CN1271213C - 一种脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学体外诊断技术，具体地讲是一种基因芯片——脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法。它是在玻璃基片上分布有多个不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中，分别固定有常见的脑膜炎致病微生物的特异性探针。用相应探针与经扩增并加入荧光标记的致病微生物DNA杂交，经扫描仪扫描芯片，并对杂交信号进行处理分析，获得有关信息。这种芯片能同时检测细菌、病毒、真菌、原虫等多种微生物，具有诊断快速准确、特异性高、信息量大的特点，对临床诊断和流行病学筛查都有很大帮助。
Description
一、技术领域：本发明涉及医学体外诊断技术，具体的讲是一种脑膜炎检测基因芯片及其制备工艺和使用方法。
二、背景技术：脑膜炎是常见的神经系统疾病，其致病微生物种类多种多样。仅常见的致病菌即近十种，治疗不当会危及生命，因而快速准确的诊断对及时恰当的处置起着至关重要的作用。而不同种属、甚至不同亚型的细菌致病力与耐药性均不同，给临床治疗带来很大困难。病毒性脑膜炎虽然在临床症状上与之非常相近，却是一种自限性疾病，抗生素治疗几乎无效。是细菌性还是病毒性脑膜炎，临床医生几乎不可能做出肯定的诊断，屡屡处于两难的境地。因此，患者必须住院观察，予静脉抗生素治疗，直到脑脊液细菌培养结果出来后再行处置。这个过程通常要花费48到72小时。据统计，90％以上的脑膜炎都是由病毒引起的。这段时间不仅造成医疗护理人力物力的巨大浪费，还可能导致误治。而且少数病例是由真菌等其他微生物所致，更增加了临床诊断的难度。
传统检测脑脊液的方法包括：革兰氏染色，基于抗体的免疫学检测和细菌培养等。镜检简单快速，却需要有相当数量的细菌。抗体检测虽然速度较快，但一次只能检测一种抗体，效率低。细菌培养将灵敏度提高了，培养时间却成为不可逾越的障碍。而且抗生素的应用还可以造成革兰氏染色及细菌培养的假阴性结果。发明一种高效高灵敏度的脑脊液检测方法成为必须。
三、发明内容；
1、发明目的：本发明提供一种脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法，其目的在于解决脑膜炎检测中存在的效率低、诊断不准确等方面存在的问题。
2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来加以实现的：
一种脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法，其特征在于：该芯片是玻璃基片上分布有不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中分别固定有脑膜炎致病微生物的特异性探针；
探针的大小为15-30个碱基，设计61个探针，所设计的探针序列见后文；
本发明制备工艺按如下步骤进行：
(1)设计脑膜炎特异性探针和引物；
从数据库中获得可靠的脑膜炎致病微生物基因序列，根据所述的探针序列设计探针；
从数据库中获得可靠的脑膜炎致病微生物基因序列，设计如下PCR引物，针对病毒病原微生物基因片段进行扩增；扩增引物序列见后文；
(2)、合成探针；
(3)、制备芯片；
用去离子水将合成的探针溶解，得到浓度为200mmol/l的溶液，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。
在合成探针的步骤中，探针5’端加氨基修饰。
点样中点的大小为50-100微米。
探针缓冲液为1xSSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB。
对上述检测芯片的使用方法按如下步骤进行：
(1).处理样品；
取准备好的病人脑脊液少量，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存；
(2).PCR扩增
在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素Cy3标记的dUTP；扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 30sec
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环，
(3).杂交；
PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1，洗涤3次；
(4).检测；
用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果；
(5).数据分析
(5).数据分析
将芯片分析结果输出。
3、优点及效果：
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，它是物理学、化学、微电子学、精密机械与生命科学交叉综合的高科技。基因芯片集成的不是电子元器件，采用在位组合化学、微电子芯片光刻技术，或者利用其它方法将大量特定序列的DNA探针有序地固定在基片上，在与待测样品DNA作用后，即可检测到大量的生命信息，包括基因识别、基因突变和基因表达等。利用基因芯片可以快速、高效地获取或处理大量的生命信息，它对生命科学研究、医学诊断、新药筛选和司法鉴定等具有革命性的推动作用。
本发明提供了一种脑膜炎检测芯片，将已经合成的特异性探针矩阵固定于基片表面，通过芯片与待测样本DNA杂交，即可获取大量与脑膜炎致病微生物相关的生物学信息。利用这种芯片，通过一次操作就可以同时完成脑膜炎致病微生物的检测。该基因芯片具有诊断准确、特异性高、信息量大的特点。如果将此芯片成功应用于临床，必将带来极大的经济效益和社会效益。
四、具体实施方式：本发明实施的具体步骤是：
1.设计脑膜炎特异性探针和引物
从NCBI等数据库获得可靠的脑膜炎致病微生物基因序列等，利用生物信息学软件设计引物和特异性的探针。针对病毒病原微生物(病毒、细菌、真菌、原虫)基因片段进行扩增。设计61个探针鉴别病毒(hhv1、hhv2、hhv3、hhv4、hhv5、hhv6、hhv7、coxsackievirus a9、coxsackievirus b4、coxsackievirus b5、echovirus22、poliovirus、la cross、St.louis、venezuelanequine、west nile、western equine、Japanese B、central european、russian、Powassan、Dengue、Mumps、Measles、Adenovirus、LCMV、HIV-l、HIV-2、inluenza-a、inluenza-b、htlv-1、htlv-2、togavirus、Rickettsia typhi、Parvovirus B19)；细菌：(Tropheryma whippelii、Borrelia afzelii、Bartonella henselae、Brucella abortus、Brucella canis、Brucella melitensis、Brucella suis、Borreliaburgdorferi、Escherichia coli、Borrelia garinii、Streptococcus pneumoniae R6、Haemophilusinfluenzae Rd、Leptospira interrogans、Bacillus subtilis、Streptococcus milleri、Mycobacteriumtuberculosis、Mycoplasma PG50、Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、Streptococcus pneumoniae)；真菌(Cryptococcus)；原虫(Acanthamoeba sp.、Naegleriajamiesoni、Toxoplasma gondii)病原微生物。
2.合成探针
可以由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。
3.制备芯片
根据需要设定点样程序，矩阵分布根据探针杂交动力学要求及点样方便与否安排。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。使用CEL公司生产的玻璃基片，用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。按照不同要求从几十点到上千点，点的大小为50-100微米左右，点间距依点的数量而定。点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝70.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。
上述脑膜炎检测芯片的应用方法包括以下步骤：
(1).处理样品
取病人脑脊液少量，分别用提取病毒、细菌、支原体、螺旋体等DNA的方法提取DNA，备用。如需长时间放置，在-20℃下冻存。
(2).PCR扩增
在反应管中加入扩增反应混合物，Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素(Cy3)标记的dUTP。扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 30sec 30个循环
72℃ 1min
72℃ 5min
(3).杂交
PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。
(4).检测
用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。
(5).数据分析
Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片分析结果输出。
以下结合具体的实施例对发明的技术方案作进一步的说明：
实施例：
设计脑膜炎引物及特异性探针61个。探针的大小为15-30个碱基。由上海生物工程有限公司合成。探针5’端加氨基修饰。
制备基因芯片：
用CEL公司生产的玻璃基片，使用BioRobotics公司的点样仪按预先设定好的程序进行点样。用去离子水将合成的探针溶解，浓度为200mmol/l。点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时。以探针缓冲液(1xSSC，0.1％SDS)及蒸馏水冲洗玻片，吹干。以封闭液(1％BSA，PH＝7 0.01mol/l PB)封闭玻片，之后洗涤3次。吹干备用。
处理样品：取临床检测为患者的脑脊液少量，根据监测项目的要求等分，分别按以下方法处理：
(1)100℃水浴10分钟，骤然冷却至0℃，13000G离心5分钟，取上清备用。
(2)用溶菌酶溶解，氯仿抽提，乙醇沉淀法提取DNA，备用。
PCR扩增：以真菌性脑膜炎为例采用的引物序列分别是：F396：5｀-TGAGAAACGGCTACCACATC C；R572：CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5｀。
反应总体积为20μl，在反应管中加入10X buffer 2μl，Taq酶0.2μl，相应的处理好的样品0.8μl和上下游引物各2μl，dNTP0.8μl以及Cy3标记的dUTP1.2μl，其余的用H2O。扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 40sec
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环；
杂交：PCR产物与芯片上的探针在60℃下杂交2小时，杂交缓冲液(10xSSC，0.1％SDS)与PCR产物的比例为1∶1。洗涤3次。
检测：用Genomic Solutions公司的扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果。数据分析：Genomic Solutions公司的扫描仪的配套分析软件将芯片结果输出。与临床检验结果比较，符合率100％。
脑膜炎检测芯片引物及探针序列表
脑膜炎诊断基因芯片探针表
meningoencephalitis
virus probe SEQUENCE
hhv1 hhv1 F3455 5｀-ACGGCGTCGC CCTGAA
hhv2 hhv2 F3455 5｀-GGGGCGTTCC GCTCAA
hhv3 hhv3 F3262 5｀-ACTTATCCC CACGAAAGTC G
hhv5 hhv5 F1644 5｀-TCTGTTCAACACCATTAATTTTCACT
hhv6 hhv6 5｀-CACAAACA TCCTTTATTA ATCCCG
hhv7 hhv7 5｀-CACAAAGA GTCTTCATTA AGCCG
coxsackievirus a9 F114 5｀-AGCAAT GCACCTCTGG TCAAT
a9，b4，b5 b4 5｀-AGCAAAGAAACAATGGTCAATTACT
b5 5｀-AGTTAC ACACACTGAT CAACAGTGG
enterovirus71 F116 5｀-GCAAC GCAAACCAGA TCAATAG
echovirus22 F111 5｀-CCCATAGTAA CCAACACCTA AGACA
poliovirus F114 ACAAAAC CAAGTTCAAT AGAAGGG
la cross F197 AGCA TGATCAAAAC AGAGG
St.louis F219 5｀-CT GCTACGAGGC AACCTTGG
venezuelan equine F128 5｀-CGC TCGATGGCTA ACCTGA
west nile F280 5｀-G CAGACAAGGA GTGGTGGACA
western equine western F800 5｀-AAGACACGACCAGCAGCACC
eastern 5｀-AAAACACGTCTAGTAGTACCATCACAA
venezuelan 5｀-ACACGACCGGCCGCTC
Japanese B F164 5｀-GAGGAGG AAATGAAGGC TCAAT
central european F107 5｀-TGGA GCTCCGCTGT GGC
russian Russian F272 5｀-AGCAGCTCT TACGCTACAT GGA
Powassan F332 5｀-CGTATGTTG TCAAGGTTGA GCC
Dengue F218 5｀-GGA CCCATGAAAT TGGTGATG
Mumps F334 5｀-GCTGTGGG AGTAATGAAT CAAGTT
Measles F196 5｀-AATGT GGAAGTTGGG AATGTCA
Adenovirus F141 5｀-GGGGATGTCA AATTTTAGCT CC
LCMV F385 5｀-TGGGGA AATCTGGACT GGAG
5｀-TGGGGA GCTCTGGACT GGAG
HIV-1 F144 5｀-AGGGATG GAAAGGATCA CCG
HIV-2 F676 5｀-GCTCCACGCTTGCTTGCTTA
inluenza-a F124 5｀-ACGGTCAACAGGACACATCAAT
inluenza-b F1567 5｀-TGATGAATGACTCAATGGCTAAGA
htlv-1 5｀-AGTTTGTTCGTGGACCCTCG
htlv-2 F183 5｀-AAAGGATGCC GAGTCTATAA AAGC
togavirus F3321 5｀-TTTTCGTGGCACTTTGGCA
Rickettsia typhi F194 5｀-GTGCCGAAAG AATTGGTTGA AT
5｀-CACGGCTTTCATTAACCAACTT
Rabies virus F257 5｀-TGCAGTCTCC ACCTCAGCAA
parvovirus B19 F795 5｀-TTTGCCAGGA ATGACTACAA AAG
Bacteria probe SEQUENCE
Tropheryma whippelii Troph F596 5｀-CGGAC CTGCGGTGGG TA
Borrelia afzelii Afzelii F596 5｀-TGTGGAGCTA TGTTGGAAAC TATATG
Bartonella henselae Barto F596 5｀-CTGGAACTGC CTTTGATACT GG
Brucella abortus B-abor F596 5｀-CCGGAACTGC CTTTGATACT G
Brucella canis B-canis F596 5｀-CCGGAACTGC CTTTGATACT G
Brucella melitensis B-meli F596 5｀-CCGGAACTGC CTTTGATACT G
Brucella suis B-suis F596 5｀-CCGGAACTGC CTTTGATACT G
Borrelia burgdorferi berg F596 5｀-CTGTGGAGCT ATGTTGGAAA CTATG
Escherichia coli esch F596 5｀-TGGGAACTGC ATCTGATACT GG
Borrelia garinii garinii F596 5｀-CTGTGGAACT ATGTTGGAAA CTATATGT
Streptococcus pneumoniae R6 group b F596 5｀-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTT
Haemophilus influenzae Rd hae F596 5｀-AGGAATTGCA TTTCAGACTG GG
Leptospira interrogans lep F596 5｀-CGCAGCCTGC ACTTGAAAC
Bacillus subtilis list F596 5｀-GGGGAGGGTC ATTGGAAACT
Streptococcus milleri milleri F596 5｀-ATTGTAGGCT TTGGAAACTG TTTAA
Mycobacterium tuberculosis mycoga F596 5｀-GAGCGTGCGG GCGATA
Mycoplasma PG50 mycopla F596 5｀-CAGTTGTATG CATTGGAAAC TATTAAT
Neisseria
meningitidis nei F596 5｀-CGGGAACTGC GTTCTGAACT
Staphylococcus aureus sta F596 5｀-GTGGAGGGTC ATTGGAAACT G
Streptococcus
pneumoniae strp-pneu F596 5｀-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTT
Fungi
probe Sequence
Cryptococcus F436 5｀-CAAATTACCC AATCCCGACA C
Protozoa probe SEQUENCE
acanthamoeb
Acanthamoeba sp. a F1759 5｀-CCGTGCTTCT TAGAGGGACTG
Naegleria jamiesoni naegleria F1759 5｀TTTGTCAGCT TCTTAAAGGG ACTT
Toxoplasma gondii Toxoplasma F1759 5｀-CACTTCTTAG AGGGACTTTG CGT
脑膜炎诊断基因芯片引物表
meningoencephalitis
virus
primer SEQUENCE
hhv1 F3394 5｀-TCCAAGCCCC GCAAGC
hhv2 R3686 CTTTGAGCTG CTTACAACGT ATC-5｀
hhv3 primer SEQUENCE
F3125 5｀-TCGGGA CATGCCAAGT AAAGT
R3335 CCGAC CTTGTTGCTT TTAGG
hhv4 primer SEQUENCE
F2469 5｀-C CGTAGCCCAT AATGGAACG
R2939 GCGTGTAG GTGGTGGGG-5｀
hhv5 primer SEQUENCE
F1502 5｀-TCAACACTA TGGCCGAGCT TT
R1865 CAGTGG ATTGCGGCGT TAGTA-5｀
hhv6 primer SEQUENCE
hhv7 F2879 5｀-GA TAAAACATAC GCGGTTCAGA GT
R2954 GTAGTACG TAATATGGCG CTC-5｀
ENTEROVIRUS
coxsackievirus primer SEQUENCE
a9，b4，b5 F3 5｀-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTTC
5｀-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTAC
R475 GGGT CTTACGCCGA TTAGG-5｀
echovirus22 primer SEQUENCE
F69 5｀-AA AACCCTTTCC CAGCCTTG
R165 GGAT ACGGACCAGG GGTGA-5｀
poliovirus primer SEQUENCE
F3 5｀-AAAACAGC TCTGGGGTTG TACC
R185 GTGAA GACAAAGGGG CCACT-5｀
la cross primer SEQUENCE
F139 5｀-G TGAAGCAAAA CCCATCCAAA
R393 TATACAAA CGTCGCGTCT AAC-5｀
St.louis primer SEQUENCE
F132 5｀-TGTCACAGT GATGGCACCA GA
R318 CTCA CTGGGTTGTA AACAGACG
venezuelan equine primer SEQUENCE
F80 5｀-T TCCCCAGAAC CGACCCT
R374 GTACCAGTA CTTTAACCTT AGAC-5｀
west nile primer SEQUENCE
F62 5｀-ATGGGTGGA TTTGGTTCTC G
R348 AC CGTTTCCTTC GTAACTGT-5｀
westem equine primer SEQUENCE
F578 5｀-AGG GAGTTCGTAA ACAGATATTT GC
5｀-AGG GAGTTCGTAA ACAGTACCTT G
R898 AGTAG TTTTCGCGAC ACTGATTC-5｀
Japanese B primer SEQUENCE
F17 5｀-TTAC AGCATTAGCC CCGACC
R265 AAAGG TCCCCTTCGA AAACA-5｀
central european primer SEQUENCE
F54 5｀-CATGACC CTTGGAGTGG GG
R224 CGTAGTCGG TATTTCCTCT GTAA-5｀
russian primer SEQUENCE
F98 5｀-ATG AGGACCATTG GGCCTCT
R403 CGACGTAG TACCTACAGT AGT-5｀
Powassan primer SEQUENCE
F102 5｀-GCACGCCAA ATTGACCAAC
R443 CCGAGCCG CTGATACCAC TA-5｀
Dengue primer SEQUENCE
F150 5｀-C GAGAAACCGC GTGTCAAC
R270 TATCGT AAGGATTCTA AAGATCGGTA
Mumps primer SEQUENCE
F261 5`-GATCAAGGCT TGAGCAATCA GTT
R390 ATTG CCATAGGAAT GGGGATGTTT-5｀
Measles primer SEQUENCE
F145 5｀-AACATC AAGCACCGCC TAAAAA
R331 GCTCCTTCTA GGCACTTGAG G
Adenovirus primer SEQUENCE
F95 5｀-GGTATT CTAAACCCCG TTCAGC
R231 TCAGGCCGAG TCACTGAGGA A
LCMV primer SEQUENCE
F153 5｀-CTCATCAT AATCACGAGC ATCAAA
R525 CAGAGTTCAG ATGTGGAGTC GTAGT-5｀
H1V-1 primer SEQUENCE
F9 5｀-A ACAGTACTAG ATGTGGGAGA TGCAT
R214 TT TAGAATCTCG GGAAATCTTG TTTT-5｀
hiv-2 primer SEQUENCE
F483 5｀-GGACATGGGA GGAGCTGGTG GGG
R770 AGAGGATCAG CGGCGGACCA-5｀
inluenza-a primer SEQUENCE
F65 5｀-TCCCTTATACTGGAGATCCTCCAT
R268 TGTTTGTCTG ACACAGGACC-5｀
inluenza-b primer SEQUENCE
F1524 5｀-ATTGAGGGACGTGATGCAGAT
R1701 TGGTAGGGGT TAAAGAAGAA AC-5｀
htlv-1 primer SEQUENCE
F147 5｀-CGCCACTTTG ATTTTATTCT TCC
R480 CACGGTTAGT ACCTGGACGG-5｀
htlv-2 primer SEQUENCE
F34 5｀-AACTGAAACCAAGGCCCTGA
R272 CCTAGGTAGG AGAGGTTCGC-5｀
togavirus primer SEQUENCE
F3245 5｀-TGTGATCAAACTTCCTGGTATCAGA
R3549 TCAATGTAGG ATCGGGGTGGG-5｀
Rickettsia typhi primer SEQUENCE
F101 5｀-CAAGCATAAC AATAGATTCA CCCTC
R458 TGGATGGTTT TAATCGGGTT CAAAC-5｀
Rabies virus primer SEQUENCE
F183 5｀-GGAGATTACA GCCCCAACAA GA
R453 ACATCAACCC CTGCCCAGTC-5｀
Parvovirus B19 primer SEQUENCE
F661 5｀-TTTGAAGAAG GCTATCATAT TCATGT
R1031 CCCTCAGAT CGCCGTGTCC5｀-
Fungi
Cryptococcus primer SEQUENCE
F396 5｀-TGAGAAACGG CTACCACATC C
R572 CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5｀
Bacteria
primer SEQUENCE
F488 5｀-CCA GCAGCCGCGG TAA
R1077 A TTCAGGGCGT TGCTCGC-5｀
Protozoa
primer SEQUENCE
F1461 5｀-GGCTTAATTT GACTCAACAC GG
5｀-GGCTTAATTC GACTCAACAC GG
R2098 TGGCGGG CAGCGAGG-5｀
Claims (6)
1.一种脑膜炎检测芯片，其特征在于：该芯片为玻璃基片上分布有不同区域的微阵列，在每个微阵列区域中分别固定有脑膜炎致病微生物的特异性探针；探针的大小为15-30个碱基，设计61个探针，所设计的探针序列如下：meningoencephalitisvirus probe SEQUENCEhhv1 hhv1 F3455 5`-ACGGCGTCGC CCTGAAhhv2 hhv2 F3455 5`-GGGGCGTTCC GCTCAAhhv3 hhv3 F3262 5`-ACTTATCCC CACGAAAGTC Ghhv5 hhv5 F1644 5`-TCTGTTCAACACCATTAATTTTCACThhv6 hhv6 5`-CACAAACATCCTTTATTAATCCCGhhv7 hhv7 5`-CACAAAGAGTCTTCATTAAGCCGcoxsackievirus a9 F114 5`-AGCAAT GCACCTCTGG TCAATa9，b4，b5 b4 5`-AGCAAAGAAACAATGGTCAATTACT
b5 5`-AGTTAC ACACACTGAT CAACAGTGG
enterovirus71 F116 5`-GCAAC GCAAACCAGA TCAATAGechovirus22 F111 5`-CCCATAGTAA CCAACACCTAAGACApoliovirus F114 ACAAAAC CAAGTTCAAT AGAAGGGla cross F197 AGCA TGATCAAAAC AGAGGSt.louis F219 5`-CTGCTACGAGGC AACCTTGGvenezuelan equine F128 5`-CGC TCGATGGCTA ACCTGAwest nile F280 5`-GCAGACAAGGA GTGGTGGACAwestern equine western F800 5`-AAGACACGACCAGCAGCACC
eastern 5`-AAAACACGTCTAGTAGTACCATCACAA
venezuelan 5`-ACACGACCGGCCGCTCJapanese B F164 5`-GAGGAGG AAATGAAGGC TCAATcentral european F107 5`-TGGA GCTCCGCTGT GGCrussian Russian F272 5`-AGCAGCTCT TACGCTACAT GGAPowassan F332 5`-CGTATGTTG TCAAGGTTGA GCCDengue F218 5`-GGA CCCATGAAAT TGGTGATGMumps F334 5`-GCTGTGGG AGTAATGAAT CAAGTTMeasles F196 5`-AATGT GGAAGTTGGG AATGTCAAdenovirus F141 5`-GGGGATGTCA AATTTTAGCT CCLCMV F385 5`-TGGGGA AATCTGGACT GGAG
5`-TGGGGA GCTCTGGACT GGAGHIV-1 F144 5`-AGGGATG GAAAGGATCA CCGHIV-2 F676 5`-GCTCCACGCTTGCTTGCTTAinluenza-a F124 5`-ACGGTCAACAGGACACATCAATinluenza-b F1567 5`-TGATGAATGACTCAATGGCTAAGAhtlv-1 5`-AGTTTGTTCGTGGACCCTCGhtlv-2 F183 5`-AAAGGATGCC GAGTCTATAA AAGCtogavirus F3321 5`-TTTTCGTGGCACTTTGGCARickettsia typhi F194 5`-GTGCCGAAAG AATTGGTTGA AT
5`-CACGGCTTTCATTAACCAACTTRabies virus F257 5`-TGCAGTCTCC ACCTCAGCAAParvovirus B19 F795 5`-TTTGCCAGGA ATGACTACAA AAGBacteria probe SEQUENCETropheryma whippelii Troph F596 5`-CGGAC CTGCGGTGGG TABorrelia afzelii Afzelii F596 5`-TGTGGAGCTA TGTTGGAAAC TATATGBartonella henselae Barto F596 5`-CTGGAACTGC CTTTGATACT GGBrucella abortus B-abor F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella canis B-canis F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella melitensis B-meli F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBrucella suis B-suis F596 5`-CCGGAACTGC CTTTGATACT GBorrelia burgdorferi berg F596 5`-CTGTGGAGCT ATGTTGGAAA CTATGEscherichia coli esch F596 5`-TGGGAACTGC ATCTGATACT GGBorrelia garinii garinii F596 5`-CTGTGGAACT ATGTTGGAAA CTATATGTStreptococcus pneumoniae R6 group b F596 5`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTHaemophilus influenzae Rd hae F596 5`-AGGAATTGCA TTTCAGACTG GGLeptospira interrogans lep F596 5`-CGCAGCCTGC ACTTGAAACBacillus subtilis list F596 5`-GGGGAGGGTC ATTGGAAACTStreptococcus milleri milleri F596 5`-ATTGTAGGCT TTGGAAACTG TTTAAMycobacterium tuberculosis mycoga F596 5`-GAGCGTGCGG GCGATAMycoplasma PG50 mycopla F596 5`-CAGTTGTATG CATTGGAAAC TATTAATNeisseria meningitidis nei F596 5`-CGGGAACTGC GTTCTGAACTStaphy lococcus aureus sta F596 5`-GTGGAGGGTC ATTGGAAACT GStrep tococcuspneumoniae strp-pneu F596 5`-CCATAGTAGG CTTTGGAAAC TGTTFungi
probe SequenceCryptococcus F436 5`-CAAATTACCC AATCCCGACA CProtozoa probe SEQUENCE
acanthamoebAcanthamoeba sp. a F1759 5`-CCGTGCTTCT TAGAGGGACTGNaegleria jamiesoni naegleria F1759 5`TTTGTCAGCT TCTTAAAGGG ACTTToxoplasma gondii Toxoplasma F1759 5`-CACTTCTTAG AGGGACTTTG CGT
2.一种制备权利要求1所述的脑膜炎检测芯片的制备工艺，其特征在于：所述制备工艺按如下步骤进行：
(1)设计脑膜炎特异性探针和引物；
从数据库中获得可靠的脑膜炎致病微生物基因序列，根据所述的探针序列设计探针；
从数据库中获得可靠的脑膜炎致病微生物基因序列，设计如下PCR引物，针对病毒病
原微生物基因片段进行扩增，扩增的同时标记荧光素；扩增引物序列如下：
meningoencephalitis
virus
primer SEQUENCEhhv1 F3394 5`-TCCAAGCCCC GCAAGChhv2 R3686 CTTTGAGCTG CTTACAACGT ATC-5`hhv3p rimer SEQUENCE
F3125 5`-TCGGGA CATGCCAAGT AAAGT
R3335 CCGAC CTTGTTGCTT TTAGGhhv4 primer SEQUENCE
F2469 5`-C CGTAGCCCAT AATGGAACG
R2939 GCGTGTAG GTGGTGGGG-5`hhv5 primer SEQUENCE
F1502 5`-TCAACACTA TGGCCG AGCT TT
R1865 CAGTGG ATTGCGGCGT TAGTA-5`hhv6 primer SEQUENCEhhv7 F2879 5`-GA TAAAACATAC GCGGTTCAGA GT
R2954 GTAGTACG TAATATGGCG CTC-5`ENTEROVIRUScoxsackievirus primer SEQUENCEa9，b4，b5 F3 5`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTTC
5`-TAAAACAG CCTGTGGGTT GTAC
R475 GGGT CTTACGCCGA TTAGG-5`echovirus22 primer SEQUENCE
F69 5`-AAAACCCTTTCC CAGCCTTG
R165 GGAT ACGGACCAGG GGTGA-5`poliovirus primer SEQUENCE
F3 5`-AAAACAGC TCTGGGGTTG TACC
R185 GTGAA GACAAAGGGG CCACT-5`lacross primer SEQUENCE
F139 5`-G TGAAGCAAAA CCCATCCAAA
R393 TATACAAA CGTCGCGTCT AAC-5`St.louis primer SEQUENCE
F132 5`-TGTCACAGT GATGGCACCA GA
R318 CTCA CTGGGTTGTA AACAGACGvenezuelan equine primer SEQUENCE
F80 5`-T TCCCCAGAAC CGACCCT
R374 GTACCAGTA CTTTAACCTT AGAC-5`west nile primer SEQUENCE
F62 5`-ATGGGTGGA TTTGGTTCTC G
R348 AC CGTTTCCTTC GTAACTGT-5`western equine primer SEQUENCE
F578 5`-AGG GAGTTCGTAAACAGATATTT GC
5`-AGG GAGTTCGTAA ACAGTACCTT G
R898 AGTAG TTTTCGCGAC ACTGATTC-5`Japanese B primer SEQUENCE
F17 5`-TTAC AGCATTAGCC CCGACC
R265 AAAGG TCCCCTTCGA AAACA-5`central european primer SEQUENCE
F54 5`-CATGACC CTTGGAGTGG GG
R224 CGTAGTCGG TATTTCCTCT GTAA-5`russian primer SEQUENCE
F98 5`-ATG AGGACCATTG GGCCTCT
R403 CGACGTAG TACCTACAGT AGT-5`Powassan primer SEQUENCE
F102 5`-GCACGCCAA ATTGACCAAC
R443 CCGAGCCG CTGATACCAC TA-5`Dengue primer SEQU ENCE
F150 5`-C GAGAAACCGC GTGTCAAC
R270 TATCGT AAGGATTCTA AAGATCGGTAMumps primer SEQUENCE
F261 5`-GATCAAGGCT TGAGCAATCA GTT
R390 ATTG CCATAGGAAT GGGGATGTTT-5`Measles primer SEQUENCE
F145 5`-AACATC AAGCACCGCC TAAAAA
R331 GCTCCTTCTA GGCACTTGAG GAdenovirus primer SEQUENCE
F95 5`-GGTATT CTAAACCCCG TTCAGC
R231 TCAGGCCGAG TCACTGAGGA ALCMV primer SEQUENCE
F153 5`-CTCATCAT AATCACGAGC ATCAAA
R525 CAGAGTTCAG ATGTGGAGTC GTAGT-5`HIV-1 primer SEQUENCE
F9 5`-A ACAGTACTAG ATGTGGGAGA TGCAT
R214 TT TAGAATCTCG GGAAATCTTG TTTT-5`hiv-2 primer SEQUENCE
F483 5`-GGACATGGGA GGAGCTGGTG GGG
R770 AGAGGATCAG CGGCGGACCA-5`inluenza-a primer SEQUENCE
F65 5`-TCCCTTATACTGGAGATCCTCCAT
R268 TGTTTGTCTG ACACAGGACC-5`inluenza-b primer SEQUENCE
F1524 5`-ATTGAGGGACGTGATGCAGAT
R1701 TGGTAGGGGT TAAAGAAGAA AC-5`htlv-1 primer SEQUENCE
F147 5`-CGCCACTTTG ATTTTATTCT TCC
R480 CACGGTTAGT ACCTGGACGG-5`htlv-2 primer SEQUENCE
F34 5`-AACTGAAACCAAGGCCCTGA
R272 CCTAGGTAGG AGAGGTTCGC-5`togavirus primer SEQUENCE
F3245 5`-TGTGATCAAACTTCCTGGTATCAGA
R3549 TCAATGTAGG ATCGGGGTGGG-5`Rickettsia typhi primer SEQUENCE
F101 5`-CAAGCATAAC AATAGATTCA CCCTC
R458 TGGATGGTTT TAATCGGGTT CAAAC-5`Rabies virus primer SEQUENCE
F183 5`-GGAGATTACA GCCCCAACAA GA
R453 ACATCAACCC CTGCCCAGTC-5`Parvovirus B19 primer SEQUENCE
F661 5`-TTTGAAGAAG GCTATCATAT TCATGT
R1031 CCCTCAGAT CGCCGTGTCC5`-FungiCryptococcus primer SEQUENCE
F396 5`-T GAGAAACGG CTACCACATC C
R572 CGTTCAGACC ACGGTCGTC-5`Bacteria
primer SEQUENCE
F488 5`-CCA GCAGCCGCGG TAA
R1077 ATTCAGGGCGT TGCTCGC-5`Protozoa
primer SEQUENCE
F1461 5`-GGCTTAATTT GACTCAACAC GG
5`-GGCTTAATTC GACTCAACAC GG
R2098 TGGCGGG CAGCGAGG-5`
(2)、合成探针；
(3)、制备芯片；
用去离子水将合成的探针溶解，得到浓度为200mmol/l的溶液，在玻璃基片上进行点样；点好的芯片于37℃下水化3天，然后在80℃下烘干2小时；以探针缓冲液及蒸馏水冲洗玻片，吹干；以封闭液封闭玻片，之后洗涤3次，吹干备用。
3.根据权利要求2所述的脑膜炎检测芯片的制备工艺，其特征在于：在合成探针的步骤中，探针5’端加氨基修饰。
4.根据权利要求2所述的脑膜炎检测芯片的制备工艺，其特征在于：点样中点的大小为50-100微米。
5.根据权利要求2所述的脑膜炎检测芯片的制备工艺，其特征在于：探针缓冲液为1×SSC，0.1％SDS；封闭液为1％BSA，PH＝7，0.01mol/l PB。
6、一种权利要求1所述脑膜炎检测芯片的使用方法，其特征在于：所述使用方法按如下步骤进行：
(1).处理样品
将病人脑脊液的样品，分别提取DNA，备用；如需长时间放置，在-20℃下冻存；
(2).PCR引物扩增
在反应管中加入扩增反应混合物——Taq酶，相应的处理好的样品和引物，足量的dNTP以及荧光素标记的dUTP；扩增条件如下：
94℃ 5min
94℃ 30sec
56℃ 30sec
72℃ 1min
72℃ 5min
以上步骤为30个循环；
(3).杂交
PCR产物与权利要求1所述脑膜炎检测芯片上的探针在60℃下杂交2小时，用10×SSC，
0.1％SDS的杂交缓冲液与PCR产物的比例为1∶1，洗涤3次；
(4).检测
用扫描仪扫描杂交后的芯片，得到图像并输出结果；
(5).数据分析
将芯片分析结果输出。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN 03111451 CN1271213C (zh) | 2003-04-14 | 2003-04-14 | 一种脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 03111451 CN1271213C (zh) | 2003-04-14 | 2003-04-14 | 一种脑膜炎检测芯片及其制备工艺和使用方法 |
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|---|---|
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| CN1271213C true CN1271213C (zh) | 2006-08-23 |
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ID=34239241
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| CN (1) | CN1271213C (zh) |
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2003
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