CN116024178A - 可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 - Google Patents
可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116024178A CN116024178A CN202211011013.XA CN202211011013A CN116024178A CN 116024178 A CN116024178 A CN 116024178A CN 202211011013 A CN202211011013 A CN 202211011013A CN 116024178 A CN116024178 A CN 116024178A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- associated fibroblasts
- cafs
- cells
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞,所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如SEQ ID No:1的多核苷酸片段,所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时,可被药物特异性的诱导死亡,所述的药物为更昔洛韦,更昔洛韦药物浓度范围为1‑100μM。本发明提供了一种全新的、方便的研究不同亚型CAFs功能的细胞构建方法及其应用,该新型CAFs在更昔洛韦处理下,会靶向死亡,削弱该类型CAFs对共培养肿瘤细胞的作用,能帮助有效区分不同亚型CAFs在肿瘤发生发展中的作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种可被靶向清除的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤的发生、发展依赖于肿瘤细胞与微环境中细胞的交互对话,肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最重要的细胞之一。多项研究发现,在乳腺癌、胰腺癌、口腔癌等肿瘤中,CAFs的数量与患者的预后密切相关。CAFs可以通过分泌如TGF-b,IL6和IL1等细胞因子促进肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤免疫微环境;此外其释放基质金属蛋白酶等参与肿瘤的细胞外基质重塑,诱导肿瘤细胞产生耐药性;CAFs也可以通过释放丙氨酸,天冬氨酸、乳酸等小分子代谢物,为肿瘤细胞生长提供能量。因此,明确CAFs功能对肿瘤治疗研究至关重要。
CAFs是肿瘤组织内或肿瘤边界处的一类非上皮细胞、非内皮细胞,非肿瘤细胞,非免疫细胞的细胞,其可以由组织内处于静息状态的成纤维细胞转化而来,也可以由骨髓间充质干细胞、内皮细胞及脂肪细胞分化而来。由于CAFs来源的多样性,不同肿瘤或同一肿瘤内CAFs的功能也各不相同。例如,乳腺癌内CD146-CAFs增强肿瘤细胞对泰莫西芬的抵抗性,而CD146+CAFs功能与之相反。当前已有大量研究利用单细胞测序、流式分选及靶向清除CAFs等方法研究不同类型CAFs的表达谱和功能,其中利用基因工程的手段使细胞表达自杀基因靶向去除CAFs是一种可以明确CAFs功能的实验方法。
大量研究已证明靶向清除CAFs有助于明确CAFs的来源及其在肿瘤进展中的作用,LeBleu等前期通过靶向去除Tgfbr2+αSMA+细胞,证明Tgfbr2信号途径影响肌成纤维细胞招募。Mertens等证明体内靶向诱导CAF凋亡能抑制肿瘤细胞生长并延长小鼠生存。目前常用的靶向去除CAFs的方法之一是单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidinekinase,HSVtk)介导的细胞死亡,HSVtk可以诱导更昔洛韦(Ganciclovir,GCV)发生磷酸化,形成三磷酸脱氧胸苷,而当细胞快速增殖时,三磷酸脱氧胸苷会整合入正在合成的DNA中,抑制DNA合成,诱导细胞死亡。虽然HSVtk自杀系统已在转基因小鼠模型中用于研究CAFs功能,但尚缺乏HSVtk自杀系统靶向清除CAFs对共培养肿瘤细胞作用的评价。因此,本研究拟构建CAFs-HSVtk细胞,通过体外共培养模型和迁移模型,比较GCV诱导的CAFs-HSVtk死亡对肿瘤细胞增殖,迁移的影响,明确应用HSVtk自杀系统靶向清除CAFs研究不同亚型CAFs功能的可行性。这是本发明要解决的问题。
发明内容
发明目的:本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足,提供一种可被靶向清除的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用,为明确不同亚型CAFs的功能提供一种新方法。
为了解决上述技术问题,本发明公开了一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞,所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如SEQ ID N0:1的多核苷酸片段。
其中,所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。
所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时,可被药物特异性的诱导死亡,所述的药物为更昔洛韦,更昔洛韦药物浓度范围为1-100μM。
本发明进一步提出了上述的肿瘤相关成纤维细胞的构建方法,包括如下步骤:
(1)构建由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段的质粒:在pCDH质粒载体基础上,经Xba I和BamH I限制性内切酶切割后,将载体与包含SEQ ID NO:1的多核苷酸片段连接,得到连接载体,然后转入Stbl3甘油菌中,所得克隆进行测序鉴定,获得由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段的质粒;其中包含SEQ ID NO:1的多核苷酸片段的正义链片段(SEQ ID NO:2)为序列为SEQ ID NO:1多核苷酸片段的5’端添加CTAGA,3’端添加G,反义链(SEQ ID NO:3)为SEQ ID NO:1多核苷酸片段的5’端添加GATCC,3’端添加T,获得的连接载体;
(2)将步骤(1)得到的质粒与包装质粒和转染试剂混合混合转染293T细胞,获得含由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段质粒的慢病毒,然后以肿瘤相关成纤维细胞为出发细胞,应用慢病毒将构建的质粒转染至肿瘤相关成纤维细胞中;其中,包装质粒选择psPAX2和pMD2.G质粒,转染试剂可选用polyjet或lipo3000用量可以根据常规用量调节。
(3)利用1μg/ml嘌呤霉素对步骤(2)获得的肿瘤相关成纤维细胞进行筛选后,荧光显微镜观察和Q-PCR鉴定。
本发明进一步提出了上述肿瘤相关成纤维细胞在制备人肿瘤相关成纤维细胞模型中的用途。
具体地,所述用途包括:将所述肿瘤相关成纤维细胞与其他肿瘤细胞共培养,构建共培养肿瘤细胞增殖模型。
在该用途中,将所述肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞共培养,混合比例按照体积比为1:0.5~2,然后用更昔洛韦处理,观察肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞增殖的作用。
作为另外一种应用,将所述肿瘤相关成纤维细胞与接种于transwell下室,肿瘤细胞接种于transwell上室,构建肿瘤细胞迁移模型。
在该应用中,利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡,削弱肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用,明确肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。
有益效果:本发明提供了一种全新的、方便的研究不同亚型CAFs功能的细胞构建方法及其应用,该新型CAFs在更昔洛韦处理下,会靶向死亡,削弱该类型CAFs对共培养肿瘤细胞的作用,能帮助有效区分不同亚型CAFs在肿瘤发生发展中的作用。
具体地,具有如下优点:
(1)与Cre-LOXP敲除系统相比,该方法操作简单、方便、经济,仅需一步克隆和一步转染即可得到目标细胞;
(2)该方法靶向行强,高浓度更昔洛韦处理后,80%新的CAFs细胞死亡,而原始CAFs细胞生存无影响;
(3)该方法应用广泛,可应用于二维或3D共培养模型,帮助明确CAFs在肿瘤发生发展中的作用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明,本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为新的CAFs细胞中HSVtk基因的转录表达水平结果图;
图2为GCV对新的CAFs细胞死亡诱导作用;
图3为新的CAFs细胞在共培养肿瘤细胞模型中的应用;
图4为肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。
具体实施方式
实施例1新型肿瘤相关成纤维细胞的构建。
下述实施例中用的试剂,除非特别指出,均为常用试剂。
(1)质粒构建:
合成包含SEQ ID NO:1的多核苷酸片段,其中该多核苷酸序列的正义链为SEQ IDNO:1多核苷酸片段的5’端添加CTAGA,3’端添加G,反义链为SEQ ID NO:1多核苷酸片段的5’端添加GATCC,3’端添加T,
将pCDH-CMV采用Xba I和BamH I进行双酶切,反应体系如表1所示:
表1
将以上反应混合物置于37℃水浴中反应6h,然后进行琼脂糖凝胶电泳,采用胶回收试剂盒回收目的片段,然后建立表2酶连体系:
表2
将以上酶连体系置于16℃水浴中反应12h后,采用热激法将酶连产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞,转化后37℃复苏1h后涂于含50μg/ml的氨苄LB平板上,37℃倒置培养16h后,挑取单克隆进行DNA测序分析。测序正确的克隆提取质粒,以备后续使用,质粒的序列如SEQ ID NO:4所示。
(2)慢病毒包装:
转染前一天,将3x106 293T细胞均匀铺到10cm大皿中,使细胞密度达90%。第二天将6μg前一步构建的质粒、4μg psPAX2和2μg pMD2.G质粒与40μl polyjet混合,然后加入293T细胞。转染后48小时收集细胞上清,并经0.45μm过滤器过滤后冻存,即为含有核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1的慢病毒。
(3)阳性细胞鉴定:
应用慢病毒将含有核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1的载体转入CAFs细胞中,嘌呤霉素筛选获得一种新CAFs,即染色体上额外携带一段序列SEQ ID NO:1。新CAFs细胞构建方法具体如下:
1)将含SEQ ID NO:1序列的pCDH载体的慢病毒按MOI 1:50侵染CAFs细胞;
2)3天后,1ug/ml嘌呤霉素筛选获得新的CAFs细胞。
3)根据RNA提取试剂说明,分别提取正常CAFs和新CAFs细胞的RNA,并应用反转录试剂逆转录成cDNA,然后使用qPCR Kit试剂盒检测相关基因表达水平,引物设计如下:
HSVtk-F:GGAGGACAGACACATCGACCG,
HSVtk-R:GCAGATACCGCACCGTATTGGC;
GAPDH-F:TGTGGGCATCAATGGATTTGG,
GAPDH-R:ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。
应用2-△△Ct法计算基因相对表达量。
本发明的一种新的CAFs细胞,显微镜下观察其形态与其他CAFs均无显著性区别,并且qPCR方法明确该新的CAFs细胞中HSVtk基因的转录表达水平显著升高(图1)。(4)GCV有效诱导新的CAFs细胞死亡
将3000个新CAFs细胞接种到96孔板中,第二天分别加入0,1,50,100μM GCV,第三天CCK-8和结晶紫检测细胞活力,1μM,10μM和100μM GCV能有效诱导CAFs-HSVtk细胞死亡。而相同浓度的GCV处理正常CAFs细胞后,与对照组相比,细胞数量无显著变化(图2)。
实施例2新的CAFs细胞在共培养肿瘤细胞模型中的应用。
分别将500,1000或2000个新CAFs细胞与1000个HSC-3-Luciferase细胞混合,均匀铺到12孔板中,第二天GCV组加入100μM GCV诱导CAFs死亡,药物处理组GCV处理6天后,应用荧光素酶报告基因检测试剂裂解细胞,酶标仪读取荧光信号。新的CAFs与肿瘤细胞共培养后,利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡,削弱CAFs的促肿瘤细胞增殖的能力,明确CAFs对共培养肿瘤细胞增殖的作用(图3)。
实施例3新的CAFs细胞在肿瘤迁移模型中的应用。
将正常CAFs或新的CAFs调整至2.5*104/ml,在24孔板下室中加入200μl细胞悬液,应用GCV处理下室细胞6天后,上室接种5*104HSC-3细胞,培养箱培养24小时后,取出小室,甲醇固定后应用结晶紫染色,显微镜下随机拍摄3个视野并分析。利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡,削弱CAFs的促肿瘤细胞迁移的能力瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用,明确肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。(图4)
本发明提供了一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法,具体实现该技术方案的方法和途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (9)
1.一种可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞,其特征在于,所述肿瘤相关成纤维细胞染色体携带序列如SEQ ID No:1的多核苷酸片段。
2.根据权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞,其特征在于,所述肿瘤相关成纤维细胞具有与其他肿瘤相关成纤维细胞相当的形态和体外生长速率。
3.根据权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞,其特征在于,所述肿瘤相关成纤维细胞在于其他肿瘤相关成纤维细胞共培养时,可被药物特异性的诱导死亡,所述的药物为更昔洛韦,更昔洛韦药物浓度范围为1-100 μM。
4.权利要求1所述的肿瘤相关成纤维细胞的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)构建由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段的质粒:在pCDH质粒载体基础上,经Xba I和BamH I限制性内切酶切割后,将载体与包含SEQ ID NO:1的多核苷酸片段连接,得到连接载体,然后转入Stbl3甘油菌中,所得克隆进行测序鉴定,获得由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段的质粒;其中包含SEQ ID NO:1的多核苷酸片段的正义链片段为序列为SEQ ID NO:1多核苷酸片段的5’端添加CTAGA,3’端添加G,反义链片段为SEQ ID NO:1多核苷酸片段的5’端添加GATCC,3’端添加T,获得的连接载体;
(2)将步骤(1)得到的质粒与包装质粒和转染试剂混合混合转染293T细胞,获得含由CMV启动子调控表达SEQ ID NO:1多核苷酸片段质粒的慢病毒,然后以肿瘤相关成纤维细胞为出发细胞,应用慢病毒将构建的质粒转染至肿瘤相关成纤维细胞中;
(3)利用1 μg/ml嘌呤霉素对步骤(2)获得的肿瘤相关成纤维细胞进行筛选后,荧光显微镜观察和Q-PCR鉴定。
5.权利要求1-3任一项所述的肿瘤相关成纤维细胞在制备人肿瘤相关成纤维细胞模型中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述用途包括:将所述肿瘤相关成纤维细胞与其他肿瘤细胞共培养,构建共培养肿瘤细胞增殖模型。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,将所述肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞共培养,混合比例按照体积比为1:0.5~2,然后用更昔洛韦处理,观察肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞增殖的作用。
8.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述用途包括:将所述肿瘤相关成纤维细胞与接种于transwell下室,肿瘤细胞接种于transwell上室,构建肿瘤细胞迁移模型。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于,利用更昔洛韦可诱导新的肿瘤相关成纤维细胞死亡,削弱肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用,明确肿瘤相关成纤维细胞对共培养肿瘤细胞迁移的作用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211011013.XA CN116024178A (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211011013.XA CN116024178A (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116024178A true CN116024178A (zh) | 2023-04-28 |
Family
ID=86069534
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211011013.XA Pending CN116024178A (zh) | 2022-08-23 | 2022-08-23 | 可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116024178A (zh) |
-
2022
- 2022-08-23 CN CN202211011013.XA patent/CN116024178A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108251423B (zh) | CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及激活方法和应用 | |
CN106566838B (zh) | 一种基于CRISPR-Cas9技术的miR-126全长基因敲除试剂盒及其应用 | |
Ji et al. | Identification of microRNA‐181 by genome‐wide screening as a critical player in EpCAM–positive hepatic cancer stem cells | |
CN108315330A (zh) | CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用 | |
CN101189348B (zh) | 用于产生合成启动子的系统 | |
CN107828738A (zh) | 一种dna甲基转移酶缺陷型cho细胞系及其制备方法及应用 | |
WO2023123195A1 (zh) | 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用 | |
CN102181445A (zh) | 一种靶向lin28基因的干扰小分子rna及其抗胶质瘤增殖的用途 | |
Cui et al. | Circular RNA circ_0067934 functions as an oncogene in glioma by targeting CSF1. | |
CN107693535A (zh) | 一种microRNA的应用 | |
CN116024178A (zh) | 可被靶向诱导死亡的肿瘤相关成纤维细胞及其构建方法和应用 | |
Lee et al. | A functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture | |
CN107523566B (zh) | 一种mcm3ap-as1基因的靶向抑制剂及其用途 | |
JP2021528984A (ja) | 成体幹細胞の拡大と誘導のインビトロでの誘発 | |
CN103952406B (zh) | 抑制人恶性脑胶质瘤增殖的靶向STAT3基因的siRNA及其表达载体和应用 | |
CN107502610A (zh) | 一种靶向STAT3信号通路miRNA及其制备方法和应用 | |
CN113897438A (zh) | 一种用于分子诊断的cd74-ros1重排的dna标准品、rna标准品及其应用 | |
CN102229928B (zh) | 人rbbp6基因的小干扰rna及其应用 | |
CN110964727A (zh) | 特异抑制c-myc基因表达的shRNA慢病毒表达载体构建方法与应用 | |
CN111228292B (zh) | 人tpt1/tctp基因在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
CN109097399A (zh) | 长链非编码rna h19的表达载体、表达h19的细胞株及其应用 | |
Ye et al. | Upregulation of MEG3 inhibits neuroblastoma progression via decreasing proliferation and promoting apoptosis | |
CN110042121B (zh) | 一种促进白血病细胞分化的方法及其应用 | |
CN110093374B (zh) | 一种mrfft1细胞的构建方法 | |
CN109097335B (zh) | 正常肝干细胞向肝癌干细胞恶性转化的诱导方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |