KR101086102B1 - 합성 프로모터 제조 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전사 강화 복합 프로모터 카세트를 제조 및 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, 전사 조절자에 의해 인식되는 이중 가닥 DNA 서열 인자들을 포함하며 무작위적으로 복합된 전사 조절인자들의 라이브러리를 설계하는 단계; 벡터에서 리포터 유전자가 뒤에 연결된 최소 프로모터의 상류에 복합된 전사 조절 인자를 삽입하는 단계; 벡터를 숙주 세포에 삽입하는 단계; 리포터 유전자의 발현이 증가된 세포를 스크리닝하는 단계; 및 세포 내에의 복합 프로모터 카세트를 확인하는 단계를 포함한다.

전사, 프로모터, 라이브러리, 프로모터 카세트

Description

합성 프로모터 제조 시스템 {System for Producing Synthetic Promoters}

본 출원은 2005년 4월 8일에 출원된 미국 특허출원 제10/907,620호에 대하여 우선권 혜택을 주장하며, 상기 미국 특허출원의 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 병합된다. 본 발명은 유전자의 효율적인 발현을 위한 프로모터를 설계하는 시스템에 관한 것이다.

유전자 치료에 관한 신기술이 각종 질병 치료를 보장할 것이라는 기대가 일찍부터 있었으나, 지금까지 대부분의 시도는 유전자 치료의 임상적 효능을 입증하지 못하였다. 임상적인 유전차 치료에 있어서 중요한 기술적 장애의 하나는 치료 유전자를 특이적인 타겟 세포에 전달시키고 바람직한 시간 동안 전이유전자의 발현을 충분히 높은 수준으로 유지시키는 것의 어려움이었다. 비록 치료 유전자를 특정 세포 타입에 전달하는 것 (타겟된 형질도입)을 목적으로 하는 것이 가장 바람직하지만, 그것은 주요한 기술적 장애요소이며 이 분야에서 단지 제한된 성공사례만이 보고되었을 뿐이다 (5, 24, 48). 대체적인 접근으로서, 과학자들은 세포 타입에 특이적인 프로모터를 사용하여 전이유전자가 그 타겟 세포에서만 제한적으로 발현 (타겟된 전사)되도록 하고 있다 (18). 이러한 프로모터들은 유전자들이 동일한 타겟 세포 내에서 특이적으로 발현되도록 맞추어져 있다 (28, 43, 51, 55). 그러나, 이들 소위 세포-특이적인 프로모터들은 비타겟 세포에서도 다양한 수준의 전이 유전자 발현을 일으키기 때문에, 타겟 세포의 선택성 관점에서는 부족한 경우가 많다. 대부분의 경우, 이들 프로모터들은 전이유전자가 실제적인 치료 효과를 위해 요구되는 수준 또는 그 이상의 수준으로 발현되도록 조정하기 충분할만큼 강력하지 못하다. 이러한 사실들은, 매우 효율적인 세포 타입-특이적 프로모터 시스템을 발전시키기 위해서는 더 많은 시스템적인 접근이 필요함을 시사한다.

본 발명은 특이적인 세포 타입에서 고효율로 유전자가 발현하도록 조절할 수 있는 전사조절서열의 합성 복합체 제조에 관한 것이다.

본 발명은 하나의 양태로서, 전사조절서열의 합성 복합체 제조는 (1) 바람직한 전사 조절자에 의해 인식되는 DNA 서열 인자의 무작위적인 조합으로 이루어진 라이브러리를 설계하는 단계; (2) 가장 적합한 소수의 DNA 서열 인자의 조합을 선별하기 위하여 FACS(fluorescence-activated cell sorter)와 같은 세포 분류기를 사용하여 라이브러리를 하이 쓰루풋 스크리닝 (high throughput screening)하는 단계; 및 (3) 가장 적합한 하나 또는 여러 개의 복합체를 최종 선별하기 위하여 상기 선별된 복합체 각각을 추가적으로 테스트하는 단계에 의하여 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체적인 양태로서, 라이브러리는 높은 친화력으로 전사 조절자에 결합할 수 있는 DNA 서열 인자를 포함하는 각각의 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오타이드를 무작위적으로 연결시켜 만들 수 있다.

무작위적인 연결 반응에 사용되는 올리고뉴클레오타이드에 포함되는 DNA 서열 인자들은 다른 방법에 기초하여 결정될 수 있는데, 그러한 방법으로는 타겟 세포의 전사 인자들을 DNA 마이크로어레이 프로파일링 하는 방법 또는 무작위적인 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 풀로부터 높은 친화력으로 결합하는 서열 인자들을 선별적으로 증폭시키는 방법을 포함한다. 또한, DNA 서열 인자는 타겟 세포에서 발현되는 유전자의 서열에 대한 알로리즘-기초 컴퓨터 분석에 의하여 결정될 수 있다.

더욱 구체적으로, 무작위적으로 조합된 서열 인자들은 제한효소에 의해 절단되고 리포터 유전자의 업스트림(upstream)에 클론될 수 있다. 리포터 유전자로는 GFP 또는 lacZ를 사용할 수 있으나 이에 제한되지 아니하고, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터 등이 생성될 수 있다. 라이브러리는 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 등을 사용하여 제조할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.

리포터 유전자가 뒤에 연결되 최소 프로모터의 상류에 클론된 무작위적인 서열 조합체의 라이브러리를 포함하는 벡터 ENA는 타겟 세포에 트랜스펙션 또는 감염될 수 있고, 리포터 유전자의 발현이 높은 세포의 선별을 위해 FACS 에 의해 분류될 수 있다. 분류된 세포는 활성이 높은 적합한 전사조절인자 복합체를 포함한 벡터 DNA를 회수 및 증폭하는데 이용된다.

분류된 세포로부터 회수 및 증폭된 벡터는 타겟 세포에 삽입될 수 있고, FACS 를 사용하여 가장 활성이 높은 전사조절인자 복합체를 재선별할 수 있다. 그리고 상기와 같이 회수된 벡터 DNA 를 세포에 삽입하고, 리포터 유전자의 발현이 가장 높은 세포를 분류하고, 분류된 세포로부터 벡터 DNA를 회수하는 동일한 과정이, 수백만개의 복합체 중 가장 활성이 높은 소수의 복합체를 획득하고 정제하기 위하여 여러차례 반복될 수 있다.

반복된 분류 빛 선별이 완성될 때, 회수된 DNA 벡터는 진정한 프로모터 활성을 테스트하기 위하여 타겟 세포에서 개별적으로 추가적인 선별을 거칠 수 있다.

한편, 세포 타입-특이적 프로모터가 적합한 것이라면 전사조절인자 복합체를 포함하는 선별된 벡터들은 비타겟 세포에서 실질적인 프로모터 활성을 가지는 벡터들을 제거하기 위한 목적 하에, 비타겟 세포에서 또한 테스트를 거칠 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 유전자 또는 바이러스 치료 벡터에 사용될 수 있는 합성 복합된 프로모터 카세트의 제조방법에 관한 것이다. 잠재적인 수백만개의 후보자들 중에서 선별된 이러한 합성 프로모터들은, 현재 이용가능한 프로모터 시스템과 비교했을 때 대단히 향상된 효율성 및 선별성을 가지고 특이적인 타겟 세포에서 전이유전자 발현을 조절할 수 있다. 일양태로서, 이러한 시스템은 하이 쓰루풋 분석 시스템, 예컨대 DNA 마이크로어레이 또는 FACS를 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 시스템은 짧은 시간 안에 실질적으로 어느 세포타입에라도 특이적인 합성 프로모터들을 제조하는데 적용될 수 있다. 본 발명은 타겟 유전자의 전사에 의존하는 현재 이용가능한 유전자 또는 바이러스 치료 벡터 시스템의 효율성을 현저히 증가시킨다. 동시에, 이러한 시스템은 암 및 각종 질병 치료를 위한 다양한 신규 유전자 또는 바이러스 치료 약물 후보물질들을 시장에 신속하게 도입하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 구체적인 실시양태로서, 본 발명은 신경아세포종 (neuroblastoma) 암세포에서 특이적으로 타겟 유전자 전사를 일으키는 합성 프로모터 카세트를 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 타겟 신경아세포종 세포에서 전사인자의 DNA 프로파일링에 기초하여, 시스-액팅 서열인자의 랜덤 복합체로 이루어진 라이브러리 설계하는 것에 관한 것이다. 시스-액팅 서열인자의 수백만개의 서로 다른 복합체는 신경아세포종 세포에서 특이적으로 발현되는 전사조절자의 결합을 위하여, 다양한 시스-액팅 서열 인자를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 무작위적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 무작위적인 연결 반응을 포함하는 시스-액팅 서열 인자는 전사 조절자 및 타겟 신경아세포종 세포에 있는 관련된 단백질들에 대하여 이전에 수행한 DNA 마이크로어레이 발현 프로파일링을 토대로 하여 결정될 수 있다. 무작위적으로 연결된 서열 인자 복합체들은 lacZ 또는 GFP와 같은 리포터 유전자가 뒤에 연결되어 있는 최소 프로모터의 업스트림에 클론된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 FACS-기초 방향성 진화 프로토콜 (FACS-based directed-evolution protocol)을 이용한 라이브러리의 프리스크리닝(prescreening)에 관한 것이다. 플라스미드 라이브러리는 타켓 신경아세포종 세포에서 가장 활성이 좋은 소수의 복합체(약 90)를 선별하기 위하여 스크리닝될 수 있는데, 그러한 복합체들은 주어진 타겟 세포에 특이적이고 가장 활성이 높은 서열 인자 복합체를 확인하기 위하여 보다 광범위한 스크리닝 과정을 거쳐 선택된 것들이다. 이러한 인 비트로 evolution 방법은, 리포터 유전자 벡터의 라이브러리를 세포에 트랜스펙션 또는 감염한 후에 베타-갈락토시다아제와 같은 리포터 유전자 산물을 발현하는 세포를 분류하기 위한 FACS 와 같은 하이 쓰루풋 세포 분류 기술력에 부분적으로 의존한다.

또한, 본 발명은 예비 선택된 시스-액팅 서열 복합체를 타겟 세포 및 비타겟 세포 모두에서 96-웰 일과성 트랜스펙션/감염 분석에 의한 개별적인 스크리닝에 관한 것이다. 예비 선택된 약 90의 복합 프로모터 카세트 각각의 활성이 평가되고, 가장 활성이 좋은 3 내지 5 의 서열 인자 복합체가 선별되었다. 여기에서, 가장 활성이 좋다는 것은 타겟 세포에서 강력한 프로모터 활성을 가지고 비타겟 세포에서는 활성이 없다는 측면에 의한 것이다. 신경전구세포 및 신경세포를 포함하는 비타겟 세포 집단이 서열 인자 복합체를 포함하는 선별된 프로모터 카세트가 정말로 타겟 신경아세포종 세포에 선별적인지를 확인하기 위한 스크리닝에 이용된다.

선별된 신경아세포종-특이적 프로모터 카세트는 타겟 세포와 비타겟 세포 모두에서 본래의 염색질 또는 염색질 유사 환경에서의 활성을 추가적으로 테스트하기 위하여, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터와 같은 벡터에 클론될 수 있다. 이 때 벡터는 상기 벡터에 제한되지 않는다. 가장 활성이 좋은 하나의 카세트는 동물 실험에 따라 신경아세포종 암 유전자 치료 또는 종양 바이러스 치료 약물의 후보물질을 개발하기 위한 다양한 벡터 시스템에 이용될 수 있다.

본 발명은 복합 프로모터 카세트를 제조 및 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, (ⅰ) 서로 다른 전사 조절자에 의해 인식되는 멀티 서열 인자들을 포함하며 무작위적으로 복합된 전사 조절 인자들의 라이브러리를 설계하는 단계; (ⅱ) 벡터에서 리포터 유전자가 뒤에 연결된 최소 프로모터의 상류에 복합 전사 조절 인자를 삽입하는 단계; 및 (ⅲ) 리포터 유전자의 업스트림 서열에 선별된 프로모터 카세트를 포함하는 특이적 세포에서 리포터 유전자의 가장 높은 수준의 발현을 스크리닝하는 단계를 포함한다.

서로 다른 전사 조절자에 의해 인식되는 멀티 서열 인자들을 포함하며 무작위적으로 복합된 전사 조절 인자들의 라이브러리는 연결 반응 조건 하에서 서로 다른 전사 조절 인자를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 함께 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오타이드의 말단에는 연결 반응을 수행하기에 앞서 돌출 말단을 생성하기 위하여 제한효소(restriction endonuclease)에 의하여 블런트(blunt) 또는 절단될 수 있는 플랭킹 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일양태로서, 리포터 유전자는 lacZ 일 수 있고, 리포터 유전자 발현은 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter, FACS)에 의하여 스크리닝될 수 있다.

또한, 상기 방법에서, 세포 타입-특이적 전사 조절자에 의하여 인식되는 DNA 서열 인자는 특이적 타겟 세포에서 발현되는 전사 조절자들의 DNA 마이크로어레이 프로파일링에 의하여 얻어질 수 있다.

상기 방법에서, 특이적 세포 타입은 암종(carcinoma), 육종(sarcoma), 흑색종(melanoma), 및 특히 신경아세포종(neuroblastoma)과 같은 암 세포일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기재된 복합 전사 조절 인자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 일과성(transiently)으로 발현된 또는 숙주세포 게놈에 통합(integrated)될 수 있는 벡터일 수 있다.

본 발명의 숙주세포는 대장균(E.coli)과 같은 원핵 세포 또는 식물, 곤충, 포유동물 및 인간과 같은 진핵 기원의 세포를 포함한다.

이상의 또는 그 외 본 발명과 관련된 사항은 다음과 같은 이하의 설명, 첨부한 참고 도면 및 첨부한 청구항에 의하여 보다 완전히 이해될 수 있다

본 발명에서 사용한 용어, "전사 조절 인자"란 전사 조절자에 의하여 인식되는 뉴클레오타이드 서열을 말하며, "시스-액팅 서열" 또는 "시스-액팅 서열 인자" 또는 "시스-액팅 부위"와 같은 의미로 사용된다.

용어, "복합 전사 조절 인자"란, 하나 이상의 전사 조절 인자를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 말한다. 복합 전사 조절 인자는 다양한 이중 가닥 전사 조절 인 자의 무작위적인 연결에 의하여 만들어질 수 있다. 임의적으로, 복합 서열 인자는 무작위적인 연결 반응에 이용되기 전에 시계열 엑소뉴클레아제(time-course exonuclease)에 의해 절단되기 위하여, 이중 가닥 DNA 분자의 영향 하에 조절받을 수 있는 스페이서 영역(spacer region) 및 그 정도 길이의 스페이서 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

용어, "올리고뉴클레오타이드"란 기능적으로 시스-액팅 영역 및 어쩌면 약 25 또는 그 이하의 외래 뉴클레오타이드까지를 포함하는 서열을 말한다. 따라서, 용어 "올리고뉴클레오타이드" 에 포함될 수 있는 뉴클레오타이드의 수는 정해진 것이 아니고, 어떤 특정 수의 뉴클레오타이드에 제한되지 않는다.

용어, "프로모터 카세트" 또는 "합성 프로모터 카세트"는 유전자의 효율적인 전사를 위한 구성요소들을 포함하는 DNA 조각을 말하며, 하나 또는 그 이상의 전사 조절 인자, 최소 프로모터 영역, 5'-비해독 영역 또는 인트론 서열을 포함할 수 있다.

용어, "최소 프로모터 영역" 또는 "최소 프로모터"란 그 자체로는 활성이 없으나 다른 전사 조절 인자와 복합되었을 때 강력한 전사를 매개할 수 있는 짧은 DNA 서열을 말한다. 최소 프로모터 서열은 원핵 또는 진핵 유전자를 포함하는 다양한 다른 근원에서 비롯된다. 그 예로서, 도파민 베타-하이드록실라아제 유전자 최소 프로모터 및 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 즉시 초기 유전자 최소 프로모터가 있다.

용어, "복합 프로모터 카세트" 또는 "합성 복합된 프로모터 카세트"는 전사 조절 인자들을 포함하는 프로모터 카세트를 말한다.

용어, "전사 조절자"란 시스-액팅 영역에 결합하는 단백질을 포함하는 모든 요소들을 말하며, 유전자의 발현을 양성적 또는 음성적으로 조절한다. 전사 인자 또는 억제인자 또는 공동-활성인자 또는 공동-억제인자가 모두 이에 포함된다.

전사 조절 발현 프로파일링

전사 조절 발현 프로파일링은 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 어떤 전사 인자가 관심 있는 세포 타입에 존재하는지, 및 어떤 시스-영역이 전사 인자 또는 억제 인자와 결합하는 부위인지를 결정하는 방법은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 하나의 양태로서, DNA 마이크로어레이에 기초한 전사 인자 발현 프로파일링은 합성 프로모터 카세트를 디자인하는데 이용될 수 있다. 진핵 유전자 전사는 활성 인자, 억제 인자, 공동 활성 인자 및 공동 억제 인자를 포함하는 멀티 단백질 조절자들의 병용효과를 포함하는 복잡한 생화학적 과정이다(7, 15, 29, 35). 따라서, 다른 세포 타입에서 이용가능한 이들 단백질들의 정확한 프로파일을 아는 것은, 이들 단백질의 다른 복합체들이 어떻게 이들 세포에서 유전자 전사를 매개하지를 이해하는데 많은 도움을 준다.

본 발명에서, 발현 프로파일링은 직접 또는 간접적으로 유전자 전사에 관여하는 전사 조절자 및 다른 단백질을 코딩하는 1500 개의 다른 유전자에 대한 올리고뉴클레오타이드가 스팟된 상업적으로 이용가능한 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하여, 세 가지의 신경아세포종 세포 타입에서 수행되었다. 그 결과는 다양한 세포 타입-특이적으로 발현된 전사 조절자들을 보여준다. 몇몇의 발전적으로 조절된 전사 조절자들의 발현 패턴은 학계에 보고된 이전의 결과들과 가깝게 들어맞는다. 이것은 마이크로어레이 분석이 상대적으로 낮은 수준에서 발현된 전사체를 탐지하기에 충분할 정도로 민감함을 보여준다. 이러한 마이크로어레이 분석 데이터를 토대로, 신경아세포종 세포에서 특이적으로 발현되는 전사 인자들을 결정할 수 있다.

그 다음에, 이러한 신경아세포종-특이적인 전사 조절자들의 시스-액팅 서열 인자들은 전사 인자들을 확인하기 위하여, 공개된 보고서 및 시스-액팅 서열이 열거된 다른 출처들을 사용하여 결정할 수 있고, 이들 타겟 세포에서 선별적으로유전자 전사를 타겟팅할 수 있는 합성 프로모터 카세트의 설계를 위해 사용될 수 있다.

전사 조절자 및 관련된 단백질들을 위한 발현 프로파일링은 많은 다른 세포 타입에서 수행될 수 있고, 데이터베이스가 생성될 수 있다. 이러한 데이터베이스(Transcription Regulator Expression Profile의 약어로서 TREP 데이터베이스라고 불림)는 다양한 조직-특이적인 발현 수준에서의 세포 타입 또는 구성적으로(constitutively) 발현된 전사 조절자 및 관련된 단백질들 간의 차이점에 대한 상세한 정보를 포함한다. 발현 프로파일의 일반화된 패턴은 다른 그룹의 세포에서부터 추론될 수 있다. 따라서, 데어터베이스는 이들 단백질들의 서로 다른 복합체들이 어떻게 정상정인 발생 과정 및 종양성 형질전환시에 세포 타입-특이적 유전자 발현에 사용될 수 있는지를 이해하는데 도움을 준다. 동시에, TREP 데이터베이스는 전이유전자의 타겟 세포-특이적 및/또는 약학적으로-유도가능한 발현에 사용될 수 있는 프로모터 카세트의 설계 및 합성을 위한 수단이 될 수 있다.

확인된 전사조절자에 대한 시스-액팅 서열이 어디에 있는지를 알 수 없는 상황에서, 그러한 DNA 서열 인자는 실험적으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 랜덤 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 집단은 결합 반응 조건 하에서 정제된 전사 조절자들과 혼합될 수 있고, 그 어떤 올리고뉴클레오타이드와의 결합이든지 전통적인 방법을 통해 분석할 수 있다. 결합된 올리고뉴클레오타이드는 시스-액팅 영역의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 시퀀싱될 수 있다.

랜덤 서열 인자 복합체 라이브러리의 설계

일단 주어진 세포 타입의 전사 조절자 및 관련된 단백질의 발현 프로파일이 파악되면, 합성 복합된 전사 조절 인자들은 타겟 세포에 특이적으로 발현하는 전사 조절자들에 대한 시스-액팅 서열과 복합됨으로서 만들어질 수 있다. 프로모터를 강력하게 하기 위하여, 일반적으로 발현되는 몇몇 전사인자에 대한 시스-액팅 서열도 또한 설계에 포함시킬 수 있다. 전사의 최대 효율성은 타겟 세포에서 일반적으로 발현되는 전사인자들에 대한, 복합 전사 카세트에 포함된 시스-액팅 서열로부터 얻어진다. 다른 한편으로, 타겟 세포의 특이성은 타겟 세포에서 특이적으로 발현되는 전사 인자에 결합하는 카세트에 포함된 시스-액팅 서열에 의하여 결정된다. 타겟 세포에서 이러한 전사 인자들의 공동 활성인자의 능력도 시스-액팅 서열을 선별할 때 고려될 수 있다.

이러한 복합 전사 조절 인자들은 적절하게 조립되었을 때, 특정 타겟 세포에서 발현되는 멀티 전사 조절자와 결합하고 전이유전자의 발현을 조절한다. 상기와 같은 복합 전사 조절 인자들은 비타겟 세포에서는 서열 인자가 결합하는 특정한 전사 조절자가 없기 때문에 활성이 없다.

복사 전사 조절 인자들은 비타겟 세포에서만 발현하는 전사 억제 인자에 결합하는 서열 인자들을 더욱 포함할 수 있고, 또한 이것은 전이유전자 발현에 대한 타겟 세포의 특이성을 강화시킨다. 억제 인자 단백질에 결합하는 프로모터 카세트에 포함된 시스-액팅 서열의 존재는 억제 인자 단백질이 높은 수준으로 발현하는 비타겟 세포에서 전사의 억제를 효과적으로 일으킨다. 반면, 타겟 세포에서는 그러한 전사 단백질이 발현되지 않기 때문에 효과가 없다. 따라서, 유전자 전사의 조합적 특징은 타겟세포 대 비타겟 세포에서 발현되는 전사 조절자 및 공동 조절자의 정확한 프로파일을 파악함으로써 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

유전자의 효율적인 전사에는 특정 유전자의 프로모터/인핸서 영역에 조립되는 전사 인자 및 공동 인자의 조합적 상호작용이 필요하다 (15,16,29). 유전자의 프로모터/인핸서 영역에 있는 시스-액팅 서열 인자에 결합하는 전사 인자들은 특정한 공간 긴축의 순서에 따라 배열된다. 합성 유전자 프로모터 카세트로부터의 가장 효율적인 전사는 오직 서열 인자에 결합하는 서로 다른 전사 인자가 적당한 공간을 가지고 특이한 순서에 따라 배열될 때 달성된다. 이론적으로, 10 개의 서로 다른 시스-액팅 서열 인자에 대해서, 각 인자가 10 서열 인자 길이의 조합에 한 번씩만 사용된다고 가정하면 3 백만 가지 이상의 배열이 나올 가능성이 있다. 따라서, 전통적 방법을 사용하여 수행하면, 멀티 전사 인자를 만들기 위한 서열 인자들의 최적의 배열을 결정하기 위해서는 이러한 모든 가능한 조합을 시행하고 테스트해보아야 한다.

이러한 제한은 본 발명의 방법에 의하여 극복될 수 있는데, 본 발명의 방법은 시스-액팅 서열 인자 복합체의 라이브러리를 제조하기 위해 무작위적인 연결 반응을 수행하는 하는 단계; 타겟 세포에서 유세포 분석기(FACS)를 사용한 방향성 진화(directed evolution) 기술을 통해 가장 활성이 좋은 약 90 의 복합체를 선별하기 위하여 라이브러리를 프리-스크리닝하는 단계; 및 최종적으로 3 내지 5 의 후보자를 선별하기 위하여 타겟 세포와 비타겟 세포 모두에서 96-웰 플레이트와 같은 일과성(transient) 트랜스펙션 분석을 통해 프리-스크리닝 또는 예비 선별된 서열 인자 복합체를 스크리닝하는 단계를 포함한다.

무작위적인 연결 반응 동안, 타겟세포에서 강력하고 선별적인 전사 활성을 가지는 최적의 배열을 가지는 서열 인자 복합체를 높은 가능성으로 포함하는 서열인자들의 수백만 개의 복합체들이 생성될 수 있다.

FACS 에 기초한 방향성 진화( directed evolution ) 기술을 이용한 라이브러리의 프리 -스크리닝

본 발명의 하나의 양태는, 황 등(20)이 제시한 FACS-기초 방향성 진화 기술을 적용한 프리-스크리닝 방법에 관한 것으로, 그 내용은 FACS 를 사용한 프로토콜이라는 점에서 참고 문헌 전체에 의해 구체화된다.

황 등(20)은 FACS에 기초한 방법이 랜덤 DNA 서열로부터 근육 특이적 전사 인자인 MyoD 의 기능적인 인핸서/프로모터 부위를 선별하는데 적용될 수 있다고 보고한 바 있다. 근육 특이적 최소 프로모터를 포함하는 랜덤 뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드는 베타-갈락토시다아제 유전자의 상류에 클론된다. 생성된 플라스미드 라이브러리는 Myo-D 발현 벡터와 함께 NIH 3T3 세포에 공동-트랜스펙션된다. 베타-갈락토시다아제가 높은 수준으로 발현된 세포는 FACS 에 의하여 선별되고, 리포터 유전자가 낮은 수준 내지 중간 수준으로 발현된 세포들의 대부분은 제거된다. 따라서, 분류된 세포들 (최초 집단의 약 5 %) 은 MyoD 가 서열 인자에 높은 친화력으로 결합하도록 매개하는 전사 활성의 수준이 높은 플라스미드를 포함한다. 플라스미드는 이러한 선별된 세포들로부터 허트 프로토콜(19)에 의하여 추출되고, 증폭되고, 트랜스팩션 및 FACS 에 의해 분류된 세포에 다시 사용되며, 상기와 같이 DNA 추출 및 증폭, 트랜스펙션 및 분류의 동일한 과정은 반복된다. 이러한 분류 및 증폭이 3 회 반복된 후, 세포 집단은 리포터 유전자의 발현을 높은 수준으로 매개하는 플라스미드가 트랜스펙션된 세포들을 많이 함유하게 된다. 이러한 방향적 진화 프로토콜에 의한 선별 프레셔(selection pressure)는 베타-갈락토시다아제 리포터 유전자를 활성화하기 위하여 MyoD 를 랜덤 서열에 결합하는 효율성을 나타낸다. 이러한 연구법은 FACS 세포당 5 베타-갈 분자 정도의 적은 분자를 탐지할 수 있고(44) 시간당 약 백만개의 세포를 분류할 수 있다. 형광-활성화된 세포 분석 과정 및 E. coli LacZ 리포터 유전자로 트랜스펙션된 후 베타-갈락토시다아제 활성을 토대로 한 살아있는 포유동물 세포의 분류는 잘 확립되어 있다 (12, 44).

본 발명에서는 황 등(20)이 제안한 FACS-기초 선별 프로토콜의 기본 콘셉을 변형하여, 리포터 유전자 발현이 멀티 서열 인자의 무작위적 복합체에 의해 조정되도록 하였다. 이 경우, 단일 인자가 랜덤 뉴클레오타이드에 결합하는 것보다는 멀티 전사 인자가 랜덤 복합 서열 인자에 결합하는 조합의 인풋(input)이 리포터 유전자 발현의 효율성을 결정한다. 이러한 연구법의 큰 특징 중 하나는 관련된 모든 조절자 및 공동 조절자가 존재하는 타겟 세포에서 실시간으로 서열 복합체를 선별할 수 있다는 것이다. 이 프로토콜은 타겟 세포에서 낮은 수준 내지는 중간 수준의 전사 활성을 가지는 복합체 대다수를 신속히 제거하려는 목적 하에, 시스-액팅 서열 인자 복합체의 라이브러리를 프리 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 약 90 의 가장 적합한 서열 복합체가, 96-웰 포맷에서 타겟 세포 및 비타겟 세포 모두에 트랜스펙션/감염에 의한 보다 철저한 스크리닝이 용이하도록 선별된다. 각 세포 타입은 96-웰 플레이트에 심어지고, 양성 또는 음성 대조군 벡터와 함께 90 의 선별된 클론들이 트랜스펙션/감염된다. 타겟 세포에서의 일과성(transient) 트랜스펙션/감염 스크리닝은 약 90개의 선별된 클론들이 그 프로모터 활성의 강력함 정도에 따라 평가되도록 한다. 또한, 세포 타입-특이적 프로모터 카세트가 적합하다면, 이러한 클론들의 스크리닝은 비타겟 세포에서 탐지 활성이 부족한 모든 클론들을 제거하기 위하여 비타겟 세포에서도 사용될 수 있다. 선별된 서열 복합체가 타겟 세포에 대해 진정으로 선별적인 것인지를 확인하기 위하여 많은 비타겟 세포 타입(개별 세포 및 세포주 모두)이 선별과정에서 테스트될 수 있다. 3 내지 5 의 최적의 복합 프로모터 카세트가 선별될 수 있고 바이러스 벡터에 클로닝된 후 추가적으로 테스트될 수 있다.

합성 복합된 프로모터 카세트를 제조하기 위한 본 발명의 방법은 실질적으로 모든 세포에 대하여 적용될 수 있고, 바람직하게는 암세포에 적용될 수 있다. 공중이 이용가능한 웹-기초 데이트베이스 및 전세계 유전자 치료 임상 시험에 관한 Journal of Gene Medicine(2004년 1월 31일 업데이트) 에 의하면, 전세계적으로 918 건의 유전자 치료 임상 시험이 진행중이다. 임상 유전자 치료 시험의 가장 많은 경우는 암에 관한 것으로서, 66 % (608 건)을 차지한다. 이러한 시험 중 약 190 건은 자살 유전자 또는 종양 억제 유전자를 사용한다. 이러한 시험들은 환자의 정상 세포에는 영향이 없이 암 세포만을 효과적이고 선별적으로 죽이는 치료 유전자 산물의 능력에 의존한다. 본 발명의 방법은 이러하나 암 유전자 치료 시험의 효율성을 높이기 위하여 특이적으로 설계된 합성 프로모터를 제조하는 데 사용될 수 있다.

신경아세포종 세포-특이적 전사 조절자

본 발명이 모든 세포 타입에 적용될 수 있지만, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 타겟 세포로서 신경아제포종(neuroblastoma)을 사용하였다. 따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 신경아세포종 암 세포-특이적이니 합성 복합된 프로모터 카세트를 제공한다. 신경아세포종은 유년기 초기에 발생하는 가장 일반적인 고형 암 중의 하나로서, 부신 수질 또는 교감 신경계의 다른 부위에서 발생한다. 매년 약 650 가지의 새로운 신경아세포종이 보고된다. 신경세포아종은 자연퇴행(spontaneous regression) 에서부터 빠른 암 전이 및 사망에 이르기까지 다양한 임상 증상을 나타낸다 (54). 비록 낮은 단계의 암은 종종 외과적 수술에 의하여 성공적으로 치료되기도 하지만, 높은 단계의 종양 신경아세포종은 다양하고 강력한 치료를 받은 소아 청소년에게도 매우 공격적이고 치명적이다 (42). 따라서, 높은 단계의 신경아세포종 환자에게는 유전자 치료 또는 종양 바이러스와 같은 진전된 치료가 절실하다.

다기능 신경능세포(neural crest cell)는 정상적인 배아 또는 후기-배아 발달 과정동안 다양한 신경 및 신경내분비 세포 타입으로 분화된다. 그 결과, 신경아세포 종양은 다양한 세포 표현형을 포함하는 다기능 신경능세포에서 비롯된다. 신경아세포 초기 종양 또는 골수 전이로부터 많은 세포주들이 확립되었고, 그러한 세포주들이 분자생물학 및 세포생물학의 다른 분야에서 광범위하게 이용되었다. 신경아세포종 세포주에 존재하는 세 가지의 세포 타입에 대한 장기 연구가 보고되었다 : I-타입 줄기 세포(I-type stem cell), N-타입 신경아-신경내분비 전구세포(N-type neuroblastic-neuroendocrine precursor), 및 S-타입 슈반-멜라노블라스트 전구 세포(S-type Schwannian-melanoblastic precursor)이 그것이다 (49). I-타입 줄기 세포는 N- 또는 S- 타입 세포보다 훨씬 악성이다. 광범위한 유전적 및 조직 병리학적 연구에 의해 인간 신경아세포종 종양에서 세 가지 유사한 타입의 세포들이 밝혀졌다 (33). I-타입 줄기 게포로 추정되는 세포가 종양의 모든 단계에 존재한다. 종양은 분화의 다양한 단계에서 N-타입 신경아세포종 세포를 포함한다. 신경아세포종 세포의 이러한 세 가지 타입은 신경아세포종 세포-특이적인 합성 복합된 프로모터 카세트를 설계하기 위한 타겟 세포로 이용된다: I-타입 : SK-N-BE(2)-C 세포; N-타입 : SH-SY5Y 세포; S-타입 : SH-EP1 세포.

세 가지 세포 타입에서 효율적으로 유전자 발현을 조절할 수 있는 복합 프로모터 카세트의 합성이 수행되었다. 이러하나 세포주에서의 선별에 기초하여 제조된 복합 프로모터 카세트는 동물의 생체 내(in vivo) 실험 또는 임상 시험에서도 동일하게 작용할 가능성이 높다.

일과성(transient) 트랜스펙션 분석에 의해 선별된 3 내지 5 개의 신경아세포종-특이적 복합 프로모터 카세트는 바이러스 발현 벡터에 삽입된 후에 추가적인 테스트를 거친다. 진핵 게놈은 복잡한 염색질 구조로 패키징되고, 히스톤 아세틸트렌스퍼라아제 및 ATP-의존성 염색질 리모델링 인자와 같은 단백질에 의하여 염색질 구조가 재구성되는 것이 전사의 용이성을 위해 필요하다는 것이 보고되었다 (13, 53). 레트로바이러스 벡터는 뉴클레오솜-유사 구조에 있는 바이러스 기본 단백질과 함께 적어도 감염 초기 단계 동안 숙주 게놈 및 아데노바이러스 게놈 복합체에 안정적으로 통합된다 (45). 따라서, 인 비트로(in vitro) 연구에서 선별된 합성 복합된 프로모터 카세트를 갖춘 재조합 레트로바이러스 및 아데노바이러스 lacZ 발현 벡터는 타겟 세포 및 비타겟 세포에서 발현의 특이성 및 효율성을 확인하기 위하여 동물 실험에서 테스트를 거친다. 예를 들어, 자살 유전자 또는 세포독성 유전자의 신경아세포종 암 세포-특이적인 발현을 보는 암 유전자 치료 시험, 또는 신경아세포종-특이적인 종양 바이러스 치료 시험이 이용될 수 있다

본 발명의 또 다른 양태로서, 다른 암 타입을 타겟팅하는 합성 복합된 프로모터 카세트의 제조는 최적화될 수 있다. 프로토콜은 최적화되어 FACS-기초 프리-스크리닝 과정이 초기세포(primary cell)를 사용하여 수행될 수 있다. 이것은 스크리닝 과정에 사용되기에 적당한 확립된 세포주가 없이도 암 종류에 기술의 적용을 가능하게 한다. 초기 암 세포는 국립 암센터의 Cooperative Human Tissue Network 을 통해 얻은 신선한 조직 샘플로부터 준비될 수 있다. 서열 복합체 라이브러리의 프리-스크리닝을 위한 FACS-기초 과정의 성공적인 적용은 타겟 세포의 트랜스펙션의 효율성에 크게 좌우된다. 일반적으로, 리피드- 또는 칼슘 포스페이트-기초 트랜스펙션 방법은 초기 세포에서 트랜스펙션 효율성이 25 % 이하이다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 렌티바이러스-기초 및/또는 전기천공법-기초 유전자 전이 방법이 트랜스펙션 효율을 높이기 위하여 고안되었다. 렌티바이러스 벡터시스템의 잇점은 휴지기 또는 성장 정지기에도 더 높은 수준으로 세포 형질도입을 일으킨다는 것이다. 프로모터가 없는 렌티바이러스 벡터 시스템은 상업적으로 이용가능하다 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 이러한 시스템을 사용하여, 베타-갈락토시다아제 유전자 발현을 조절하는 서열 인자의 복합체를 포함하는 렌티바이러스 벡터 라이브러리가 비교적 짧은 시간 동안 초기 세포에 형질도입되기 위하여 제조되고 패키징될 수 있다. 전기천공법은 비교적 높은 효율성으로 초기 세포를 트랜스펙션하는 또다른 방법이다.

벡터 기술을 최적화 및 단순화(streamlining)하는 본 발명의 또다른 방법은 다양한 세포 타입에서 수집된 데이터에 의한 TREP (Transcription Regulator Expresstion Profile)를 확장시킬 수 있다. 충분히 많은 수의 세포 타입에 대한 데이터베이스가 완성되었을 때, 전사 조절자 발현의 일반적인 패턴이 각 특정 세포 그룹으로부터 추론될 수 있고, 더욱 예측가능한 방법으로 수행하도록 제안된 프로토콜의 일부를 설계하는데 도움을 줄 수 있다. 다른 관련된 정보, 예컨대 각 FACS-기초 선별 실험으로부터 예비 선별된 약 90 개의 랜덤 복합 프로모터 카세트의 뉴클레오타이드 서열 및 타겟 세포와 비타겟 세포에서 일과성 트랜스펙션 분석에 의해 확인된 프로모터 활성과 같은 정보 역시 데이터베이스에 포함된다. 이러한 기술은 다양한 세포 타입을 타겟팅하는 합성 복합된 프로모터 카세트에 적용되므로, 데이터베이스는 특정한 세포 타입의 전사조절자 그룹 또는 다른 복합체의 작용에 대한 정보들을 축적한다. 길게 보면, 데이터베이스는 분석을 수행하기 이전이라도 설계자가 어떤 전사 인자 복합체의 결과를 예측하는 것을 가능하게 하므로, 더욱 정확하고 효과적으로 합성 프로모터 카세트를 설계할 수 있게 한다.

본 발명은 구체적인 실시예에서 보여준 특정 실시예의 범위에 제한되지 않는다. 실제로, 여기에 기재된 것에 추가적으로 본 발명의 기재 및 첨부한 도면엘 바탕으로 당업자가 명백히 알 수 있는 다양한 변형이 가능할 것이다. 그러한 변형은 첨부한 청구항의 범위에서 제외하였다. 이하의 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 전사 조절 인자들이 무작위적으로 서로 연결되고 리포터 유전자(lacZ)가 뒤에 연결된 최소 프로모터(D 96)의 상류에 클론된 벡터 시스템을 나타낸 것이다.

실시예 1. 신경아세포종 세포에서 전사조절자 및 관련된 단백질의 마이크로어레이 발현 프로파일링

1.1. 실험 준비

1.1.1.세포 배양 및 전체 RNA 분리

SH-EP1, SH-SY5Y, 및 SK-N-BE(2)-C 신경아세포종 세포를 D-10 배지에서 배양하였다. 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 리터 당 4.5 g 의 포도당, 열 불활성화된 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum), 0.03 % 글루타메이트, 100 unit/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 배지를 이용하였다. 세포는 95 % 의 습도, 5 %의 이산화탄소, 37 ℃의 배양기에 유지시켰다. 전체 RNA는 T150 조직 배양 플라스크에 80-85 % 의 컨플루언스로 생장시킨 세포에서부터 RNeasy Midi Kit (Qiagen)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 추출하였으며, 알리쿼트(aliquot)는 -80℃에서 보관하였다.

1.1.2. 마이크로어레이 분석

전사 조절자 및 관련된 단백질의 발현 프로파일은 Geneka Biotechnology, Inc.에서 제조한 PROM (Proteomic Regulatory Oligonucliotides Microarrray) 칩을 사용하여 SH-EP1, SH-SY5Y, 및 SK-N-BE(2)-C 신경아세포종 세포로부터 얻었다. 칩은 유전자 전사에 관련된 전사 인자, 공동 인자, DNA-결합 단백질 및 기타 단백질에 대한 1500 개 유전자로부터 복제된 35-45 염기쌍의 올리고뉴클레오타이드 스팟을 포함한다. cDNA 합성 및 형광 염색에 의한 라벨링, 마이크로어레이 혼성화, 마이크로어레이 스캐닝, 및 데이터 분석은 Geneka Biotechnology, Inc.에서 수행하였 다. 요약하면, 분석은 다른 형광 태그들(Cy5 vs. Cy3)을 사용하여 표지된 신경아세포종 세포 cDNA 및 HeLa 세포 cDNA 의 공동-혼성화(co-hybridizing)에 의해 수행되었으며, 3 가지 서로 다른 신경아세포종 세포 중 1500 유전자의 상대적인 발현 수준을 비교할 수 있었다. 신경아세포종 세포로부터 각 유전자의 상대적인 발현 수준은 HeLa 세포에서의 발현 수준과 대조적인 비율을 나타낸다. 또한, 각 올리고뉴클레오타이드 칩은 외부 대조군으로서 Agamous (식물) 유전자 표지, 내부 대조군으로서 18S rRNA, 베타-엑틴 및 GAPDH 유전자를 포함하며, 이들은 시그날을 표준화하여 사용되었다. 각 신경아세포종 세포주는 복제 슬라이드(duplicate slide)에서 스크리닝되었는데, 첫번째 슬라이드는 Cy5-표지된 신경아세포종 cDNA에 Cy3-표지된 신경아세포종 cDNA이 혼성화된 것이고, 두번째 슬라이드는 Cy3-표지된 신경아세포종 cDNA에 Cy5-표지된 신경아세포종 cDNA가 혼성화된 것이었다.

1.2. 결과 및 논의

PROM 마이크로어레이 분석 결과는 세 가지 신경아세포종 세포 타입에서 상향- 또는 하향 조절된 다양한 유전자를 보여준다. 흥미로운 것은, SH-EP1 세포에서의 NeuroD 유전자 전사체, SH-SY5Y 세포 및 SK-N-BE(2)-C 세포에서의 Phox2b 유전자 전사체의 세포 타입-특이적 발현에 대한 탐지 결과이다. NeuroD 는 기본적인 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 전사 인자 패밀리의 구성요소이며, 신경 전구세포의 분화에 중요한 역할을 한다 (1). 말초신경계의 배 발달 과정에서, NeuroD mRNA 가 유사후분열(postmitotic) 신경 전구세포에서 일과적으로 발현된다 (34). 다른 한편으로, Phox2b는 다른 신경세포 타입의 생존 및 발생을 조절하는 호메오도메인 전사 인자이다 (4, 10). Phox2a 및 Phox2b 는 노르아드레날린에 의해 활성화되는 바이오합성 효소인 도파민 베타-하이드록실라아제 (DBH)을 발현하는 모든 중추 및 말초 뉴런에서 공동 발현된다. 김 등(27)은 DBH 유전자가 5' 프로모터 지역에 이들 호메오도메인 단백질에 대하여 적어도 2개의 시스-액팅 서열을 가진다고 보고하였다. Phox2b 발현이 콜린성 SH-EP1 세포가 아닌, 노르아드레날린성인 SH-SY5Y 세포 및 SK-N-BE(2)-C 세포에서만 나타났기 때문에, 이것은 학계에서 알아낸 것이 무엇인지를 확인시켰다. 세포-특이적인 상향-조절된 전사 인자 및 공동 인자의 다른 예로서, SH-EP1 세포에서의 NPAS1(neuronal basic helix-loop-helix-PAS family member) 및 TBX21 (T-box 단백질), SH-SY5Y 세포에서의 ATF-3, C/EBP-알파, NKκB 및 PIAS3 (protein inhibitor of activated STAT3), SK-N-BE(2)-C 세포에서의 CBP (CREB binding protein), HTLF (T- cell leukemia virus enhancer factor), N-Myc 및 Oct-1 등이 있다. 발적적인 또는 세포 타입-특이적으로 조절되는 유전자 전사체의 이러한 예들을 탐지하는 PROM 마이크로어레이 분석력은, 분석이 상대적으로 낮은 수준에서 발현되는 전사체를 탐지하는 데에도 충분히 민감하다는 것을 나타낸다. 그러나, 합성 프로모터의 설계를 위하여 낮은 수준에서 발현하는 전사 인자 유전자를 선택하는 경우에는, 마이크로어레이 결과를 확인하기 위하여 노던 블랏 분석 또는 젤 유동성 변환 분석이 수행될 수 있다.

PROM 마이크로어레이 데이터는 세 가지 신경아세포종 세포 타입 모두에서 특이적으로 발현되는 Sox, Hox, Pbx, Pax, Egr 및 핵 호르몬 수용체 패밀리의 구성요 소들을 보여준다. 광범위한 연구들은 이러한 전사 인자들이 각종 방법으로 배 발생 및 세포 분화에 관련이 있음을 보여주었다. 다른 일반적으로 발현되는 전사 조절자뿐만 아니라 공동 조절자를 포함하는 이러한 전사 인자들의 복잡한 조합 상호작용은 신경능(neural crest) 발생 동안 세포 운명 결정에 필요한 특이적 유전자 발현을 촉진한다 (31, 52, 57). 신경아세포종 세포에서 상향-조절된 공동 조절자들 일부는 SNWl, N-CoR, NCOA3, 및 HDAC6 을 포함한다. 또한, c-myc의 발현 억제와 관련 있는 것으로 알려져 있는 두 개의 가깝게 관련된 전사 조절인자는 세 가지 신경아세포종 모두에서 하향 조절된다.

10 가지 다른 전사 인자에 대한 시스-액팅 서열 인자는 상기 신경아세포종 세포-특이적인 전사 인자 및 Oct, CREB, AP-I 및 STAT 패밀리 구성원 중에서 선택되며, 무작위적 연결 반응에 사용된다. 신경아세포종 세포-특이적인 하향-조절된 억제 인자도 또한 랜덤 카세트 설계에 포함될 수 있다. 이러한 특정 전사 억제인자는 신경아세포종에서는 발현되지 않으므로, 랜덤 복합체에 포함되는 이들 억제인자 단백질과 결합하기 위한 서열 인자는 신경아세포종에서 프로모터 복합체에 의해 조절되는 전사 수준에 영향을 주지 않는다. 반면, 동일한 억제 인자는 억제 인자 단백질의 발현이 높은 비타겟 세포에서는 전사를 방해하는 효과가 있을 것이다.

라이브러리 복합체에 포함되는 서열 인자는 신경아세포종 세포에서 효과적인 유전자 전사를 위하여 다른 특정 구성원들과 밀접하게 협동함으로써 기능하는 각 상응 전사 인자의 가능성을 고려한 후에 결정된다. Sp-1 결합 서열 인자는 다른 전사 인자들과 상승 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로, Sp-1 결합 서열 인자 역시 반응에 포함될 수 있고, Sp-1 결합 부위는 메틸화로부터 CpG 섬(island)을 보호하는데 필수적이다 (3,40,41).

전사 조절자 및 공동 조절자의 발현 프로파일은 세 가지 관련된 타겟 신경아세포종 세포 타입에서 얻어진다. 데이터는 단일 타겟 세포 타입에서 얻어지는 발현 프로파일과 비교했을 때, 암 세포-특이적이니 프로모터 카세트의 설계 및 구성에 정확하고 의미있는 정보를 제공한다. 그러나, 프로젝트에서 무작위적 연결 반응에 포함되는 전사 인자 또는 억제 인자에 대한 시스-액팅 서열 인자의 정확한 결정은, 더욱 심도있는 연구가 요구된다. 본 연구는 복합되었을 때 타겟 세포에서 효율적이고 선별적인 전사를 위하여 다른 구성요소들과 협력적으로 상호작용을 수행하는, 가장 적합한 후보 서열 인자를 결정하기 위하여 수행되었다.

실시예 2. 전사 인자들의 DNA 마이크로어레이 프로파일링에 기초한 서열 인자의 무작위적 복합체 라이브러리의 설계

선별된 전사인자 각각에 결합하는 보존된 시스-액팅 서열을 포함하는 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 결합(anneal)하였다. 무작위적 연결 반응은 결합된 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 사용하여 수행하였다 (36). 멀티 시스-액팅 서열의 무작위적 신장(extension)의 결과물을 LacZ 리포터 유전자가 뒤에 연결된 인간 도파민 베타-하이드록실라아제(DBH) 최소 프로모터의 업스트림에 서브클론(subclone)하였다. 신경아세포종 세포주를 포함하는 DBH는 신경 능(neural crest)-유래 세포에서 특이적으로 발현하기 때문에, TATA 박스를 포함하는 DBH 최 소 프로모터 (전사 개시 부위로부터 -45 내지 +51) 를 선택하였다. DBH 최소 프로모터는 그 자체로는 불활성 상태이나, 다른 서열 인자들과 조합되면 강력한 세포-특이적 전사를 매개한다 (21).

무작위적 연결 반응에 이용되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 시스-액팅 서열은 시스-액팅 서열 간의 공간 또는 전사 개시 부위로부터의 거리의 중요성을 고려하여 조심스럽게 디자인하였다. 전사 활성을 증가시키키 위하여, 각 조절 인자의 서열 플랭킹 코어 모티프(sequences flanking the core motif)를 신경아세포종 세포에서 특이적으로 발현하는 보존된 유전자로부터 얻었다. 이들 플랭킹 서열은 재조립되었을 때 코어 조절 인자가 DNA 이중 나선의 같은 표면에 나타나는 것으로 결정되었다. Protein Data Bank는 250 이상의 단백질-DNA 복합체 구조를 포함한다 (2). 분자생물학 및 생화학 연구의 결합으로, 이러한 구조는 단백질이 선별적으로 특정 DNA 서열에 결합하는 것에 의한 예증된 다양한 전략을 가지게 되었다. 모든 이용가능한 소스에 의한 정보는 합성 프로모터 카세트에 부가되는 올리고뉴클레오타이드의 정확한 구조를 결정하는 데 이용될 수 있다. 어떤 경우에는, 개별적인 시스-액팅 서열 인자 및 플랭킹 서열을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드가 고정된 비율로 DNA 분자의 끝에서부터 뉴클레오타이드를 제거하는 엑소뉴클레아제 Ⅲ (ExoⅢ)에 의해 치료될 수 있다. 반응 조건은 그러한 DNA 분자가 ExoⅢ 분해 후 연속적으로 플랭킹 서열에서 결실된 1 염기쌍이 회복되도록 설정하였다. 복합 조절 인자를 형성하기 위한 무작위적 연결 반응에 가해지기 전에 ExoⅢ에 의한 개별적인 시스-액팅 서열 인자 DNA 분자의 치료는, 복합 프로모터 카세트에서 시스-액팅 서 열 인자 간 공간의 무작위성을 증가시킨다.

몇몇 발전적으로 조절된 전사 인자의 경우에는, 시스-액팅 서열 인자의 특이성이 패밀리의 구성원에 의존하여 변한다. 그러하나 경우 및 전사 인자에 대한 정확한 일치(consensus) 시스-액팅 서열이 명확하게 알려지지 않은 경우 또는 그러한 서열이 결정되어야 하는 경우에는, 관련된 타겟 인자들의 세포 타입-특이적인 서열은 실험적으로 결정된다. CASTing (cyclic amplification and selection of targets) 프로토콜은 전사 인자의 시스-액팅 서열, 특히 다성분 복합체(multicomponent complex)를 탐지하는 데 이용될 수 있다 (14). 프로토콜에서, 중간에 퇴보된 랜덤 뉴클레오타이드 (15-35 bp) 범위를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 알리쿼트(aliquot)는 타겟 세포에서부터 분리된 핵 추출물과 혼합될 수 있다. 단백질-DNA 복합체는 특정?坪環? 인자에 특이적인 항체를 사용하여 면역침강되고, 결합된 DNA 분자는 PCR 증폭되고, 핵 단백질 결합 및 면역침강의 다른 주기에 다시 사용될 수 있다. 여러번 주기가 반복되면 전사인자에 높은 친화력으로 결합하는 랜덤 뉴클레오타이드가 많아진다. 높은 친화력을 가진 뉴클레오타이드로부터 일지 결합하는 서열을 알아낼 수 있다. 따라서, 이러한 방법을 사용하여 특정 전사 인자가 결정된 시스-액팅 서열은, 다른 상호작용하는 조절자 및 공동 조절자의 존재 하에 생체 내에서 (in vivo) 단백질의 결합 선호도를 더욱 정확하게 반영할 수 있다. 무작위적 연결 반응에 부가되기 전에 이러한 방법을 사용하여 시스-액팅 올리고뉴클레오타이드의 서열을 조심스럽게 결정하는 것은 최적의 프로모ㅌ터 카세트 제조의 가능성을 증가시킨다.

2.1. 실험 과정

2.1.1. 시스 - 액팅 서열 결정을 위한 CASTing

CASTing은 조절자 및 공동 조절자가 상호작용을 하는 관계에 있어서, 정확한 결합 서열이 요구되는 전사 인자를 위해 수행된다. CASTing은 필수적으로 풍크 등(14) 및 라이트 등(58)의 방법에다가 약간의 변형을 가하여 수행된다. 풍크 등 및 라이트 등의 내용은 첨부문헌에 의하여 구체화 되과, 특히 시스-액팅 서열 결정 방법에 있어서 본 발명과 전체로서 관련이 있다. 올리고뉴클레오타이드는 중간에 25 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 양 끝에 각각 3 개의 다른 제한효소 부위 (Sal I-Hind Ⅲ-Xba l-N25-EcoRl-BamHI-Xho I)로 만들어진다. 제한효소 부위를 포함하는 양 끝의 약 25 bp 의 서열 및 스페이서(spacer) 뉴클레오타이드는 PCR 증폭을 위한 전방 및 역방 프라이머를 디자인하는데 이용된다. 올리고뉴클레오타이드는 단독 PCR 프라이머로서 역방 프라이머를 사용하여 30 분동안 Taq DNA 중합효소와 함께 신장(extension)됨으로써 이중 가닥이 만들어진다. 이 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 샘플은 비특이적인 상호작용을 감소시키기 위하여 최종 농도 약 100mM의 NaCl, 10㎍의 초음파처리된 연어 정자 DNA 의 존재 하에 SK-N-BE(2)-C 세포에서 분리된 핵 추출물과 혼합되었다. 단백질-DNA 복합체는 타겟 전사인자에 대한 항체로 코팅된 마그네틱 비드 (Dynal Inc., Great Neckk, NY) 를 이용하여 면역침강하였다. 단백질-DNA 복합체는 자석(magnet)을 이용하여 회수하였고, 0.5 % NP-40을 함유한 PBS 및 0.1 % BSA로 세 번 세척하였다. 복합체는 30 ㎕의 PCR 반응 버퍼로 재 현탁(resuspend)하였고, 전방 및 역방 프라이머를 사용하여 9 주기 동안 증폭시켰다 (100 ℃에서 5분간 변성, Taq를 첨가하고 10분 연장과 함께 94 ℃ 에서 1분, 65 ℃에서 1분, 및 72 ℃ 에서 1분으로 9번 순환). 10 ㎕의 증폭된 샘플은 CASTing 의 다른 주기에 다시 사용되었다. CASTing 가 6번 수행되었고, 결과 DNA 샘플이 플라스미드에 클론되었고, 약 30 개의 다른 클론을 골라 시퀀싱하였고, 일치 서열이 추론되었다.

2.1.2. 시스 - 액팅 서열 올리고뉴클레오타이드의 랜덤 연결

상보적인 뉴클레오타이드 세트에 TREP 프로파일링 DNA 마이크로어레이 분석 결과의 분석으로 선별된 각 전사 인자들의 특이적인 시스-액팅 서열 인자 및 플랭킹 서열을 포함시켰다. 상보적인 뉴클레오타이드 각 세트는 TEN 버퍼 반응(10 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EDTA; 50 mM NaCl)에 의해 결합(anneal)시키고 인산화시켰다. 각 반응은 20 μM의 각 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 1 mM ATP, 및 0.5 U/ml의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제를 포함하여 총 부피 300 ㎕에서 70 ℃, 15분동안 수행되었고, 상온에서 30분 이상 천천히 식혔다. 무작위적 연결 반응을 위하여, 다른 시스-액팅 서열에 대한 같은 molar 의 올리고뉴클레오타이드가 최종 반응 부피 150 ㎕ 에서 200 pmol의 총 올리고뉴클레오타이드 양을 유지하며 사용되었다. 연결은 16 ℃ 에서 T4 DNA 연결효소 20 U 를 사용하여 밤새 수행하였다. 연결 혼합물을 6 % 아크릴아마이드 겔에 걸었고, 75 bp 내지1.0 kbp 사이의 DNA 밴드를 포함하는 겔의 부분이 절단되었다. 2 배 부피의 확산(diffusion) 버퍼에서 겔 조각 을 37 ℃에서 밤새 배양한 후, DNA 절편은 Qiaex II Gel Extraction kit (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 겔 조각으로부터 분리하였다. 정제된 DNA 절편은, 중간에 8 bp의 Asc Ⅰ 제한효소부위를 포함하고 인산화되고 결합(anneal)된 12 bp의 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 150 ㎕ 의 결합 반응 안에서 10 U의 T4 연결효소와 함께 16 ℃에서 밤새 배양하였다. 반응은 Qiaquick Nucleotide Removal kit (Qiagen)를 사용하여 완료하였고, Asc Ⅰ 으로 분해하였고, 베타-갈락토시다아제 리포터 플라스미드(pD96L)의 Asc Ⅰ부위에 연결시켰다. 도 1에 나타난 바와 같이, pD96L 내에서, 베타-갈락토시다아제 리포터 유전자는 45 bp의 프로모터 서열 및 TATA 박스 뿐만 아니라 5' 비해독 영역의 51 bp를 포함하는 도파민 베타-하이드록실라아제 (DBH) 최소 프로모터의 다운스트림에 위치한다. 연결된 클론들을 Qiaquick Nucleotide Removal kit에 의하여 정제하고 electrocompetent E.coli DH10b 균주 안으로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아 세포는 암피실린 (100 ㎍/㎖)이 존재하는 5 ㎖ LB 에 8 시간 동안 심어 두었고, 밤새 200 ㎖ 로 증폭하였다. 플라스미드는 Qiagen Maxi prep 를 사용하여 분리하였다.

실시예 3. 최적의 서열 복합체를 선별하기 위하여 FACS 를 사용한 라이브러리 프리 -스크리닝

타겟 SK-N-BE(2)-C 신경아세포종 세포들을 LacZ 유전자의 업스트림에 클론된 무작위적인 복합 프로모터 카세트를 포함하는 플라스미드 라이브러리로 트랜스펙션하였다. FACS는 베타-갈락토시다아제가 강하게 발현하는 약 3-5 % 의 트랜스펙션된 세포를 선별하기 위하여 사용하였다. 플라스미드는 분류된 세포에스 분리하였고, 증폭한 후 SK-N-BE(2)-C 세포의 트랜스펙션에 다시 사용하였다. 동일한 과정을 3회에서 3회 반복하여 높은 수준으로 리포터 유전자를 발현할 수 있는 플라스미드를 포함하는 세포 집단을 만들었다. 최종 선별 후, 플라스미드를 분리하였고 개별적으로 증폭시키고, 96-웰 일과성 트랜스펙션 분석을 시행하였다. SK-N-BE(2)-C 세포는 전이에 가장 높은 잠재력을 가지고 있어 발전된 단계의 신경아세포종의 유전자 치료에 초기 타겟이 될 수 있기 때문에, 프리-스크리닝을 위해 선택되었다. 이러한 세포는 배지에서 공격적으로 생장하며, 상대적으로 높은 수준의 트랜스펙션 효율성을 가진다. 트랜스펙션 효율성이 90 %에 이를때까지 Metafectene reagent (Biontex; Munich, Germany)를 사용하여 SK-N-BE(2)-C 세포를 얻었다.

3.1. 실험 과정

3.1.1. SK -N- BE (2)-C 세포의 트랜스펙션 및 FACS 에 의한 분류

SK-N-BE(2)-C 신경아세포종 세포는 T75 플라스크의 D-10 배지에서 배양하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 약 1 x 10⁷ 의 SK-N-BE(2)-C 세포를 20 ㎍ 의 플라스미드 DNA 라이브러리 및 50 ㎕의 Metafectene으로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 48시간이 지나고, 세포를 PBS 에서 5 mM EDTA 를 사용하여 배양 플레이트로부터 분리하였고, 분리된 더블릿(doublet) 및 클럼프에 23 게이지의 바늘에 통과시켰다. 세포를 0.2 ㎕ 의 PBS 에 재현탁시키고, Falcon 2085 튜브에 옮겨 37 ℃에서 따뜻 하게 하였다. 피어링 등 (12), 황 등(20), 및 놀란 등(44)이 제시한 방법에 따라 세포의 β-gal 활성에 대한 유세포 측정기 분석을 시행하였다. 요약 하면, H₂O 내에 200 ㎕ 의 2 mM 플루오레세인 (fluorescein) di-β-D-갈락토시드 (FDG; Molecular Probes)에 세포를 더하고, 혼합물을 37 ℃에서 1분간 배양하였다. 배양 마지막에, 10 부피의 차갑게 얼은 PBS를 더하고 세포를 얼음 안에서 20 내지 60 분 유지하였다. 2 mM의 phenylethyl-β-D-thiogalactoside (Molecular Probes)을 넣어 반응을 종결시켰다. 분류하기 전에 propodium iodide (Sigma) 을 5 ㎍/㎕ 로 넣었다. 세포는 FACS 기기에서 4 ℃ 에서 분류되었다. FITC(Fluorescein isothiocyanate)-양성 세포는 3-5 % 수준까지 분류기로부터 모아졌다.

3.1.2. 분류한 세포로부터 플라스미드 회수

분류된 세포로부터, SDS 및 NaCl의 존재 하에 세포성 게놈 DNA의 우선 침전을 통하여 낮은 분자량을 가지는 DNA를 추출하도록 개발된 Hirt 프로토콜(19)에 의하여 플라스미드를 추출하였다. 요약하면, 분류된 세포는 45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, 0.5 % SDS 및 1.6 M 염화 나트륨에서 재현탁하였고, 4 ℃에서 밤새 분해시켰다. 세포성 추출물을 펠렛으로 만들고 두 번의 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 (25:24:1) 및 한 번의 클로로포름으로 DNA를 추출하였다. DNA는 에탄올에 의해 침전시키고 H₂O 50 ㎕에서 재현탁시켰다. 분류된 세포로부터 분리된 플라스미드 DNA는, 높은 형질전환 효율을 갖는 electrocompetent E.coli DH10b 균주에 대하여 사 용하였고, 엠피실린이 첨가된 200 ㎖ LB 에서 밤새 혼합배양하였다. 플라스미드는 Qiagen Maxi kit를 사용하여 분리하였다.

3.1.3. 반복된 분류

트랜스펙션, 분류 및 플라스미드 DNA 분리의 동일한 주기(cycle)가 3회 내지 4회 반복 수행되어 낮은 또는 중간 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 대다수의 클론들을 제거하였다. 높은 수준으로 리포터 유전자 발현을 조절하는 서열 복합체들은 점진적인 선별 과정에서 살아남았다. 선별의 최종 과정 후에, 플라스미드를 분류된 세포에서부터 분리하였고, E. coli 에 형질전환시키고 아가 플레이트(100 ㎍/㎖의 암파실린 포함) 에 플레이트하였다. 플레이트로부터, 90-100 박테리아 형질전환체를 고르고, 밤새 배양하고, 플라스미드 프렙(prep)에 사용하였다. 각 주기에서 FACS 세포 분류 동안 선별의 마지막 및 주기(cycle)의 수(3-4)는 경험적으로 최적화하였고, 마지막 단계 후 약 90-100의 최적의 서열 복합체가 선별과정에서 살아남았다. 선별된 플라스미드는 시퀀싱되고 추가적인 스크리닝에 사용되었다.

실시예 4 . 3 내지 5의 최적 후보물들의 최종 선택을 위한 타겟 또는 비-타겟 세포들 양쪽에서의 96-웰 일과성 트랜스펙션 분석에서의 스크린 예비-선택된 조합들

이러한 방법에서, FACS에 의해 분석된 SK-N-BE(2)-C 세포들에서의 그들의 성능으로 예비-선택된 약 90의 서로 다른 조합된 프로모터 카세트들을 SK-N-BE(2)-C, SH-SY5Y 및 SH-EP1 세포들, 및 다른 비-타겟 세포들에서 일과성 트랜스펙션 어세이에서 각각 시험하였다. 비-타겟 세포들뿐만 아니라 타겟 세포에서 각각 조합된 전사 조절 요소의 성능을 평가하고, 3-5 최고로 평가되는 조합들을 추가적인 분석을 위해 선택하였다. 평가 기준은 타겟 세포 내의 전사 효율 및 비-타겟 세포 내에서의 전사 활성의 부재이다. 분석은 제한 없이 HeLa 세포, HCN-1A 및 HCN-2 인간 피질 신경 세포 (ATCC, Manassas, VA), HNPC 인간 신경 전구체 세포 (Clonexpress, Inc., Gaithersburg, MD), ARPE 인간 홍채 색소 상피 세포(ATCC), 293 인간 신장 세포 (ATCC), HepG2 인간 간세포 종양 세포, 및 PC12 및 NIH 3T3과 같은 다른 비-인간 세포들을 포함하는 다양한 서로 다른 비-타겟 세포들 내에서 수행되었다.

실시예 4.1 - 실험 방법

일과성 트랜스펙션 분석을 위하여, 10,000 내지 30,000 세포들을 트랜스펙션 전에 12 내지 16 시간 동안 적절한 성장 배지 내에서 이중 96-웰 플레이트 상에 플레이트 하였다(plated). 트랜스펙션의 시점에서 세포들이 70 내지 90%의 컨플루언스가 되도록 플레이트하는 밀도를 결정하였다. 또한, 세포들을 메타펙텐, 리포펙타민(인비트로젠), 퓨젠-6(로슈), 및 수퍼펙텐(키아젠) 을 포함하는 서로 다른 상업적으로 이용가능한 트랜스펙션 시약들을 사용하여 예비 시험하였다.

세포들을 DNA 50 내지 200 ng을 사용하여 제조자의 프로토콜을 따라 적절한 트랜스펙션 시약을 사용하여 트랜스펙션하였다. 이후에 세포들을 PBS로 세척하고 트랜스펙션 후 48시간 동안 리포터 용해 완충액(reporter lysis buffer, 프로메가) 50 ㎕를 사용하여 용해시켰고, 베타-갈락토시다제 분석 시스템(프로메가)를 사용하여 β-Gal 활성에 대해 플레이트 상에서 직접 분석하였다. 약 90의 예비-선택된 플라스미드 DNA 샘플들에 추가하여, CMV 인핸서/프로모터-유래된 β-Gal 리포터 플라스미드 및 최소 DBH 프로모터에 의해 유도된 리포터 플라스미드들을 각각 양성 및 음성 대조군으로서 이중 웰 내에 추가하였다.

또한, 522 bp 티로신 하이드록실레이즈 프로모터(50) 유도된 β-Gal 리포터 플라스미드들을 세포 유형-특이성에 대한 대조군으로서 이중 웰 내에서 사용하였다. 서로 다른 세포 유형들이 다양한 전사 효율을 보이기 때문에, 동일한 세포 클론들을 사용한 서로 다른 세포들로부터 기록된 β-Gal 활성은 평가를 위해 직접 비교가능하지 않았다. 따라서, 서로 다른 시스-활성 서열 조합들과 함께 플라스미드 샘플들의 성능을 음성 대조군 웰로부터 수득된 백그라운드 시그널을 뺀 후에 CMV 인핸서/프로모터 유도된 양성 대조군 웰들로부터 수득된 수치에 대한 백분율로서 표현하였다. 최고-평가된 3-5 플라스미드들을 타겟 세포 내에서의 발현 강도 및 비-타겟 세포들 내에서의 발현 부재의 관점에서 선택하였다.

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본 발명에 의한 복합 프로모터 카세트는 신경아세포종 암 유전자 치료 또는 종양 바이러스 치료 약물의 후보물질을 개발하기 위한 다양한 벡터 시스템에 이용될 수 있다.

Claims (24)

1. 전사 강화 복합 프로모터 카세트를 제조 및 스크리닝하는 방법으로서,

   (i) DNA 마이크로어레이 프로파일링을 수행하여, 특이적인 전사 조절자에 의해 인식되는 DNA 서열 인자들을 얻는 단계;

   (ii) 무작위적으로 복합된 전사 조절 인자들의 라이브러리를 설계하는 단계로서, 상기 복합된 전사 조절 인자 각각은 상기 (i) 단계에서 얻은 특이적인 전사 조절자에 의해 인식되는 이중 가닥 DNA 서열 인자들 및 플랭킹(flanking) 서열을 포함하는 것인 단계;

   (iii) 벡터에서 리포터 유전자가 뒤에 연결된 최소 프로모터의 상류에 상기복합된 전사 조절 인자를 삽입하는 단계;

   (iv) 상기 벡터를 숙주 세포에 삽입하는 단계; 및

   (v) 리포터 유전자의 발현이 증가된 세포를 스크리닝하고, 상기 세포에서 복합 프로모터 카세트를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 무작위적으로 복합된 전사 조절 인자들의 라이브러리는 연결 반응 조건 하에서 전사 조절자에 의하여 함께 인식되는 개개의 이중 가닥 DNA 서열 인자들을 혼합함으로써 만들어지는 것인 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 서열 인자는 한쪽 말단 또는 양 말단에 스페이서 뉴클레오타이드(spacer nucleotide)를 포함하는 것인 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자의 발현은 형광-활성화된 세포 분류기(fluorescence-activated cell sorter, FACS)에 의하여 스크리닝되는 것인 방법.
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 lacZ 또는 GFP인 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 숙주세포는 암 세포인 방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 암은 신경아세포종인 방법.
9. 제 1항의 복합 프로모터 카세트를 포함하는 벡터.
10. 제 9항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
11. 제 9항에 있어서, 바이러스인 벡터.
12. 제 9항에 있어서, 일과성으로(transiently) 발현되는 것인 벡터.
13. 제 9항에 있어서, 숙주세포의 게놈에 통합되는(integrated) 것인 벡터.
14. 제 9항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
15. 제 14항에 있어서, 원핵 세포인 숙주세포.
16. 제 14항에 있어서, 진핵 세포인 숙주세포.
17. 제 16항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주세포.
18. 제 17항에 있어서, 인간 세포인 숙주세포.
19. 제 18항에 있어서, 암 세포인 숙주세포.
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