CN105683395A - 肺炎链球菌的检测 - Google Patents
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Abstract
本发明基于样品中肺炎链球菌的检测方法,其允许特异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。此外,本发明涉及(i)试剂盒,其包含在其中设置本发明的探针的微阵列;(ii)探针组本身;(iii)微阵列,其包含探针组;和(iv)以上方法、试剂盒、探针组、和微阵列用于检测样品中肺炎链球菌的用途。
Description
发明背景
肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)是脓毒症(sepsis)的致病剂,并且能够特异性检测其在血液中的存在将会是方便的。肺炎链球菌还是社区获得性肺炎(community-acquiredpneumonia)的主要成因。非常重要的是,能够区分肺炎链球菌与链球菌族群的其他成员,从而确定样品中存在的任何链球菌是否实际上对应于致病肺炎链球菌种,或对应于宿主中组成性地存在的不引起疾病的其他无害链球菌种。
已经进行了许多尝试以检测肺炎链球菌并且将其与链球菌族群的其他成员区分(Wessels等人,J.Clin.Microbiol.2012年4月,第50卷,第4期,1171-1177)。这些包括培养物测试和常规生物化学和表型测试,如革兰氏染色形态、奥普托欣敏感性、菌落形态、和羊血琼脂上的α-溶血。所使用的另外的技术包括:MALDI-TOF(MS基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorptionionization-timeofflightmassspectrometry))、若干基因的序列分析、和包括实时PCR测定在内的分子测定。然而,归因于不同种之间的高度序列相似性,这些技术中的大多数不能将肺炎链球菌与链球菌族群的其他成员区分。其他技术包括用于检测链球菌属细菌的基于基因rpoB区域的扩增的分子方法。在EP1558637和EP1694861中提供了这种方法的两个具体实例。
EP1558637利用rpoB基因的724bp片段(在WO2004/041841中显示为SEQID),用于检测可能存在于样品中的链球菌属细菌。可以通过指定片段的扩增来进行这样的检测。然而,没有为链球菌属的不同种的特异性检测提供特定的探针。
在EP1694861中,利用对于所有链球菌属的种常见的一对引物扩增rpoB基因的片段。从而得到扩增产物,而如在以上EP1558637中的,与可以存在于样品中的特定种无关。在本情况中,提供了探针,其预期用于肺炎链球菌和酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的特异性检测(相应WO2005/059156的表3)。然而,一些探针之间的最小序列差异可以证实以下是困难的:这样的探针可以实际上用于它们靶向的两种不同链球菌种的特异性检测(例如:SEQID和SEQID的探针,分别对应于酿脓链球菌和肺炎链球菌,仅有两个核苷酸的差异)。没有提供对应于链球菌属的其他种的其他探针。
考虑到以上信息,需要提供基于探针杂交的用于相对于链球菌属的其他种特异性检测肺炎链球菌的有效方法。换句话说,非常理想的是提供允许差异检测样品中存在的肺炎链球菌的的方法,即与链球菌属的其他种相区别的肺炎链球菌的特异性检测。
发明概述
本发明要解决的问题是提供用于检测样品中存在的肺炎链球菌的方法,其允许特异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。
解决方案基于同时使用包含SEQID和SEQID(参见以下表1)或由其组成的探针以检测样品中肺炎链球菌的存在。在一个实施方案中,探针由SEQID或SEQID组成。
如以上所指出的,在链球菌属的不同种之间存在高序列相似性;当试图通过探针杂交检测肺炎链球菌并且将其与其他链球菌种特异性区分时,这种情况构成了沉重的负担。SEQID和SEQID的探针以及因此的本发明的各种方面允许有效地检测肺炎链球菌并且将肺炎链球菌与链球菌属的至少以下种区分:星座链球菌(Streptococcus(S.)constellatus)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)、轻型链球菌(S.mitis)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、猪链球菌(S.suis)、中链球菌(S.intermedius)、血链球菌(S.sanguinis)、口腔链球菌(S.oralis)和副血链球菌(S.parasanguinis)。
根据本发明的各种方面,通过与如SEQID和SEQID中定义的两个探针的杂交进行同时检测,用于肺炎链球菌的特异性检测。仅当样品中存在的DNA对应于肺炎链球菌时,才发生与这两种探针的结合。在没有或仅一种SEQID和SEQID的探针结合样品中存在的DNA的情况下,该DNA不对应于肺炎链球菌,而是对应于链球菌属的其他种。唯一的例外是含有轻型链球菌的DNA的样品的情况,在这种情况中,样品DNA与SEQID的探针结合,还在一定水平上发生了DNA与SEQID的探针的结合,但是比与SEQID的探针结合低得多的程度(参见以下实施例2)。“低得多的程度”理解为意味着与利用SEQID获得的结合水平相比20%以下的结合水平。
表1.
如由表1的SEQIDSEQID和SEQIDN°5定义的探针也结合肺炎链球菌的核酸。然而,已经证实它们是非特异性的,因为它们也任意地结合链球菌属的其他种的核酸,而不遵循任何类型的可预测模式。
发明人不清楚现有技术水平中或探针序列中存在任何线索(pointer),以解释为什么与SEQID和SEQID的探针的同时杂交会导致以将会允许将其与链球菌属的其他种以特定方式区分的方式检测肺炎链球菌。在解链温度、核苷酸的数量、%GC(表1)方面或这些探针区别于肺炎链球菌野生型序列的核苷酸数量方面没有要发现的解释(表2)。
表2.SEQID至5的探针区别于肺炎链球菌野生型序列和链球菌属的其他种的序列的核苷酸数量:
有时已经检测了某些种的序列的不同变体。这是为什么有时某个探针区别于链球菌的某个种的序列的核苷酸数量在两个值之间的范围内的原因。
发明人因此已经意外地发现,利用如由SEQID和SEQID定义的探针同时温育允许检测肺炎链球菌并且特异性地区分肺炎链球菌与链球菌属的其他种。因此,SEQID和SEQID的探针的同时使用提供了对于样品中肺炎链球菌的特异性检测的问题的解决方案。这对于将肺炎链球菌与其他微生物相区分是非常重要的;尤其是,与宿主中组成性地存在的并且不引起疾病的无害链球菌种(尤其是呼吸道中的)相区分。这对于作为脓毒症的致病剂存在于血液中的肺炎链球菌的检测来说也是重要的。
本发明的方面之一因此对应于一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的方法,所述方法包括使所述样品与由SEQID和SEQID定义的探针接触。探针可以设置在微阵列中。
本发明的第二方面对应于一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的试剂盒,其中所述试剂盒包含一个阵列容器或一组阵列容器,其各自包含其中设置SEQID和SEQID的探针的微阵列。
本发明的第三和第四方面分别对应于探针组,所述探针组包括探针SEQID和SEQID并且对应于一种微阵列,所述微阵列包含该探针组。另一个方面涉及由SEQID组成的分离的核酸序列并且涉及包含SEQID的微阵列。在一个实施方案中,分离的核酸序列用可检测部分标记。另一个方面涉及由SEQID组成的分离的核酸序列并且涉及包含SEQID的微阵列。在一个实施方案中,分离的核酸序列用可检测部分标记。另一个方面涉及包含SEQID和/或SEQID的组合物。
本发明的另外的方面对应于本发明的方法、试剂盒、微阵列、分离的核酸序列或探针组用于检测肺炎链球菌以及用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的用途。尤其是,感染是脓毒性感染或呼吸道感染。
在另一个方面中,本发明涉及一种用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的方法,所述方法包括使来自所述患者的样品与由SEQID和SEQID定义的探针接触。
附图简述
图1.
图1示出了本发明的实施例1的扩增产物(事先变性)与具有包含本发明的SEQID和SEQID的探针的微阵列杂交的可视化。
被矩形包围的“斑点”对应于SEQID和SEQID的探针的位置。在被每个矩形包围的两个“斑点”中,第一个对应于SEQID并且第二个对应于SEQID矩形外显示信号的“斑点”对应于位置标记物。
含有肺炎链球菌的实施例1的样品在对应于SEQID和SEQID的探针的两个位置处显示阳性信号并且具有相等的强度。这归因于样品的扩增并变性的DNA与这两种探针的特异性结合。
图2.
图2显示了本发明的实施例2的扩增产物(事先变性)与具有包含本发明的SEQID和SEQID的探针的微阵列杂交的可视化。
被矩形包围的“斑点”对应于SEQID和SEQID的探针的位置。在被每个矩形包围的两个“斑点”中,第一个对应于SEQID并且第二个对应于SEQID矩形外显示信号的“斑点”对应于位置标记物。
含有轻型链球菌的实施例2的样品在对应于SEQID的探针的位置处显示阳性信号,并且在SEQID的探针的位置处显示低得多的强度的信号。在SEQID的位置处出现的信号具有小于在SEQID的位置处出现的信号的20%的强度。
图3.
图3示出了本发明的实施例3的扩增产物(事先变性)与具有包含本发明的SEQID和SEQID的探针的微阵列杂交的可视化。
被矩形包围的“斑点”对应于SEQID和SEQID的探针的位置。在被每个矩形包围的两个“斑点”中,第一个对应于SEQID并且第二个对应于SEQID矩形外显示信号的“斑点”对应于位置标记物。
含有口腔链球菌的实施例3的样品仅在对应于SEQID的探针的位置处显示阳性信号,并且在SEQID的探针的位置处不显示信号。
图4.
图4示出了本发明的实施例4的扩增产物(事先变性)与具有包含本发明的SEQID和SEQID的探针的微阵列杂交的可视化。
被矩形包围的“斑点”对应于SEQID和SEQID的探针的位置。在被每个矩形包围的两个“斑点”中,第一个对应于SEQID并且第二个对应于SEQID矩形外显示信号的“斑点”对应于位置标记物。
含有停乳链球菌的实施例4的样品在SEQID或SEQID的探针的位置处不显示任何类型的信号。
发明详述
在以下章节中,更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确有相反指示,如此定义的每个方面均可以与任何其他一个方面或多个方面组合。尤其是,指出作为优选的或特别有利的任何特征均可以与任何其他优选的或有利的一个特征或多个特征组合。
本发明的第一方面对应于一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的方法,所述方法包括使所述样品与SEQID和SEQID的探针接触。
本发明的第二方面涉及一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的试剂盒,其中所述试剂盒包含一个阵列容器或一组阵列容器,其各自包含其中设置SEQID和SEQID的探针的微阵列。
本发明的第三和第四方面分别对应于探针组,所述探针组包括SEQID和SEQID的探针,并且对应于一种微阵列,所述微阵列包含该探针组。另一个方面涉及由SEQID组成的分离的核酸序列。另一个方面涉及由SEQID组成的分离的核酸序列。
本发明的另外的方面对应于本发明的方法、试剂盒、微阵列、分离的核酸序列或探针组用于检测肺炎链球菌以及用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的用途。尤其是,感染是脓毒性感染或呼吸道感染。
在另一个方面中,本发明涉及一种用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的方法,所述方法包括使来自所述患者的样品与由SEQID和SEQID定义的探针接触。所述方法可以包括如以下进一步解释的扩增步骤。如果两种探针都与样品中存在的DNA杂交,则将患者诊断为患有由肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)引起的感染。所述方法优选在体外或离体进行。
本发明还涉及一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的测定,所述方法包括使所述样品与SEQID和SEQID的探针接触。
定义:
如在本文中所使用的术语“SEQID和SEQID的/定义的探针”是指描绘为SEQID和SEQID的两条核苷酸序列,而且还指它们的明显的等同物,如它们的互补序列或具有与SEQID和SEQID或它们的互补序列等同的结合能力的序列(例如,与SEQID和2的序列或与它们的互补序列区别在于其1个突变的序列)。
如在本文中所使用的“引物”、“扩增引物”或“PCR扩增引物”意指“核酸扩增反应的引物”。如在本文中所使用的“低得多的结合程度”理解为意指与作为参照的结合水平相比20%以下的结合水平。待测试的DNA和任何探针的结合通过杂交发生。
在优选的实施方案中,探针设置在微阵列中,例如固定在固体支持物上。微阵列是微小寡核苷酸斑点的集合。DNA微阵列(通常也被称为基因芯片、DNA芯片、或生物芯片)是连接至固体表面的微小DNA斑点的集合。合成探针并且之后将其经由表面改造(surfaceengineering)通过与化学基质(经由环氧基-硅烷、氨基硅烷、赖氨酸、聚丙烯酰胺或其他)的共价键连接至固体表面。固体表面是本领域中已知的并且包括微珠以及固体支持物。
因此,具体地,本发明的探针可以固定在固体支持物上。这种固体支持物可以是阵列容器的底部或者连接至阵列容器的底部的不同固体支持物。这意味着,微阵列的表面可以是阵列容器的平坦底部。备选地,微阵列的表面可以是连接至阵列容器的底部的固体支持物。本发明的探针可以包含在单个阵列容器中,或者包含在一组阵列容器中。
在本文中所描述的并且根据本发明,探针容纳在微阵列中,所述微阵列可以置于载玻片上,或者容纳在反应容器中,其之后被称为阵列容器。阵列容器可以具有不同的提供形式,包括单个阵列容器,如孔或管,或排列在孔或管的条带,或平板中的阵列容器组。通常,板由阵列容器条带的组构成。因此,本发明的微阵列可以容纳在单个阵列容器中。备选地,两个以上微阵列可以容纳在容器的条带中。在优选的实施方案中,容器的条带由8个容器构成。此外,三个以上阵列容器可以排列在容器条带的组中。在另一个优选的实施方案中,容器条带的组是微量滴定板。在此外另一个优选实施方案中,微量滴定板由96个阵列容器组成。
本发明的探针可以通过不同方法获得,诸如化学合成(例如,通过常规磷酸三酯方法);或遗传工程技术,例如通过重组质粒的分子克隆,对应的核苷酸序列插入所述重组质粒中并且以后可以通过用核酸酶消化而获得。
根据本发明的方法和试剂盒,试验样品可以在与SEQID和SEQID的探针接触之前扩增。应该是这样的情况,任何技术人员已知的对于核酸扩增并且尤其是对于PCR扩增所需的组分也可以存在于扩增混合物中。因此,PCR扩增引物,适当的三磷酸核苷酸如dATP、dCTP、dGTP、dTTP,和适合的用于聚合的酶也可以存在于扩增试剂的混合物中。
可以使用任何方便的用于聚合的酶。具体地,QIAGEN多重PCR试剂盒的HotStarTaqDNA聚合酶表现特别良好。这种DNA聚合酶是TaqDNA聚合酶的改进形式,其在环境温度下没有聚合酶活性,并且通过在95℃的15分钟的温育而活化。也可以优选使用现有技术水平中已知的任何其他具有这些特征的酶。
标准热循环条件可以用于进行根据本发明的扩增。一些特别优选的条件是:
一些特别优选的PCR扩增引物是包含由以下表3中显示的SEQID和SEQID形成的组中的任何序列的核酸序列。最优选地,PCR扩增引物由核酸序列SEQID和SEQID组成。
表3:
M=A/C;R=A/G;Y=C/T
扩增引物并非必须是SEQID和SEQID的那些。可以备选地使用产生包含与SEQID和SEQID的探针杂交的区域的扩增产物的其他扩增引物对。
本发明容许在同一反应混合物中存在用于其他微生物的扩增引物。此外,其还容许包含用于扩增至少一个内部对照(InternalControl)和一个提取对照(ExtractionControl)的引物对。
优选地,在扩增过程之后,将所得到的扩增产物转化为单链DNA,之后与相应探针杂交。最优选地,通过变性扩增产物,最优选通过热变性,得到单链DNA。
在与探针温育前不扩增待测试样品的情况下,可以通过任何本领域中已知的DNA标记方法来标记样品中存在的核酸。
此外,可以在扩增期间在DNA扩增产物中引入标记以允许进一步的检测;尤其是,提供可以通过比色法、通过荧光法、或通过任何本领域中已知的标记方法检测的信号的标记。标记可以是放射性试剂、化学发光试剂、发光试剂和荧光试剂。在优选的方面中,所使用的标记是生物素。然而,可以使用任何本领域中已知的其他类型的标记(例如洋地黄毒苷(digoxigenin))。在优选的方面中,在5’端用生物素标记所使用的引物中的至少一个。此外,可以备选地通过将携带标记的修饰的核苷酸(例如,生物素化的或洋地黄毒苷dUTP衍生物)加入至PCR混合物来实现扩增的DNA的标记。在某些实施方案中,可以使用放射性标记,以及荧光团。
可以使用技术人员已知的可以使得能够检测任何扩增产物及其相应探针之间相互作用的备选方法,包括隐含(imply)探针的标记的方法。
可以将变性的扩增产物与固定在微阵列中的探针温育,所述变性的扩增产物是其本身,或与本领域技术人员已知的包含盐和洗涤剂的杂交溶液混合以促进DNA分子之间的相互作用。
归因于样品DNA的标记,每当样品分子与微阵列的表面上的探针分子相互作用时,报告试剂结合于标记并且产生可以通过检测装置检测的可见信号。通过微阵列的表面上的信号的位置来确定相互作用的探针和样品分子。在其中用生物素标记样品扩增产物的具体情况中,报告试剂可以是共价连接至链霉亲和素的辣根过氧化物酶。后者与生物素特异性地结合,并且过氧化物酶引起底物如四甲基联苯胺(TMB)或邻联茴香胺的沉淀。
任何现有技术水平中已知的其他检测方法,如荧光,可以用于检测扩增产物和相应探针之间的相互作用。
可以等同地使用任何引起在阵列元件上沉淀并且可以用于检测靶标和探针分子之间相互作用的其他反应。
在优选的实施方案中,靶标分子及其相应特异性或对照探针之间的相互作用的可视化由以下步骤组成:
-首先,使用光学器件捕获阵列的图像;
-之后,分析图像;
-最后,提供含有结果的说明的报告。
优选地,用适当的软件分析图像。可以使用任何适用于这种处理的装置。
在优选的实施方案中,可以在本发明中处理的试验样品的类型是鼻咽渗出物、鼻咽洗出液、痰、支气管-肺泡吸出物、和支气管-肺泡洗出液。这些将会是用于呼吸道感染的诊断的最适合的样品。根据本发明的方法和试剂盒处理的另外的样品是血液和血液培养物样品,在患有脓毒症的患者的情况下它们是最适合的。还可以使任何来自个体的其他体液、或组织进行本发明的方法和试剂盒。个体是人。
试验样品可以等同地为从原始样品中提取的遗传物质。可以通过现有技术水平的自动提取技术以及手动提取技术二者进行遗传物质的提取。
在最优选的实施方案中,自动提取系统是BioMerieux的NucliSENSeasyMAG(EP1694813),其与用于来自宽范围的样品体积和类型的总核酸的通用分离的BioMerieux的技术组合使用磁性粒子。可以等同地使用其他自动提取技术。
技术人员还将清楚用于手动处理样品以提取核酸的技术和方法;并且可以使用任何这种适合的方法。
在具体实例中,从待测试的样品中提取核酸。优选地,最初体积在200μl至1ml的范围内。在提取步骤之后,将沉淀物在25μl至80μl体积的无RNA酶水中重悬。在具体的实施方案中,将包含从试验样品中提取的遗传物质的25至80μl中的5μl添加至含有扩增反应物的容器中,最终体积为50μl。
在本说明书中提及的全部文献通过引用其整体结合在本文中。
除非另外指出,本文中使用的“和/或”应理解为具体公开了多个指定特征或组分中的每一个,并且在每个组合中具有或不具有其他特征或组分。例如,“A、B和/或C”应理解为具体公开了(i)A、(ii)B、(iii)C、(iv)A和B,(v)B和C或者(vi)A和B和C中的每一个,如同每个在本文中单独地给出。
如在本文中和在所附权利要求中使用的,单数形式“一个(a)”、“一个(an)”、和“所述(the)”包括复数的所指对象,除非上下文另外指出。
除非上下文另外指出,以上给出的特征的描述和定义不限于本发明的任何具体方面或实施方案并且等同地应用于所描述的全部方面和实施方案。
以下提供的实施例仅是说明本发明并且不以任何方式限制所附权利要求的范围。
实施例
实施例1:
得到对肺炎链球菌阳性的血液培养物的样品,并且借助BioMerieux的NucliSENSeasyMAG试剂盒从其中提取DNA。所使用的血液培养物的最初体积为1ml,而洗脱之后的最终体积为80μl。
接下来,选取5μl的洗脱体积并且用以下试剂的混合物对其进行扩增:
通过在95℃温育10分钟使扩增产物变性。之后,在标准杂交溶液的存在下,将5μl的变性PCR产物与固定在已知位置处的包含SEQID和SEQID的探针的微阵列温育。
在一系列标准洗涤和封闭步骤之后,拍摄图像,得到图1中示出的最终结果的可视化。
实施例2
得到对轻型链球菌阳性的血液培养物的样品,并且针对肺炎链球菌进行实施例1中描述的相同步骤。在图2中显示了最终结果的可视化。
实施例3
得到对口腔链球菌阳性的血液培养物的样品,并且针对肺炎链球菌进行实施例1中描述的相同步骤。
在图3中显示了最终结果的可视化。
实施例4:
得到对停乳链球菌阳性的血液培养物的样品,并且对其进行针对肺炎链球菌的实施例1中描述的相同步骤。在图4中显示了最终结果的可视化。
Claims (18)
1.一种用于检测试验样品中肺炎链球菌(Streptococcuspnumoniae)的方法,所述方法包括使所述样品与和的探针接触。
2.权利要求1所述的方法,其中在与所述探针接触前,对所述样品进行PCR扩增。
3.权利要求2所述的方法,其中使用两条分别包含和的核酸序列作为PCR扩增引物。
4.权利要求1至3所述的方法,其中在与和的所述探针接触之前,由所述样品或由任何由其得到的PCR扩增产物得到单链寡或多核苷酸。
5.权利要求4所述的方法,其中通过使所述样品中或由其得到的所述扩增产物中存在的任何双链寡或多核苷酸变性得到单链寡或多核苷酸。
6.权利要求1至5所述的方法,其中和的所述探针设置在微阵列中。
7.权利要求1至6所述的方法,其中和的所述探针包含在单个阵列容器中,或者包含在一组阵列容器中。
8.一种用于检测试验样品中肺炎链球菌的试剂盒,其中所述试剂盒包含一个阵列容器或一组阵列容器,其各自包含其中设置和的探针的微阵列。
9.权利要求8所述的试剂盒,其中所述试剂盒还包含:
i)用于使核酸与所述微阵列的所述探针的杂交可视化的试剂,和
ii)具有PCR扩增引物的扩增混合物。
10.权利要求9所述的试剂盒,其中所述扩增混合物包含两条分别包含和的核酸序列作为PCR扩增引物。
11.探针组,所述探针组包括和的探针。
12.一种分离的核酸序列,所述分离核酸序列由定义。
13.一种分离的核酸序列,所述分离核酸序列由定义。
14.一种微阵列,所述微阵列包含权利要求11、12或13中定义的所述探针组。
15.权利要求1至7的所述的方法、权利要求8至10所述的试剂盒、权利要求11所述的探针组、权利要求12或13所述的分离的核酸或权利要求14所述的微阵列用于检测肺炎链球菌的用途。
16.权利要求1至7的所述的方法、权利要求8至10所述的试剂盒、权利要求11所述的探针组、权利要求12或13所述的分离的核酸或权利要求14所述的微阵列用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的用途。
17.权利要求16所述的用途,其中所述感染是脓毒性感染或呼吸道感染。
18.一种用于诊断患者中由肺炎链球菌导致的感染的方法,所述方法包括使来自所述患者的样品与由和定义的探针接触。
Applications Claiming Priority (3)
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