CN101638688B

CN101638688B - 鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片

Info

Publication number: CN101638688B
Application number: CN2009100920239A
Authority: CN
Inventors: 刘伟; 江涛; 张维胜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-09-04
Filing date: 2009-09-04
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2029-09-04
Also published as: CN101638688A

Abstract

本发明公开了一种鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片。本发明提供的鉴定致病性念珠菌专用探针，由如下24个DNA片段中的至少一个组成：核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的12个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的反向互补序列的12个DNA片段。本发明还提供了含有所述专用探针的用于鉴定致病性念珠菌的DNA芯片。所述专用探针、DNA芯片或装置均可应用于鉴定致病性念珠菌。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将待测念珠菌的rDNA的ITS区通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交并显色，从而最终鉴定出待测念珠菌。本发明具有特异性强、快速的特点，可以在检测临床标本中的常见致病性念珠菌，以及进行念珠菌菌种鉴定时发挥快速、特异的积极作用。

Description

鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片

技术领域

本发明涉及一种鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片。

背景技术

近年来，随着高效广谱抗生素的广泛应用，抗肿瘤治疗的深入开展，器官移植和外科其它介入性治疗的长足发展，由各种原因引起的侵袭性真菌感染的发生呈现上升趋势，而且严重危及患者的生命。例如念珠菌血症已跃居院内致死性血行感染的第一位，念珠菌所致的深部感染的防治已经成为目前医学实践中十分重要的课题，已经引起广大医务工作者的广泛重视。引起念珠菌感染的病原菌除了最常见的白念珠菌外，由克柔念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等引起的感染也逐渐增多，这些新近出现的病原性念珠菌对传统的抗真菌药物氟康唑多不敏感，例如克柔念珠菌和光滑念珠菌对氟康唑天然耐药，近平滑念珠菌对棘白球素类药物天然耐药。传统用于念珠菌感染的检查手段主要包括真菌镜检、培养、鉴定以及抗真菌药物敏感性测定等，但是这些方法往往需时长，大约需要3-4周；而且检测的阳性率低，如血培养的阳性率大约只有50％。这些特点使得快速、敏感、特异地检测常见致病性念珠菌并对其进行种水平的鉴定，成为临床上迫切需要解决的重要问题；这一问题的解决，对于正确的诊断、合理选择敏感的药物并制定治疗方案具有十分重要的意义。

分子生物学相关的从临床标本中直接检测真菌的技术和方法正在不断发展中，最为活跃的PCR技术较真菌培养等方法当然具有快速、敏感等特点，该技术可以扩增血清、血浆、全血、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和脓液等标本中的真菌成份。但是，目前所用PCR方法仍然不能快速、特异地检测临床标本中的念珠菌并进一步进行菌种鉴定，从而帮助临床医生选择合理的抗真菌药物。

导流杂交技术(Flow-through hybridization，US专利号6020187和5741647)是将探针固定在质基体上，检测样品流经置于导流杂交装置的质基体时，靶序列与探针杂交形成复合体，然后通过显色来检测杂交复合体从而反映出被检测样品中的核酸靶分子；这项技术较传统的杂交方法具有特异性强、快速的特点；如果能够将这项技术与高通量低密度基因芯片技术和灵敏性高的PCR技术结合起来，则可以在检测临床标本中的常见致病性念珠菌，以及进行念珠菌菌种鉴定时发挥快速、特异的积极作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片。

本发明提供了一种鉴定致病性念珠菌的专用探针，由如下24个DNA片段中的至少一个组成：核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的12个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的反向互补序列的12个DNA片段。以上24个DNA片段，均是根据不同种的念珠菌的保守序列设计的，其中每个DNA片段，或每两个DNA片段、每三个DNA片段、每四个DNA片段，……，直至全部DNA片段的组合，均可用于鉴定致病性念珠菌。

本发明还保护用于鉴定致病性念珠菌的DNA芯片，含有以上任一所述的专用探针。

本发明同时保护鉴定致病性念珠菌的装置，包括以上任一所述的专用探针或以上任一所述的DNA芯片。所述装置还可包括序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对。为了便于检测待测DNA与所述探针的杂交结果，所述引物对上可标记有生物素。

以上任一所述的专用探针、以上任一所述的DNA芯片或以上任一所述的装置均可应用于鉴定致病性念珠菌。

以上所述专用探针、所述DNA芯片、所述装置或所述应用中，所述致病性念珠菌具体可为白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)等。

本发明还保护一种鉴定致病性念珠菌的方法，是将待测念珠菌的rDNA的ITS区分别与以上任一所述的专用探针中的每个DNA片段杂交，根据杂交结果鉴定待测念珠菌。所述待测念珠菌的rDNA的ITS区具体可为以待测念珠菌的总DNA为模板，用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA。所述方法中，所述致病性念珠菌具体可为白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)等。

本发明还保护一种检测样本中含有哪种或哪几种致病性念珠菌的方法，其特征在于：所述致病性念珠菌具体可为白念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、克柔念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、热带念珠菌(Candidatropicalis)；所述方法包括如下步骤：以待测样本的总DNA为模板用序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对进行PCR扩增，得到目标DNA；将目标DNA分别与序列表的序列1至序列表的序列12所示DNA片段进行杂交，根据杂交结果评判如下：如果序列1(CA1)和/或序列2(CA2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有白念珠菌(Candida albicans)；如果序列3(CD1)和/或序列4(CD2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)；如果序列5(CG1)和/或序列6(CG2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有光滑念珠菌(Candida glabrata)；如果序列7(CK1)和/或序列8(CK2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有克柔念珠菌(Candida krusei)；如果序列9(CT1)和/或序列10(CT2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有热带念珠菌(Candida tropicalis)；如果序列11(CP1)和/或序列12(CP 2)的杂交结果为阳性，所述样本中含有近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)。如果仅有一种念珠菌相应的探针的杂交结果为阳性，则待测样本仅含有该一种念珠菌，如果几种不同念珠菌相应的探针的杂交结果均为阳性，则待测样本中含有该几种念珠菌。

本发明利用PCR法检测真菌最常用的靶序列之一-内转录间区(Internaltranscriptional space，ITS)，这是一个多拷贝的串联重复序列，其28s、5.8s和18s rDNA在种间具有保守性，故可以用于设计通用引物，然后进行PCR扩增；而ITS1和ITS2区具有可变性，因此可以进行种特异性探针的选择。本发明中将种特异性探针包被在低密度基因芯片膜上，然后将上述PCR产物通过基于导流杂交技术的检测平台，与低密度基因芯片膜上的种特异性探针进行导流杂交并显色，从而最终实现临床标本中常见致病性念珠菌的快速检测及其准确的菌种鉴定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店或生物试剂公司购买得到的。

以下实施例中所用的DNA片段如下：

致病性念珠菌核酸rDNA的ITS区中的种特异性探针：

CA1(Candida albicans)：5’-AACATTGCTTGCGGCGGTAGCGTCTACCACGTATA-3’；35bp；序列表的序列1。

CA2(Candida albicans)：5’-CGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCT-3’；24bp；序列表的序列2。

CD1(Candida dubliniensis)：5’-TGATAGTGGTATAAGGCGGAGATGC-3’；25bp；序列表的序列3。

CD2(Candida dubliniensis)：5’-TTGCTAAGGCGGTCTCTGGCGTCGC-3’；25bp；序列表的序列4。

CG1(Candida glabrata)：5’-CGAGCGCAAGCTTCTCTATTAATCTGCTGC-3’；30bp；序列表的序列5。

CG2(Candida glabrata)：5’-AGTGAGTGATACTCTCGTTTTTGAGTTAACTTGAAAT-3’；37bp；序列表的序列6。

CK1(Candida krusei)：5’-CTTGGCGGCCGAGAGCGAGTGTTGCG-3’；26bp；序列表的序列7。

CK2(Candida krusei)：5’-GGACGACGTGTAAAGAGCGTCGGAGCT-3’；27bp；序列表的序列8。

CT1(Candida tropicalis)：5’-AACGCTTATTTTGCTAGTGGCCACCACAAT-3’；30bp；序列表的序列9。

CT2(Candida tropicalis)：5’-GAATTTAACGTGGAAACTTATTTTA-3’；25bp；序列表的序列10。

CP1(Candida parapsilosis)：5’-ACTGCATTTTTTCTTACA-3’；18bp；序列表的序列11。

CP2(Candida parapsilosis)：5’-CACTCATTGGTACAAACTCCAAAACT-3’；26bp；序列表的序列12。

将上述探针分别包被在基因芯片膜(硝酸纤维素膜)上。

扩增念珠菌的rDNA的ITS区的引物对(引物上标记有生物素)：

Forward(序列表的序列13)：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA-3’；

Reverse(序列表的序列14)：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCG-3’。

以下实施例中所用的念珠菌样本分别购自ATCC，每个菌种样本的编号如下：

白念珠菌(Candida albicans)：ATCC24433；

都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)：ATCC MY646；

光滑念珠菌(Candida glabrata)：ATCC 2001；

克柔念珠菌(Candida krusei)：ATCC6258；

热带念珠菌(Candida tropicalis)：ATCC750；

近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)：ATCC22019。

实施例1、致病性念珠菌检测及菌种快速鉴定

将含有已知不同菌种的念珠菌的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列13和序列14)进行PCR反应，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列12所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应，根据反应的结果判断被检测样本中的念珠菌种，所需时间为6小时。结果见表1。

表1常见致病性念珠菌的鉴定结果

样本	检测结果
		白念珠菌(Candida albicans)	CA1、CA2阳性；CD1、CD2、CG1、CG2、CK1、CK2、CT1、CT2、CP1、CP2阴性
都柏林念珠菌(Candidadubliniensis)	CD1、CD2阳性；CA1、CA2、CG1、CG2、CK1、CK2、CT1、CT2、CP1、CP2阴性
		光滑念珠菌(Candida glabrata)	CG1、CG2阳性；CD1、CD2、CA1、CA2、CK1、CK2、CT1、CT2、CP1、CP2阴性
克柔念珠菌(Candida krusei)	CK1、CK2阳性；CD1、CD2、CA1、CA2、CG1、C62、CT1、CT2、CP1、CP2阴性
		热带念珠菌(Candida tropicalis)	CT1、CT2阳性；CD1、CD2、CA1、CA2、CK1、CK2、CG1、C62、CP1、CP2阴性
近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)	CP1、CP2阳性；CD1、CD2、CA1、CA2、CK1、CK2、CG1、CG2、CT1、CT2阴性

实施例2、致病性念珠菌混合菌的检测及菌种的快速鉴定

将含有已知的致病性念珠菌混合菌的样本按照标准方法提取基因组DNA，然后用上述引物对(序列表的序列13和序列14)进行PCR反应，之后将PCR产物与标记有不同探针(分别为序列1至序列12所示探针)的硝酸纤维素膜通过医用核酸分子杂交仪进行导流杂交反应，根据反应的结果可以判断被检测样本中所存在的混合的念珠菌种，所需时间为6小时。结果见表2。

表2常见致病性念珠菌的鉴定结果

标本	混合菌种标本中的菌种	检测结果
			标本一	白念珠菌和光滑念珠菌	CA1、CA2和CG1、CG2阳性；其余为阴性
标本二	都柏林念珠菌和热带念珠菌	CD1、CD2和CT1、CT2阳性；其余为阴性

序列表

<110>刘伟江涛

<120>鉴定致病性念珠菌的专用探针与基因芯片

<130>CGGNARY92518

<160>14

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aacattgctt gcggcggtag cgtctaccac gtata 35

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cggtagtggt aaggcgggat cgct 24

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tgatagtggt ataaggcgga gatgc 25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

ttgctaaggc ggtctctggc gtcgc 25

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cgagcgcaag cttctctatt aatctgctgc 30

<210>6

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

agtgagtgat actctcgttt ttgagttaac ttgaaat 37

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cttggcggcc gagagcgagt gttgcg 26

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggacgacgtg taaagagcgt cggagct 27

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

aacgcttatt ttgctagtgg ccaccacaat 30

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

gaatttaacg tggaaactta tttta 25

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

actgcatttt ttcttaca 18

<210>12

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cactcattgg tacaaactcc aaaact 26

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

tccgtaggtg aacctgcgga aggatca 27

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

cgcttattga tatgcttaag ttcagcg 27

Claims

1.鉴定致病性念珠菌的专用探针，由如下24个DNA片段中的至少一个组成：核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的12个DNA片段和核苷酸序列分别是序列表的序列1至序列12的反向互补序列的12个DNA片段。

2.用于鉴定致病性念珠菌的DNA芯片，含有权利要求1所述专用探针。

3.鉴定致病性念珠菌的装置，包括权利要求1所述专用探针或权利要求2所述DNA芯片。

4.如权利要求3所述的装置，其特征在于：所述装置还包括序列表的序列13和序列表的序列14所示核苷酸组成的引物对。

5.如权利要求4所述的装置，其特征在于：所述引物对上标记有生物素。