 측정하였다. 이 때 대조군으로 Ad-OA 처리하지 않은 조혈모세포를 사용하였고 실험군은 Ad-OA 처리한 조혈모세포를 사용하여, 양 군간에 세포수의 차이가 없음을 확인하였다 (표 1 참조). 또한 조혈모세포 체외 배양시 Ad-OA에 의한 분화, 증식 촉진 효과를 라이트(Wright) 염색법으로 측정하였다 (도 5 a,b 참조) 그리고, 본 발명의 아데노바이러스 클론 Ad-OA 가 배아줄기세포 성장에 미치는 효과는 트리판 블루 염색법 (cell exclusion assay)으로 측정하였다. 이 때 대조군으로 Ad-OA 처리하지 않은 배아 줄기세포를 사용하고 실험군은 Ad-OA 처리한 배아 줄기세포를 사용하여, 양 군간에 세포수의 차이가 없음을 확인하였다 (표 2 참조).

그리고, 상기 아데노바이러스가 텔로머라제 활성을 억제하는지 알아보기 위하여 텔로미어 반복 중합 연쇄 반응 (telomeric repeat amplification protocol; TRAP)으로 측정하여 텔로머라제 활성억제 효과를 확인하였다 (도 6 참조). Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)을 통하여 아포토시스의 정도를 측정하는 Cell Death Detection ELISA^PLUS(Roche, Germany) kit를 사용하여 Ad-OA에 감염된 조혈모세포와 감염되지 않은 조혈모세포의 아포토시스(apoptosis) 양상의 차이를 규명하여 차이가 없음을 확인하였다. (도 7a 참조). 또한, Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)을 통하여 아포토시스의 정도를 측정하는 Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche, Germany) kit를 사용하여 Ad-OA에 감염된 배아 줄기세포와 감염되지 않은 배아 줄기세포의 아포토시스(apoptosis) 양상의 차이를 규명하여 차이가 없음을 확인한다. (도 7b 참조)

그리고, Western blot 법을 이용하여 Ad-OA 감염되지 않은 조혈모세포에서는 나타나지 않는 세포 분화, 증식과 관련된 유전자인 Cyclin D, E의 발현이 Ad-OA 감염된 조혈모세포에서 나타나는지를 확인하였다. (도 8 참조). 또한, 유세포분석법(Flowxytometry)을 이용한 CD34+45- 세포 수의 측정을 통하여 Ad-OA 처리된 배아 줄기세포가 처리되지 않은 인간 배아 줄기세포 보다 많은 양의 CD34+45- 세포를 분화시킴을 확인하였다 (도 9 참조).

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시 예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 안티센스 텔로머라제를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터의 제조

본 발명은 안티센스 텔로머라제를 포함하는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 아데노바이러스 타입 5 에서 E1유전자 부위를 제거하고 이에 인간 사이토메갈로바이러스의 최전 프로모터(immediate early promoter), 다클로닝 부위 및시미언 바이러스 40의 후 아데닌다중화 (late polyadenylation) 신호로 구성되는 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 p△ACMVp(A) (Chinghai Cao 제조, 한국특허출원 10-1997-0005206 참조)를 이용하였다. 본 발명의 안티센스 텔로머라제를 세포 내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터를 제조하기 위하여, 각 끝에 제한 효 소인 BamHI과 HindIII 자리를 갖는 한 쌍의 시발체를 제조하였고 (서열번호1, 서열번호 2) 이를 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM EDTA 버퍼에서 90 ℃ 10 분, 55 ℃ 4시간 방치하여 상보 결합시키고 이를 상기 발현 벡터 p△ACMVp(A)의 다클로닝 부위에 존재하는 Bam HI/HindIII 제한효소부위에 삽입하였다. 그 결과, 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-OA를 제조하였다 (도1a 참조).

실시예 2: 안티센스 텔로머라제를 세포내에서 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론의 제조

세포에 감염되어 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 클론을 제조하기 위하여, 본 발명의 아데노바이러스 발현벡터 p△ACMV-OA를 헬퍼 아데노바이러스 벡터 pJM17 (Product#: PD-01-06, Microbix 사 제품, 캐나다)와 함께 패키징 세포주인 293 세포(한국세포주은행 KCLB#21573)에 리포좀 (FuGENE 6: 로쉬 사 제품) 이용하여 공동형질감염(cotransfection)시켰다 (도 1b 참조). 이 때 형질감염은 24-웰 플레이트를 사용하여 수행하였고 그 결과 4개의 웰에서 바이러스에 의한 플라크가 생성됨을 확인하였다. 본 발명에서 선별한 아데노바이러스 클론을 Ad-OA로 명명하고 이를 2001년 8월 29일에 한국 미생물 보존센터에 기탁하였다 (수탁번호 : KCCM 10312).

실시예 3 증식성 재조합 변이 바이러스의 분석

실시예 2에서 얻은 아데노바이러스 클론에 존재할 수 있는 증식성 재조합 변이 바이러스(replication competent recombinant virus, RCV)를 분석하기 위하여, RCV는 293 세포내에 존재하는 아데노바이러스 유전자와 아데노바이러스 발현 벡터 의 유전자 중복 부위가 재조합(recombination)에 의해 E1A 유전자 서열이 아데노바이러스 발현 벡터에 삽입되어 발생한다는 사실을 기초로 하여 다음과 같이 조사하였다. 구체적으로 아데노바이러스 클론에서 분리한 DNA에 아데노바이러스 타입 5 의 E1A 유전자 부위 및 E1B 유전자 부위가 존재하는가를 확인하기 위하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1A 시발체 그리고 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 한 쌍의 E1B 시발체를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. 이 때 아데노바이러스 DNA는 프로티나제 K (proteinase K, 2mg/ml)를 0.5% SDS 존재하에 처리한 다음 페놀 추출 및 에탄올 침전 등을 수행하여 분리하였다. 상기 E1A 시발체 및 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 통해 주형으로 사용한 바이러스 DNA에 E1 유전자 부위 (752bp 및 1818bp 크기)가 존재하지 않음을 아가로스 겔 상에서 확인하였다 (도 3 참조). 도 3에서, 레인 1-3은 아데노바이러스 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 시발체, E1A, E1B 시발체를 이용해 Ad-OA 바이럴 DNA 증폭한 것이고, M은 100 베이스 페어 마커이고, 레인 4-6은 아데노바이러스 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 시발체, E1A, E1B 시발체를 이용해 293 DNA 증폭한 것이다. 대조군으로 E1 유전자 부위에 해당하지 않는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 아데노바이러스 시발체로 중합효소 연쇄반응을 수행하면 E1 유전자의 유무에 상관없는 861bp 크기의 DNA 절편을 확인할 수 있다.

실시예 4: 안티센스 발현 및 목적부위 hTR의 선택 특이적 제거

재조합 바이러스가 안티센스를 생산함을 확인하기 위해, Ad-OA 감염 293 세 포에서 바이럴 DNA를 추출해서 서열 1을 DIG-DNA 표지 및 탐색 킷 (베링거 맨하임사)를 이용해 표지하고 바이럴 DNA를 동 회사의 나일론 맴브레인에 부착 후 상기 킷을 이용하여 돗블럿을 실시하였다 (도 2). 도 2에서, Mock은 전처리 하지 않은 293 세포주의 DNA이고, Ad-CMV는 대조군인 Ad-CMV null 감염시킨 세포에서 얻은 바이럴 DNA이고, Ad-OA는 Ad-OA 처리한 세포에서 얻은 바이럴 DNA이다. 또한 Ad-OA 감염 NCI-H358(한국세포주은행 KCLB# 25807)에서 전체 세포 RNA를 TRIZol 반응용액 (기브코사제품)으로 추출한 후 올리고 (dT)15 (프로메가 제품)과 수퍼스크립트 II 역전사 효소 (기브코사 제품)를 이용 cDNA 합성 후 발현 안티센스 특이 시발체 (서열표 9, 10 참조)를 이용하여 r-Taq (타카라 제품)으로 중합반응을 시행하여 안티센스가 발현됨을 확인했으며 (도 4 참조) hTR 특이 시발체 (서열표 9, 11 참조)을 사용한 중합반응을 시행하여 Ad-OA에 의한 목적 부위인 hTR의 선택 특이적 제거 효과를 확인하였다 (도 4 참조). 도 4에서, M은 100 베이스 페어 마커이고, 레인 1, 4, 7은 목 (mock) 감염이고, 레인 2, 5, 8은 Ad-CMV null 감염이고, 레인 3, 6, 9는 Ad-OA 감염이고, 350bp는 GAPDH이고, 400bp는 hTR이고, 120bp antisense OA이다. 이때 서열 번호 12 및 서열번호 13의 염기서열을 갖는 인간 글리세르 알데하이드-3인산 탈수소효소 (glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) 시발체를 대조군으로 사용한다.

실시예 5: 텔로머라제 활성 억제 효과

아데노바이러스 Ad-OA로 감염된 조혈모세포에서 텔로머라제 활성 억제 효과를 조사하기 위하여, 6-웰에 세포를 배양하여 100 pfu/세포 농도의 아데노바이러스 Ad-OA 또는 Ad-CMV null 으로 처리한 다음 Kim (Kim et al., 1994) 등에 의한 텔로미어 반복 중합 연쇄 반응 (telomeric repeat amplification protocol; TRAP) 으로 2000개의 세포에서 텔로머라제 활성도를 측정하였다. 그 결과 Ad-CMV null 감염 세포에 비해 Ad-OA 감염 세포의 텔로머라제 활성이 약 40 % 감소하였다 (도 6). 상대적 활성도는 밀도 분석 프로그램 (Total Lab. 사 제품)을 사용하여 분석하였다. 도 6은 Ad-OA에 의한 조혈모세포에서의 텔로머라제 활성 억제 효과를 텔로미어 반복 중합 연쇄 반응 (telomeric repeat amplification protocol; TRAP)으로 측정한 결과이다.

실시예 6: 세포 아포토시스 분석

아데노바이러스 Ad-OA로 감염되지 않은 조혈모세포(대조군)와 감염된 조혈모세포(실험군)에서 배양 14일째에 유발되는 아포토시스를 조사하기 위하여, Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)을 통하여 아포토시스의 정도를 측정하는 Cell Death Detection ELISA^PLUS(Roche, Germany) kit를 사용하여 그 결과를 비교, 분석하였다. 그 결과, negative control은 0.020, positive control은 0.156이고, 대조군 (Mock)은 평균 0.0983(0.0786-0.121), 실험군 (Ad-OA)은 평균 0.0994(0.0811-0.123)으로 아포토시스 정도의 유의한 차이가 없음을 확인할 수 있었다. (도 7a). 도 7에서, 아포토시스 정도는 흡광도(A405nm A490nm)에 의한 ELISA방법으로 측정되었다.

또한, 아데노바이러스 Ad-OA로 감염되지 않은 배아 줄기세포(대조군)와 감염 된 배아 줄기세포(실험군)에서 배양 7일째에 유발되는 아포토시스를 조사하기 위하여, Histone-DNA 비율의 측정(absorbance, A405nm-A490nm)으로 아포토시스 정도를 측정하는 Cell Death Detection ELISA^PLUS(Roche, Germany) kit를 사용하여 결과를 비교, 분석하였다. 그 결과, (negative control: 0.020, positive control: 0.186) 대조군은 평균 0.129(0.092-0.134), 실험군은 평균 0.138(0.087-0.152)로 아포토시스 정도의 차이가 없음을 확인하였다. (도 7b)

실시예 7: 아데노바이러스 Ad-OA 의 조혈모세포 분화, 증식 촉진 효과

본 발명의 아데노바이러스 클론을 조혈모세포의 분화, 증식 촉진 요법에 효과적으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, Ad-OA 처리를 하지않은 조혈모세포를 배양한 대조군과 Ad-OA 처리를 한 조혈모세포를 배양한 실험군을 배양 14일 째에 그 결과를 비교, 분석하였다. 트리판 블루 염색법 (trypan blue dye exclusion assay) 및 라이트 염색법 (Wright staining)을 실시하였다. 그 결과 트리판 블루 염색법에서는 대조군과 실험군(Ad-OA 처리)에서 각각 평균 76%, 77%로 생존세포 비율에서는 차이가 없었으나 (표 1 참조), 라이트 염색을 통한 총 세포 수 계산 결과 실험군이 대조군보다 유의하게 세포 수가 많음(대조군: 1.32(0.97-2.1) X 104/ml vs 실험군: 3.9(1.9-5.3) X 104/ml,) 통계적으로 유의하게 telomerase antisense를 처리한 실험군에서 세포 수가 많았다 (P<0.001).관찰함으로써 생존 세포 수 또한 유의하게 Ad-OA 처리한 실험군이 대조군에 비하여 의미있게 많음을 확인할 수 있었다(P<0.001). 또한 세포의 형태학적인 면에서도 대조군에 비하여 실험군(Ad-OA 처 리)에서 보다 분화된 세포들을 관찰할 수 있었다 (도 5 a,b 참조). 표 1은 조혈모세포 체외 배양시 Ad-OA에 의한 증식 촉진 효과를 트립판 블루(Tryphan blue) 염색법으로 측정한 결과로서, A는 Control group이고, B는 Study group (Treated with Ad-OA)이고, Cell viability는 tryphan dye exclusion test로 평가되었다. 도 5 a,b은 조혈모세포 체외 배양시 Ad-OA에 의한 분화, 증식 촉진 효과를 라이트(Wright) 염색법(X 1,000)으로 측정한 결과로서, A는 Control group이고, B는 Study group (Treated with Ad-OA)이다.

실시예 8: 아데노바이러스 Ad-OA 의 배아줄기세포 분화, 증식 촉진 효과

본 발명의 아데노바이러스 클론을 SNUhES-3 인간 배아 줄기세포(세포응용연구 사업단. 서울대학교, 문신용 교수)의 분화, 증식 촉진 요법에 효과적으로 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, Ad-OA 처리를 하지않은 인간 배아 줄기세포를 배양한 대조군과 Ad-OA 처리를 한 인간 배아 줄기세포를 배양한 실험군을 배양 7일에 그 결과를 비교, 분석하였다. 트리판 블루 염색법 (trypan blue dye exclusion assay) 및 라이트 염색법 (Wright staining)을 실시하였다. 그 결과 트리판 블루 염색법에서는 대조군과 실험군(Ad-OA 처리)에서 각각 93%, 89%의 중앙값으로 생존세포 비율에서는 차이가 없었으나 (표 2 참조), 라이트 염색을 통한 총 세포 수 계산 결과 실험군이 대조군보다 유의하게 세포 수가 많음(대조군: 2.37(1.97-2.93) X 104/ml vs 실험군: 2.8(2.3-3.2) X 104/ml,) 통계적으로 유의하게 telomerase antisense를 처리한 실험군에서 세포 수가 많았음을 (P<0.001) 관찰함으로써 생존 세포 수 또한 유의하게 Ad-OA 처리한 실험군이 대조군에 비하여 의미 있게 많음을 확인하였다(P<0.001). 세포의 형태학적인 면에서도 대조군에 비하여 실험군(Ad-OA 처리)에서 보다 분화된 세포들을 관찰할 수 있었다. 표 2는 조혈모세포 체외 배양시 Ad-OA에 의한 증식 촉진 효과를 트립판 블루(Tryphan blue) 염색법으로 측정한 결과로서, A는 Control group이고, B는 Study group (Treated with Ad-OA)이고, Cell viability는 tryphan dye exclusion test로 평가되었다.

실시예 9: 세포 분화, 증식 관련 유전자 탐색

아데노바이러스 Ad-OA로 감염되지 않은 조혈모세포(대조군)와 감염된 조혈모세포(실험군)에서 분화, 증식 관련 유전자의 변화 양상을 비교, 분석하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blot) 법으로 유전자 탐색을 실시하였다. 그 결과 G1기에 중요한 역할을 하는 Cyclin D와 S기에 중요한 역할을 하는 Cyclin E가 특이하게 실험군에서 활성화 되나 대조군에서는 발현되지 않음을 확인할 수 있었다. (도 8). 도 8는 Ad-OA 감염되지 않은 조혈모세포에서는 나타나지 않는 세포 분화, 증식과 관련된 유전자인 Cyclin D, E의 발현이 Ad-OA 감염된 조혈모세포에서 나타난 결과이다. 도 8a에서 화살표는 TA 처리되지 않은 Control group에서 없으나, TA 처리된 Study group(A8, 3G, 5G는 각각 10, 100, 500 moi)에서 관찰되는 Cyclin D 발현을 가리킨다. 도 8b에서, 화살표는 TA 처리되지 않은 Control group (A1, A2)에서 없으나, TA 처리된 Study group (B1, B2)에서 관찰되는 Cyclin E 발현을 가리킨다.

실시예 10: 인간 배아줄기세포에서 분화된 CD34+45- 세포 측정

아데노바이러스 Ad-OA로 감염되지 않은 인간 배아 줄기세포(대조군)와 감염된 인간 배아 줄기세포(실험군)로부터 조혈모세포로의 분화 유도 효과를 5일 간의 배아체 배양 후 유세포분석법(flowcytometry) 통하여 조혈모세포로의 분화유도 마커인 CD34+45- 세포 수를 측정하였다. 도 9는 Ad-OA 감염된 배아줄기세포와 감염되지 않은 배아줄기세포에서 조혈모세포로의 분화유도 마커인 CD34+45- 세포 수를 측정한 결과로서, 도 9a는 Control group의 FACS 데이타이고, 도 9b는 Study group (Treated with Ad-OA)의 FACS 데이터이고, 도 9b는 양자의 비교 그래프이다(Con: Control group, Study: Study group (Treated with Ad-OA)). 그 결과, 대조군인 아 데노바이러스 Ad-OA로 처리되지 않은 인간 배아 줄기세포는 CD34+45- 세포가 평균 279(230-321)/uL, 실험군인 아데노바이러스 Ad-OA로 처리된 인간 배아 줄기세포는 CD34+45- 세포가 평균 453(289-578)/uL로 유의하게 실험군이 높음을 확인하였다 (P<0.01). 이로부터, Ad-OA 처리된 배아 줄기세포가 처리되지 않은 인간 배아 줄기세포 보다 많은 양의 CD34+45- 세포를 분화시켰음을 알 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 아데노바이러스 발현 벡터 및 이로부터 얻은 바이러스 클론 Ad-OA 는 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화를 유도하고, 조혈모세포의 증식, 분화를 유도하는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 상기 아데노바이러스 클론은 다양한 중합효소 연쇄반응 등을 수행한 결과 증식성 변이 바이러스를 전혀 만들어내지 않으므로 안전하고 용이하게 사용될 수 있기 때문에 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 안전한 분화, 증식 유도를 통하여 난치성 질환을 대상으로 하는 면역세포를 이용한 세포치료를 위한 면역세포의 생산 및 인공 혈액의 생산에 상당한 기여를 할 수 있으리라고 기대된다. 그리고, 본 발명의 아데노바이러스 Ad-OA 는 기존의 안티센스 올리고머에 비해 독성이나 부작용이 적은 반면 기존의 안티센스 올리고머와 거의 같은 효과를 내는 것으로 생각되어 매우 우수한 안전성을 나타낸다.

[참고문헌]

A.I.Glukhov, O.V. Zimnik and S.E. Severin. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells in vitro by antisense oligonucleotides. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 248, 368-371 (1998)

Bhaswati P. and Nitai. P. Detection of telomerase activity in Chinese hamster V79 cells and its inhibition by 7-deaza-deoxy guanosine triphosphate and (TTAGGG)4 in vitro. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 251, 620-624 (1998)

Bisoffi, A.E.Chakerian, M.M.Fore. Inhibition of human telomerase by a retrovirus expressing telomeric antisense RNA. European J. of Cancer vol.14 pp1242-1249 (1998)

David Wynfold and David Kipling Telomerase. Cancer and the knockout mouse. Nature vol.389 pp.551-552 (1997)

Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PLC, Coviello GM, Wright WE, Weinric SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 266: 2011-2015 (1994).

Kohtaro Fujimoto and Morinobu Takahashi. Telomerase activity in human leukemic cell lines is inhibited by antisense pentadecadeoxynucleotides targeted against c-myc mRNA. Bioche. and BioPhy. Res. Comm. 241, 775-781 (1997)

Kondo S, Kondo Y, Li G, Silverman RH, Cowell JK. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene.16:3323-3330 (1998).

Lee CT, Wu S, Gabrilovich D, Chen H, Nadaf-Rahrov S, Ciernik IF, Carbone DP. Antitumor effects of an adenovirus expressing antisense insulin-like growth factor I receptor on human lung cancer cell lines. Cancer Res. 1996;56: 3038-41.

Peng-Sheng Zheng, Tsuyoshi Iwasaka et al. Telomerase activity in gynecologic tumors. Gynecologic oncology 64, 171-175 (1997)

Scanlon KJ, Ohta Y, Ishida H, Kijima H, Ohkawa T, Kaminski A, Tsai J, Horng G, Kashani-Sabet M. Oligonucleotide-mediated modulation of mammalian gene expression. FASEB J.9:1288-1296 (1995)

Steiner MS, Anthony CT, Lu Y, Holt JT. Antisense c-myc retroviral vector suppresses established human prostate cancer. Hum Gene Ther. 1998;9: 747-755.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

1. 바이러스의 증식에 관여하는 E1 유전자를 제거하고 서열번호 1의 6 내지 26번째 염기서열을 갖는 안티센스 텔로머라제 DNA를 포함하여 세포 내에서 안티센스 텔로머라제를 생산할 수 있는 아데노바이러스 발현 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 안티센스 텔로머라제 DNA가 사이토메갈로바이러스 (CMV)의 최전 프로모터, 다클로닝 부위 및 시미언바이러스 (SV) 40의 후 아데닌다중화 신호로 구성되는 발현 카세트에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 발현 벡터.
3. 제 2항에 있어서, 상기 안티센스 텔로머라제 DNA가 서열번호 1 및 2의 시발체들을 합성후 상보 결합하여 생성하고, 이를 상기 발현 카세트의 다클로닝부위내 BamHI 및 HindIII 제한부위에 삽입되어 이루어진 것을 특징으로 하는 도 1a의 아데노바이러스 발현 벡터 p△ACMV-OA.
4. 제 1항 내지 제 3항의 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 헬퍼 아데노바이러스 벡터와 함께 패키징 세포에 공동형질감염 (cotranspection)한 후 증식시켜 얻은 아데노바이러스 클론.
5. 제 4항에 있어서, 상기 아데노바이러스 발현 벡터를 pJM17와 함께 293세포에 공동형질감염한 후 증식시켜 얻은 것을 특징으로 하는 수탁번호 (KCCM 10312)의 아데노바이러스 클론 Ad-OA.
6. 제 1항 내지 제 3항의 아데노바이러스 발현 벡터를 바이러스 증식을 위한 헬퍼 아데노바이러스 벡터와 함께 패키징 세포에 공동형질감염 (cotranspection)하여 아데노바이러스 클론을 증식시키는 단계 및 상기 아데노바이러스 클론 중 안티센스 텔로머라제의 발현하는 클론을 선별하는 단계를 포함하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
7. 제 6항에 있어서, 서열번호 9 및 10의 염기서열을 갖는 발현 안티센스 특이 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 안티센스 텔로머라제의 발현하는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 아데노바이러스 클론 중 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 클론을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서, 서열번호 3 및 4 의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1A 시발체 또는 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 E1 유전자 부위의 E1B 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증식성 변이 바이러스를 생산하지 않는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
10. 제 6항에 있어서, 상기 아데노바이러스 클론 중 목적부위 hTR의 선택 특이적 제거 활성을 갖는 클론을 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
11. 제 10항에 있어서, 서열번호 9 및 11 의 염기 서열을 갖는 hTR 특이 시발체를 이용한 중합효소 연쇄반응을 수행하여 목적부위 hTR의 선택 특이적 제거 활성을 갖는 클론을 선별하는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 클론의 제조방법.
12. 제 4항의 아데노바이러스 클론을 숙주세포에 형질감염시켜 얻어지는 형질감염세포.
13. 제 12항에 있어서, 상기 숙주세포는 인간의 배아줄기세포 또는 인체에서 분리된 조혈모 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염세포.
14. 제 4항의 아데노바이러스 클론을 유효성분으로 함유하는 조혈모세포의 분화, 증식 촉진을 위한 유전자 요법용 조성물.
15. 제 4항의 아데노바이러스 클론을 유효성분으로 함유하는 인간 배아줄기세포로부터 조혈모세포의 분화 유도를 위한유전자 요법용 조성물.

Images