CN101189348B - 用于产生合成启动子的系统 - Google Patents

Abstract

本申请披露了一种用于制作和选择转录增强组合启动子盒的方法，该方法包括：构建随机组合转录调节元件的文库，这些元件包括由转录调节子识别的双链DNA序列元件；将组合转录调节元件插入载体中的报道基因在其后面的最小启动子的上游；将载体插入到宿主细胞中；然后筛选显示出报道基因增强表达的细胞，并鉴别细胞中的组合启动子盒。

Description

用于产生合成启动子的系统

相关申请的交叉引用

本申请要求于2005年4月8日提交的美国申请第10/907,620号的优先权，将其全部内容以引用方式结合于本文。

技术领域

本申请涉及一种系统，该系统用于为基因的有效表达设计启动子。

背景技术

尽管早期预期为用于治疗各种疾病的有希望的新技术，但在大多数至今为止进行的试验中并未证明基因治疗的临床效力。临床基因治疗的主要技术障碍之一是很难将治疗性基因递送到特定的靶细胞并且保持足够高水平的转基因表达所希望的时间。虽然将治疗性基因递送到特定的细胞类型(靶向转导)是最期望的，但它是主要的技术障碍并且在此领域仅报道了有限的成功(5、24、48)。作为一种可替换的方式，科学家使用了细胞类型特异性的启动子以将转基因的表达仅限制在靶细胞中(靶向转录)(18)。这些启动子制作自在相同靶细胞中特异性地表达的基因(28、43、51、55)。然而，就靶细胞选择性而论，这些所谓的细胞特异性启动子经常是渗漏的，引起转基因以不同的水平在非靶细胞中表达。在大多数情况下，这些启动子并不强大到足以在获得实际的治疗效果所需要的水平或在高于所述水平介导转基因表达。这些事实表明，需要更系统的方式来开发高效细胞类型特异性的启动子系统。

发明内容

本发明涉及生产转录调节序列的合成组合，其可以在特定的细胞类型中高效驱动基因表达。

在本发明的一个方面，可以通过下述来完成上述生产：(1)构建DNA序列元件(其由所希望的转录调节子识别)的随机组合的文库；(2)利用细胞分选仪如FACS(荧光激活细胞分选仪)对文库进行高通量筛选，以选择少量的DNA序列元件的表现最好的组合(best performing combination)；以及可选地(3)进一步试验所选择的每个组合，以最终选择一种或多种表现最好的组合。

在本发明的一种特定具体实施方式中，可以通过将双链DNA寡核苷酸随机连接在一起而构建文库，其中每种双链DNA寡核苷酸可以包含能够高亲和力地结合转录调节子的DNA序列元件。

包括在寡核苷酸(用于随机连接反应)中的DNA序列元件可以基于不同的方法来确定，上述不同的方法包括对靶细胞中的转录因子进行DNA微阵列图谱分析(profiling，分布或作图)或选择性地从包含随机核苷酸的寡核苷酸的池扩增高亲和力结合序列元件。还可以利用对在靶细胞中表达的基因的序列进行基于算法的计算机分析来确定DNA序列元件。

更详细地，可以用限制酶切割随机组合的序列元件并克隆在报道基因的上游，其可以是但不限于GFP或LacZ，并且可以产生质粒DNA或病毒载体的文库。该文库可以利用但不限于反转录病毒载体或腺病毒载体来产生。

可以将载体DNA转染或感染进入靶细胞，然后用FACS分选，以选择表达高水平报道基因的细胞，其中DNA载体包含随机序列组合的文库，而随机序列组合被克隆在最小启动子(后面是报道基因)的上游。然后分选的细胞用来回收和扩增载体DNA，该载体DNA包含所希望的高表现转录调节元件组合。

可以将回收和扩增自分选的细胞的载体插入靶细胞，然后再次通过利用FACS来选择最高表现的转录调节元件组合。可以重复若干次相同的步骤：将回收的载体DNA插入细胞，分选最高表达的细胞，以及从分选的细胞回收载体DNA，以从上百万不同组合中精选和获得少量的最高表现的组合。

在完成重复分选和选择以后，可以在靶细胞中单独地进一步筛选回收的DNA载体以试验它们的真正启动子活性。

作为对照，如果需要细胞型特异性启动子，则也可以在非靶细胞中试验所选择的包含转录调节元件组合的载体，以便消除在非靶细胞中具有显著的启动子活性的载体。

在本发明的一个方面，本发明涉及一种用于生产合成组合启动子盒的方法，其中所述盒用于基因或病毒治疗载体中。与其它目前可获得的启动子系统相比，这些合成启动子(选自上百万潜在的候选物)可以以很大改善的效率和选择性地驱动转基因在特定靶细胞中的表达。在一个方面，该系统利用高通量测定系统，如但不限于DNA微阵列和荧光激活细胞分选仪(FACS)，并且可以用来产生在短期内对实际上任何类型的细胞均特异的合成启动子。本发明显著地增加了目前可获得的基因或病毒治疗载体系统的效力，这些系统依赖于靶向基因转录。同时，它使得可以将各种新的基因或病毒治疗药物候选物快速引入市场，用于治疗癌症和其它疾病。

在本发明的一个特别示例性说明的方面，产生了合成启动子盒，其能够使基因转录特异性地靶向成神经细胞瘤癌细胞。此外尤其是，本发明涉及构建顺式作用(cis-acting)序列元件的随机组合的文库，其是基于对靶成神经细胞瘤细胞中的转录调节子进行DNA分析(分布，profiling)。通过随机连接双链寡核苷酸可以产生顺式作用序列元件的上百万的不同的组合，其中双链寡核苷酸包含各种顺式作用序列元件，用于结合在成神经细胞瘤细胞中特异地表达的转录调节子。包括在随机连接反应中的顺式作用序列元件的确定是基于先前进行的对在靶成神经细胞瘤细胞中的转录调节子和相关蛋白的DNA微阵列表达谱分析(表达分布，expression profiling)。将随机连接的序列元件组合克隆在最小启动子的上游，其中最小启动子的后面是报道基因如lacZ或GFP。

在本发明的另一个特定方面，本发明涉及利用基于FACS的定向进化方案对文库进行预筛选。可以筛选质粒文库以选择少量(大约90个)的在靶成神经细胞瘤细胞中表现最好的组合，其被选用以经受更广泛的筛选步骤，从而鉴别对给定靶细胞特异的序列元件的最高表现组合。这种体外进化方法部分地取决于高通量细胞分选技术(如FACS)分选细胞的能力，其中所述细胞在用报道基因载体的文库转染或感染以后表达报道基因产物如β-半乳糖苷酶。

此外，本发明涉及单独地用96孔瞬时转染/感染测定(在靶和非靶细胞中)对预选择的顺式作用序列组合进行筛选。对大约90种预选择的组合启动子盒的性能均进行了评估，并且根据它们在靶细胞中的启动子活性强度以及在非靶细胞中的活性缺乏选择了序列元件的大约3-5种表现最好的组合。非靶细胞类型的集合，包括神经元前体细胞和神经元细胞，用于筛选以确保所选择的包含序列元件组合的启动子盒对于靶成神经细胞瘤细胞真正具有选择性。

可以将选择的成神经细胞瘤特异的启动子盒克隆在载体中如但不限于反转录病毒和腺病毒载体，以另外试验在天然染色质或染色质样环境中它们的活性(在靶细胞和非靶细胞中)。该单独的表现最好的盒用于各种载体系统中，以在动物试验以后将其开发成成神经细胞瘤癌基因治疗或肿瘤溶解病毒治疗药物候选物。

本发明涉及一种用于制作和选择组合启动子盒的方法，该方法包括：(i)构建随机组合的转录调节元件的文库，其中包括由不同的转录调节子识别的多序列元件；(ii)将组合转录调节元件插入载体中的最小启动子(后面是报道基因)的上游；以及(iii)筛选在特定细胞中报道基因的最高水平的表达，在报道基因的上游其序列包括所选择的启动子盒。

可以在连接反应条件下，通过将包含不同DNA序列元件的双链寡核苷酸混合在一起来制作随机组合转录调节元件的文库，其中包括由不同的转录调节子识别的多DNA序列元件。另外，寡核苷酸的末端可以包含侧翼核苷酸，借助于限制性内切核酸酶，上述侧翼核苷酸可以被平整或切割，以在经受连接反应以前产生突出的末端。在一个方面，报道基因可以是lacZ并且报道基因表达可以通过荧光激活细胞分选仪(FACS)加以筛选。

另外，在上述方法中，通过对在特定靶细胞中表达的转录调节子进行DNA微阵列图谱分析可以获得由细胞类型特异性转录调节子识别的DNA序列元件。

在以上描述的方法中，特定的细胞类型可以是癌细胞：癌细胞、肉瘤细胞、黑素瘤细胞、以及尤其是成神经细胞瘤细胞。

在另一个方面，本发明涉及一种包括上述组合转录调节元件的载体。该载体可以是质粒、病毒、瞬时表达的、或能够被整合宿主细胞基因组中。

本发明还包括原核生物或真核生物起源的宿主细胞，如大肠杆菌、植物、昆虫、哺乳动物、以及人。

根据本发明的以下描述、附图以及所附权利要求，本发明的这些和其它目的将更充分地被理解。

附图说明

根据下文给出的详细描述和附图可以更充分地理解本发明，其中附图仅通过举例说明方式给出而不是限制本发明，并且其中：

图1示出了一载体系统，在该载体系统中转录调节元件被彼此随机连接并克隆在最小启动子(D96)(后面是报道基因(LacZ))的上游。

具体实施方式

在本申请中，“一”、“一个”以及“一种”用来指单数和复数对象。

如在本文中所使用的，“转录调节元件”是指由转录调节子识别的核苷酸序列，并且与“顺式作用序列”或“顺式作用序列元件”或“顺式作用区”同义，而且有时表示为“序列元件”。

如在本文中所使用的，“组合转录调节元件”是指包括多于一个的转录调节元件的双链DNA分子。可以通过以随机方式连接各种双链转录调节元件来产生组合转录调节元件。可选地，组合序列元件可以包含间隔区并且间隔核苷酸(间隔区核苷酸，spacernucleotide)的长度可以通过在随机连接反应中使用双链DNA分子以前使它们经受一段时间的外切核酸酶消化来加以控制。

如在本文中所使用的，“寡核苷酸”是指一种序列，该序列功能上包括顺式作用区以及也许多达约25个或较少的体外核苷酸。因此，由术语“寡核苷酸”包含的核苷酸的数目不可能是固定的，因而不限于任何特定数目的核苷酸。

如在本文中所使用的，“启动子盒”或“合成启动子盒”是指DNA片段，其包含用于基因有效转录的成分，并且可以包括一种或多种转录调节元件、最小启动子区、来自5’-非翻译区的序列或内含子。

如在本文中所使用的，“最小启动子区”或“最小启动子”是指短DNA片段，其本身是无活性的，但当和其它转录调节元件结合时可以介导强转录。最小启动子序列可以衍生自各种不同的来源，包括原核基因和真核基因，其实例是多巴胺β-羟化酶基因最小启动子和巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因最小启动子。

如在本文中所使用的，“组合启动子盒”或“合成组合启动子盒”是指包含组合转录调节元件的启动子盒。

如在本文中所使用的，“转录调节子”是指包括蛋白质的任何因子，其结合于顺式作用区并正或负调节基因的表达。转录因子或阻遏物(阻抑物，repressor)或辅激活物(co-activator)或辅阻遏物都包括在其中。

转录调节子表达谱分析(表达分布)

可以通过各种方法进行转录调节子表达谱分析。可以利用各种方法来确定：哪些转录因子存在于感兴趣的细胞类型中以及哪些顺式区是转录因子或阻遏物的结合部位。在本发明的一个方面，基于DNA微阵列的转录因子表达谱分析可以用来设计合成启动子盒。真核基因转录是一种复杂的生化过程，该过程涉及来自多蛋白调节子的组合效应，其中多蛋白调节子包括转录激活物、阻遏物、辅激活物以及辅阻遏物(7、15、29、35)。因此，知道在不同细胞类型中这些蛋白可获得的准确外形可大大有助于理解在这些细胞中这些蛋白的不同组合如何介导基因转录。

在本发明中，利用商业上可获得的DNA微阵列芯片对3种成神经细胞瘤细胞类型进行表达谱分析，其中DNA微阵列芯片点样有寡核苷酸，用于1500种不同的基因编码转录调节子以及直接或间接与基因转录有关的其它蛋白。这些结果显示出各种细胞类型特异性表达的转录调节子。若干发育调节的转录调节子的表达模式精密地与在文献中报道的先前的观测结果一致。这表明，微阵列测定是敏感的，足以检测在相对低水平表达的转录产物。基于来自这些微阵列测定的数据，确定了特异地表达在成神经细胞瘤细胞中的转录因子。

然后利用出版的报道和其它来源(其列出用于鉴别的转录调节子的顺式作用序列)确定了这些成神经细胞瘤特异的转录调节子的顺式作用序列元件，并且它们用于构建能够在这些靶细胞中选择性地靶向基因转录的合成启动子盒。

在许多不同细胞类型中进行转录调节子和相关蛋白的表达谱分析，并且产生了数据库。该数据库(称作TREP数据库，来自转录调节子表达谱(表达分布，expression profile))包含关于细胞类型之间在各种组织特异性或组成型表达转录调节子和相关蛋白的表达水平差异方面的详细信息。对于不同组的细胞可以推出表达谱的一般模式。因而上述数据库便于我们理解：在发育的正常过程中以及在致瘤性转化中，这些蛋白的不同组合如何用于细胞类型特异性基因表达。同时，TREP数据库变成一种用于启动子盒的设计和合成的工具，其中启动子盒用于转基因的靶细胞特异性和/或药理上诱导性表达。

在用于鉴别的转录调节子的顺式作用序列不可获得的情况下，则可以用实验方法获得这样的DNA序列元件。例如，一组包含随机核苷酸序列的寡核苷酸可以在结合反应条件下与经纯化的转录调节子进行混合，然后利用常规方法测定与任何寡核苷酸的结合。可以对结合的寡核苷酸进行测序，以确定顺式作用区的核苷酸序列。

构建随机序列元件组合的文库

对于给定细胞类型，在知道转录调节子和相关蛋白的表达谱以后，则通过结合用于特异性地表达在靶细胞中的转录调节子的顺式作用序列元件就可以制作合成组合转录调节元件。为了增加启动子强度，在构建中还可以包括用于多种遍在(ubiquitously)表达的转录因子的顺式作用序列。最大转录效率可获自顺式作用序列，其包括在组合启动子盒中，用于在靶细胞中遍在表达的转录因子。另一方面，根据顺式作用序列可确定靶细胞特异性，其中顺式作用序列包括在盒中，用于结合在靶细胞中特异性地表达的转录因子。当选择顺式作用序列时，还考虑到在靶细胞中这些转录因子的辅激活物的可用性。

当适当装配时，这些组合转录调节元件结合在特定靶细胞中表达的多转录调节子，并且有效地驱动转基因表达。在非靶细胞中相同的组合转录调节元件是无活性的，这是由于缺少为结合于序列元件所需要的特定转录调节子。

组合转录调节元件还可以包括这样的序列元件，其用于结合仅在非靶细胞中表达的转录阻遏物，从而进一步增强转基因表达的靶细胞特异性。在启动子盒中顺式作用序列元件(用于结合阻抑蛋白)的存在将在表达高水平阻抑蛋白的非靶细胞中有效地抑制转录。另一方面，它在靶细胞中将没有任何效应，因为它们并不表达相同的阻抑蛋白。因此，通过知道在靶细胞与非靶细胞中表达的转录调节子和辅调节子的准确的外形，则可以最有效地利用基因转录的组合特性。

基因的有效转录需要转录因子和辅因子(装配在特定基因的启动子/增强子区上)的组合相互作用(15、16、29)。转录因子结合于在基因的启动子/增强子区的顺式作用序列元件，其以特定顺序排列并具有特定的空间收缩(space constriction)。仅当不同转录因子结合序列元件以特定顺序排列并在它们之间具有适当间距时，才可以实现来自合成基因启动子盒的最有效的转录。在理论上，对于10种不同的顺式作用序列元件，假设对于长度为10个序列元件的组合每个元件仅使用一次，则存在3百万以上的不同的可能排列。因此，如果利用常规方法进行，则需要惊人的时间来装配和试验所有这些可能的组合以确定对于多转录因子的最好的序列元件排列。

通过采用本发明的方法可以克服这种限制，该方法包括(1)采用随机连接反应来产生顺式作用序列元件组合的文库；采用定向进化方法并利用流式细胞仪(FACS)在靶细胞中对文库进行预筛选以选择大约90个表现最好的组合；以及在靶细胞和非靶细胞中利用瞬时转染测定(如在96孔平板中)来筛选预选择的或预筛选的序列元件组合，从而选择约3-5个最终的候选物。

在随机连接反应过程中，会产生序列元件的上百万的不同组合，其中很可能包含具有序列元件的最佳排列(就在靶细胞中具有强和选择性的转录活性而言)的组合。

利用基于FACS的定向进化对文库进行预筛选

本发明的一个方面涉及一种预筛选方法，该方法采用如在Huang等人(20)中所描述的基于FACS的定向进化方案，将其全部内容以引用方式结合于本文，尤其是关于利用FACS的方案。

Huang等人(20)报道了基于FACS的方法，该方法用来从随机DNA序列选择用于肌肉特异性转录因子MyoD的功能增强子/启动子部位。具有埋入肌肉特异性最小启动子中的随机核苷酸的寡核苷酸被克隆在β-半乳糖苷酶基因的上游。借助于MyoD表达载体，得到的质粒文库被共转染进入NIH 3T3细胞。通过FACS选择表达高水平β-半乳糖苷酶的细胞并消除大多数表达低到中等水平的报道基因的细胞。由此分选的细胞(最初群体的约5％)包含具有高水平转录活性的质粒，其中转录活性是由MyoD结合于高亲和力序列元件所介导。通过Hirt方案(19)自这些选择的细胞提取质粒，对质粒进行扩增，并再次用于转染细胞和通过FACS进行分选，然后重复DNA提取和扩增、转染、以及分选的相同步骤。在上述分选和扩增的3个循环以后，细胞群高度富集用能够介导最高水平报道基因表达的质粒转染的细胞。在此定向进化方案中的选择压力是MyoD结合于随机序列的效率(用于激活β-半乳糖苷酶报道基因)。此方式是有效和快速的，因为FACS可以检测少至5个β-半乳糖苷酶/细胞(44)并且它可以每小时分选约1百万个细胞。在用大肠杆菌LacZ报道基因转染以后，基于β-半乳糖苷酶活性，对活哺乳动物细胞的荧光激活细胞分析和分选的步骤已很好地建立起来(12、44)。

在本发明中，对Huang等人(20)的基于FACS的选择方案的基本概念已进行了改进，使得报道基因表达由多序列元件的随机组合来介导。在这种情况下，来自多转录因子结合于随机组合序列元件、而不是单因子结合于随机核苷酸的组合输入决定了报道基因表达的效率。这种方式的一个显著特点是，在所有相关调节子和辅调节子存在的情况下，在靶细胞中实时选择序列组合。这种方案用于预筛选顺式作用序列元件组合的文库，以便快速消除大多数在靶细胞中具有低到中等转录能力的组合。选择了大约90种表现最好的序列组合，使它们容易用于更充分的筛选，其中筛选是在靶细胞和非靶细胞中进行并借助于96孔格式的转染/感染。将每种细胞类型平皿接种于96孔平板，然后用90种选择的克隆加上阳性和阴性对照载体进行转染/感染。在靶细胞中的瞬时转染/感染筛选使大约90种选择的克隆可以按照它们在启动子活性中的强度进行排列。此外，如果需要细胞类型特异性启动子盒，则可以在非靶细胞中对这些克隆进行筛选，以消除在这些非靶细胞中具有可检测活性的所有渗漏克隆。在筛选中试验了许多不同的非靶细胞类型(原代细胞和细胞系)，以确保所选择的序列组合对于靶细胞是真正选择性的。可以选择约3至5种表现最好的组合启动子盒并在克隆在病毒载体中以后进一步试验。

本发明的制作合成组合启动子盒的方法实际上可以用于任何类型的细胞，优选癌细胞。根据公众可获得的并由基因医学杂志(2004年1月31日更新)提供的基于万维网的数据库(用于世界范围的基因治疗临床试验)，全世界有918项基因治疗临床试验正在进行中。在临床基因治疗试验中最经常治疗的疾病是癌症，构成66％(608项试验)。这些试验的大约190项使用自杀基因或肿瘤抑制基因。这些试验依赖于治疗性基因产物有效地和选择性地杀死癌细胞而不影响患者的正常细胞的能力。本发明的方法可以用于合成启动子的生产，其中合成启动子特别为这些癌基因治疗试验的每一项的要求而设计，从而导致改善的效力。

成神经细胞瘤细胞-特异性转录调节子

虽然任何细胞类型可以用来实施本发明，但本文以成神经细胞瘤作为靶细胞举例说明。因此，在本发明的一个方面，制备了成神经细胞瘤癌细胞-特异性合成组合启动子盒。成神经细胞瘤是儿童早期的最常见的实体瘤之一，其发生于肾上腺髓质或交感神经组织的其它部位。每年有大约650例成神经细胞瘤新病例。其特征在于多种多样的临床行为：从自发消退到快速肿瘤进展以及死亡(54)。虽然通过外科切除术可以经常成功地治疗初期肿瘤，但后期恶性成神经细胞瘤极具攻击性并且在较大儿童中是致命的，甚至在加强的多模式疗法(多重模式疗法，multimodal therapy)以后(42)。因此，迫切需要先进的治疗策略如基因治疗或溶瘤细胞病毒治疗，以用于后期成神经细胞瘤患者。

在胚胎发育和胚后期发育的正常过程中，多能神经嵴细胞分化成各种神经和神经内分泌细胞类型。因此，产生自多能神经嵴细胞的成神经细胞瘤肿瘤包含多细胞表型。从成神经细胞瘤原发性肿瘤或从骨髓转移灶已建立了许多细胞系，并广泛用于分子和细胞研究的不同领域。长期研究表明，在成神经细胞瘤细胞系中存在3种不同的细胞类型：I型干细胞、N型成神经细胞-神经内分泌前体、以及S型施旺-成黑素细胞前体(Schwannian-melanoblastic precursor)(49)。I型干细胞比N型细胞或S型细胞明显地更为恶性。全面的遗传和组织病理学研究揭示了在人成神经细胞瘤肿瘤中的3种相似类型的细胞(33)。推测的I型干细胞存在于所有阶段的肿瘤中。在各种不同的分化阶段，肿瘤包含N型成神经细胞。基质细胞包含起源于肿瘤的S型细胞和正常细胞。3种上述不同类型的成神经细胞瘤细胞系用作靶细胞，以便设计成神经细胞瘤细胞特异性合成组合启动子盒：I型：SK-N-BE(2)-C细胞；N型：SH-SY5Y细胞；S型：SH-EP1细胞。

进行了能够在上述3种细胞类型中有效地介导基因表达的组合启动子盒的合成。基于在这些细胞系中的选择所制备的组合启动子盒具有高度的可能性：在动物试验中和在临床试验中，以相同方式在体内发挥作用。

在将选自瞬时转染测定的3-5种成神经细胞瘤特异性组合启动子盒放入病毒表达载体以后，进一步对它们进行试验。真核基因组被包装进入复合染色质结构，并且已有报道，为了便于转录，需要通过蛋白质，如组蛋白乙酰转移酶和依赖ATP的染色质重建因子，来重建染色质结构(13、53)。至少在感染的早期，借助于在核小体样结构中的病毒基础蛋白将反转录病毒载体稳定地整合到宿主基因组和腺病毒基因组复合物中(45)。因此，在动物研究中再次对装备有合成组合启动子盒(在体外研究中所选用的)的重组反转录病毒和腺病毒LacZ表达载体进行试验，以了解它们在靶细胞和非靶细胞中表达的特异性和效率。选择一种表现最好的合成组合启动子盒并进一步开发成基因或病毒治疗药物候选物，用于在适当载体中的临床试验。因此，例如，它可以在癌基因治疗试验中用于自杀或细胞毒基因的成神经细胞瘤癌细胞特异性表达，或用于载体中，这些载体用于成神经细胞瘤特异性肿瘤溶解病毒治疗试验。

在本发明的另一个方面，可以优化靶向不同癌类型的合成组合启动子盒的生产。对方案进行优化以便可以利用原代细胞进行基于FACS的预筛选步骤。这使得该技术可以应用于多种癌类型而无需为进行筛选步骤而建立任何适当的细胞系。原代癌细胞可以制备自新鲜组织样品，其可以通过全国癌症研究所的人组织协作网络(Cooperative Human Tissue Network of the National CancerInstitute)获得。基于FACS的步骤在预筛选序列组合文库方面的成功应用很大程度上依赖于转染靶细胞的效率。一般说来，基于脂质或基于磷酸钙的转染方法在原代细胞中达到小于25％的转染效率。为了克服这种限制，试验了基于慢病毒和/或基于电穿孔的基因转移方法，以获得更高水平的转染效率。使用慢病毒系统的优点是它能够转导静止期或生长停滞期的细胞。无启动子的慢病毒载体系统可商业上获得(Invitrogen，Carlsbad，CA)。利用这种系统，可以制备和包装包含序列元件的不同组合(驱动β-半乳糖苷酶基因表达)的慢病毒载体文库，用于在相对较短时间内转导原代细胞。电穿孔是另一种相对高效转染原代细胞的方法。

本发明的用于优化和层流载体技术的另一种方法是通过收集来自多种多样的细胞类型的数据来扩大转录调节子表达谱(TREP)数据库。当从足够大量的细胞类型建造数据库时，则可以为每个特定组的细胞推出转录调节子表达谱的一般模式，其有助于以更加可预测的方式完成所提出方案的设计部分。其它有关信息也包括在数据库中，如大约90种预选择的随机组合启动子盒的核苷酸序列，其中预选择是根据每个基于FACS的选择实验以及在靶细胞和非靶细胞中的瞬时转染测定中它们的启动子活性。因为该技术用于合成靶向各种癌类型的组合启动子盒，所以数据库会积累关于转录因子的不同组合或组在特定细胞类型中的行为的信息。在长期运转中，通过使设计者可以预测转录因子的某些组合的结果(甚至在进行测定之前)，该数据库使得可以更准确和有效地完成合成启动子盒的设计。

本文描述的特定具体实施方式并不限制本发明的范围。确实，根据先前的描述和附图，对于本领域技术人员来说，除本文描述之外的本发明的各种改进将变得显而易见。这样的改进包括在所附权利要求的范围内。以下实施例是用来说明本发明，而不是对本发明的限制。

实施例

实施例1-在成神经细胞瘤细胞中转录调节子和相关蛋白的微阵列表达谱分析(表达分布)

实施例1.1-实验步骤：

实施例1.1.1-细胞培养和总RNA分离：在D-10培养基中培养SH-EP1、SH-SY5Y、以及SK-N-BE(2)-C成神经细胞瘤细胞，D-10培养基为：每升有4.5g葡萄糖的(杜尔贝科)Dulbecco改良的Eagle培养基，包含10％小牛血清(热灭活)并补充有谷氨酰胺(0.03％)、青霉素(100单位/ml)、以及链霉素(100μg/ml)。将细胞保持在37℃、加湿的95％空气、5％二氧化碳气氛的培养箱中。利用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)并按照制造商的方案，从在T150组织培养瓶中生长到80-85％汇合的细胞提取总RNA，然后以等分试样存储在-80℃。

实施例1.1.2-微阵列测定：利用Geneka Biotechnology公司生产的蛋白质组调节寡核苷酸微阵列(PROM)芯片，从SH-EP1、SH-SY5Y、以及SK-N-BE(2)-C成神经细胞瘤细胞获得转录因子和相关蛋白的表达谱。上述芯片包含35-45个碱基对寡核苷酸，其点样有双份1500种基因，用于转录因子、辅因子、DNA-结合蛋白、以及与基因转录有关的其它蛋白。在Geneka Biotechnology公司进行cDNA合成和用荧光染料标记、微阵列杂交、微阵列扫描、以及数据分析。简单地说，通过用HeLa细胞cDNA(利用不同的荧光标签(Cy5与Cy3)加以标记)共杂交每一种成神经细胞瘤细胞cDNA进行测定，其使得可以在三种不同成神经细胞瘤细胞系之间比较1500种基因的每一种的相对表达水平。来自成神经细胞瘤细胞的每种基因的相对表达水平表示为相对于在HeLa细胞中表达水平的比率。此外，每种寡核苷酸芯片包含用于作为外部对照的无性(植物)基因的探针，以及用于作为内部对照的18S rRNA、β-肌动蛋白以及GAPDH基因的探针，其用来对信号进行规一化。用双份载玻片来筛选每种成神经细胞瘤细胞系，以使相对于Cy3-标记HeLa cDNA用Cy5-标记成神经细胞瘤cDNA杂交第一载玻片，以及相对于Cy5-标记HeLa cDNA用Cy3-标记成神经细胞瘤cDNA杂交第一载玻片。

实施例1.2-结果和讨论

来自PROM微阵列测定的结果表明，在这些三种不同的成神经细胞瘤细胞类型中各种基因有差别地上调节或下调节。一些有趣的观测结果包括，在SH-EP1细胞中检测到神经D基因(NeuroD gene)转录产物的细胞类型特异性表达，以及在SH-SY5Y和SK-N-BE(2)-C细胞中分别检测到Phox2b基因转录产物的细胞类型特异性表达。神经D是基础螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员并在神经元前体细胞的分化中具有重要作用(1)。在周围神经系统的胚胎发育期间，神经D mRNA在有丝分裂期后的神经元前体细胞中瞬时表达(34)。另一方面，Phox2b是同源(异型)结构域(homeodomain)转录因子，其控制不同神经元类型的生成和存活(4、10)。Phox2b和Phox2a共表达在所有表达去甲肾上腺素能生物合成酶多巴胺β-羟化酶(DBH)的中枢神经元和周围神经元中(46)。Kim等人(27)已表明，DBH基因具有至少2个顺式作用序列用于在其5’启动子区的这些同源(异型)结构域蛋白。因为在测定中仅在SH-SY5Y和SK-N-BE(2)-C细胞(其是去甲肾上腺素能的)中检测到Phox2b表达但胆碱能SH-EP1细胞中未检测到，所以它证实了从文献中知道的情况。细胞特异性地正调节的转录因子和辅因子的其它实例包括：在SH-EP1细胞中的NPAS1(神经元基础螺旋-环-螺旋-PAS家族成员)和TBX21(T-box蛋白)；在SH-SY5Y细胞中的ATF-3、C/EBP-α、NFkB、以及PIAS3(激活STAT3的蛋白抑制剂)；以及在SK-N-BE(2)-C细胞中的CBP(CREB结合蛋白)、HTLF(T细胞白血病病毒增强子因子)、N-Myc和Oct-1。PROM微阵列测定检测这些发育上或细胞类型特异性地调节的基因转录产物的能力表明，该测定是足够敏感的以检测以相对低水平表达的转录产物。然而，如果以低水平表达的转录因子基因被选择用于合成启动子构建，则可以进行RNA印迹分析或凝胶迁移率变动分析以证实微阵列结果。

PROM微阵列数据表明，Sox、Hox、Pbx、Pax、Egr、以及核激素受体家族的成员特异性地表达在所有三种成神经细胞瘤细胞类型中。对可获得文献的广泛研究表明，这些转录因子以一种方式或另一种方式与胚胎发育和细胞分化有关。这些转录因子、以及其它遍在表达的转录调节子和辅调节子的复杂的组合相互作用会触发特异性基因的表达，其是在神经嵴发育过程中决定细胞的命运所需要的(31、52、57)。一些在成神经细胞瘤细胞中正调节的辅调节子包括SNW1、N-CoR、NCOA3、以及HDAC6。此外，两种紧密相关的已知与抑制c-myc表达有关的转录阻遏物在所有三种成神经细胞瘤细胞中被下调节。

在随机连接反应中使用了用于10种不同转录因子的顺式作用序列元件，其选自上述成神经细胞瘤细胞特异性转录因子和Oct、CREB、AP-1以及STAT家族的成员，用于组成型表达的转录因子。成神经细胞瘤细胞特异性下调节阻遏物元件也可以包括在随机盒构建中。因为这种特定的转录阻遏物并不表达在成神经细胞瘤细胞中，所以用于结合包括在随机组合中的这种阻遏物蛋白的序列元件将在成神经细胞瘤细胞中对由启动子组合驱动的转录水平没有任何影响。另一方面，相同的阻遏物元件将在表达高水平阻遏物蛋白的非靶细胞中作为转录的抑制剂。

要包括在文库构建中的序列元件是在考虑每种相应的转录因子起作用(通过和其它参与的成员紧密合作，以便在成神经细胞瘤细胞中进行有效的基因转录)的潜力以后加以确定。Sp-1结合序列元件也包括在反应中，因为已知Sp-1和其它转录因子协同作用，并且Sp-1结合位点对保护CpG岛免受甲基化是必需的(3、40、41)。

转录调节子和辅调节子的表达谱获自三种相关的靶成神经细胞瘤细胞类型。与表达谱获自单一靶细胞类型的情况相比，这些数据为癌细胞特异性启动子盒的设计和构建提供了更有意义和准确的信息。然而，对要包括在计划中的随机连接反应中的用于转录因子或阻遏物的顺式作用序列元件的实际确定，需要仔细研究可获得的文献。进行这些研究以确定最好的候选序列元件，当加以组合物，其和其它成分进行协同相互作用，以在靶细胞中获得有效和选择性的转录。

实施例2-基于转录因子的DNA微阵列图谱分析构建序列元件的随机组合的文库。

合成并退火互补寡核苷酸，其包含用于结合每种所选择的转录因子的保守顺式作用序列。利用退火的寡核苷酸的混合物进行随机连接反应(36)。得到的多顺式作用序列的随机伸展(extension)被亚克隆在人多巴胺β-羟化酶(DBH)基因最小启动子(后面是LacZ报道基因)的上游。选择包含TATA框(盒，box)的DBH最小启动子(离转录起始位点-45至+51)，因为DBH特异性地表达在神经嵴衍生细胞(包括成神经细胞瘤细胞系)中(27、59)。研究表明，DBH最小启动子本身是无活性的，但当和其它序列元件结合时则介导强细胞特异性转录(21)。

小心设计要用在随机连接反应中的包含寡核苷酸的顺式作用序列，要考虑到顺式作用序列之间的间距或它们离转录起始位点的距离的重要性。为了增加转录激活的效率，位于每个调节元件的核心基序的侧翼的序列是取自在成神经细胞瘤细胞中特异性地表达的保守基因。确定这些侧翼序列(flanking sequence)，以致当重装配时核心调节元件将出现在DNA双螺旋的相同面上。Protein DataBank(蛋白质数据库)包含250个以上的蛋白质-DNA复合物的结构(2)。和分子以及生化研究相结合，这些结构说明了各种不同的策略，借助于这些策略，蛋白质选择性地结合于特定的DNA序列。来自所有可获得来源的信息可用来确定要加入到合成启动子盒中的寡核苷酸的精确结构。在某些情况下，用外切核酸酶III(ExoIII)处理包含单独的顺式作用序列元件和侧翼序列的双链寡核苷酸，其中外切核酸酶III以固定速率从DNA分子的末端除去核苷酸。设置反应条件，以便在ExoIII消化以后，借助于在侧翼序列中的累进1个碱基对缺失来恢复DNA分子。在将单独的顺式作用序列元件DNA分子加入随机连接反应以形成组合转录调节元件以前，用ExoIII对它们进行处理可导致在组合启动子盒中在顺式作用序列元件之间间距的随机性增加。

在多个发育调节转录因子的情况下，顺式作用序列元件的特异性随家族的成员而变化。在这样的情况下以及当用于转录因子的准确的共有顺式作用序列并不清楚已知时或当它们必须加以确定时，则实验上确定有关靶元件的细胞类型特异性序列。CASTing(靶的循环扩增和选择)方案已用于检测转录因子的顺式作用序列，尤其是用于多成分复合物(14)。在此方案中，使等分部分的双链寡核苷酸(在中部包含一段简并随机核苷酸(15-35bp))与制备自靶细胞的核提取物进行混合。利用对特定转录因子特异的抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合物，PCR扩增结合的DNA分子，然后再次用于核蛋白结合和免疫沉淀的另一个循环。要是没有对转录因子具有最高结合亲和力的寡核苷酸，则多个重复循环会富集随机寡核苷酸的群。根据得到的高亲和力核苷酸序列，则可以推出共用结合序列。因此，利用本方法为特定转录因子确定的顺式作用序列可以更准确地反映在有其它相互作用调节子和辅调节子存在的情况下蛋白质在体内的结合优先性。在加入随机连接反应以前，利用这些方法小心地确定用于顺式作用元件的寡核苷酸的序列可增加生产最佳启动子盒的可能性。

实施例2.1-实验步骤

实施例2.1.1-用于顺式作用序列确定的CASTing：在其它相互作用调节子和辅调节子的范围内，为需要准确结合序列的转录因子进行CASTing。基本上以如在Funk等人(14)和Wright等人(58)中所披露的相同方式进行CASTing，并具有少量改进。将Funk等人和Wright等人的全部内容以引用方式结合于本文，尤其是当它们涉及确定顺式作用序列的方法时。制备在中部具有约25个随机核苷酸序列以及在每个末端具有三个不同限制位点的寡核苷酸(SalI-Hind III-Xba I-N25-EcoRI-BamHI-Xho I)。在两末端包含限制位点和间隔核苷酸的大约25bp序列用于设计正向引物和反向引物(用于PCR扩增)。利用反向引物作为唯一的PCR引物，并通过用TaqDNA聚合酶延伸30分钟，来制备双链的寡核苷酸。将这种双链寡核苷酸的样品与制备自SK-N-BE(2)-C细胞的核提取物(NaCl的最终浓度为约100mM，并在有10μg超声处理大马哈鱼精子DNA存在的情况下)进行混合，以降低非特异性相互作用。利用磁珠(DynalInc.，Great Neck，NY)来免疫沉淀蛋白质-DNA复合物，其中磁珠涂敷有相对于靶转录因子的抗体。利用磁体回收蛋白质-DNA-珠复合物，然后用包含0.5％NP-40和0.1％BSA的PBS洗涤三次。将复合物再悬浮在30μl的PCR反应缓和液中，然后利用正向和反向引物扩增9个循环(在100℃下变性5分钟，接着加入Taq，然后是9个循环：94℃ 1分钟，65℃ 1分钟，以及72℃ 1分钟，其中延伸10分钟)。10μl的扩增样品再次用于CASTing的另一个循环。进行6个CASTing循环并将得到的DNA样品克隆进入质粒，然后挑选约30种不同的克隆并测序，从而推出共有序列。

实施例2.1.2-顺式作用序列寡核苷酸的随机连接：合成一组互补寡核苷酸以包含特异性顺式作用序列元件和侧翼序列，其用于在分析TREP图谱(分布，profiling)DNA微阵列测定结果以后选择的每种转录因子。在TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5；1mMEDTA；50mM NaCl)中的一个反应中退火和磷酸化每组互补寡核苷酸。在70℃下在300μl的最终容积(包含20μM的每种互补寡核苷酸、1mM ATP、以及0.5U/ml的T4多核苷酸激酶)中进行反应15分钟，然后经30分钟缓慢冷却至室温。对于随机连接反应，使用了相同摩尔量的用于不同顺式作用序列的寡核苷酸，以在150μl的最终反应容积中保持寡核苷酸的总量为200pmol。在16℃下利用20U的T4 DNA连接酶进行连接作用过夜。在6％丙烯酰胺凝胶上流动(run)连接混合物，然后切割包含75 bp至1.0kb之间的DNA带的凝胶的一部分。在37℃下，在两容积的扩散缓冲液中温育凝胶块过夜以后，利用Qiaex II Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)从凝胶块洗脱DNA片段。在16℃下，在150μl的连接反应(包含磷酸化和退火的12bp互补寡核苷酸，而该寡核苷酸在中部包含8bp的AscI限制位点)中用10U的T4连接酶温育经纯化的DNA片段过夜。利用Qiaquick Nucleotide Removal试剂盒(Qiagen)对反应进行提纯(净化，clean up)，用Asc I消化，然后连接到β-半乳糖苷酶报道质粒(pD96L)的Asc I位点。如图1所示，在pD96L中，β-半乳糖苷酶报道基因位于多巴胺β-羟化酶(DBH)最小启动子的下游，其中最小启动子包含具有TATA框的45bp启动子序列以及基因的5’非翻译区的51bp。通过QiaquickNucleotide Removal试剂盒纯化连接的克隆并转化成电感受态(electrocompetent)大肠杆菌DH10b菌株。在有氨苄青霉素(100μg/ml)存在的情况下，将转化的细菌细胞作为一批接种到5ml LB中8小时，然后扩增到200ml过夜。利用Qiagen Maxi制剂分离质粒。

实施例3-利用FACS对文库进行预筛选，以选择表现最好的序列组合。

用质粒文库转染靶SK-N-BE(2)-C成神经细胞瘤细胞，其中质粒包含随机组合的克隆在LacZ基因上游的启动子盒。FACS用来选择大约3-5％的具有强β-半乳糖苷酶表达的转染细胞。从分选的细胞分离质粒，扩增并再次用于SK-N-BE(2)-C细胞的转染。重复相同的步骤3至4次，以使得到的细胞群体包含能够以最高水平表达报道基因的质粒。在最后的分选以后，分离质粒并单独地扩增，然后用于96孔瞬时转染测定。选择SK-N-BE(2)-C细胞用于预筛选，因为这些细胞具有最高的转移潜力，因而是晚期成神经细胞瘤的基因治疗的主要靶。这些细胞在培养基中也过分地生长，并在这些细胞中可以实现相对高水平的转染率。利用Metafectene试剂(Biontex；Munich，Germany)在SK-N-BE(2)-C细胞中可以达到高达90％的转染率。

实施例3.1-实验步骤

实施例3.1.1-转染SK-N-BE(2)-C细胞以及通过FACS进行分选：在T75瓶中的D-10中生长SK-N-BE(2)-C成神经细胞瘤细胞。按照制造商的方案，用20μg的质粒DNA文库和50μl的Metafectene转染大约1×10⁷个SK-N-BE(2)-C细胞。在转染48小时以后，利用在PBS中的5mM EDTA从培养板脱离细胞并通过23规格的针以进一步解离二联体(双联体)和凝块。将细胞再悬浮在0.2ml的PBS中，转移到Falcon 2085管并加热至37℃。如在Fiering等人(12)、Huang等人(20)、以及Nolan等人(44)中所描述的，对细胞的β-半乳糖苷酶活性进行流式细胞术分析，其中将上述文献的全部内容以引用方式结合于本文，尤其是当它们涉及流式细胞术技术时。简单地说，将在水中的200μl的2mM荧光素二-β-D-半乳糖苷(FDG；Molecular Probes)加入细胞，然后在37℃下温育混合物1分钟。在温育结束时，加入10容积冰冷的PBS并将细胞保持在冰上20-60分钟。通过加入2mM苯乙基-β-D-硫代半乳糖苷(MolecularProbes)来终止反应。在分选以前，加入5μg/ml的碘化丙啶(Sigma)。在4℃下用FACS仪对细胞进行分选。从分选仪收集在上部3-5％水平的异硫氰酸荧光素(FITC)-阳性细胞。

实施例3.1.2-从分选的细胞回收质粒：通过Hirt方案(19)提取在分选细胞中的质粒，其中Hirt方案通过在有SDS和NaCl存在的情况下优先沉淀细胞基因组DNA而开发用来提取低分子量DNA。简单地说，将分选的细胞悬浮在45mM Tris-硼酸盐、1mMEDTA、0.5％SDS以及1.6M氯化钠中，然后在4℃下消化过夜。将细胞提取物压成丸并用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)从上清提取DNA两次，然后用氯仿提取一次。用乙醇沉淀DNA，然后悬浮在50μl的水中。然后分离自分选细胞的质粒DNA用于转化高效电感受态大肠杆菌DH10b菌株，其在补充有氨苄青霉素的200ml的LB中生长为混合培养基过夜。利用Qiagen Maxi试剂盒对质粒进行分离。

实施例3.1.3-重复分选：进行转染、分选以及质粒DNA分离的相同循环三至四次，以便消除大多数具有低到中等水平报道基因表达的克隆。驱动报道基因以最高水平表达的序列组合经受住累进选择过程。在最后一次选择以后，从分选细胞分离质粒，在大肠杆菌中转化然后平皿接种在琼脂板(具有100μg/ml氨苄青霉素)上。从平板挑选90-100个细菌转化体，培养过夜然后单独地用于质粒制备。在每个循环的FACS细胞分选期间选择(3-5％)的阈值和循环的数目(3-4)是根据经验加以优化，以使在最后一次以后大约90-100种表现最好的序列组合经受位选择过程。对选择的质粒进行测序并用于另外的筛选步骤。

实施例4-在靶细胞和非靶细胞的96孔瞬时转染测定中对预选择的组合进行筛选，以最终选择3-5种表现最好的候选物。

在此步骤中，用在SK-N-BE(2)-C细胞、在SH-SY5Y和SH-EP1细胞、以及其它非靶细胞中的瞬时转染测定单独地试验了大约90种不同的预选择的组合启动子盒，其中预选择是依据它们在SK-N-BE(2)-C细胞中的性能(通过FACS加以分析)。对每种组合转录调节元件在靶细胞以及在非靶细胞中的性能进行打分，并且选择3-5种得分最高的组合用于进一步分析。打分标准(scoringcriteria)是在靶细胞中的转录效率以及在非靶细胞中转录活性的缺少。在各种不同的非靶细胞中进行测定，其中非靶细胞包括但不限于HeLa细胞、HCN-1A和HCN-2人皮质神经元细胞(ATCC，Manassas，VA)、HNPC人神经元前体细胞(Clonexpress，Inc.，Gaithersburg，MD)、ARPE-19人视网膜色素上皮细胞(ATCC)、293人肾细胞(ATCC)、HepG2人肝细胞癌细胞、以及其它非人细胞如PC12和NIH3T3。

实施例4.1-实验步骤

为了瞬时转染测定，在转染前12-16小时，将10,000至30,000个细胞双份平皿接种于在适当生长培养基中的96孔板。确定平皿接种密度，以便在转染时细胞变成70-90％汇合(confluent)。还利用不同的商业上可获得的转染试剂预试验了细胞的转染率(transcription efficiency)，其中转染试剂包括Metafectene、Lifofectamine(Invitrogen)、Fugene-6(Roche)、以及Superfectene(Qiagen)。按照制造商的方案，利用50-200ng的DNA并借助于适当的转染试剂对细胞进行转染。然后用PBS洗涤细胞并利用50μl的报道裂解缓冲液(Promega)在转染后裂解48小时，然后利用β-半乳糖苷酶测定系统(Promega)在平板上直接测定β-半乳糖苷酶活性。除大约90种预选择的质粒DNA样品之外，还分别双份加入CMV增强子/启动子驱动的β-半乳糖苷酶报道质粒和由最小DBH启动子驱动的报道质粒作为阳性对照和阴性对照。此外，522bp酪氨酸羟化酶启动子(50)驱动的β-半乳糖苷酶报道质粒双份用于孔中作为细胞类型特异性的对照。因为不同的细胞类型显示不同的转录率，所以利用相同质粒克隆记录自不同细胞的β-半乳糖苷酶活性并不能直接用于得分的比较。因此，具有不同顺式作用序列组合的质粒样品的性能表示为百分比，该百分比是相对于在减去本底信号(基线信号，background signal)(获自阴性对照孔)以后从CMV增强子/启动子驱动的阳性对照孔获得的数值。根据在靶细胞中的表达强度和在非靶细胞中的表达缺少选择了得分最高的3-5种质粒。

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本文引用的所有参考文献的全部内容以引用方式结合于本文。

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本领域技术人员将明了，或利用常规实验能够确定对本文具体描述的本发明的特定具体实施方式的许多等同替换。这样的等同替换包括在权利要求的范围内。

Claims (12)

1.一种用于制备和选择转录增强组合启动子盒的方法，包括：

（i）执行DNA微阵列以获得被特异性转录调节子识别的DNA序列元件；

（ii）构建随机组合的转录调节元件的文库，所述转录调节元件中的每一个包括在步骤（i）中获得的由特异性转录调节子识别的双链DNA序列元件以及侧翼序列；

（iii）将所述组合的转录调节元件插入载体中的最小启动子的上游，其中所述最小启动子的后面是报道基因；

（iv）将所述载体插入到宿主细胞中；以及

（v）筛选显示出所述报道基因增强表达的细胞，并在所述细胞中鉴别所述组合启动子盒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在连接反应条件下，通过将由转录调节子识别的单个双链DNA序列元件混合在一起来制备所述随机组合的转录调节元件的文库。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述双链DNA序列元件包括在任何一端或两端的间隔核苷酸。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述报道基因表达是通过荧光激活细胞分选仪（FACS）来筛选的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述报道基因是lacZ或GFP。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述宿主细胞是癌细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述癌是成神经细胞瘤。

8.一种用于制备和选择转录增强组合启动子盒的方法，包括：

（i）构建随机组合的转录调节元件的文库，所述转录调节元件中的每一个包括由特异性转录调节子识别的双链DNA序列元件以及侧翼序列；

（ii）将所述组合的转录调节元件插入载体中的最小启动子的上游，其中所述最小启动子的后面是报道基因；

（iii）将所述载体插入到成神经细胞瘤宿主细胞中；以及

（iv）筛选显示出所述报道基因增强表达的细胞，并在所述细胞中鉴别所述组合启动子盒。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，在连接反应条件下，通过将由转录调节子识别的单个双链DNA序列元件混合在一起来制备所述随机组合的转录调节元件的文库。

10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述双链DNA序列元件包括在任何一端或两端的间隔核苷酸。

11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述报道基因表达是通过荧光激活细胞分选仪（FACS）来筛选的。

12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述报道基因是lacZ或GFP。