具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实验用动物及饲养
实验动物:8-10周龄、体重在23.5-27.5g,背景为C57BL/6品系的心脏特异性Cre小鼠(α-MHC-Cre(DKK3+/+),购自Jackson Laboratory,货号005650)、心脏特异性DKK3基因敲除小鼠(DKK3-/-,购自RBRC,货号:02847)、心脏特异性DKK3转基因小鼠(DKK3-TG,心脏特异性DKK3转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建)及非转基因小鼠(NTG,同窝对照非转基因小鼠)为实验对象。
心脏特异性DKK3转基因小鼠的构建如下:
转基因载体构建信息:扩增小鼠DKK3全长基因(NCBI, Gene ID:16364, XM_006516560.1),把cDNA连接于α-MHC启动子下游,将序列构造通过显微注射构造成受精胚胎(C57BL/6J背景),得到心脏特异性DKK3-TG小鼠。(上述的转基因小鼠参照下述文献制备:Zhang Y, Liu Y, Zhu XH, Zhang XD, Jiang DS, Bian ZY, Zhang XF et al. Dickkopf-3 attenuates pressure overload-induced cardiac remodelling. Cardiovascular Research 2014; 102(1):35-45.)
饲养环境:所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件:室温在22-24℃之间,湿度在40-70%之间,明暗交替照明时间为12h,自由饮水摄食。
【实施例1】 心肌梗死(MI)模型获得
1. 实验动物分组:雄性C57BL/6背景小鼠(DKK3+/+)、DKK3基因敲除小鼠(DKK3-/-)及心脏特异性DKK3转基因小鼠(DKK3-TG)和非转基因小鼠(NTG),通过结扎小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死(MI)模型。随机分为8组,每组:C57BL/6背景a-MHC-Cre小鼠假手术组(DKK3+/+ Sham)及MI术组(DKK3+/+ MI)、DKK3基因敲除小鼠假手术组(DKK3-/- Sham)及MI术组(DKK3-/- MI)、非转基因小鼠假手术组(NTG Sham)及MI术组(NTG MI)、心脏特异性DKK3转基因小鼠假手术组(DKK3-TG Sham)及MI术组(DKK3-TG MI)。
2. MI模型采用阻断小鼠心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌梗死,模型操作流程:
2.1 称重麻醉备皮:用电子天平于动态模式下准确称取小鼠体重(g),用双蒸水准确配置3%戊巴比妥钠溶液,轻轻摇动使其充分溶解,采用80mg/kg体重剂量,计算所需戊巴比妥钠溶液体积后用1mL注射器准确抽取相应体积溶液,行腹腔注射麻醉小鼠,待小鼠充分麻醉倒(约3min)后,用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发(充分暴露手术区)。
2.2 气管插管:麻醉一定时间(约20-30min)后,夹趾检测无反应即可开始手术。打开外置光源、显微镜开关,打开呼吸机,设置好各参数(呼吸频率100bpm、恒压16-17mmHg),将小鼠门齿用橡皮筋固定在自制斜面上,外置光源照向小鼠颈部,眼科镊拉出小鼠舌头,调节光源亮度及位置,此时可见小鼠声门随呼吸呈开闭运动,声门开启时将气管插管沿声门送入气管,取下小鼠接上呼吸机,观察小鼠呼吸状况,胸廓起伏与呼吸机频率一致表示插管成功,即可进行下步手术,整个手术过程用加热垫维持小鼠体温在37℃左右。
2.3 开胸:小鼠采用右侧卧位,用医用胶带固定好小鼠四肢(左前肢位于右前肢前以充分暴露手术区),用医用碘酊及75%医用酒精对手术区皮肤进行消毒清洁处理,用眼科剪在左前肢下0.5cm处沿肋骨走向剪开皮肤,逐层分离筋膜、肌肉等组织(尽量避开较大血管,若不能避免则先行阻断再剪断血管),用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏,用显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包,充分暴露左冠状动脉前降支(LAD)或所在区域。
2.4 结扎冠状动脉:于显微镜下找到LAD走向或可能所在位置(小鼠LAD走行于左心耳与肺动脉圆锥间,多发出于左心耳下缘处),用无齿持针器持取7-0带针缝合线,于左心耳下缘1mm处进针,肺动脉圆锥旁出针,进针深度0.5mm,宽度为1mm,缝线从LAD下方穿过,稳定5s后,在心脏表面结扎处放置一长度2mm,大小为10号的聚乙烯塑料棒(要求表面光滑,大小为取出棒后结扎线不会压迫血管),后在其上打一活结,轻拉以结扎LAD(力度以能完全阻断LAD血流为准,宁轻勿重),剪去线头,结扎成功,则可见左室前壁明显由鲜红色变为苍白而不再恢复,同时心电图显示sT段抬高和(或)T波高耸或者倒置呈弓背向上单向曲线。6-0缝线完全缝合胸腔开口关闭胸腔,5mL注射器接套管经切口插入胸腔,抽取1mL气体,平整各层肌肉,合拢皮肤切口暂不缝合(Sham组不结扎LAD,直接关胸)。
2.5 关胸:结扎完成后,6-0缝线完全缝合胸腔开口(保证无缝隙、无错位)关闭胸腔,5mL注射器接套管经切口插入胸腔,抽取1mL气体,6-0缝线由内向外逐层缝合各层肌肉,后用5-0缝线将皮肤切口缝合完整。
2.6 术后管理:术后密切关注小鼠状态,有无呼吸异常等。待小鼠自然苏醒后将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管,放入干净的饲养笼,填写手术记录卡片,放回IVC笼架饲养,密切关注小鼠术后状态以及死亡情况并做好相应记录。
小鼠心肌梗死模型建立的过程中Sham组均无死亡小鼠,DKK3+/+ MI组有31只小鼠纳入实验,在术后1周(1W)的时间里死亡16只小鼠;DKK3-/- MI组有54只小鼠纳入实验,术后1周(1W)死亡40只小鼠;NTG MI组有31只小鼠纳入实验,术后1周(1W)死亡15只小鼠;TG MI组有34只小鼠纳入实验,术后1周(1W)死亡13只小鼠。
通过术后各组小鼠生存状况的统计,可以明显发现DKK3-/- MI组小鼠的死亡率明显高于DKK3+/+ MI组小鼠,DKK3-TG MI的死亡率则明显低于NTG MI组。应用软件Graph Pad Prism 5绘制各组小鼠的生存曲线(见图1),结果表明DKK3-/- MI的生存率明显低于DKK3+/+MI组,而Sham组无死亡小鼠,没有明显差异(A);同样DKK3-TG MI的生存率则明显高于NTG MI组(B),说明DKK3-/- MI组小鼠较高的死亡率可能是由于DKK3基因的缺失而引起的。
【实施例2】 小鼠心肌梗死(MI)模型心脏梗死比例、心肌肥厚及纤维化检测
1. 取材
(1)前期工作:预先准备装有20mL的10%甲醛的尿杯,并贴好标签(小鼠编号、组别、手术类型及取材日期)。将倒满10%KCl溶液的培养皿置于取材处。打开分析天平,调零备用,再称重处死小鼠。
(2)取材:眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂,剪下心脏,迅速置于10%KCl溶液中。待心脏停跳在舒张期后,置于灭菌纱布上,轻轻挤压心腔内液体,蘸干表面液体后,称重并记录,将心脏放入相应的尿杯中,固定48h后用于病理学检测。
(3)相关测量及计算:取出小鼠肺脏,修剪后滤纸吸干,称重并记录。剪开小鼠后肢胫骨处皮肤,测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值(HW/BW),肺重与体重的比值(LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值(HW/TL),测定结果见图2。
2. 病理学检测
2.1 制备石蜡标本切片
由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片,主要操作程序包括修剪心脏→包埋框处理→流水冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→摊片→晾干或烘烤后备用。
2.2 苏木精-伊红(HE)染色
主要步骤为:
55℃烘烤30min→二甲苯5min,3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→双蒸水1min→苏木素溶液5min→水洗1min→1%盐酸酒精1-3s→水洗1min→Scott液(碳酸氢钠0.35g,硫酸镁2g,蒸馏水100mL)1min→水洗1min→伊红溶液3-5min→蒸馏水洗去浮色→70%酒精1s→95%酒精1s→100%酒精30s,3次→二甲苯2min,3次→趁二甲苯未干立即封片→通风橱内吹干,显微镜拍照。
心脏梗死比例大小的计算参照公式如下:
梗死比例=心梗区域的左心室心内膜长度/左心室完整心内膜周长×100%;
心肌细胞横截面积统计:每张图片选择3个以上边界清楚,核大致位于中央的细胞,用Image-Pro Plus 6.0软件圈细胞面积。
心脏组织HE染色、梗死比例及心肌细胞横截面积统计结果见图3。
2.3 天狼星红(PSR)染色
主要步骤为:
55℃烘烤30min→二甲苯2min,3次→100%酒精1min→95%酒精1min→70%酒精1min→流水冲洗10min→双蒸水1min→0.2%磷钼酸2min→0.1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上,湿盒中染色90min→去除残液→0.01N盐酸4s→70%酒精1次→90%酒精1次→100%酒精30s,3次→二甲苯2min,3次→趁二甲苯未干立即盖玻片封片,显微镜拍照。
PSR染色图片统计:左室胶原容积分数比例=胶原面积/总面积×100%。
心脏组织天狼星红染色(红色代表胶原)及左室胶原容积分数比例统计柱状图如图4。
HE染色结果可见,Sham组心肌排列整齐、细胞质丰富均匀、间质正常;MI组部分心肌细胞核丢失、心肌细胞呈空泡样变、梗死区可见心肌组织紊乱、梗死区心肌细胞消失,代之以纤维瘢痕组织。
小鼠心身比、肺身比及心胫比的统计柱状图见图2。Sham组中DKK3+/+小鼠和DKK3-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义;DKK3+/+小鼠MI术后1周的HW/BW、LW/BW、HW/TL高于其Sham组;MI术后1周,DKK3-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较DKK3+/+小鼠明显增加(A);MI术后1周DKK3-TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠(B)。
HE染色结果见图3。染色结果可观察到:Sham组均无明显梗死,大体可见MI术后1周(1W)梗死区明显变薄、成白色并形成疤痕,高倍显微镜可观察到Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密,形态完整,胞核及核仁结构清晰;MI组肌丝排列紊乱、松散,心肌细胞体积明显增大,形态不规整,胞核深染、增大、畸形,核仁模糊,且DKK3-/-组较DKK3+/+组更为明显;DKK3-/-小鼠MI术后梗死比例、心肌细胞横截面积均大于其Sham组,同时大于DKK3+/+小鼠MI组,差异有统计学意义(A)。MI术后DKK3-TG小鼠的梗死比例远小于NTG组,MI组较Sham组的心脏均增大,但MI术后DKK3-TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠,同时可观察到:TG小鼠MI术后心肌细胞横截面积大于Sham组,但显著小于NTG小鼠MI组(B)。
PSR染色结果见图4。PSR染色后,MI组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加,胶原增粗,排列紊乱成网络状;且DKK3-/-小鼠MI术后胶原含量比DKK3+/+小鼠MI术后增加更为明显;Sham组之间无统计学差异(A);而DKK3-TG小鼠MI术后心肌间质胶原含量远少于NTG小鼠MI组(B)。
【实施例3】 心肌梗死(MI)模型小鼠心功能检测
1 超声检测心功能
1.1 前期准备
(1)麻醉机准备:先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口,再拧开麻醉机上加药口密封盖,迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门,调整流量控制阀的旋钮,出气压力维持在0.2-0.3mPa。
(2)待测小鼠准备:待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后,左胸前区剃毛,将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内,以1.5-2.0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
1.2心功能检测
小鼠取左侧卧位或仰卧位,并在剃毛区均匀涂抹耦合剂。采用高频超声诊断仪,频率为15MHz,选取标准左心室乳头肌短轴切面,测量小鼠的左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVESd)及短轴缩短率(FS)。
2 PV检测血流动力学
2.1 前期准备
(1)麻醉机准备:同超声检测心功能部分。
(2)待测小鼠准备:待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后,颈部手术区剃毛,并用湿纱布擦拭去毛。将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内,以1.5-2.0%异氟烷以维持麻醉深度,避免麻醉过深或过浅。
2.2 PV检测
碘酒及75%酒精消毒后,剪开小鼠颈部皮肤,依次分离肌肉和软组织,并游离出右颈总动脉,于血管下穿过双线并结扎远心端,同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口(1/3-1/2管径),于体视显微镜下将Millar1.4F超微导管迅速插入右颈总动脉,同时穿一缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结,将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内,连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况,调节导管的位置使波形图清晰且稳定。监测小鼠的心率(HR)、射血分数(EF)、左室内压最大上升速率(dP/dt max)及左室内压最小上升速率(dP/dt min)等指标。
本研究运用M型超声心动图和血流动力学检测评价心肌肥厚和心功能。由Laplace定理可知:S=Pr/2h,P为心室内压,r为心腔内径,h为心壁厚度。在心脏压力负荷过重的情况下,为适应心脏做功增加,室壁厚度增加,左室室壁应力增加,提高心脏收缩功能起到早期代偿的机制;但持续的压力超负荷,可促进心肌肥厚,导致心肌细胞的坏死及凋亡,心脏的收缩和/或舒张功能受到损害,最终发展为慢性心力衰竭甚或心源性猝死。
图5是小鼠的超声检测结果。与DKK3+/+ Sham组相比,DKK3+/+小鼠MI术后1周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDd、LVESd升高,而反应心功能的指标FS则下降。MI术后1周,与DKK3+/+小鼠相比,DKK3-/-小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反应心功能的指标下降的程度更明显(A);而DKK3-TG组小鼠MI后LVEDd、LVESd较NTG组降低,FS较NTG组升高(B);Sham组小鼠的以上指标之间差异甚微,均无统计学差异。
图6是小鼠的PV检测血流动力学结果。通过血流动力学指标的检测,观察到各Sham组HR、EF、dp/dt max和dp/dt min均无明显差异。MI术后1周DKK3+/+小鼠EF、dp/dt max和dp/dt min均比其Sham组降低。DKK3-/-小鼠MI术后EF、dp/dt max和dp/dt min与DKK3+/+小鼠相比则显著降低,差异有统计学意义,HR则无明显差异(A);DKK3-TG小鼠MI术后EF、dp/dt max和dp/dt min降低的程度则小于NTG组,差异有统计学意义,HR则无明显差异(B)。
上述研究成果表明,DKK3基因敲除小鼠在阻断心脏左冠状动脉前降支(LAD)造成心肌缺血中,DKK3基因敲除后小鼠心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化的程度明显增加,而心脏特异性DKK3转基因小鼠的心脏梗死比例、心肌肥厚和纤维化在一定程度上被抑制。证明了DKK3基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病模型中有着重要的保护作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。