TWI601533B - lｎｃＲＮＡ ＡＯＣ４Ｐ供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途 - Google Patents

Description

lncRNA AOC4P供應用於製備一用來治療肝細 胞癌之醫藥品的用途

本發明是有關於使用長非-編碼的RNA(long non-coding RNA,lncRNA)AOC4P來治療癌症。

癌症是現今造成人類死亡的主要原因之一，雖然癌症的形成機轉仍未被完全地瞭解，據信，癌症發生(carcinogenesis)或腫瘤發生(tumorigenesis)可歸因於當細胞蓄積外源性或內生性因素而導致基因變異(genetic abnormalities)時，該等細胞內的信號傳遞途徑會發生錯誤而造成細胞分裂(cell division)失去控制，進而使得該等細胞逐漸形成癌細胞。癌細胞能夠迴避細胞凋亡(apoptosis)並且具有移動(migration)與侵入(invasion)的能力，因此癌細胞會不斷地增生(proliferate)並且會經由淋巴系統(lymphatic system)或血管系統(vascular system)轉移(metastasize)至身體的其他部位。

雖然目前臨床上用於治療癌症的藥物有很多，但是在治療效用上仍不盡理想，主要的原因包括：患者本身的個體差異、抗癌藥物的嚴重副作用(side effect)以及癌細胞的抗藥性(drug resistance)。因此，本領域的相關研究人員皆致力於開發有效並且不會產生非所欲的副作用的藥物來供用於治療癌症。

長非-編碼的RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種大小落在200bp至100kb之間且無法被轉譯成蛋白質的RNA。近年來，在人類的基因體(genome)中，有許多的lncRNA已被發現具有調控腫瘤的效用，例如，可以促進腫瘤發生和/或腫瘤轉移的lncRNA MALAT-1、lncRNA MVIH、lncRNA PANDAR、lncRNA AB073614、lncRNA CCAT2以及lncRNA HOTAIR(Lai M.C.et al.(2012),Med.Oncol.,29：1810-1816；Yuan S.X.et al.(2012),Hepatology,56：2231-2241；Wu Z.H.et al.(2014),Oncol.Rep.,32：395-402；Peng W.and Fan H.(2015),Biomed.Pharmacother.,72：113-118；Cheng Z.et al.(2015),Oncotarget,6：25381-25389；Zhang X.et al.(2015),J.Surg.Oncol.,111：834-839)，以及可以抑制腫瘤發生和/或腫瘤轉移的lncRNA MEG3、lncRNA uc002mbe.2以及lncRNA LET(Zhou Y.et al.(2012),J.Mol.Endocrinol.,48：R45-R53；Yang H. et al.(2013),Biochem.Pharmacol.,85：1761-1769；Yang F.et al.(2013),Mol.Cell.,28：1083-1096)。由於這些可以抑制腫瘤發生和/或腫瘤轉移的lncRNA具有作為抗癌藥物潛力，它們已經成為當今醫藥界關注與研究的重點。

含銅胺氧化酶(copper-containing amine oxidases,AOC)是一種銅依賴性酵素(copper dependent enzyme)，它能夠催化許多不同種類的內生性胺(endogenous amines)的氧化。人類的AOC基因包括下列4種：(1)AOC1基因，其編碼一種二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)，它主要存在腎臟、腸道、以及肺臟中，而其功能主要涉及組織胺(histamine)的代謝；(2)AOC2基因，其編碼一種視網膜-特異性的胺氧化酶(retina-specific amine oxidase,RAO)，它是一具有未知生理功能的膜蛋白(membrane protein)；(3)AOC3基因，其編碼一種半卡肼-敏感的胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase,SSAO)[又被稱為血管黏著蛋白-1(vascular adhesion protein-1,VAP-1)]，它在肺臟、主動脈(aorta)、肝臟以及迴腸(ileum)中被高度地表現，而其功能包括白血球黏著(leukocyte adhesion)以及葡萄糖攝入(glucose uptake)；以及 (4)AOC4基因(又被稱為AOC4P基因)，其被認為是一經截短且無-功能的基因(truncated and non-functional gene)[亦即偽基因(pseudogene)]，它會轉錄成一大小為2073bp的lncRNA AOC4P，其序列被顯示於序列辨識編號：1中(參見NCBI登錄編號NR_002773.1)。

已有研究在探討AOC與癌症之間的關聯性，而這些研究主要是著重於VAP-1。例如，在Marttila-Ichihara F.et al.(2009),Cancer Res.,69：7875-7883中，Marttila-Ichihara F.等人將B16黑色素瘤細胞(B16 melanoma cells)分別注射至VAP-1-缺乏的小鼠(VAP-1-deficient mice)以及野生型小鼠中並觀察腫瘤的生長情形。而實驗結果發現，腫瘤在VAP-1-缺乏的小鼠中的體積增長速度是顯著地低於野生型小鼠所具者。此外，與野生型小鼠相較之下，在VAP-1-缺乏的小鼠中還被觀察到腫瘤血管新生(tumor neoangiogenesis)的缺失以及在Gr-1⁺CD11b⁺骨髓細胞(Gr-1⁺CD11b⁺ myeloid cell)至腫瘤的增補(recruitment)上的減低。而使用EL-4 T-細胞淋巴瘤細胞(EL-4 T-cell lymphoma cells)來進行實驗亦有得到類似的結果。Marttila-Ichihara F.等人進一步使用一表現酵素去活化的VAP-1(enzymatically inactive VAP-1)的基因轉殖小鼠來探討VAP-1的氧化酶活性所扮演的角色。而實驗結果發現，VAP-1的氧化酶活 性對於Gr-1⁺CD11b⁺骨髓細胞的增補、腫瘤血管新生以及腫瘤進展(tumor progression)是必需的。Marttila-Ichihara F.等人認為：抑制VAP-1的氧化酶活性應可達到抑制腫瘤生長的效用。

在Marttila-Ichihara F.et al.(2010),J.Immunol.,184：3164-3173中，Marttila-Ichihara F.等人使用被注射以B16黑色素瘤細胞的小鼠來評估兩種VAP-1酵素抑制劑(亦即SZE5302以及LJP1586)以及兩種抗-VAP-1單株抗體(亦即抗-VAP-1單株抗體7-106以及7-88/3)[它們能夠抑制白血球-內皮交互作用(leukocyte-endothelial interactions)而不會抑制VAP-1的酵素活性]的抗癌效用。而實驗結果發現，SZE5302以及LJP1586皆能夠減緩在腫瘤中的Gr-1⁺CD11b⁺骨髓細胞累積並且阻礙腫瘤發育以及腫瘤血管新生，而抗-VAP-1單株抗體7-106以及7-88/3皆不具有這些效用。另外，使用EL-4 T-細胞淋巴瘤細胞來進行實驗亦有得到類似的結果。因此，VAP-1酵素抑制劑被預期可供用於癌症的治療。

雖然已存在有上述的文獻報導，就申請人所知，迄今尚無任何文獻或專利前案曾經揭示lncRNA AOC4P具有何種生理活性。經研究，申請人意外地發現，lncRNA AOC4P能夠抑制肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)細胞的增生 (proliferation)以及轉移(metastasis)。因此，lncRNA AOC4P被預期可供用於治療癌症。

發明概要

於是，本發明提供lncRNA AOC4P供應用於製備一用來治療癌症之醫藥品的用途。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有癌症的個體的方法，其包括對該個體投藥以lncRNA AOC4P。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的 方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於治療癌症的藥物上，申請人意外地發現到：lncRNA AOC4P具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示lncRNA AOC4P供應用於製備一用來治療癌症之醫藥品的用途。

依據本發明，lncRNA AOC4P已藉由活體外試驗(in vitro test)而被証實可以有效地抑制肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)細胞的增生(proliferation)以及轉移(metastasis)。此外，lncRNA AOC4P已藉由活體內動物試驗(in vivo animal test)而被証實可以有效地抑制肝細胞癌細胞的生長以及轉移。因此，本發明提供一種用於治療癌症的醫藥品，其包含有lncRNA AOC4P。

如本文中所使用的，術語“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性的進展(progression of severity)。

依據本發明，lncRNA AOC4P可以藉由使用下列方法之至少一者而被獲得：化學合成(chemical synthesis)、活體外轉錄(in vitro transcription)以及活體內表現(in vivo expression)。有關這些方法的操作條件的設定是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該癌症是下列的至少一者：肝細胞癌、卵巢癌、口腔癌、結腸直腸癌、肺癌以及乳癌。

依據本發明，該醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)，以及類似之物。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)以及靜脈內注射(intravenous injection)。

在本發明的一個較佳具體例中，該醫藥品被製成適於以皮下注射而被投藥的劑型。

在本發明的另一個較佳具體例中，該醫藥品被製成適於以靜脈內注射而被投藥的劑型。

依據本發明，該醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥品包含有一藥學上可接受的溶劑，並且該溶劑是下列的任一者：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含糖溶液以及含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有癌症的個體的方法，其包括對該個體投藥以lncRNA AOC4P。

依據本發明，lncRNA AOC4P的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的個體之年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的醫藥品的每日投藥劑量通常是40mg/kg體重至80mg/kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥或非經腸道地投藥。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是重組型載體pCDNA3.1-AOC4P的一架構圖，其中Neo^r表示新黴素抗性基因；圖2顯示108位帶有肝細胞癌的病患的lncRNA AOC4P的相對表現位準；圖3顯示J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及J7/AOC4P藉由細胞生長分析在波長450nm下所測得的吸光值(OD₄₅₀)，其中“***”表示p<0.001； 圖4顯示SK-Hep1細胞、轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1以及SK-Hep1/AOC4P藉由細胞移動分析所測得的移動的細胞數目，其中“***”表示p<0.001；圖5顯示J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及J7/AOC4P藉由細胞移動分析所測得的移動的細胞數目，其中“***”表示p<0.001；圖6顯示SK-Hep1細胞、轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1、轉形株SK-Hep1/AOC4P、J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及轉形株J7/AOC4P藉由細胞侵入分析而被觀察到的結果；圖7顯示轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1以及SK-Hep1/AOC4P藉由群落形成分析所測得的細胞群落的數目，其中“*”表示p<0.05；圖8顯示裸鼠在被皮下注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P或SK-Hep1/pCDNA3.1之後，在牠們的背部中的腫瘤體積隨著時間的變化，其中“SK-Hep1/pCDNA3.1”表示被皮下注射以轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1的裸鼠；“SK-Hep1/AOC4P”表示被皮下注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P的裸鼠；以及“***”表示p<0.001；以及圖9顯示裸鼠在被尾部靜脈內注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P或SK-Hep1/pCDNA3.1之後的第8週結束之時，牠們的肺臟組織藉由組織病理學檢驗所測得的腫瘤面積，其中 “SK-Hep1/pCDNA3.1”表示被尾部靜脈內注射以轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1的裸鼠；“SK-Hep1/AOC4P”表示被尾部靜脈內注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P的裸鼠；以及“*”表示p<0.05。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗材料：

1.人類肝細胞癌(human hepatocellular carcinoma,HCC)細胞株J7以及SK-Hep1的來源與培養：在下面實施例中所使用的人類肝細胞癌細胞株SK-Hep1(ATCC HTB-52)是購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)，以及人類肝細胞癌細胞株J7是由長庚大學生物醫學研究所林光輝教授所提供。

這2種細胞分別被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Gibco)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、100U/mL盤尼西林(penicillin)以及100μg/mL鏈黴素(streptomycin)]的10-cm培養皿(10-cm petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約90%匯聚時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)來洗滌細胞共計2次，接著加入胰蛋白酶(trypsin)-EDTA以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液(cell suspension)分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂的培養箱中進行培養。

2.下面實施例中所使用的質體pCDNA3.1是購自於Invitrogen。

3.下面實施例中所使用的重組型載體pCDNA3.1-AOC4P是委託GenScript公司(Piscataway,NJ,USA)來製備，其架構如圖1所示。

4.實驗動物：在下面實施例中所使用的雄性BALB/C裸鼠(BALB/C nude mice)(6至8週大)[購自於國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)(台北，台灣)]被飼養於一具有12小時光亮/12小時黑暗循環、溫度為17至23℃、濕度為30至80%的無 病原體(pathogen-free)的條件下，並且經高壓蒸氣滅菌標準的飼料以及水分被自由地供給。該等裸鼠是依據國家衛生研究院(National Institute of Health,NIH)的實驗動物飼養管理以及使用規範(Guides for the Care and Use of Laboratory Animals)而被飼養在長庚紀念醫院的動物中心(Animal Center of Chang Gung Memorial Hospital)(桃園，台灣)。有關動物研究的所有實驗是由長庚紀念醫院的動物實驗照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)所認可。

一般實驗方法：

1.定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)：在下面的實施例中，肝細胞癌組織以及對應的鄰近正常肝組織是得自於林口長庚紀念醫院的組織銀行(Tissue Bank)。來自各個組織檢體的總RNA是使用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)而被分離。為了移除任何汙染基因體或質體DNA，該等RNA樣品是依據製造商的操作指南而被處理以無RQ1 RNase的DNase(Promega,Madison,WI,USA)。2μg的該等經處理的RNA樣品是使用一TaqMan非-編碼的RNA分析(TaqMan non-coding RNA assay)(Applied Biosystems)而被進行定量即 時聚合酶鏈反應，俾以偵測長非-編碼的RNA(long non-coding RNA,lncRNA)表現；GAPDH被使用作為一內部對照組。

2.統計學分析(statistical analysis)：在下面的實施例中，原始的定量即時聚合酶鏈反應數據與西方墨點法(western blot)以及移動分析(migration assay)數據被記錄作為連續變數(continuous variables)並且使用史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)而被分析。所有統計學分析是使用SPSS 16.0以及Excel 2007軟體而被執行。所有統計學檢定(statistical tests)是雙邊的(two-sided)，並且用於顯著性(significance)的閾值(threshold)被設定在p<0.05(*)、p<0.01(**)或p<0.001(***)。

3.HCC細胞轉形株(HCC cell transformant)的製備：下面實施例中所使用的4種HCC細胞轉形株是藉由使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)來分別對J7細胞以及SK-Hep1細胞轉染以質體pCDNA3.1或重組型載體pCDNA3.1-AOC4P而被製得。有關各個HCC細胞轉形株的名稱以及所帶有的載體或質體分別被顯示於下面的表1中。

實施例1. 在肝細胞癌的組織中被向下調控(downregulated)的lnc RNA的篩選與鑑定 A、lncRNA的篩選與鑑定：

為了確認lncRNA是涉及肝細胞癌的進展(progression)，總RNA是從3位帶有肝細胞癌的病患的肝腫瘤組織以及對應的鄰近正常肝組織中被分離，接著，該等經分離的總RNA是藉由使用一Ambion^® WT表現套組(Ambion^® WT Expression Kit)(Applied Biosystems)並依據製造商的操作指南來生成cDNA並且被進行微陣列分析(microarray analysis)(Affymetrix GeneChip^® Human Gene 2.0)。一大於2的倍數變化(fold-change)被設定為用於基因表現(gene expression)差異的閾值。使用此閾值，相較於對應的鄰近正常肝組織，申請人在該等肝腫瘤組織中皆有偵測到41種被向上調控(upregulated)以及43種被向下調控的lncRNAs。

為了驗證這些發現，申請人選擇10種顯示出一倍數變化大於4的表現的lncRNAs(包含AOC4P)並且它們的表現是依照上面“一般實驗方法”的第1項「定量即時聚合酶鏈反應」當中所述方法在15個帶有肝細胞癌的病患的肝腫瘤組織以及對應的鄰近正常肝組織中被分析[lncRNA AOC4P的表現位準是藉由使用AOC4P表現分析套組(AOC4P expression assay kit)(Thermo Fisher Scientific,Cat.No.4426961)而被進行分析]。實驗結果發現：在全部的肝腫瘤組織中，lncRNA AOC4P皆呈現被向下調控的情形。

B、在肝腫瘤組織與正常肝組織中的lncRNA AOC4P表現位準的分析：

為了探討lncRNA AOC4P向下調控(downregulation)對於肝細胞癌的生物學顯著性(biological significance)，申請人依照上面“一般實驗方法”的第1項「定量即時聚合酶鏈反應」當中所述方法來分析108位病患的肝腫瘤組織以及對應的鄰近正常肝組織(得自於林口長庚紀念醫院的108位帶有肝細胞癌的病患)中的lncRNA AOC4P表現位準，並且計算出各個病患的肝腫瘤組織中的lncRNA AOC4P表現位準相對於對應的鄰近正常肝組織所具者的比值(下稱lncRNA AOC4P的相對表現位準)。

圖2顯示108位帶有肝細胞癌的病患的lncRNA AOC4P的相對表現位準。從圖2可見，與正常肝組織相較之下，有68%的病患(73/108)(p<0.0001)的肝腫瘤組織中的lncRNA AOC4P的表現位準被顯著地減少達至10%至90%。申請人據此而認為：lncRNA AOC4P在肝細胞癌中的向下調控顯示出它作為一腫瘤抑制子(tumor suppressor)的潛在功能。

實施例2. lncRNA AOC4P在活體外(in vitro)抑制肝細胞癌細胞的增生(proliferation)上的效用評估 實驗方法：

依照上面“一般實驗方法”的第3項「HCC細胞轉形株的製備」當中所述方法而製備出的HCC細胞轉形株J7/pCDNA3.1與J7/AOC4P被拿來進行下面的細胞生長(cell growth)分析。另外，未經轉染的J7細胞被用來作為對照組。有關細胞生長分析是依據製造商的操作指南使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT](Cayman Chemical,Michigan,USA)而被測定。簡言之，將J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及J7/AOC4P分別以一為1×10³細胞/井的數量培養於含有100μL的DMEM(添加有10% FBS)的96-井培養盤(96-well plate)中，並在培養箱(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時8小時。在培養之後的第0、24、48 以及72小時之時，對各井加入10μL的MTT(5mg/mL，配於PBS中)並予以培養歷時4小時。之後，移除各井中的液體，繼而加入50μL的二甲基亞碸(dimethylsulfoxide,DMSO)並予以混合均勻，然後於450nm的波長下以一ELISA讀取機(ELISA reader)(Thermo Fisher Scientific)來量測各井的吸光值(OD₄₅₀)。

結果：

圖3顯示J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及J7/AOC4P藉由細胞生長分析在波長450nm下所測得的吸光值(OD₄₅₀)。從圖3可見，在培養之後的第72小時之時，相較於轉形株J7/pCDNA3.1，轉形株J7/AOC4P所測得的增生活性(proliferation activity)被顯著地抑制達至大約44%(p<0.001)。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以在活體外有效地抑制肝細胞癌細胞的增生。

實施例3. lncRNA AOC4P在活體外抑制肝細胞癌細胞的轉移(metastasis)上的效用評估

在本實施例中，依照上面“一般實驗方法”的第3項「HCC細胞轉形株的製備」當中所述方法而製備出的4種HCC細胞轉形株被拿來進行細胞移動分析、細胞侵入分析以及群落形成分 析，俾以評估lncRNA AOC4P在活體外抑制肝細胞癌細胞的轉移上的效用。

實驗方法： A、細胞移動分析(cell migration assay)：

有關細胞移動分析是藉由使用ThinCert^TM組織細胞培養小杯(ThinCert^TM Tissue Cell Culture Inserts)(Greiner Bio-One)[含有一孔徑為8μm的聚對苯二甲酸乙二酯膜(polyethylene terephthalate membrane)並且被置放於一個12-井培養盤的各個井中，藉此而界定出一上層室(upper chamber)以及一下層室(lower chamber)]來進行評估。首先，將SK-Hep1細胞、轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1、轉形株SK-Hep1/AOC4P、J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及轉形株J7/AOC4P分別培養於含有DMEM(添加有10% FBS)的培養皿中，並在培養箱(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時24小時。之後，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)以使細胞自培養皿的底部脫離，接著以無血清的DMEM(serum-free DMEM)來散浮細胞，而得到一具有一濃度為5×10⁵細胞/mL的細胞懸浮液。

之後，分別將500μL的DMEM(添加有10% FBS)加入至下層室的各個井中，以及將100μL的細胞懸浮液加入至上層室的各個井中。接著，將該12-井培養盤置於一潮濕的培養箱 (humidified incubator)(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時24小時。之後，以500μL的甲醇來固定細胞歷時15分鐘，繼而以棉花棒來塗抹上層室的內表面，俾以移除未移動的細胞。接著，以500μL的PBS來清洗聚對苯二甲酸乙二酯膜，然後在室溫下將細胞以500μL的結晶紫(crystal violet)(Sigma-Aldrich)予以染色歷時20分鐘。在以500μL的PBS予以洗滌之後，被染色的細胞是藉由使用一倒立顯微鏡(OLYMPUS CKX41)並在一為100倍的放大倍率下來進行觀察以及拍照，然後使用ImagePro 6.2軟體來分析所得到的影像。之後，被染色的細胞數目是藉由對5個隨機的視野(random field)來進行計數而被獲得，然後依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

B、細胞侵入分析(cell invasion assay)：

本實驗大體上是參照上面第A項的“細胞移動分析”當中所述的方法來進行，不同之處在於：(1)在加入細胞懸浮液至上層室的各個井之前，聚對苯二甲酸乙二酯膜被塗覆以30mg/cm²基質膠(Matrigel)(Sigma-Aldrich)，俾以形成一基質屏障(matrix barrier)；以及(2)該12-井培養盤在該潮濕的培養箱中被培養歷時48小時。

C、群落形成分析(colony formation assay)：

將轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1以及SK-Hep1/AOC4P分別以一為500細胞/井的數量培養於含有DMEM(添加有10% FBS)的6-井培養盤中，並在培養箱(37℃、5% CO₂)中進行培養歷時12天(每3天更換新鮮的培養基)。接著，以甲醇來固定所形成的細胞群落，繼而以0.1%結晶紫予以染色，然後以肉眼來進行細胞群落的觀察與計數。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

結果： A、細胞移動分析：

圖4顯示SK-Hep1細胞、轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1以及SK-Hep1/AOC4P藉由細胞移動分析所測得的移動的細胞數目。從圖4可見，轉形株SK-Hep1/AOC4P所測得的移動的細胞數目相較於SK-Hep1細胞以及轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1所具者都有顯著的減少。

圖5顯示J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及J7/AOC4P藉由細胞移動分析所測得的移動的細胞數目。從圖5可見，轉形株J7/AOC4P所測得的移動的細胞數目相較於J7細胞以及轉形株J7/pCDNA3.1所具者都有顯著的減少。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以有效地抑制肝細胞癌細胞的移動能力。

B、細胞侵入分析：

圖6顯示SK-Hep1細胞、轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1、轉形株SK-Hep1/AOC4P、J7細胞、轉形株J7/pCDNA3.1以及轉形株J7/AOC4P藉由細胞侵入分析而被觀察到的結果。從圖6可見，轉形株SK-Hep1/AOC4P以及J7/AOC4P所觀察到的細胞數目相較於其他4種細胞株所具者都有顯著的減少。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以有效地抑制肝細胞癌細胞的侵入能力。

C、群落形成分析：

圖7顯示轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1以及SK-Hep1/AOC4P藉由群落形成分析所測得的細胞群落的數目。從圖7可見，轉形株SK-Hep1/AOC4P所測得的細胞群落的數目相較於轉形株SK-Hep1/pCDNA3.1所具者有顯著的減少。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以有效地抑制肝細胞癌細胞的群落形成能力。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：lncRNA AOC4P可以在活體外有效地抑制肝細胞癌細胞的轉移。

實施例4. lncRNA AOC4P在活體內(in vivo)抑制肝細胞癌細胞的生長上的效用評估

在本實施例中，申請人分別使用HCC細胞轉形株SK-Hep1/AOC4P以及SK-Hep1/pCDNA3.1來誘發裸鼠產生腫瘤，並且藉由腫瘤體積的測量來評估lncRNA AOC4P在活體內抑制肝細胞癌細胞的生長上的效用。

實驗方法：

將轉形株SK-Hep1/AOC4P以及SK-Hep1/pCDNA3.1分別以一為1×10⁶細胞的數量加入至100μL的含有基質膠(Cat.No.356234,BD Biosciences)的生理鹽水中並予以混合均勻，而得到一含有SK-Hep1/AOC4P的混合物以及一含有SK-Hep1/pCDNA3.1的混合物。之後，將裸鼠隨機分成1個AOC4P組以及1個pCDNA3.1組(每組n=5)。接著，各組裸鼠藉由腹膜內注射(intraperitoneal injection)以一含有甲苯噻嗪(xylazine)(80至120mg/kg)以及克他明(ketamine)(10mg/kg)的麻醉劑雞尾酒(anesthetic cocktail)而被麻醉，然後將該含有SK-Hep1/AOC4P的混合物皮下注射至AOC4P組的裸鼠的左側與右側背部中，以及將該含有SK-Hep1/pCDNA3.1的混合物皮下注射至pCDNA3.1組的裸鼠的左側與右側背部中，俾以誘發腫瘤生成。

在皮下注射之後的第0、4、7、11、14、18、20以及22天，以數位卡尺(digital caliper)來量測裸鼠背部腫瘤的體積， 然後依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

結果：

圖8顯示裸鼠在被皮下注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P或SK-Hep1/pCDNA3.1之後，在牠們的背部中的腫瘤體積隨著時間的變化。從圖8可見，AOC4P組的裸鼠所測得的腫瘤體積會小於pCDNA3.1組的裸鼠所具者，並且會隨著時間的增加而更趨於明顯。特別地，在皮下注射之後的第22天之時，AOC4P組的裸鼠所測得的腫瘤體積與pCDNA3.1組的裸鼠所具者的差值達至大約600mm³。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以在活體內有效地抑制肝細胞癌細胞的生長。

實施例5. lncRNA AOC4P在活體內抑制肝細胞癌細胞的轉移(metastasis)上的效用評估

在本實施例中，申請人分別使用HCC細胞轉形株SK-Hep1/AOC4P以及SK-Hep1/pCDNA3.1來誘發裸鼠產生腫瘤，然後取出牠們的肺臟組織並且藉由組織病理學檢驗(histopathological examination)來評估lncRNA AOC4P在活體內抑制肝細胞癌細胞的轉移上的效用。

實驗方法：

將轉形株SK-Hep1/AOC4P以及SK-Hep1/pCDNA3.1分別以一為1×106細胞的數量加入至100μL的含有基質膠的生理鹽水中並予以混合均勻，而得到一含有SK-Hep1/AOC4P的混合物以及一含有SK-Hep1/pCDNA3.1的混合物。之後，將裸鼠隨機分成1個AOC4P組以及1個pCDNA3.1組(每組n=5)。接著，各組裸鼠藉由腹膜內注射以一含有甲苯噻嗪(80至120mg/kg)以及克他明(10mg/kg)的麻醉劑雞尾酒而被麻醉，然後將該含有SK-Hep1/AOC4P的混合物經由尾部靜脈內注射(intravenous tail injection)至AOC4P組的裸鼠，以及將該含有SK-Hep1/pCDNA3.1的混合物經由尾部靜脈內注射至pCDNA3.1組的裸鼠，俾以誘發腫瘤生成。在尾部靜脈內注射之後的第8週結束之時，藉由頸椎脫位術(cervical dislocation)來犧牲各組裸鼠，接著取出牠們的肺臟組織並依據下面的操作步驟來進行組織病理學檢驗。

首先，將肺臟組織以PBS予以清洗，然後以4%甲醛(formaldehyde)來進行固定處理(fixation)歷時24小時，繼而將經固定的肺臟組織以以石蠟(paraffin)予以包埋(embedding)，然後進行切片處理，藉此而得到具有一厚度為2μm的組織切片(tissue sections)。

之後，所得到的組織切片藉由使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)並且依據熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行染色。經染色的組織切片是藉由使用一正立光學顯微鏡(OLYMPUS DP71)並在一為200倍的放大倍率下來進行觀察以及拍照，然後藉由使用ImagePro 6.2軟體來量測腫瘤的面積。之後，依照上面“一般實驗方法”的第2項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

結果：

圖9顯示裸鼠在被尾部靜脈內注射以轉形株SK-Hep1/AOC4P或SK-Hep1/pCDNA3.1之後的第8週結束之時，牠們的肺臟組織藉由組織病理學檢驗所測得的腫瘤面積。從圖9可見，AOC4P組的裸鼠所測得的腫瘤面積是顯著地小於pCDNA3.1組的裸鼠所具者。這個實驗結果顯示：lncRNA AOC4P可以在活體內有效地抑制肝細胞癌細胞的轉移。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：lncRNA AOC4P具有發展成為一抗癌藥物的高潛力。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

<110> 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院

<120> lncRNA AOC4P供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途

<130> lncRNA AOC4P

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2073

<212> RNA

<213> 智慧人(Homo sapiens)

<400> 1

Claims (4)

1. lncRNA AOC4P供應用於製備一用來治療肝細胞癌之醫藥品的用途，其中lncRNA AOC4P具有一如序列辨識編號：1所示的核苷酸序列。
2. 如請求項1的用途，其中該醫藥品進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
3. 如請求項2的用途，其中該藥學上可接受的載劑包含有一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、吸收延遲劑以及脂質體。
4. 如請求項1的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。