JP2009529855A - 合成プロモーター産生システム - Google Patents

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Abstract

本発明は、転写を促進する組合せプロモーターカセットの作成と選択の方法を開示しており、該方法は以下を含む。ランダムに組み合わせた転写制御要素のライブラリーを構築すること、なお該要素には転写制御因子が認識する二本鎖DNA配列要素が含まれる；組み合わせた転写制御要素を最小プロモーターとこれに続くレポーター遺伝子の上流に挿入してベクターとすること；該ベクターを宿主細胞に挿入すること；そしてレポーター遺伝子の発現が促進されている細胞をスクリーニングし、該細胞中に組合せプロモーターカセットを同定すること。
【選択図】 なし

Description

本出願は、プロモーターをデザインすることにより遺伝子を効果的に発現するシステムに関する。
（関連出願への相互参照）
本出願は、米国特許出願10/907,620、出願日２００５年４月８日の優先権の利益を請求する。その出願の内容のすべては参照により本明細書に援用される。
遺伝子療法は、種々疾患を治療する有望な新技術であると当初は期待されていたが、これまでに実施された大部分の試験例では納得し得る臨床的有効性が証明されていない。臨床癌治療における主要な技術上の障害の一つは、治療用癌遺伝子を特定の標的に送達し、かつ導入遺伝子を所望の時間にわたり十分に高いレベルで発現させ続けるのが困難であることである。特定の細胞型に治療用遺伝子を送達することを目標とする（標的化された形質転換）のは最も望まれることではあるが、これには技術上の主要な障害であり、当該分野で報告されている成功は限定されている(5,24, 48)。細胞型に特異的なプロモーターを使用して導入遺伝子の発現を標的細胞にのみ限定する別のアプローチをした科学者らもいる(18)。それらのプロモーターは同じ標的細胞において特異的に発現される遺伝子から作り変えたものである(28,43, 51, 55)。しかし、これらいわゆる細胞特異的プロモーターは標的細胞選択性においてしばしば完璧ではなく、非標的細胞では導入遺伝子の発現レベルが容易に変わる。多くの場合に、これらプロモーターは強力でないので、導入遺伝子の発現が実際の治療効果に必要なレベルを達成または超えることはない。これらの事実から、細胞型に特異的なプロモーターの効率の高い系を開発する更に体系的なアプローチが必要であると指示される。

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本明細書に引用の参照文献全てはそのまま参照により援用される。なお、本文中非特許文献の引用は、非特許文献の表示をせず単に(NO.)で数字のみで表示した。
本発明は、合成的に組み合わせた転写制御配列であって、特定の細胞型において遺伝子発現を高い効果をもって促進することができる配列の産生に関する。
本発明の一態様では、該産生を実現可能にするために、（１）所望の転写制御因子により認識される転写制御要素(elements)のランダムな組合せのライブラリーを構築し、（２）細胞分取器、例えばFACS(蛍光標示式細胞分取器）を使用して該ライブラリーを高処理スクリーニングすることによりDNA配列要素(elements)の数少ない最良性能の組合せを選択し、かつ任意であるが（３）選択した各組合せを更にテストして１または数個の最良性能の組合せを最終的に選定する。
本発明の特別な実施態様では、該ライブラリーを作成可能にするために、二本鎖DNAオリゴヌクレオチドを連結し、その各々に転写制御因子と高い親和性をもって結合可能なDNA配列要素(elements)を含ませる。
ランダムな連結反応で使用されるオリゴヌクレオチド中に含ませるべきDNA配列要素(elements)の決定は種々の方法に基づいてよく、例えば標的細胞中で転写因子をDNAマイクロアレイによりプロファイリングするとか、あるいはランダムヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドのプールから高親和性結合配列要素(elements)を選択的に増幅するとかが挙げられる。DNA配列要素(elements)を決定するために、標的細胞中で発現される遺伝子の配列をコンピュータによってアルゴリズム系解析をすることもできる。
更に詳細には、ランダムに組み合わせた配列要素(elements)を制限酵素にて切断してレポーター遺伝子の上流にクローン化してもよい。ここでレポーター遺伝子はGFPまたはLacZが可能であるが、これらに限定されない。またプラスミドDNAまたはウイルベクターのライブラリーを作成してもよい。このライブラリーを産生するには、レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを使用することができるが、これらに限定されない。
最小プロモーターとこれに続くレポーター遺伝子の上流にクローン化したランダム配列組合せのライブラリーを包含するベクターDNAを標的細胞に形質導入または感染させ、FACSで分別してレポーター遺伝子が高レベルで発現する細胞を選択する。次に、分取した細胞を使用して所望する転写制御因子の高性能組合せを含有するベクターDNAを回収し増幅する。
分取した細胞から回収し増幅したベクターは、標的細胞に導入し再びFACSを使用して転写制御因子の最高性能な組合せを選出してよい。回収ベクターの細胞への導入、最高発現の細胞の分取、分取細胞からベクターDNAの回収という同じ操作を数回繰り返すことによって、数百万個の異なる組合せの中から数少ない最高性能の組合せを精選取得してよい。
分取と選択の反復を終えた上で、回収DNAベクターを１個ごとに標的細胞でスクリーニングするためにそれらのプロモーターの真の活性をテストしてよい。
細胞型に特異的なプロモーターを所望するのであれば、非標的細胞でプロモーターとしての実質的な活性を有するベクターを除外するために、コントロールテストとして転写制御因子の組合せを含有するベクターを非標的細胞でもテストするのがよい。
本発明の一態様において、本発明は、遺伝子治療またはウイルス治療用のベクターにおいて使用すべき合成的に組み合わせたプロモーターカセットを産生する方法に関する。数百万個の潜在的な候補から選出したこれら合成プロモーターによって導入遺伝子の特定標的細胞での発現が促進されれば、その効率性および選択性は現在入手可能な他のプロモーター系に比べ各段に上昇可能である。一態様において、この系が使用する高処理アッセイ系は、例えばDNAマイクロアレイおよび蛍光標示式細胞分取器（FACS)が挙げられるが、これらに限定されない。またこの系を適用すれば実在するどのような型の細胞であってもそれに特異的な合成プロモーターを短時間で産生することができる。遺伝子治療またはウイルス治療用ベクターの現在入手可能な系であって、その成否が標的遺伝子の転写に依存する系は、本発明によって有意にその効果が増大する。同時に、遺伝子治療またはウイルス治療用の多様な新しい薬剤候補が癌などの疾患の治療のために市場に導入されるのが本発明により迅速可能となる。
本発明の特別な例示態様では、遺伝子転写を神経芽細胞腫の癌細胞に特異的に標的化することができる合成プロモーターカセットが産生される。更に具体的には、本発明はシス作用配列要素(elements)のランダムな組合せのライブラリーを構築することに関し、これは神経芽細胞腫の標的細胞で転写制御因子をDNAプロファイルすることをベースとする。シス作用配列要素(elements)の数百万個の組合せを産生するには、多様なシス作用配列要素(elements)を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドをランダムに連結して神経芽細胞腫の細胞で特異的に発現する転写制御因子を結合してもよい。神経芽細胞腫の標的細胞での転写制御因子と関連タンパク質の発現について予め実施したDNAマイクロアレイによるプロファイリングをベースにしてランダムに連結する反応に含むべきシス作用配列要素(elements)を決定する。配列要素(elements)のランダムに連結した組合せを最小プロモーターとこれに続くレポーター遺伝子、例えばlacZまたはGFPの上流にクローン化する。
本発明の特別な他の態様では、本発明は該ライブラリーをあらかじめスクリーニングするにあたりFACSによる展開指向型プロトコールを使用することに関する。すなわち、プラスミドライブラリーをスクリーニングして神経芽細胞腫の標的細胞において最良性能である少数（約９０）の組合せを選抜し、選抜してから更に広範囲なスクリーニング操作を加えることによって標的細胞に特異的で最高性能の配列要素(elements)組合せを同定してよい。このインビトロでの展開方法の成否は、レポーター遺伝子のベクターを形質導入または感染した細胞群からレポーター遺伝子の生産物、例えばβガラクトシダーゼを発現する細胞を高処理細胞分取技術、例えばFACSが分取する能力にかかっている。
更に本発明は、あらかじめ選択したシス作用の配列組合せを個別に９６穴の一過性形質転換／感染アッセイにより標的細胞と非標的細胞の両方でスクリーニングすることに関する。あらかじめ選抜した約９０個の各組合せプロモーターカセットの性能を評価し、標的細胞でのプロモーター活性の強度および非標的細胞での活性不存在に基づいて配列要素(elements)の約３〜５個の最高性能組合せを選択する。非標的細胞型、例えばニューロンの前駆細胞およびニューロン細胞の集団を使用してスクリーニングすることにより、配列要素(elements)の該組合せを含有する選択したプロモーターカセットが神経芽細胞腫の標的細胞に真に選択性があることを確認する。
神経芽細胞腫に特異的な選択プロモーターカセットを、ベクター、例えば限定されないがレトロウイルスベクターおよびアデノウイルスベクターにクローン化して、それらがクロマチン自体またはクロマチン様の環境で活性を有することを標的細胞および非標的細胞で更にテストするのがよい。最高性能の１個のカセットを多様なベクター系において使用し、動物実験後に神経芽細胞腫の遺伝子治療用または癌崩壊性ウイルス治療用の候補薬剤へと展開する。
本発明は、組合せプロモーターカセットの作成と選択の方法に関し、該方法は以下を含む。（i）転写制御要素(elements)のランダムな組合せのライブラリーを構築すること、なお該組合せには別々の転写制御因子によって認識される複数の配列要素(elements)が含まれる、（ii）組み合わせた転写制御要素(elements)をベクター中の最小プロモーターとこれに続くレポーター遺伝子の上流に挿入すること、および（iii）特定細胞においてレポーター遺伝子を最高レベルで発現するベクターをスクリーニングすること、なおレポーター遺伝子の上流の配列には選択したプロモーターカセットが含有される。
ランダムに組み合わせた転写制御要素(elements)は別々の転写制御因子によって認識される複数のDNA配列要素(elements)を含有するので、これのライブラリーを作成するには、異なるDNA配列要素(elements)を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドを連結反応の条件下に混合すればよい。更に、該オリゴヌクレオチドの末端に制限エンドヌクレアーゼで平滑または切断されるフランキング配列を含有させれば、突き出た末端が形成されてから連結反応を受ける。一態様において、レポーター遺伝子がlacZであり、そのレポーター遺伝子の発現は蛍光標示式細胞分取器（FACS)によりスクリーニングすればよい。
更に上記方法において、細胞型特異的な転写制御因子によって認識されるDNA配列要素(elements)を取得するには、特定の標的細胞で発現される転写制御因子をDNAマイクロアレイでプロファイリングすればよい。
上記方法において、特定の細胞型は、癌−腫瘍、肉腫、黒色腫、特に神経芽細胞腫であってよい。
別の態様において、本発明は、上記の組み合わせた転写制御要素(elements)を含有するベクターに関する。該ベクターは一過的に発現した、または宿主細胞ゲノム中に導入可能なプラスミド、ウイルスであってよい。
また、本発明には、原核起源または真核起源、例えば大腸菌、植物、昆虫、哺乳動物、およびヒトの宿主細胞が包含される。
本発明のこれら目的は、以下の発明の説明、添付の参照図面および添付の特許請求の範囲から更に十分に理解される。
本出願書において、「a」および「an」は対象物の1個および複数個の表示に使う。
本明細書で使用する「転写制御要素(elements)」とは転写制御因子によって認識されるヌクレオチド配列を言い、「シス作用配列」または「シス作用配列要素(elements)」または「シス作用領域」と同義であり、時には「配列要素(elements)」と表現される。
本明細書で使用する「組み合わせた転写制御要素(elements)」とは二以上の転写制御要素(elements)を含有する二本鎖DNA分子を言う。この組み合わせた転写制御要素(elements)を作成するには、種々の二本鎖転写制御要素(elements)をランダムに連結すればよい。任意ではあるが、組み合わせた転写制御要素(elements)にはスペーサー領域が含有されてよく、そのスペーサーの長さを制御するには二本鎖DNA分子をエキソヌクレアーゼにより経時的に消化し、次にランダムに連結反応すればよい。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」とはシス作用領域およびおそらく約２５個以下の外来性ヌクレオチドを機能的に含有する配列を言う。したがって、「オリゴヌクレオチド」の用語に包含されるヌクレオチドの数は固定することができず、ヌクレオチドの特定の数に限定されない。
本明細書で使用する「プロモーターカセット」または「合成プロモーターカセット」とは遺伝子を効果的に転写するための成分を含有するDNAセグメントを言い、一以上の転写制御要素(elements)、最小プロモーター領域、５'−非転写領域、またはイントロンを含有してもよい。
本明細書で使用する「最小プロモーター領域」または「最小プロモーター」とは、それ自体は不活性であるが、他の転写制御要素(elements)と組み合わされると強力な転写を媒介する短いDNAセグメントを言う。最小プロモーター配列は種々の異なる起源、例えば原核細胞および真核細胞の遺伝子から誘導することができる。これの例はドーパミンベータヒドロキシラーゼ遺伝子の最小プロモーターおよびサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子の最小プロモーターがある。
本明細書で使用する「組み合わせたプロモーターカセット」または「合成的に組み合わせたプロモーターカセット」とは、組み合わせた転写制御要素(elements)を含有するプロモーターカセットを言う。
本明細書で使用する「転写制御因子」とは、遺伝子の発現を正または負に制御するタンパク質を含む因子を全て言う。転写因子または抑制因子または補助活性化因子または補助抑制因子の全てが包含される。
（転写制御因子の発現のプロファイリング）
転写制御因子の発現のプロファイリングは多様な方法によって実施できる。対象としている細胞にはどんな転写制御因子が存在するか、また転写因子または転写抑制因子が結合する部位はどんなシス領域かを決定するには、多様な方法を使用して実施できる。本発明の一態様において、ＤＮＡマイクロアレイをベースとする転写因子発現のプロファイリングを使用することによって、合成プロモーターカセットをデザインしてよい。真核細胞での遺伝子転写は複雑な生化学的プロセスであって、それには多数のタンパク質制御因子、例えば転写の活性因子、抑制因子、補助活性因子、および補助抑制因子に由来する組合せ効果が絡む(7,15, 29, 35)。したがって、異なる細胞型で入手可能なこれらタンパク質の正確なプロファイルが判れば、これらタンパク質の種々の組合せがこれら細胞での遺伝子転写をどのように仲介するかを理解するのに役立つ。
本発明では、三つの神経芽細胞腫細胞型における発現をプロファイリングするにあたり、遺伝子転写に直接または間接に関与する転写制御因子および他のタンパク質をコード化する１５００個の異なる遺伝子のオリゴヌクレオチドの点在する、市販のＤＮＡマイクロアレイ用チップを使用した。その結果、細胞型に特異的な転写制御因子が多様に発現したことが判る。成育途上で制御された数個の転写制御因子の発現パターンは文献で報告されている従来の観察結果とよく合致している。このことから、マイクロアレイアッセイは比較的に低レベルで発現した転写物を検出するのに十分に感度がよいことが判る。これらマイクロアレイアッセイのデータに基づいて、神経芽細胞腫細胞型で特異的に発現する転写因子を決定した。
次に、これら神経芽細胞腫に特異的な転写制御因子のシス作用配列要素(elements)を決定するにあたっては、同定した転写制御因子に対するシス作用配列をリスト表示している公開レポートおよび他の出典を使用し、それらを使用して、これら標的細胞における遺伝子転写を選択的に標的することができる合成プロモーターカセットを構築する。
転写制御因子および関連タンパク質の発現のプロファイリングを多くの異なる細胞型で実施し、データベースを作成する。このデータベース（TranscriptionRegulator Expression Profile、すなわちTREPデータベースと命名）には、種々の組織特異的なまたは組織別に発現する転写制御因子および関連タンパク質の発現レベルについての細胞型間の差に関する詳細な情報が含まれている。細胞の異なるグループ毎に発現プロファイルの一般化したパターンを推定することができる。正常な成育過程において、および悪性形質転換において細胞型に特異的な遺伝子発現をさせるためには、これらタンパク質のどのような組合せを利用すればよいかの理解がこれらのデータベースから容易になる。同時に、TREPデータベースは、導入遺伝子を標的細胞特異的におよび／または薬理学的な誘導性発現をさせるのに使用するプロモーターカセットをデザインし合成するツールとなる。
同定した転写制御因子に対するシス作用配列を入手することはできない状況ではあるが、そのようなDNA配列要素(elements)は実験的に取得することができる。例えば、ランダムにヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドの集団を精製した転写制御因子と共に結合反応の条件下に混合し、どのオリゴヌクレオチドに結合したかを慣用方法でアッセイすることができる。結合したオリゴヌクレオチドの配列を決定することによりシス作用領域のヌクレオチド配列を決定すればよい。
（配列要素(elements)のランダムな組合せのライブラリーを構築）
転写制御因子と関連タンパク質の発現プロファイルが所与の細胞型についていったん判明すれば、合成的に組み合わせた転写制御要素(elements)を作成するにあたり、シス作用配列要素(elements)を組み合わせることによって標的細胞で特異的に発現する転写制御因子とすることができる。プロモーターの強度を増加するために、自由自在に発現する数個の転写因子に対するシス作用配列を構築体に包含させることができる。標的細胞において転写因子を自由自在に発現させるシス作用配列がプロモーターの組合せカセットに包含されると、最大の転写効率が達成される。他方、カセットに包含されたシス作用配列から、標的細胞で特異的に発現した転写因子が結合するための標的細胞特異性が決定する。シス作用配列を選択するには、標的細胞におけるこれら転写因子の補助活性化因子が入手可能か否かも考慮する。
これらの組み合わせた転写制御要素(elements)を適切に組み立てれば、これらは特定の標的細胞で発現した多数の転写制御因子と結合して導入遺伝子の発現を効果的に促進する。この同じ組み合わせた転写制御要素(elements)が非標的細胞では不活性である。その理由はこの配列要素(elements)に結合するのに必要な特定の転写制御因子を欠いているからである。
また、この組み合わせた転写制御要素(elements)には非標的細胞でのみ発現する転写抑制因子が結合するための配列要素(elements)が含有されていてもよく、それによって導入遺伝子が発現するための標的細胞特異性が増大する。プロモーターカセット中に抑制因子タンパク質が結合するためのシス作用の配列要素(elements)が存在すると、非標的細胞では抑制因子タンパク質が高レベルで発現して転写が効果的に阻害される。他方、その配列要素(elements)は標的細胞では同じ抑制因子タンパク質を発現しないので、効果がない。したがって、遺伝子転写の組み合わせの性質を最も効果的に利用するためには、標的細胞と非標的細胞とで発現する転写制御因子と補助制御因子の正確なプロファイルを知ることである。
遺伝子を効果的に発現させるには、特定遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域上に構築された転写因子と補助因子の組み合わせ相互作用が必要である(15, 16,29)。転写因子は、遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域において、空間的に圧縮して、特定の順序に配列しているシス作用配列要素(elements)に結合する。合成遺伝子プロモーターカセットから最も効果的な転写が達成されるのは、異なる転写因子によって結合した配列要素(elements)が特定の順序で配列し、かつそれら相互間に適切な空間がある場合のみである。理論的には、１０個の配列要素(elements)からなる組合せの長さ毎に各要素(elements)は１回のみ使用されると仮定すると、１０個の異なるシス作用配列要素(elements)について３００万個を超える異なる配列が可能である。したがって、これら可能な組合せを全て構築しかつ多数の転写因子に対して配列要素(elements)の最良の順列を決定するには、これを従来の方法で実施すれば巨大な時間が必要になる。
この制約を克服するには、独創的な方法を採用すればよい。独創的な方法には以下が含まれる。（１）ランダムな連結反応を利用してシス作用配列要素(elements)の組合せのライブラリーを作成すること、そのライブラリーをあらかじめスクリーニングして約９０個の最良性能の組合せを進化指向法で選択するために標的細胞でフローサイトメトリー(FACS)を使用すること、そして予備選択または予備スクリーニングした配列要素(elements)の組合せを標的細胞および非標的細胞の両方で一過性形質転換アッセイ、例えば９６穴プレートでスクリーニングして約３〜５個の最終候補を選出すること。
ランダムな連結反応の間に配列要素(elements)の数百万個の異なる組合せが作成され、標的細胞において強力で選択的な転写活性を発揮するのに最適な順列をもつ配列要素(elements)の組合せがその中に含まれている可能性が高い。
（FACSベースの指向された進化を使用してライブラリーを予備スクリーニング）
本発明の一態様は、Huangら(20)に記載のFACSベースの進化指向式プロトコールを適用する予備スクリーニングに関する。当文献の内容すべては、特にFACSを利用するプロトコールに関して、参照により本明細書に援用される。
Huangら(20)は、筋肉に特異的な転写因子MyoDに対する機能的なエンハンサー／プロモーター部位をランダムなDNA配列から選択するのにFACSに基づく方法を適用したことを報告している。筋肉特異的な最小プロモーター中にランダムにヌクレオチドが埋め込まれているオリゴヌクレオチドをβガラクトシダーゼ遺伝子の上流にクローン化している。得られたプラスミドライブラリーをMyoD発現ベクターと共にNIH3T3細胞中に形質導入している。βガラクトシダーゼを高レベルで発現している細胞をFACSにより選択し、レポーター遺伝子を低ないし中程度のレベルで発現している大部分の細胞は除去する。分取した細胞（原集団の約５％）に含まれるプラスミドには、MyoDが高親和性の配列要素(elements)に結合することによって生じた高レベルの転写活性がある。プラスミドをHirtprotocol (19)により抽出し、増幅し、再び細胞の形質転換とFACSによる分取に使用し、DNA抽出、増幅、形質導入、分取の同じ操作を繰り返す。この分取と増幅を３ラウンド行うと、その細胞集団には、レポーター遺伝子を高レベルで発現させることができるプラスミドで形質転換された細胞が高度に密集する。この進化指向式プロトコールにおける選択圧力はMyoDがランダム配列に結合してβガラクトシダーゼレポーター遺伝子を活性化する効率である。このアプローチは有力かつ迅速である。その理由は、FACSは１細胞当たり５個という少数のβガラクトシダーゼ分子を検出することができ（４４）、かつ１時間あたり約１００万個の細胞を分取できるからである。大腸菌LacZレポーターで形質転換した哺乳動物の生長可能な細胞をβガラクトシダーゼ活性に基づいて蛍光活性化して細胞分析し分取する操作は確立されている(12,44)。
本発明では、Huangら(20)によるFACSベースの選択プロトコールの基本コンセプトを修正し、レポーター遺伝子の発現を多数の配列要素(elements)のランダムな組合せによって促進する。この場合には、１個の因子がランダムなヌクレオチドに結合するのではなく、むしろ多数の転写因子がランダムに組み合わされた配列要素(elements)に結合して生ずる組合せ入力によってレポーター遺伝子の発現の効率が定まる。このアプローチのひとつの特徴は、関連する全ての制御因子および補助制御因子の存在下に標的細胞においてリアルタイムに配列の組合せを選択することにある。標的細胞において低ないし中程度の転写能をもった大部分の組合せを迅速に排除する目的でこのプロトコールを使用してシス作用配列要素(elements)の組合せのライブラリーをスクリーニングする。最高性能の約９０個の配列組合せを選出し、これらを更に徹底的にスクリーニング可能にするために標的細胞および非標的細胞の両方において９６穴のフォーマットでの形質導入／感染をする。各細胞型を９６穴プレートに植え、９０個の選択したクローンと正および負のコントロールベクターを形質導入／感染する。標的細胞において一過性形質転換／感染をスクリーニングすることにより、約９０個の選択したクローンをプロモーター活性の強度によってランク付けすることができる。更に、細胞型に特異的なプロモーターを所望する場合には、これらのクローンを非標的細胞でスクリーニングし、これら非標的細胞で検出可能な活性を示す洩れやすいクローンを全て排除してもよい。このスクリーニングで多数の非標的細胞型(一次細胞および細胞株の両方)をテストすることにより、配列の選択した組合せが標的細胞に対し真に選択的であることが確実になる。最高性能の組合せプロモーターカセットを約３〜５個選択し、ウイルスベクター中にクローン化して更にテストしてもよい。
合成組合せプロモーターカセットを作成する本発明方法を実在の細胞型、好ましくは癌細胞に適用するのがよい。遺伝子治療の全世界での臨床試験例のためにtheJournal of Gene Medicine (updated Jan 31, 2004)が提供し一般に入手可能なウエブベースのデータベースによれば、全世界で進行中の遺伝子治療の臨床試験は９１８例ある。遺伝子治療の臨床試験で最も頻繁に扱われている疾患型は癌であり、６６％（６０８例）を含む。これら試験例のうち約１９０例では自殺遺伝子か腫瘍抑制遺伝子が使用されている。これら試験例の成否は、その遺伝子の治療用産物が患者の正常細胞には作用せずに癌細胞を効率的かつ選択的に殺滅することができるか否かにかかっている。本発明方法を使用することにより、これら癌遺伝子治療の試験例の必要条件に対して特異的にデザインされた合成プロモーターを産生するのがよく、その結果として有効性が上昇する。
（神経芽細胞腫の細胞に特異的な転写制御因子）
どのような細胞型を使用しても本発明を実施することができるが、本明細書では標的細胞の例として神経芽細胞腫の細胞を挙げる。したがって、本発明の一態様では神経芽細胞腫の細胞に特異的な合成組合せプロモーターカセットが作成される。神経芽細胞腫は幼少期の最も一般的な固形腫瘍の一つであり、交感神経組織の副腎髄質その他の部位に生ずる。神経芽細胞腫は毎年約６５０症例が新たに生ずる。これの特徴は自然退縮から腫瘍の急速な進行および死まで臨床的挙動が多様なことである(54)。低段階の腫瘍は外科的切除によりしばしば治療に成功するが、高段階の悪性神経芽細胞腫はきわめて攻撃的であり、年齢の高い子供では徹底的に多様な治療を施しても致死的である(42)。したがって、神経芽細胞腫が高段階の患者には進んだ治療策、例えば遺伝子治療または癌崩壊性のウイルス治療が緊急に必要である。
多分化能の神経冠細胞は胚形成および胚形成後の正常な発生の過程で種々の神経細胞型および神経内分泌細胞型に分化する。したがって、多分化能の神経冠細胞に由来する神経芽細胞腫には多様な細胞表現型が包含される。神経芽細胞腫の原発性腫瘍または骨髄転移から確立され、かつ分子研究および細胞研究の種々の分野で広く使用されている細胞株は多い。長期の研究から神経芽細胞腫の細胞株には三つの異なる細胞型、すなわちI型幹細胞、N型神経芽−神経内分泌前駆体、およびS型シュワン−黒色素芽細胞の前駆体が存在することが判っている(49)。I型幹細胞はN型またはS型細胞よりも有意に悪性である。包括的な遺伝子的および組織病理学的研究により、ヒトの神経芽細胞腫には類似した細胞型が三つあることが明らかにされている(33)。推定のI型幹細胞は全段階の腫瘍に存在する。腫瘍には種々の分化段階にあるN型神経芽細胞が含まれている。ストローマ細胞には腫瘍由来のS型細胞と正常細胞が含まれている。神経芽細胞腫の細胞に特異的な合成組合せプロモーターカセットをデザインする目的でこれら三つの異なる型の神経芽細胞腫の細胞株、すなわちI型:SK-N-BE(2)-C細胞、N型：SH-SY5Y細胞、S型：SH-EP1細胞を標的細胞に使用する。
これら三つの細胞株において遺伝子発現を効果的に促進することができる組合せプロモーターカセットの合成を行う。この組合せプロモーターカセットはこれら細胞株での選別に基づいて作成されているので、動物試験でも臨床試験でもインビボでは同様に性能発揮する可能性は高い。
一過性形質転換アッセイから選択した神経芽細胞腫に特異的な合成組合せプロモーターカセットの３〜５個をウイルス性発現ベクターに挿入して更にテストする。真核細胞ゲノムを複合体クロマチン構造の中にパッケージする。転写を容易にするためには、タンパク質、例えばヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびATP依存性クロマチン再モデル化因子によってクロマチン構造を再モデル化することが必要であると報告されている(13,53)。宿主ゲノムおよびアデノウイルスゲノムとウイルス性基本タンパク質とのヌクレオソーム様構造をした複合体にレトロウイルスベクターを少なくとも感染の初期段階において安定に組み込む(45)。インビトロ研究で選択した合成組合せプロモーターカセットを装備したレトロウイルス性およびアデノウイルス性LacZ発現組み換えベクターを再び動物試験して標的細胞および非標的細胞での発現の特異性と効率性につきテストする。最良性能の合成組合せプロモーターカセットを１個選択し、遺伝子治療用またはウイルス治療用の薬剤候補の中に展開して適切なベクターでの臨床試験を行う。例えば、癌遺伝子治療試験において自殺性ないし細胞障害性遺伝子を神経芽細胞腫の癌細胞特異的に発現させるために、あるいは神経芽細胞腫に特異的な癌崩壊性ウイルス治療試験用にベクター中に使用することができる。
本発明の他の態様において、異なる癌タイプを標的とする合成組合せプロモーターカセットの産生を最適化してよい。一次細胞を使用してFACSベースの予備スクリーニング操作を行うようにプロトコールを最適化する。この最適化をすれば、スクリーニング操作用に格別の細胞株を確立しなくても本技術を癌のタイプに適応させることができる。癌の一次細胞は、theCooperative Human Tissue Network of the National Cancer Instituteを経由して得られる新鮮な組織サンプルから調整することができる。配列組合せライブラリーの予備スクリーニングにFACSベースの操作が適用できるか否かは標的細胞を効率的に形質転換したかどうかにかかる。一般に、脂質ベースまたは燐酸カルシウムベースでの形質転換方法によって達成される形質転換効率は一次細胞において２５％未満である。この限界を突破するためにはレンチウイルスベースおよび／または電気穿孔ベースの遺伝子導入方法をテストして比較的高レベルの形質転換効率を達成する。レンチウイルス系を使用する利点は、レンチウイルスが細胞を静止段階または成長抑止段階にて形質導入することができることである。プロモーターのないレンチウイルスベクター系は市販品で入手可能である（Invitrogen,Carlsbad, CA）。この系を使用することによって、βガラクトシダーゼ遺伝子の発現を促進する配列要素(elements)の各種組合せを包含するレンチウイルスベクターのライブラリーを一次細胞の形質導入用として比較的短時間で作成しパッケージすることができる。電気穿孔は、一次細胞を比較的に高い効率で形質転換する別の方法である。
ベクター技術を最適化し能率化するための別の本発明方法は多様な細胞型からデータを収集してthe Transcription RegulatorExpression Profile (TREP)のデータベースを拡大することである。十分に多数の細胞型からデータベースを構築すれば、転写制御因子発現プロファイルの一般化したパターンを細胞の特定グループ毎に推定することができ、それを助けにすれば提案プロトコールのデザイン部分をいっそう予測可能な態様で実施できる。他の関連情報、例えばFACSベースの各選択実験から予備選択された約９０個のランダム組合せプロモーターカセットのヌクレオチド配列とか一過性形質転換アッセイでの標的細胞および非標的細胞におけるそれらのプロモーター活性とかもデータベースに包含させる。本技術を適用して多様な癌タイプを標的にする組合せプロモーターカセットを合成するに伴い、異なる組合せまたはグループの転写因子が特定の細胞型においてどのような挙動をするかに関する情報がデータベースに蓄積される。長期にわたりデータベースによって合成プロモーターカセットを更に精密かつ効率的にデザインできるためには、デザイナーがたとえアッセイ実施前であっても転写因子の所定の組合せがどのような結果を招来するかをこのデータベースにより予測できるようにしておく。
本発明の範囲は本明細書に記載の具体的な実施態様例によって限定されない。本明細書に記載に加えて、当業者には多様な改変例が上記の説明および添付図から自明である。そのような改変例は添付の特許請求の範囲に属するものである。以下の実施例の提供は本発明の例示目的であって、限定目的ではない。
実施例１−神経芽細胞腫の細胞での転写制御因子と関連タンパク質のマイクロアレイ発現プロアイリング
実施例１．１−実験操作
実施例１．１．１−細胞培養と全RNA単離
神経芽細胞腫の細胞SH-EP1, SH-SY5Y, および SK-N-BE(2)-CをD-10培地（ダルベッコ改良イーグル培地と4.5g／Lのグルコース、１０％のウシ胎仔血清(加熱不活性化)含有、グルタミン(0.03％)、ペニシリン（100単位／ml）およびストレプトマイシン（100ｐｇ／ml）を補充）で培養した。細胞を空気９５％炭酸ガス５％の湿潤大気中で３７℃のインキュベータ中に保持した。T150組織培養フラスコ中で集密度８０〜８５％まで生育させた細胞からRNeasymidi kit (Qiagen)を使用し製造者のプロトコールに従って全部のRNAを抽出し、小分け状態にて−８０℃で保存した。
実施例１．１．２−マイクロアレイアッセイ
神経芽細胞腫の細胞SH-EP1, SH-SY5Y, および SK-N-BE(2)-Cから転写因子と関連タンパク質をGeneka Biotechnology,Inc製造のProteomic Regulatory Oligonucleotides Microarray (PROM)チップを使用して取得した。チップには、転写因子、補助因子、DNA結合性タンパク質および遺伝子転写に関係する他のタンパク質に対する１５００個の遺伝子からの複製物としてスポットされた３５〜４５個の塩基対オリゴヌクレオチドが含まれている。cDNA合成と蛍光色素での標識、マイクロアレイハイブリダイゼーション、マイクロアレイスクリーニング、およびデータ解析はGenekaBiotechnology, Incで行った。アッセイを行うために、各神経芽細胞腫細胞のcDNAを異なる蛍光タグ（Cy5対Cy3）で標識したHeLa細胞のcDNAとともにハイブリダイゼーションした。これにより１５００個の遺伝子の各々の相対的な発現レベルを三つの異なる神経芽細胞腫の細胞株の間で比較することができる。神経芽細胞腫の細胞由来の各遺伝子の相対的な発現レベルはHeLa細胞での発現レベルに対する比として示される。更に各オリゴヌクレオチドチップには、外部コントロールとしてAgamous(植物)の遺伝子に対する、および内部コントロールとして18SrRNA、βアクチンおよびCAPDHの遺伝子に対するプローブが含まれており、これらを使用することによってシグナルを正規化する。各神経芽細胞腫細胞株を二枚のスライドにスクリーニングし、第一のスライドはCy3標識HeLacDNAに対するCy5標識神経芽細胞腫cDNAとハイブリダイズし、第二のスライドはCy５標識HeLa cDNAに対するCy３標識神経芽細胞腫cDNAとハイブリダイズした。
実施例１．２−結果と考察
PROMマイクロアレイアッセイの結果から、これら三つの異なる神経芽細胞腫の細胞型では多様な遺伝子が上方にまたは下方に制御されるのが判る。いくつかの興味ある観察結果では、例えばSH-EP1細胞では神経D遺伝子の転写が、またSH-SY5Y細胞およびSK-N-BE(2)-C細胞ではPhox2b遺伝子の転写がそれぞれ細胞型に特異的に発現するのが検出された。神経Dは基本的なヘリックスループヘリックス型の転写因子ファミリーの一員であり、神経前駆体細胞の分化において重要な役割をする(1)。末梢神経系の胚の発生中に神経DmRNAは分裂終了の神経前駆体細胞に一過的に現れる(34)。他方、Phox2bはホメオドメインの転写因子であり、別の神経型の生成と生存を制御する(4, 10)。Phox2bおよびPhox2aは、ノルアドレナリン作動性生合成酵素ドパミンβヒドロキシラーゼ（DBH）を発現する全ての中枢および末梢のニューロンで共に発現される(46)。遺伝子はその５'プロモーター領域にこれらホメオドメインタンパク質に対する少なくとも２個のシス作用配列を有することがKimら(27)によって示されている。本アッセイでは、Phox2bの発現はアドレナリン作動性のSH-SY5Y細胞およびSK-N-BE(2)-C細胞でのみ検出され、コリン作動性のSH-EP1細胞では検出されないことから、文献からの公知事項が確認される。細胞特異的に上方に制御される転写因子および補助因子の他の例は、例えばSH-EP1細胞ではNPAS1（ニューロンの基本ヘリックスループヘリックスファミリーのメンバー）およびPIAS3（Tボックスタンパク質）であり、SH-SY5Y細胞ではATF-3、Ｃ／EBP-アルファ、NFkB、およびPIAS3（活性化されたSTAT3のタンパク質インヒビター）であり、またSK-N-BE(2)-C細胞ではCBP（CREB結合性タンパク質）、HTLF（T細胞白血病ウイルスエンハンサー因子）、N-MycおよびOct-1である。発生的にまたは細胞型特異的に制御される遺伝子転写物のこれらの例をPROMマイクロアレイアッセイは検出することができることから、このアッセイは十分に感度がよく比較的低レベルで発現した転写物を検出することが示唆される。合成プロモーターの構成のために選択した転写因子遺伝子が低レベルで発現された場合には、ノーザンブロット分析またはゲル移動シフト分析を実施してマイクロアレイでの結果を確認するのがよい。
PROMマイクロアレイのデータから、Sox、Hox、Pbx、Pax、Egr、および核内のホルモン受容体ファミリーのメンバーが三つの神経芽細胞腫の細胞型全てにおいて特異的に発現するのが判る。入手可能な文献を広範囲に調査すると、これら転写因子は胚の発生および細胞の分化に多様に係わっているのが判る。これら転写因子ならびに他の自由自在に発現する転写制御因子と補助因子の複雑でコンビナトリアルな相互作用によって、細胞の運命を決定するのに必要な特異遺伝子の発現が神経冠の発生中に始動される(31,52, 57)。神経芽細胞腫の細胞で上方に制御される補助因子のいくつかは、例えばSNW1、N-CoR、NCOA3、およびHDAC6である。更に、発現の抑制に係わることが判っている二つの密接に関連する転写抑制因子がこれら三つの神経芽細胞腫の細胞全てにおいて下方に制御された。
上記三つの神経芽細胞腫の細胞に特異的な転写因子および構成要素(elements)として発現された転写因子に対するOct、CREB、AP-1およびSTATのファミリーのメンバーから選択した10個の異なる転写因子に対するシス作用配列要素(elements)をランダム連結反応において使用する。神経芽細胞腫の細胞に特異的な下方に制御される抑制因子もランダムカセットの構築に包含されてよい。この特異な転写抑制因子は神経芽細胞腫の細胞では発現されないので、ランダム組合せに包含されるこの抑制因子タンパク質が結合するための配列要素(elements)は、プロモーター組合せによって促進される神経芽細胞腫の細胞での転写のレベルには何の効果もない。他方、高レベルで抑制因子タンパク質を発現する非標的細胞では同じ抑制因子要素(elements)が転写阻害因子として作用する。
ライブラリーの構築に包含させるべき配列要素(elements)を決定するにあたっては、対応する各転写因子が何かの役割を果たすために他の参加メンバーと密接に協働して神経芽細胞腫細胞での効率的な遺伝子転写をするための潜在的な能力を考慮する。Sp-1結合性配列要素(elements)もこの反応に包含させる。その理由は、Sp-1は他の転写因子と相乗的に作用することが知られており、Sp-1結合部位はCpG島をメチル化から防護するのに必須であるからである(3,40, 41)。
関連する標的である三つの神経芽細胞腫の細胞型から転写制御因子と補助制御因子の発現パターンを得た。単独の標的細胞型から発現プロファイルを獲得する場合に比較すると、癌細胞に特異的なプロモーターカセットをデザインし構築するためのより意味のある精確な情報がこのデータから得られる。しかし、このプロジェクトでのランダム連結反応に包含させるべき転写因子または抑制因子のためのシス作用配列要素(elements)を実際に決定するには、入手可能な文献を慎重に調査する必要があった。その調査を行うことによって最良候補の配列要素(elements)を決定した。それら配列要素(elements)を組み合わせると他の成分と協働的に相互作用して標的細胞で効率的かつ選択的に転写がなされる。
実施例２−配列要素(elements)のランダム組合せのライブラリーを転写因子のDNAマイクロアレイプロファイリングに基づいて構築
選択した転写因子の各々が結合するための保存されたシス作用配列を含有する相補性オリゴヌクレオチドを合成しアニーリングする。ランダム連結反応を行うにあたってはアニールしたオリゴヌクレオチドの混合を使用する(36)。得られるランダムに伸長した多数のシス作用配列をヒトのドパミンβヒドロキシラーゼ（DBH）遺伝子の最小プロモーターとこれに続くLacZレポーター遺伝子の上流に再クローン化する。TATAボックスを含有するDBH最小プロモーター（転写開始部位から−４５〜＋５１）を選択した。その理由は、DBHは神経冠由来細胞、例えば神経芽細胞腫の細胞型で特異的に発現するからである(27,59)。DBH最小プロモーター自体は不活性であることは判ったが、他の配列要素(elements)と組み合わされると強力な細胞特異的転写を仲介する(21)。
ランダム連結反応で使用するオリゴヌクレオチドを含有するシス作用配列を慎重にデザインするにあたって、シス作用配列では配列間のスペーシングあるいは転写開始部位からのそれらの距離が重要であることを考慮する。転写の活性化効率を上げるために、各制御要素(elements)の中心モチーフの側面に隣接する配列は神経芽細胞腫細胞で特異的に発現し保存される遺伝子から採取する。これらフランキング配列を決定するにあたっては、再構築したときに中心の制御要素(elements)がDNA二重ヘリックスの同じ面に出現するようにする。TheProtein Data Bankには２５０個を超えるタンパク質−DNA複合体の構造物が包含されている(2)。これらの構造物は、分子的および生化学的研究と結びついて、タンパク質が特定のDNA配列に選択的に結合する多様なストラテジーを描写してきた。入手可能な全ての出典からの情報を使用して合成プロモーターカセットに加えるべきオリゴヌクレオチドの正確な構造を決定する。ある場合には、個々のシス作用配列要素(elements)とフランキング配列を含有する二本鎖オリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼIII（ExoIII）で処理し、それによってDNA分子末端からヌクレオチドを一定の比率で除去する。反応条件は、ExoIIIで消化後にDNA分子が回収されるとともにフランキング配列中の１塩基対が漸次削除されるように設定する。個々のシス作用配列要素(elements)DNA配列をExoIIIで処理し、次にこれらをランダム連結反応に加えて組合せた転写制御要素(elements)を形成すれば、結果としてその組合せプロモーターカセットではシス作用配列要素(elements)間のスペーシングのランダム度が上昇する。
発生的に制御された数個の転写因子の場合では、シス作用配列要素(elements)の特異性がファミリーのメンバーに応じて変化する。そのような場合、および転写因子のための正確なコンセンサスシス作用配列が明瞭に判っていない場合、またはそれらを決定する必要がある場合には、関連標的要素(elements)の細胞型に特異的な配列を実験により決定する。CAST（サイクル式の標的の増幅と選択）をするためのプロトコールを使用して転写因子、特に多成分複合体のシス作用配列を検出してきた(14)。このプロトコールでは、中央の伸長している退化ランダムヌクレオチド（１５〜３５塩基対）を標的細胞から調整した核抽出物と混合する。タンパク質−DNA複合体を免疫沈降させるために特定の転写因子に特異的な抗体を使用し、結合したDNA分子をPCR増幅し、再び核タンパク質結合と免疫沈降を行う次のサイクルのために使用する。サイクルの数回の繰り返しにより、ランダムオリゴヌクレオチドの集団は転写因子への結合親和性の最も高いものだけに濃縮される。得られた高親和性のヌクレオチド配列からコンセンサスの結合配列を推定する。したがって、この方法で決定した特定の転写因子に対するシス作用配列は、インビボで他の相互作用性制御因子および補助制御因子の存在下で優先的に結合するタンパク質を反映すると思われる。これらの方法を使用してシス作用要素(elements)に対するオリゴヌクレオチド配列を慎重に決定し、次にそれらをランダム連結反応に加えれば、最適のプロモーターカセットが産生される可能性は増大する。
実施例２．１−実験操作
実施例２．１．１−シス作用配列を決定するためのCAST操作：
転写因子に対してCAST操作を行うには、正確な結合配列が他の相互作用性制御因子および補助制御因子と関連する必要がある。Funkら(14)およびWrightら(58)で開示されている方式と基本的に同じながら僅かな変更を加えた方式でCAST操作を行う。FunkらおよびWrightらの内容は全体、特にシス作用配列の決定方法に関する全体を参照により本明細書に編入する。約２５個のランダムヌクレオチド配列を中央にまた三つの異なる制限部位を各末端に有するオリゴヌクレオチドを作成する（SalI-Hind lll-Xba I-N25-EcoRl-BamHl-Xho I）。制限部位とスペーサーヌクレオチドを含有する両末端の約２５塩基対の配列を使用してPCR増幅用の前進および逆進プライマーをデザインする。単独PCRプライマーとして逆進プライマーを使用し３０分間のポリメラーゼでの伸長によりオリゴヌクレオチドを二本鎖にする。この二本鎖オリゴヌクレオチドサンプルをSK-N-BE(2)-C細胞から調製した核抽出物と共に、塩化ナトリウム最終濃度約１００ｍMにてかつ非特異的相互反応を低下させるために超音波処理したサケ精子DNAの１０μgの存在下で混合する。タンパク質−DNA複合体を、標的転写因子に対する抗体を被覆した磁気ビーズ（DynalInc., Great Neck, NY）を使用して免疫沈降させる。タンパク質−DNA−ビーズ複合物を磁石で回収し、０．５% NP-40および ０．１%BSAを含有するPBSで３回洗浄する。この複合物を３０μｌのPCR反応緩衝液に再懸濁し、前進および逆進プライマーを使用して９サイクル（１００℃５分で変性し、次にTaqを加え、そして９４℃１分、６５℃１分、７２℃１分、１０分延長を９サイクル）の増幅をする。増幅したサンプル１０μｌをCAST操作の更なるサイクルに再び使用する。CAST操作の６サイクルを行い、得られるDNAサンプルをプラスミドにクローン化し、約３０個のクローンを取り上げ、配列決定し、コンセンサス配列を推定する。
実施例２．１．２−シス作用配列オリゴヌクレオチドのランダム連結：
相補性オリゴヌクレオチドのセットを合成し、そのセット中に、DNAマイクロアレイアッセイによるTREPプロファイリングの結果を解析して選択した各転写因子に対する特定のシス作用配列要素(elements)とそのフランキング配列を包含させる。相補性オリゴヌクレオチドの各セットのアニーリングとリン酸化をTEN緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.5； 1 mM EDTA; 50 mM NaCl）中での一反応で行う。この反応は、各相補性オリゴヌクレオチド２０μM、１ｍMATP、および０．５U／mlのT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む最終容積３００μｌ中で７０℃にて１５分間行い、３０分以上をかけてゆっくり室温まで冷却する。ランダム連結反応にあたって、異なるシス作用配列に対するオリゴヌクレオチドの使用モル量を同一にすることによって、反応の最終容積１５０μｌ中のオリゴヌクレオチドの全量を２００pmolに維持する。連結するために２０UのT4DNAリガーゼを１６℃で終夜使用する。連結混合物を６％アクリルアミドゲル上に展開し、７５bpから１．０kbの間のDNAバンドを含むゲル部分を切り取る。そのゲル片を２倍容積の核酸緩衝液中で３７℃にて終夜インキュベートした後、QiaexIIGel Extraction kit (Qiagen, Chatsworth, CA)を使用してゲル片からDNA断片を溶出する。精製したDNA断片を１０UのT4DNAリガーゼとともに、中央に８塩基対のAsc I制限部位を含むリン酸化されアニールされた１２塩基対の相補性オリゴヌクレオチドを含有する連結反応液１５０ml中で１６℃にて終夜インキュベートする。この反応液をQiaquickNucleotide Removal kit (Qiagen)にて洗浄し、Asc Iで消化し、βガラクトシダーゼレポータープラスミド（pD96L）のAsc I部位に連結する。図１に示すごとく、pD96Lではβガラクトシダーゼレポーター遺伝子が、TATAボックスのあるプロモーター配列の４５塩基対および遺伝子の５'非翻訳領域の５１塩基対を含むドパミンβヒドロキシラーゼ（DBH）最小プロモーターの下流に設置されている。連結したクローンをQiaquickNucleotide Removal kitにより精製し、電気性能のある大腸癌DHlOb株に形質導入する。形質導入されたバクテリア細胞をアンピシリン（１００μg／ml）の存在下でLB５ml中に１バッチで８時間播き、終夜２００mlに増幅する。プラスミドをQiagenMaxi prepにより単離する。
実施例３−最良性能の配列組合せを選択するためにFACSを使用してライブラリーを予備スクリーニング
神経芽細胞腫の標的細胞SK-N-BE(2)-C を、LacZ遺伝子の上流にクローン化したランダム組合せプロモーターカセットを含有するプラスミドのライブラリーで形質転換する。FACSを使用して、形質転換されβガラクトシダーゼを強力に発現する細胞の３〜５％を選択する。分取した細胞からプラスミドを単離し、増幅し、SK-N-BE(2)-C細胞の形質転換に再び使用する。同じ操作を３ないし４回繰り返すと、その結果得られる細胞集団にはレポーター遺伝子を最高レベルで発現可能なプラスミドが含まれる。最終的に分取してからプラスミドをそれぞれ単離して増幅し、９６穴一過性形質転換アッセイに使用する。これらSK-N-BE(2)-C細胞を予備スクリーニング用に選択する。その理由は、これら細胞は最高の転移能を有し進行段階の神経芽細胞腫を遺伝子治療する場合の一次標的となるからである。また、これら細胞は培養で激烈に成育し、またこれら細胞では比較的に高レベルの形質転換効率が達成される。SK-N-BE(2)-C細胞ではMetafectenereagent (Biontex; Munich, Germany)を使用すると９０％に及ぶ形質転換効率を達成することができる。
実施例３．１−実験操作
実施例３．１．１−SK-N-BE(2)-C細胞の形質転換とFACSによる分取：
神経芽細胞腫の細胞SK-N-BE(2)-C をT75フラスコのＤ−１０中で成育する。約１ｘ１０７個のSK-N-BE(2)-C細胞を２０μgのプラスミドDNAライブラリーおよび製造者のプロトコールに従い５０μｌのMetafecteneで形質転換する。形質転換から４８時間後にPBS中の５ｍMEDTAを使用して細胞を培養プレートから剥がし、２３ゲージの針の中を通過させてダブレットおよび塊を更に解きほぐす。細胞を０．２mlのPBSに再懸濁し、Falcon2085チューブに移し、３７℃に加温する。Fieringら(12)、 Huangら(20)、 および Nolanら(44)に記載のごとくに細胞のβGal活性をフローサイトメトリー分析する。これら文献の全体、特にフローサイトメトリー技術に関する全体を参照により編入する。概略すれば、２mMフルオレスセインジ−β−D−ガラクトサイド（FDG； Molecular Probes）／H2Oの２００μｌを細胞に加え、その混合物を３７℃で１分間インキュベートする。インキュベートの終わりに１０倍容量の氷冷PBSを加え、細胞を氷上に２０〜６０分間保持する。２mMのフェニルエチル−β−D−チオガラクトサイド（MolecularProbes）を加えて反応を停止する。分取する前にヨウ化プロポジウム（Sigma）を５μg／mlで加える。細胞をFACS器上に４℃で分取する。フルオレスセインイソチオシアネート（FITC）陽性の上位３〜５％レベルの細胞を分取器から収集する。
実施例３．１．２−分取細胞からプラスミドの回収：
分取細胞中のプラスミドをHirtのプロトコール(19)によって抽出する。このプロトコールは低分子量のDNAを抽出するために開発され、細胞ゲノムDNAをSDSおよびNaClの存在下で優先的に沈殿させる。概略すると、分取した細胞を４５mMトリス硼酸塩、１mM EDTA、０．５% SDSおよび１．６M塩化ナトリウムに懸濁し、４５℃で終夜消化する。細胞抽出物をペレットにし、上澄み液からDNAをフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回、クロロフォルムで１回抽出する。DNAをエタノールで沈殿させ５０μｌのH2Oに再懸濁する。次に分取した細胞から単離したプラスミドDNAを使用して効率の高い電気性能をもつ大腸癌DH10b株を形質転換し、アンピシリンを補充した２００mlのLB中で混合培養の形態で終夜成育する。QiagenMaxi kitを使用してプラスミドを単離する。
実施例３．１．３−反復分取：
形質転換、分取そしてプラスミドDNA単離の同じサイクルを３ないし４回実施することにより、レポーター発現が低ないし中程度レベルの大部分のクローンを除去する。レポーター遺伝子の発現を最高レベルで促進する配列組合せが厳しい選択操作を生き抜く。最終ラウンドの選択後、分取した細胞からプラスミドを単離し、大腸癌を形質転換し、寒天プレート（１０μg／mlアンピシリンを補充）に拡げる。プレートから９０〜１００個の菌形質転換体を取り上げ、終夜培養し、それぞれプラスミド標本に使用する。FACSによる細胞分取のサイクル毎の選択閾値（３〜５％）およびサイクル数（３〜４）は、最終ラウンド後に最高性能の配列組合せの約９０〜１００個が選択プロセスを生き抜くように実験により最適化する。選択したプラスミドは配列決定し、更なるスクリーニング操作に使用する。
実施例４−予備選択した組合せを標的および非標的細胞での一過性形質転換アッセイでスクリーンして３〜５個の最良性能候補を最終選択する。
この操作では、FACSで分析したSK-N-BE(2)-Cでの性能により予備選択した約９０個の異なる組合せプロモーターカセットをそれぞれSK-N-BE(2)-C、SH-SY5Y、SH-EP1、および他の非標的細胞での一過性形質転換アッセイでテストする。標的細胞および非標的細胞での組合せ転写制御要素(elements)の性能をスコア化し、最高スコアの組合せ３〜５個を選択して更に分析する。スコアによって標的細胞での転写効率および非標的細胞での転写活性の不存在が規準化される。アッセイを種々の異なる非標的細胞、例えば、限定されないがHeLa細胞、 HCN-1A および HCN-2 ヒト皮質ニューロン細胞 (ATCC, Manassas, VA)、HNPCヒトニューロン前駆体細胞(Clonexpress, Inc., Gaithersburg, MD)、ARPE-19 ヒト網膜色素エピテリアル細胞(ATCC)、293ヒト腎臓細胞(ATCC)、HepG2ヒト肝細胞癌細胞、および他の非ヒト細胞、例えばPC12およびNIH3T3で実施する。
実施例４．１−実験操作
一過性形質転換アッセイにあたり、転写の１２〜１６時間前に１０，０００〜３０，０００個の細胞を適切な成育培地の二重９６穴プレート上に拡げる。転写時点で細胞集密度が７０〜９０％になるようにプレート密度を決定する。細胞の転写効率を予備テストするために、種々の市販品で入手可能な転写試薬、例えばMetafectene、Lifofectamine (Invitrogen)、 Fugene-6 (Roche)、およびSuperfectene (Qiagen)を使用する。細胞を適切な転写試薬で形質転換するにあたり、５０〜２００ngのDNAを使用する製造者のプロトコールに従う。次に、細胞をPBSで洗浄し、形質転換から４８時間後に５０μlのレポーター溶解性緩衝液（Promega）を使用して細胞を溶解し、βガラクトシダーゼアッセイ系（Promega）を使用してプレート上で直接にβGal活性をアッセイする。約９０個の予備選択したプラスミドDNAサンプルに加えて、CMVエンハンサー／プロモーター促進性βGalレポータープラスミド、および最小DBHプロモーターで促進されるレポータープラスミドをそれぞれ正および負のコントロールとして二重に加える。また、５２２塩基対のチロシンヒドロキシラーゼプロモーター(50)促進性βGalレポータープラスミドを二重ウエルに細胞型特異性のコントロールとして使用する。細胞型が異なると転写効率は変化するので、同じプラスミドを使用して異なる細胞から記録したβGal活性は、スコアとは直接に対比できない。シス作用配列の異なる組合せを有するプラスミドサンプルの性能は、負のコントロールウエルから得るバックグラウンドシグナル値を差し引いたCMVエンハンサー／プロモーター促進性の正のコントロールウエルから得る値に対するパーセントとして表現される。標的細胞での発現強度および非標的細胞で発現が存在しないことに関して最良スコアのプラスミド３〜５個を選択する。

当業者は、本明細書に具体的に記載された本発明の具体的な実施態様に対する多数の同等な態様を単なる日常的な実験によって認識し、または確認することができる。そのような同等な態様は特許請求の範囲に包含される。
本発明は、以下の詳細説明、および付随の図面から更に十分に理解されるであろうが、図面は単に例図にすぎないので本発明を限定しない。
転写制御要素(elements)をランダムに相互に連結し、最小プロモーター(D96）とこれに続くレポーター遺伝子（LacZ）の上流にクローン化したベクター系を示す。

Claims (19)

  1. 転写増強用組合せプロモーターカセットを作成し選択する方法であって、
    （ｉ）ランダムに組み合わせた転写制御要素(elements)のライブラリーを構築すること、なお各要素(elements)には特定の転写制御因子により認識される二本鎖DNA配列要素(elements)およびフランキング配列が含まれる、
    （ｉｉ）この組合せ転写制御要素(elements)を最小プロモーターとこれに続くレポーター遺伝子の上流に挿入してベクターとすること、
    （ｉｉｉ）このベクターを宿主細胞中に挿入すること、および
    （ｉｖ）該レポーター遺伝子の発現が増強されている細胞をスクリーニングし、その細胞中に組み合わせたプロモーターカセットを同定すること、
    を含む方法。
  2. 該ランダムに組み合わせた転写制御要素(elements)のライブラリーを作成するにあたり転写制御因子により認識される二本鎖DNA配列の各要素(elements)を連結反応の条件下に混合して一体化することを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 該二本鎖DNA配列要素(elements)が一端または両端にスペーサーヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
  4. 該レポーター遺伝子の発現を蛍光標示式細胞分取器（FACS）によりスクリーニングすることを特徴とする請求項１記載の方法。
  5. 転写制御因子によって認識される該DNA配列要素(elements)を取得するにあたり転写制御因子および補助制御因子をDNAマイクロアレイによりプロファイリングすることを特徴とする請求項１記載の方法。
  6. 該レポーター遺伝子がlacZまたはGFPであることを特徴とする請求項１記載の方法。
  7. 該宿主細胞が癌細胞であることを特徴とする請求項１記載の方法。
  8. 該癌が神経芽細胞腫であることを特徴とする請求項７記載の方法。
  9. 請求項１記載の組合せプロモーターカセットを含むベクター。
  10. プラスミドである請求項９記載のベクター。
  11. ウイルス由来である請求項９記載のベクター。
  12. 一過的に発現される請求項９記載のベクター。
  13. 宿主細胞のゲノム中に組み込まれた請求項９記載のベクター。
  14. 請求項９記載のベクターを含む宿主細胞。
  15. 原核細胞である請求項１４記載の宿主細胞。
  16. 真核細胞である請求項１４記載の宿主細胞。
  17. 哺乳動物細胞である請求項１６記載の宿主細胞。
  18. ヒト細胞である請求項１７記載の宿主細胞。
  19. 癌細胞である請求項１８記載の宿主細胞。
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