JP2001521721A - サルモネラ菌を検出するための核酸分子セット、核酸、キットおよび使用 - Google Patents
サルモネラ菌を検出するための核酸分子セット、核酸、キットおよび使用Info
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- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
本発明はサルモネラ菌属の細菌を検出するための核酸分子もしくはその分子群ならびに方法に関する。さらにこの発明の目的は、前記検出方法を実施するための試験キットもしくは試験キット群である。
Description
【０００１】 使用した原料を介してまたは生産または包装工程中の病原性微生物による食品
および薬品産業の製品類の汚染は大きな問題である。サルモネラ菌は食料品を通
して人間に伝染する最も重要な病原体に属している。常套的な微生物学的検出方
法によるサルモネラ菌の検出および同定は非常に時間がかかるので − 法律規定
（ＬＭＢＧ、ＦＤＡ）により要請された精製とその後に続く血清型別のために少
なくとも５日必要であり − 代替の迅速法に大きな需要がある。
および薬品産業の製品類の汚染は大きな問題である。サルモネラ菌は食料品を通
して人間に伝染する最も重要な病原体に属している。常套的な微生物学的検出方
法によるサルモネラ菌の検出および同定は非常に時間がかかるので − 法律規定
（ＬＭＢＧ、ＦＤＡ）により要請された精製とその後に続く血清型別のために少
なくとも５日必要であり − 代替の迅速法に大きな需要がある。
【０００２】 定期的な微生物の把握の導入に向けて近年一連の新たな方法が開発されてきた
。これには、多価または単クローン抗体の導入に基づく免疫学的な方法と、病原
菌に特異的な核酸へのハイブリッド形成を利用して検出するための核酸プローブ
が使用される方法とが含まれる。その他の方法として核酸ハイブリッド形成によ
る確認反応のある又はそれに適合する確認反応のない特異的な核酸増幅に基づく
方法が記述されている。核酸を増幅するための適切な方法は、たとえばポリメラ
ーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）［米国特許第４６８３１９５
号、第４６８３２０２号および第４９６５１８８号］、リガーゼ連鎖反応［ＷＯ
公開第８９／０９８３５号］、‘自己維持配列複製’［欧州特許出願ＥＰ-３２ ９８２２号］、‘増幅系に基づく転写’［欧州特許出願ＥＰ-３１０２２９号］ およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系［米国特許第４９５７８５８号］がある。
。これには、多価または単クローン抗体の導入に基づく免疫学的な方法と、病原
菌に特異的な核酸へのハイブリッド形成を利用して検出するための核酸プローブ
が使用される方法とが含まれる。その他の方法として核酸ハイブリッド形成によ
る確認反応のある又はそれに適合する確認反応のない特異的な核酸増幅に基づく
方法が記述されている。核酸を増幅するための適切な方法は、たとえばポリメラ
ーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、PCR）［米国特許第４６８３１９５
号、第４６８３２０２号および第４９６５１８８号］、リガーゼ連鎖反応［ＷＯ
公開第８９／０９８３５号］、‘自己維持配列複製’［欧州特許出願ＥＰ-３２ ９８２２号］、‘増幅系に基づく転写’［欧州特許出願ＥＰ-３１０２２９号］ およびＱβ ＲＮＡレプリカーゼ系［米国特許第４９５７８５８号］がある。
【０００３】 上述の核酸に基づく方法は、常套的な微生物学の方法と異なり、被検試料から
検出すべき微生物の、時間のかかる増殖が必要なくなるほど敏感である。従って
、たとえばサルモネラ菌類の存在または非在の検査は、上述の核酸に基づく方法
を適用すると通常１日以内の作業日で終了してしまう。 ポリメラーゼ連鎖反応によりサルモネラ菌を検出するために幾つかの核酸配列
が知られている。しかしその欠点は、プライマとしてこの核酸配列を導入する際
にポリメラーゼ連鎖反応に誤った正の［ＷＯ９５／３３８５４］または誤った負
の［ＷＯ９２／０１０５６；ＷＯ９５／００６６４；ＷＯ９２／０１０５６；Ｗ
Ｏ９３／０４２０２］結果が発生することである。別の場合では７つのサルモネ
ラ菌亜種全ての菌株のうち不十分な数のみが調査された［ＷＯ９２／０８８０５
；ＷＯ９４／２５５９７；ＤＥ４３３７２９５］ため、この結果それぞれの核酸
配列が全てのサルモネラ菌株の検出に適しているかどうかはこれまでまだ明らか
にされていない。
検出すべき微生物の、時間のかかる増殖が必要なくなるほど敏感である。従って
、たとえばサルモネラ菌類の存在または非在の検査は、上述の核酸に基づく方法
を適用すると通常１日以内の作業日で終了してしまう。 ポリメラーゼ連鎖反応によりサルモネラ菌を検出するために幾つかの核酸配列
が知られている。しかしその欠点は、プライマとしてこの核酸配列を導入する際
にポリメラーゼ連鎖反応に誤った正の［ＷＯ９５／３３８５４］または誤った負
の［ＷＯ９２／０１０５６；ＷＯ９５／００６６４；ＷＯ９２／０１０５６；Ｗ
Ｏ９３／０４２０２］結果が発生することである。別の場合では７つのサルモネ
ラ菌亜種全ての菌株のうち不十分な数のみが調査された［ＷＯ９２／０８８０５
；ＷＯ９４／２５５９７；ＤＥ４３３７２９５］ため、この結果それぞれの核酸
配列が全てのサルモネラ菌株の検出に適しているかどうかはこれまでまだ明らか
にされていない。
【０００４】 たとえば国際特許出願ＷＯ９５／００６６４に記載されたプライマおよびプロ
ーブの長所は、この特許出願が誤った正の結果を生ぜずに、サルモネラ菌属の細
菌の高選択性の検出を可能にすることである。しかしポリメラーゼ連鎖反応のよ
うな増幅方法におけるＷＯ９５／００６６４記載のオリゴヌクレオチドを導入す
る際の欠点は、記述されたプライマ対のいずれによっても７つのサルモネラ菌亜
種の全代表物質が検出されないという事実にある。たとえばプライマＳＴ１１／
ＳＴ１５を導入する際に亜種IIIａ（サブスピーシーズ アリゾナエ）の複数の代
表物質が、プライマＳＴ１１／ＳＴ１４を導入する際に亜種Ｉ（サブスピーシー
ズ エンテリカ 血清型、ブロックレー）の複数の代表物質および亜種IIIａ（サ ブスピーシーズ アリゾナエ）が検出されない。
ーブの長所は、この特許出願が誤った正の結果を生ぜずに、サルモネラ菌属の細
菌の高選択性の検出を可能にすることである。しかしポリメラーゼ連鎖反応のよ
うな増幅方法におけるＷＯ９５／００６６４記載のオリゴヌクレオチドを導入す
る際の欠点は、記述されたプライマ対のいずれによっても７つのサルモネラ菌亜
種の全代表物質が検出されないという事実にある。たとえばプライマＳＴ１１／
ＳＴ１５を導入する際に亜種IIIａ（サブスピーシーズ アリゾナエ）の複数の代
表物質が、プライマＳＴ１１／ＳＴ１４を導入する際に亜種Ｉ（サブスピーシー
ズ エンテリカ 血清型、ブロックレー）の複数の代表物質および亜種IIIａ（サ ブスピーシーズ アリゾナエ）が検出されない。
【０００５】 ここに提示した発明の目標は、プライマおよび／またはプローブとしての核酸
配列の導入がサルモネラ菌属の全代表物質を可能な限り完全に把握することを保
証する核酸配列の確定によるＷＯ９５／００６６４に記載された検出方法を最適
化することであった。
配列の導入がサルモネラ菌属の全代表物質を可能な限り完全に把握することを保
証する核酸配列の確定によるＷＯ９５／００６６４に記載された検出方法を最適
化することであった。
【０００６】 一実施態様に基づき本発明が解決しようとする課題は、サルモネラ エンテリ カ サブスピーシーズ エンテリカ、サラマエ、アリゾナエ、ジアリゾナエ、フー
テナエ、ボンゴリおよびインディカの代表物質を検出するための方法において、
これらの亜種の全代表物質を検出することができる核酸分子セットにより解決さ
れ、その際このセットは （ａ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの代表物質の核 酸分離株を利用して第１核酸分子（核酸分子１）が取得または誘導され、この第
1核酸分子が特異的に前記代表物質または前記の１つのサルモネラ エンテリカ亜
種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に別のサルモネラ エ ンテリカ亜種の代表物質に追加して検出するためのプライマまたはプローブとし
て適しており、 （ｂ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの他の代表物質 の核酸分離株を利用して第２核酸分子（核酸分子２）が取得または誘導され、こ
の第2核酸分子が特異的に前記代表物質または前記の他のサルモネラ エンテリカ
亜種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に前記サルモネラ エンテリカ亜種の別の代表物質に追加して検出するためのプライマまたはプロー
ブとして適しており、かつ （ｃ）（ａ）および（ｂ）に基づき取得可能の核酸分子により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質がまだ検出できない場合、（ａ）および／または（
ｂ）記載の核酸分子の取得または誘導が、取得または誘導された核酸分子セット
により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質を検出することができるま で長く継続されること、により取得可能である。
テナエ、ボンゴリおよびインディカの代表物質を検出するための方法において、
これらの亜種の全代表物質を検出することができる核酸分子セットにより解決さ
れ、その際このセットは （ａ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの代表物質の核 酸分離株を利用して第１核酸分子（核酸分子１）が取得または誘導され、この第
1核酸分子が特異的に前記代表物質または前記の１つのサルモネラ エンテリカ亜
種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に別のサルモネラ エ ンテリカ亜種の代表物質に追加して検出するためのプライマまたはプローブとし
て適しており、 （ｂ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの他の代表物質 の核酸分離株を利用して第２核酸分子（核酸分子２）が取得または誘導され、こ
の第2核酸分子が特異的に前記代表物質または前記の他のサルモネラ エンテリカ
亜種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に前記サルモネラ エンテリカ亜種の別の代表物質に追加して検出するためのプライマまたはプロー
ブとして適しており、かつ （ｃ）（ａ）および（ｂ）に基づき取得可能の核酸分子により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質がまだ検出できない場合、（ａ）および／または（
ｂ）記載の核酸分子の取得または誘導が、取得または誘導された核酸分子セット
により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質を検出することができるま で長く継続されること、により取得可能である。
【０００７】 誘導された核酸分子は、取得された核酸分子によりハイブリッド形成可能であ
り、かつ好ましくは同一の塩基数を有し、その際ハイブリッド形成条件が 温度≧２５℃および１Ｍ Ｎａｃｌ濃度 とすることができる核酸分子とすることができる。 誘導された核酸分子は、たとえば核酸分子の配列がコンピュータデザインを利
用して決定されており、かつその後に化学合成により製造および取得された核酸
分子とすることができる。
り、かつ好ましくは同一の塩基数を有し、その際ハイブリッド形成条件が 温度≧２５℃および１Ｍ Ｎａｃｌ濃度 とすることができる核酸分子とすることができる。 誘導された核酸分子は、たとえば核酸分子の配列がコンピュータデザインを利
用して決定されており、かつその後に化学合成により製造および取得された核酸
分子とすることができる。
【０００８】 本発明が解決しようとする課題の解決策は、１つまたはそれ以上の核酸分子（
群）Ｙ（Ｚ，．．．）が考慮されており、その際この核酸分子（群）の導入が − 核酸分子（Ｘ）の導入に追加して − サルモネラ菌属の細菌を検出するため の方法において、サルモネラ菌の検出が核酸分子（Ｘ）の導入により達成されず
、もしくは低感度でのみ達成されるようなサルモネラ菌株またはサルモネラ菌分
離株によっても検出可能であることを特徴とする前記核酸分子（群）である、と
記述することもできる。 本発明に基づく核酸分子セットは、核酸分離株が系統発生的に保存された塩基
配列またはこの塩基配列の領域を含有または明示すること、を特徴とすることが
できる。系統発生的に保存された塩基配列の概念については、たとえばＷＯ９５
／００６６４またはヘルダー生化学および分子生物学百科事典、増補版１９９５
年、１３２頁、スペクトル、製造等を参照。
群）Ｙ（Ｚ，．．．）が考慮されており、その際この核酸分子（群）の導入が − 核酸分子（Ｘ）の導入に追加して − サルモネラ菌属の細菌を検出するため の方法において、サルモネラ菌の検出が核酸分子（Ｘ）の導入により達成されず
、もしくは低感度でのみ達成されるようなサルモネラ菌株またはサルモネラ菌分
離株によっても検出可能であることを特徴とする前記核酸分子（群）である、と
記述することもできる。 本発明に基づく核酸分子セットは、核酸分離株が系統発生的に保存された塩基
配列またはこの塩基配列の領域を含有または明示すること、を特徴とすることが
できる。系統発生的に保存された塩基配列の概念については、たとえばＷＯ９５
／００６６４またはヘルダー生化学および分子生物学百科事典、増補版１９９５
年、１３２頁、スペクトル、製造等を参照。
【０００９】 本発明に基づく核酸分子セットは、個々の核酸分子または核酸分子の各々が （ｉ）種々の系統発生的に保存された塩基配列で、または （ii）同一の系統発生的に保存された塩基配列自体に重なり合わない配列領域で
、または （iii）同一の系統発生的に保存された塩基配列自体に重なり合う配列領域で ハイブリッドを形成すること、を特徴とすることができる。
、または （iii）同一の系統発生的に保存された塩基配列自体に重なり合う配列領域で ハイブリッドを形成すること、を特徴とすることができる。
【００１０】 サルモネラ エンテリカ サブスピーシーズ エンテリカ、サラマエ、アリゾナ エ、ジアリゾナエ、フーテナエ、ボンゴリおよびインディカの代表物質を検出す
るための方法において、前記亜種の全代表物質を検出することができる本発明に
基づく核酸分子セットまたは本発明に基づく一核酸分子セットは、個々の核酸分
子、複数の該セットの個々の核酸分子または該セットの個々の核酸分子の各々の
ためのセットがそれぞれ少なくとももう１つの別の核酸分子を含有し、この核酸
分子がそのヌクレオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で塩
基配列の１００％未満、しかし少なくとも８０％で一致すること、を特徴とする
ことができる。
るための方法において、前記亜種の全代表物質を検出することができる本発明に
基づく核酸分子セットまたは本発明に基づく一核酸分子セットは、個々の核酸分
子、複数の該セットの個々の核酸分子または該セットの個々の核酸分子の各々の
ためのセットがそれぞれ少なくとももう１つの別の核酸分子を含有し、この核酸
分子がそのヌクレオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で塩
基配列の１００％未満、しかし少なくとも８０％で一致すること、を特徴とする
ことができる。
【００１１】 前記のような本発明に基づく核酸分子セットは、個々の核酸分子、複数の該セ
ットの個々の核酸分子または該セットの個々の核酸分子の各々のためのセットが
それぞれ少なくとももう１つの別の核酸分子を含有し、この核酸分子がそのヌク
レオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で正確に１つの塩基
位置で他のもしくは別の核酸分子と異なること、を特徴とすることができる。 本発明に基づく核酸分子セットは、このセットが１つまたは複数の、ただし非
排他的にＷＯ９５／００６６４記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の断片またはこの断 片と相補的な配列になるような核酸分子を含有すること、を特徴とすることがで
きる。
ットの個々の核酸分子または該セットの個々の核酸分子の各々のためのセットが
それぞれ少なくとももう１つの別の核酸分子を含有し、この核酸分子がそのヌク
レオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で正確に１つの塩基
位置で他のもしくは別の核酸分子と異なること、を特徴とすることができる。 本発明に基づく核酸分子セットは、このセットが１つまたは複数の、ただし非
排他的にＷＯ９５／００６６４記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の断片またはこの断 片と相補的な配列になるような核酸分子を含有すること、を特徴とすることがで
きる。
【００１２】 さらに本発明に基づく核酸分子セットは、個々の核酸分子がサルモネラ エン テリカ亜種の代表物質の核酸分離株の同一の鎖にハイブリッドを形成し、これら
の核酸分子が該核酸分子を検出するための方法に従うこと、を特徴とすることが
できる。 さらに本発明が解決しようとする課題は、本発明に基づく核酸分子セットに属
し、またはこのようなセットに使用可能である核酸分子により解決され、その際
この核酸分子は核酸分子の配列が該核酸分子のヌクレオチド鎖の少なくとも１０
個連続するヌクレオチドの領域で正確に前記サルモネラ エンテリカ亜種の少な くとも１つの代表物質の配列領域と一致し、その際この配列領域が系統発生的に
保存された塩基配列またはこの配列領域の１領域を含有または明示すること、を
特徴とする。
の核酸分子が該核酸分子を検出するための方法に従うこと、を特徴とすることが
できる。 さらに本発明が解決しようとする課題は、本発明に基づく核酸分子セットに属
し、またはこのようなセットに使用可能である核酸分子により解決され、その際
この核酸分子は核酸分子の配列が該核酸分子のヌクレオチド鎖の少なくとも１０
個連続するヌクレオチドの領域で正確に前記サルモネラ エンテリカ亜種の少な くとも１つの代表物質の配列領域と一致し、その際この配列領域が系統発生的に
保存された塩基配列またはこの配列領域の１領域を含有または明示すること、を
特徴とする。
【００１３】 前記のような本発明に基づく核酸分子は、この核酸分子が該核酸分子のヌクレ
オチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で、次の配列またはこ
の配列に相補的な配列の１つまたはそれ以上に相当する数で連続するヌクレオチ
ドに対して１００％までまたは少なくとも８０％まで同一であること、を特徴と
することができる。
オチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの領域で、次の配列またはこ
の配列に相補的な配列の１つまたはそれ以上に相当する数で連続するヌクレオチ
ドに対して１００％までまたは少なくとも８０％まで同一であること、を特徴と
することができる。
【化２】
【００１４】 さらに本発明が解決しようとする課題は、核酸分子の配列に関し本発明に基づ
くおよび上記の核酸分子と同種であり、かつ該核酸分子のヌクレオチド鎖の少な
くとも１０個連続するヌクレオチドの領域で （ｉ）本発明に基づく上記核酸分子と同一であり、または （ii）１つを超えないヌクレオチドで本発明に基づく上記核酸分子と異なり、ま
たは （iii）２つを超えないヌクレオチドで本発明に基づく上記核酸分子と異なるこ と、を特徴とする核酸分子により解決される。 本発明に基づく核酸分子は１０〜２５０個かつ好ましくは１５〜３０個のヌク
レオチド長さになること、を特徴とすることができる。
くおよび上記の核酸分子と同種であり、かつ該核酸分子のヌクレオチド鎖の少な
くとも１０個連続するヌクレオチドの領域で （ｉ）本発明に基づく上記核酸分子と同一であり、または （ii）１つを超えないヌクレオチドで本発明に基づく上記核酸分子と異なり、ま
たは （iii）２つを超えないヌクレオチドで本発明に基づく上記核酸分子と異なるこ と、を特徴とする核酸分子により解決される。 本発明に基づく核酸分子は１０〜２５０個かつ好ましくは１５〜３０個のヌク
レオチド長さになること、を特徴とすることができる。
【００１５】 さらに本発明に基づく核酸分子は一本鎖であり、または相補的な鎖を有するこ
と、を特徴とすることができる。 さらに本発明に基づく核酸分子は、該核酸分子が （ｉ）ＤＮＡとして、または （ii）（ｉ）に相当するＲＮＡとして、または （iii）ＰＮＡとして存在し、その際この核酸分子が必要のある場合に分析的検 出方法、特にハイブリッド形成および／または増幅に基づき、自体公知の方法で
修飾または標識されること、を特徴とすることができる。
と、を特徴とすることができる。 さらに本発明に基づく核酸分子は、該核酸分子が （ｉ）ＤＮＡとして、または （ii）（ｉ）に相当するＲＮＡとして、または （iii）ＰＮＡとして存在し、その際この核酸分子が必要のある場合に分析的検 出方法、特にハイブリッド形成および／または増幅に基づき、自体公知の方法で
修飾または標識されること、を特徴とすることができる。
【００１６】 さらに本発明に基づく核酸分子は修飾または標識された核酸分子であり、この
核酸分子においてプローブおよび／またはプライマのために自体公知であり、特
に細菌では自然に存在しないヌクレオチドを明示する該核酸分子のヌクレオチド
鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのうちのヌクレオチドの２０％まで
構成単位になること、を特徴とすることができる。
核酸分子においてプローブおよび／またはプライマのために自体公知であり、特
に細菌では自然に存在しないヌクレオチドを明示する該核酸分子のヌクレオチド
鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドのうちのヌクレオチドの２０％まで
構成単位になること、を特徴とすることができる。
【００１７】 さらに本発明に基づく核酸分子は、該核酸分子が修飾または標識された核酸分
子または追加で修飾または標識された核酸分子であり、この核酸分子が分析的検
出方法のために自体公知の方法で１つまたはそれ以上の放射性群、着色群、蛍光
群、固相に不動化するための群、間接的または直接的反応のための、特に酵素反
応のための群が、好ましくは抗体、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素
複合体と親和性を有する物質を利用して、および／または別様の自体公知の修飾
するまたは修飾された群が核酸に類似した構造を有すること、を特徴とすること
ができる。
子または追加で修飾または標識された核酸分子であり、この核酸分子が分析的検
出方法のために自体公知の方法で１つまたはそれ以上の放射性群、着色群、蛍光
群、固相に不動化するための群、間接的または直接的反応のための、特に酵素反
応のための群が、好ましくは抗体、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素
複合体と親和性を有する物質を利用して、および／または別様の自体公知の修飾
するまたは修飾された群が核酸に類似した構造を有すること、を特徴とすること
ができる。
【００１８】 さらに本発明が解決しようとする課題は分析的検出方法、特にサルモネラ菌属
の細菌を検出するためのキットにより解決され、その際このキットが （ｉ）本発明に基づく核酸分子セット または （ii）本発明に基づく１つまたはそれ以上の核酸分子 を特徴とする。 つまり本発明に基づくキットは本発明に基づく核酸分子セットまたは１つまた
はそれ以上の本発明に基づく核酸分子を含有することができ、その際その他にも
核酸ハイブリッド形成または核酸増幅のために通常用いられる他の構成要素、た
とえばポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼまたはＲＮＡポリメラーゼが考慮さ
れる。たとえばＷＯ９５／００６６４参照。
の細菌を検出するためのキットにより解決され、その際このキットが （ｉ）本発明に基づく核酸分子セット または （ii）本発明に基づく１つまたはそれ以上の核酸分子 を特徴とする。 つまり本発明に基づくキットは本発明に基づく核酸分子セットまたは１つまた
はそれ以上の本発明に基づく核酸分子を含有することができ、その際その他にも
核酸ハイブリッド形成または核酸増幅のために通常用いられる他の構成要素、た
とえばポリメラーゼ、逆転写酵素、リガーゼまたはＲＮＡポリメラーゼが考慮さ
れる。たとえばＷＯ９５／００６６４参照。
【００１９】 好ましくは本発明に基づくキットの核酸分子セットが合成により、少なくとも
２つの互いに分離された合成調合で製造される。本発明に基づくキットは好まし
くは変性核酸分子をまったく含まない。 最後に本発明が解決しようとする課題は、サルモネラ菌属の細菌、特に上記サ
ルモネラ エンテリカ亜種の代表物質の一群に属す細菌の存在または非在を検出 するための本発明に基づく核酸分子セットまたは本発明に基づくキットの使用に
より解決される。 本発明の使用のために核酸ハイブリッド形成および／または核酸増幅を実施す
ることができる。 核酸増幅としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することができる。
２つの互いに分離された合成調合で製造される。本発明に基づくキットは好まし
くは変性核酸分子をまったく含まない。 最後に本発明が解決しようとする課題は、サルモネラ菌属の細菌、特に上記サ
ルモネラ エンテリカ亜種の代表物質の一群に属す細菌の存在または非在を検出 するための本発明に基づく核酸分子セットまたは本発明に基づくキットの使用に
より解決される。 本発明の使用のために核酸ハイブリッド形成および／または核酸増幅を実施す
ることができる。 核酸増幅としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することができる。
【００２０】 本発明に基づく使用のために検出すべき細菌および検出しない細菌に関しこれ
らの細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの差異が本発明に基づく核酸分子
の領域で少なくとも１つのヌクレオチド位置で確定され、かつサルモネラ菌属の
細菌の一群の代表物質、特に上記サルモネラ エンテリカ亜種の代表物質を検出 することができる。 核酸ハイブリッド形成または増幅を利用してサルモネラ菌を検出するために、
サルモネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドが使用される。サルモネラ菌特異性の
オリゴヌクレオチドは１０〜２５０塩基（好ましくは１５〜３０塩基）の長さの
核酸分子であり、この核酸分子の塩基配列はサルモネラ菌に特徴的である。プラ
イマまたはプローブとして前記オリゴヌクレオチドを導入する際に − 適切な反
応条件下で − 検出すべきサルモネラ菌のＤＮＡが調査試料中に存在する場合、
ただし他の細菌のＤＮＡが存在しない場合にのみハイブリッド形成／増幅が行わ
れる。
らの細菌のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの差異が本発明に基づく核酸分子
の領域で少なくとも１つのヌクレオチド位置で確定され、かつサルモネラ菌属の
細菌の一群の代表物質、特に上記サルモネラ エンテリカ亜種の代表物質を検出 することができる。 核酸ハイブリッド形成または増幅を利用してサルモネラ菌を検出するために、
サルモネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドが使用される。サルモネラ菌特異性の
オリゴヌクレオチドは１０〜２５０塩基（好ましくは１５〜３０塩基）の長さの
核酸分子であり、この核酸分子の塩基配列はサルモネラ菌に特徴的である。プラ
イマまたはプローブとして前記オリゴヌクレオチドを導入する際に − 適切な反
応条件下で − 検出すべきサルモネラ菌のＤＮＡが調査試料中に存在する場合、
ただし他の細菌のＤＮＡが存在しない場合にのみハイブリッド形成／増幅が行わ
れる。
【００２１】 さらに以下に説明するように、特定の条件下で非特異的なオリゴヌクレオチド
もプライマまたはプローブとして使用することができる。このようなオリゴヌク
レオチドはサルモネラ菌ＤＮＡが試料中に存在する場合のみならず、サルモネラ
菌属に含まれない細菌または複数の細菌のＤＮＡの存在中でもハイブリッド形成
もしくは増幅を可能にする。 高保存された遺伝子領域自体において非常に近い親縁性の細菌のもとでＤＮＡ
の交換（たとえば点突然変異）が存在する可能性があるので、適切なオリゴヌク
レオチドを選択するために包括的なＤＮＡ配列決定もしくは特異性試験（たとえ
ばＰＣＲの実施利用）が必要である。これは検出しない細菌（たとえばサルモネ
ラ菌属に含まれない細菌）と同様に検出すべき細菌（たとえばサルモネラ菌）に
も該当する。
もプライマまたはプローブとして使用することができる。このようなオリゴヌク
レオチドはサルモネラ菌ＤＮＡが試料中に存在する場合のみならず、サルモネラ
菌属に含まれない細菌または複数の細菌のＤＮＡの存在中でもハイブリッド形成
もしくは増幅を可能にする。 高保存された遺伝子領域自体において非常に近い親縁性の細菌のもとでＤＮＡ
の交換（たとえば点突然変異）が存在する可能性があるので、適切なオリゴヌク
レオチドを選択するために包括的なＤＮＡ配列決定もしくは特異性試験（たとえ
ばＰＣＲの実施利用）が必要である。これは検出しない細菌（たとえばサルモネ
ラ菌属に含まれない細菌）と同様に検出すべき細菌（たとえばサルモネラ菌）に
も該当する。
【００２２】 サルモネラ菌を検出するために、核酸、好ましくはゲノムＤＮＡがまず初めに
被検試料もしくは細菌培養の中に含まれる細胞から遊離される。次に核酸ハイブ
リッド形成を利用し、プローブとして本発明に基づくサルモネラ菌特異性のオリ
ゴヌクレオチドの導入下で、サルモネラ菌核酸の直接的な検出が被検査試料で行
なうことができる。そのために、たとえば‘サザンブロット’または‘ドットブ
ロット’のような、専門家に知られている種々の方法が適している。 しかし特により感度が高いために、求めているＤＮＡ／ＲＮＡ配列がまず初め
に核酸を増幅するための上述の方法、好ましくはＰＣＲを利用して増幅される間
接的な検出が好ましい。ＤＮＡ／ＲＮＡの増幅はサルモネラ菌特異性のオリゴヌ
クレオチドの導入により行われる。その際サルモネラ菌ＤＮＡ／ＲＮＡが被験試
料の中に存在する場合にのみ特異の増幅体が形成される。プローブとしてサルモ
ネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドの使用下で後続の検出反応により検出方法の
特異性を高めることができる。同様にプローブとして非特異性のオリゴヌクレオ
チドの使用も可能である。
被検試料もしくは細菌培養の中に含まれる細胞から遊離される。次に核酸ハイブ
リッド形成を利用し、プローブとして本発明に基づくサルモネラ菌特異性のオリ
ゴヌクレオチドの導入下で、サルモネラ菌核酸の直接的な検出が被検査試料で行
なうことができる。そのために、たとえば‘サザンブロット’または‘ドットブ
ロット’のような、専門家に知られている種々の方法が適している。 しかし特により感度が高いために、求めているＤＮＡ／ＲＮＡ配列がまず初め
に核酸を増幅するための上述の方法、好ましくはＰＣＲを利用して増幅される間
接的な検出が好ましい。ＤＮＡ／ＲＮＡの増幅はサルモネラ菌特異性のオリゴヌ
クレオチドの導入により行われる。その際サルモネラ菌ＤＮＡ／ＲＮＡが被験試
料の中に存在する場合にのみ特異の増幅体が形成される。プローブとしてサルモ
ネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドの使用下で後続の検出反応により検出方法の
特異性を高めることができる。同様にプローブとして非特異性のオリゴヌクレオ
チドの使用も可能である。
【００２３】 選択肢として、１つまたはそれ以上の非特異的なオリゴヌクレオチドの存在中
でも増幅を実施することができるため、この結果、必要がある場合にはその他の
検出しない微生物のＤＮＡ／ＲＮＡも増幅することができる。このような増幅方
法の１つは、通常特異性が少なく、かつそのためプローブとしてサルモネラ菌特
異性のオリゴヌクレオチドによる後続の検出反応で保証されなければならない。 専門家には、間接的な方法で生ずる増幅生成物を検出することができる種々の
方法が知られている。この方法には、特にゲル電気泳動を利用した可視化、不動
化された反応生成物へのプローブのハイブリッド形成［ナイロンまたは硝酸繊維
素フィルタ（‘サザンブロット’）またはたとえば‘ビーズ’または微量定量プ
レートに結合］および不動化されたプローブへの反応生成物のハイブリッド形成
（たとえば‘逆ドットブロット’またはプローブと結合された‘ビーズ’または
微量定量プレート）が含まれる。
でも増幅を実施することができるため、この結果、必要がある場合にはその他の
検出しない微生物のＤＮＡ／ＲＮＡも増幅することができる。このような増幅方
法の１つは、通常特異性が少なく、かつそのためプローブとしてサルモネラ菌特
異性のオリゴヌクレオチドによる後続の検出反応で保証されなければならない。 専門家には、間接的な方法で生ずる増幅生成物を検出することができる種々の
方法が知られている。この方法には、特にゲル電気泳動を利用した可視化、不動
化された反応生成物へのプローブのハイブリッド形成［ナイロンまたは硝酸繊維
素フィルタ（‘サザンブロット’）またはたとえば‘ビーズ’または微量定量プ
レートに結合］および不動化されたプローブへの反応生成物のハイブリッド形成
（たとえば‘逆ドットブロット’またはプローブと結合された‘ビーズ’または
微量定量プレート）が含まれる。
【００２４】 記述されたサルモネラ菌特異性のもしくは非特異性のオリゴヌクレオチドをプ
ローブおよび／またはプライマとして導入するため、直接的または間接的な検出
方法で標識もしくは修飾することのできる多数の異なる変形態様が記述されてい
る。これらは、たとえば放射性の、着色されたまたは蛍光性の群、または固相へ
の不動化を可能にする群またはたとえば抗体、抗原、酵素または酵素もしくは酵
素複合体と親和性のあるその他の物質のような別様に修飾されたもしくは修飾す
る群を含むことができる。プローブもしくはプライマは、自然に存在するか又は
合成で製造された二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはたとえば
ＰＮＡのようなＤＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態とすることができる（これ
らの分子では糖単位がアミノ酸またはペプチドで交換されている）。プローブま
たはプライマの個々のまたは複数のヌクレオチドは、類似の構成要素（たとえば
標的核酸の中に自然に存在しないヌクレオチド）と置換することができる。上述
の間接的な検出方法では、内部標識増幅体を介しても検出することができる。こ
れは、たとえば増幅反応中に修飾（たとえばジゴキシゲニンまたはフルオレセイ
ンと結合）されたヌクレオシド三リン酸の取込みを介して行なうことができる。
ローブおよび／またはプライマとして導入するため、直接的または間接的な検出
方法で標識もしくは修飾することのできる多数の異なる変形態様が記述されてい
る。これらは、たとえば放射性の、着色されたまたは蛍光性の群、または固相へ
の不動化を可能にする群またはたとえば抗体、抗原、酵素または酵素もしくは酵
素複合体と親和性のあるその他の物質のような別様に修飾されたもしくは修飾す
る群を含むことができる。プローブもしくはプライマは、自然に存在するか又は
合成で製造された二本鎖または一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくはたとえば
ＰＮＡのようなＤＮＡまたはＲＮＡの修飾された形態とすることができる（これ
らの分子では糖単位がアミノ酸またはペプチドで交換されている）。プローブま
たはプライマの個々のまたは複数のヌクレオチドは、類似の構成要素（たとえば
標的核酸の中に自然に存在しないヌクレオチド）と置換することができる。上述
の間接的な検出方法では、内部標識増幅体を介しても検出することができる。こ
れは、たとえば増幅反応中に修飾（たとえばジゴキシゲニンまたはフルオレセイ
ンと結合）されたヌクレオシド三リン酸の取込みを介して行なうことができる。
【００２５】 本発明に基づくサルモネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドとして適しているの
は、少なくとも１０個の塩基長さの配列で配列１ないし１０またはこの配列と相
補的な配列と一致する、好ましくは１５個ないし３０個の塩基長さの核酸である
。この１０個の塩基長さの配列内のわずかな差異（１個ないし２個の塩基）は、
増幅および／またはハイブリッド形成時にそれぞれ所定の特異性を失わずに可能
である。専門家には、このようなわずかな差異の場合の反応条件をそれに応じて
変化させる必要のあることが知られている。
は、少なくとも１０個の塩基長さの配列で配列１ないし１０またはこの配列と相
補的な配列と一致する、好ましくは１５個ないし３０個の塩基長さの核酸である
。この１０個の塩基長さの配列内のわずかな差異（１個ないし２個の塩基）は、
増幅および／またはハイブリッド形成時にそれぞれ所定の特異性を失わずに可能
である。専門家には、このようなわずかな差異の場合の反応条件をそれに応じて
変化させる必要のあることが知られている。
【００２６】 ＷＯ９５／００６６４に記述されたＤＮＡ領域を利用して全てのサルモネラ菌
株の完全な検出を可能にするために、包括的なＤＮＡ配列の分析が必要であった
。このＤＮＡ領域の配列は７つの全亜種から選択された３７のサルモネラ菌株が
決定された（殆どの菌株ではプライマＳＴ１５とＳＴ１１の間にあるＤＮＡ領域
の配列。これはＷＯ９５／００６６４のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１２７５〜
１６５４に相当）。可能な実験的方法が専門家に知られているが、ここでは細部
を記述せず、その結果を簡単に要約することにする。選択されたサルモネラ菌株
のＤＮＡは標準方法を利用して調製され、重要な領域がＰＣＲにより増幅され、
かつその後で配列決定された。ＰＣＲならびにその後の配列決定では殆どのサル
モネラ菌株のために以下のプライマが使用された。
株の完全な検出を可能にするために、包括的なＤＮＡ配列の分析が必要であった
。このＤＮＡ領域の配列は７つの全亜種から選択された３７のサルモネラ菌株が
決定された（殆どの菌株ではプライマＳＴ１５とＳＴ１１の間にあるＤＮＡ領域
の配列。これはＷＯ９５／００６６４のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の位置１２７５〜
１６５４に相当）。可能な実験的方法が専門家に知られているが、ここでは細部
を記述せず、その結果を簡単に要約することにする。選択されたサルモネラ菌株
のＤＮＡは標準方法を利用して調製され、重要な領域がＰＣＲにより増幅され、
かつその後で配列決定された。ＰＣＲならびにその後の配列決定では殆どのサル
モネラ菌株のために以下のプライマが使用された。
【化３】
【００２７】 しかし前記プライマ対を有する亜種IIIａ、IV、ＶおよびVIの複数の菌株によ り増幅が行われず、または不十分な増幅のみが行われたので、この場合にはＰＣ
Ｒおよび配列決定のために以下のプライマが使用された。
Ｒおよび配列決定のために以下のプライマが使用された。
【化４】
【００２８】 ３７のサルモネラ菌株全てのＤＮＡ配列の比較は、たしかに全体的に保存され
たＤＮＡ領域であるが、サルモネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドを誘導するた
めに、保存率が一瞥して条件付きでのみ適しているとみられることが明らかにな
った。最大に保存された領域でさえ個々の配列決定された菌株において塩基交換
が観察された。興味深いことに、多数の塩基交換が下位集団内にのみ存在し、か
つこの塩基交換が特に前記下位集団内にほとんど保存されていることが明らかに
なった。これは、プライマ結合箇所の領域で１つまたはそれ以上の塩基交換が存
在するような変形態様によっても増幅を可能にするため、ＰＣＲで２つ以上のプ
ライマを使用する可能性が勧められた。専門家に知られているように、そのため
に通常変性されたプライマ、または変異箇所にデソキシイノシンを含むプライマ
が使用される。従って上記配列比較から潜在的に全てのサルモネラ エンテリカ 亜種を検出するためのプライマとして適している複数の変性オリゴヌクレオチド
が誘導された。しかしこれらの変性されたプライマは特に高い複合性を有する配
列領域で結果的に非特異的な反応生成物の出現が増加したので、前記変性プライ
マは条件付きでのみＰＣＲ検出に適していることが明らかになった。このような
非特異的な反応生成物の発生時にはＰＣＲ検出の感度が通常害を受けるので、別
の方法が試された。ＰＣＲでは“相補的”プライマが使用された。プライマ混合
物の中に個々の塩基交換の全ての可能な組合せが表わされている変性プライマと
異なり（プライマ数＝２ｘｘ３ｙｘ４ｚ、式中ｘ、ｙおよびｚは、プライマ結合
箇所の領域で２、３または４種類の塩基が観察される位置の数である）、前記の
ような相補的プライマでは実際に存在する配列のみが存在する。変性プライマと
比べた長所は本発明に基づくプライマ混合物の複雑性がより少ないことであり、
それにより非特異的な増幅生成物の発生確率が明らかに低減している。複数の実
験で明らかになったように、これは特に高濃度の“非特異的”ＤＮＡ（検出すべ
き細菌から派生しないＤＮＡ）を含む試料から成るＰＣＲ検出において好ましく
、それ以外の場合ではこの検出感度が著しく低下する可能性がある。
たＤＮＡ領域であるが、サルモネラ菌特異性のオリゴヌクレオチドを誘導するた
めに、保存率が一瞥して条件付きでのみ適しているとみられることが明らかにな
った。最大に保存された領域でさえ個々の配列決定された菌株において塩基交換
が観察された。興味深いことに、多数の塩基交換が下位集団内にのみ存在し、か
つこの塩基交換が特に前記下位集団内にほとんど保存されていることが明らかに
なった。これは、プライマ結合箇所の領域で１つまたはそれ以上の塩基交換が存
在するような変形態様によっても増幅を可能にするため、ＰＣＲで２つ以上のプ
ライマを使用する可能性が勧められた。専門家に知られているように、そのため
に通常変性されたプライマ、または変異箇所にデソキシイノシンを含むプライマ
が使用される。従って上記配列比較から潜在的に全てのサルモネラ エンテリカ 亜種を検出するためのプライマとして適している複数の変性オリゴヌクレオチド
が誘導された。しかしこれらの変性されたプライマは特に高い複合性を有する配
列領域で結果的に非特異的な反応生成物の出現が増加したので、前記変性プライ
マは条件付きでのみＰＣＲ検出に適していることが明らかになった。このような
非特異的な反応生成物の発生時にはＰＣＲ検出の感度が通常害を受けるので、別
の方法が試された。ＰＣＲでは“相補的”プライマが使用された。プライマ混合
物の中に個々の塩基交換の全ての可能な組合せが表わされている変性プライマと
異なり（プライマ数＝２ｘｘ３ｙｘ４ｚ、式中ｘ、ｙおよびｚは、プライマ結合
箇所の領域で２、３または４種類の塩基が観察される位置の数である）、前記の
ような相補的プライマでは実際に存在する配列のみが存在する。変性プライマと
比べた長所は本発明に基づくプライマ混合物の複雑性がより少ないことであり、
それにより非特異的な増幅生成物の発生確率が明らかに低減している。複数の実
験で明らかになったように、これは特に高濃度の“非特異的”ＤＮＡ（検出すべ
き細菌から派生しないＤＮＡ）を含む試料から成るＰＣＲ検出において好ましく
、それ以外の場合ではこの検出感度が著しく低下する可能性がある。
【００２９】 相補的オリゴヌクレオチド／プライマを導入する際の大きな長所は、既存の検
出方法の最適化の可能性にある。それにより事情によって生じる個々の誤った負
の結果は、事前に把握されていない菌株の配列を有するオリゴヌクレオチドがＰ
ＣＲおよび／またはハイブリッド形成反応時に追加で導入されることにより除去
することができる。 ＤＮＡ配列比較はサルモネラ菌検出方法の最適化のために記述された戦略（Ｐ
ＣＲで合計≧３プライマの導入）に潜在的に適しているとみられる複数のより短
いＤＮＡ領域が得られた。以下の例はこの点を明らかにするものである。
出方法の最適化の可能性にある。それにより事情によって生じる個々の誤った負
の結果は、事前に把握されていない菌株の配列を有するオリゴヌクレオチドがＰ
ＣＲおよび／またはハイブリッド形成反応時に追加で導入されることにより除去
することができる。 ＤＮＡ配列比較はサルモネラ菌検出方法の最適化のために記述された戦略（Ｐ
ＣＲで合計≧３プライマの導入）に潜在的に適しているとみられる複数のより短
いＤＮＡ領域が得られた。以下の例はこの点を明らかにするものである。
【００３０】 例１：ポリメラーゼ連鎖反応による合計７亜種のサルモネラ菌株の検出 配列されたＤＮＡ領域の以下の３断片は観察された配列変化の例として利用さ
れる。 断片Ｉ（ＷＯ９５／００６６４のＳＥ ＩＤ ＮＯ：１の位置１３３６〜１３５５
）
れる。 断片Ｉ（ＷＯ９５／００６６４のＳＥ ＩＤ ＮＯ：１の位置１３３６〜１３５５
）
【化５】 Ｓ断片II（ＷＯ９５／００６６４のＳＥ ＩＤ ＮＯ：１の位置１３４２〜１３６
１）
１）
【化６】 断片III（ＷＯ９５／００６６４のＳＥ ＩＤ ＮＯ：１の位置１４８３〜１５０ ２に対し相補的）
【化７】
【００３１】 上記の配列断片が７亜種の全てのサルモネラ菌株の検出に適しているかどうか
を検査するために、以下の組合せのオリゴヌクレオチドＳａ１〜１０がＰＣＲに
導入された。 プライマ組合せ１： Ｓａ１／Ｓａ２ （各０．２μＭ 最終濃度） Ｓａ６／Ｓａ７／Ｓａ８／Ｓａ９／Ｓａ１０（各０．０８μＭ 最終濃度） プライマ組合せ２： Ｓａ３／Ｓａ４／Ｓａ５ （各０．１３μＭ 最終濃度） Ｓａ６／Ｓａ７／Ｓａ８／Ｓａ９／Ｓａ１０（各０．０８μＭ 最終濃度）
を検査するために、以下の組合せのオリゴヌクレオチドＳａ１〜１０がＰＣＲに
導入された。 プライマ組合せ１： Ｓａ１／Ｓａ２ （各０．２μＭ 最終濃度） Ｓａ６／Ｓａ７／Ｓａ８／Ｓａ９／Ｓａ１０（各０．０８μＭ 最終濃度） プライマ組合せ２： Ｓａ３／Ｓａ４／Ｓａ５ （各０．１３μＭ 最終濃度） Ｓａ６／Ｓａ７／Ｓａ８／Ｓａ９／Ｓａ１０（各０．０８μＭ 最終濃度）
【００３２】 第１ａ表に掲載したサルモネラ菌株の純粋培養から、標準方法を利用してＤＮ
Ａが単離された。次にこのＤＮＡ組織標本のそれぞれ約１０ないし１００ｎｇが
プライマ組合せ１もしくはプライマ組合せ２、２００μＭ ｄＮＴＰ’ｓ（ベー リンガー マンハイム）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ （ＮＨ３）２ＳＯ １ 、６７ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％トウィーン２０およ び０．０３Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（バイオマスタ）の存在中でＰＣＲに 導入された。ＰＣＲは下記の温度特性を有するパーキン-エルマー９６００サー モサイクラーで実施された。 − 初期変性 ９５℃ ５ｍｉｎ − 増幅（３５サイクル） ９５℃ ３０ｓｅｃ ６３℃ ９０ｓｅｃ − 最終合成 ７２℃ ５ｍｉｎ
Ａが単離された。次にこのＤＮＡ組織標本のそれぞれ約１０ないし１００ｎｇが
プライマ組合せ１もしくはプライマ組合せ２、２００μＭ ｄＮＴＰ’ｓ（ベー リンガー マンハイム）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１６ｍＭ （ＮＨ３）２ＳＯ １ 、６７ｍＭ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．０１％トウィーン２０およ び０．０３Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（バイオマスタ）の存在中でＰＣＲに 導入された。ＰＣＲは下記の温度特性を有するパーキン-エルマー９６００サー モサイクラーで実施された。 − 初期変性 ９５℃ ５ｍｉｎ − 増幅（３５サイクル） ９５℃ ３０ｓｅｃ ６３℃ ９０ｓｅｃ − 最終合成 ７２℃ ５ｍｉｎ
【００３３】 ＰＣＲ反応の終了後、増幅生成物はアガロース-ゲル電気泳動を利用して分離 され、かつ臭化エチジウムで着色することにより可視化された。予想されていた
長さ１６７ｂｐ（プライマ組合せ１）もしくは１６１ｂｐ（プライマ組合せ２）
の生成物は、サルモネラ菌属の菌株のＤＮＡが存在していた全ての場合で観察さ
れた（第１ａ表参照）が、試験された他の細菌のＤＮＡの存在では観察されなか
った（表１ｂ参照）。この経過の終了後、ゲルの中に含まれているＤＮＡが標準
方法を利用してナイロン-フィルタに移行され、かつ特に塩基に忠実な特異性を 検査するために５’末端でジゴキシゲニンで標識されたオリゴヌクレオチドＳＴ
１４（ＴＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＧ（ＷＯ９５／００６
６４請求項３参照）によりハイブリッド形成された。このハイブリッド形成は、
５ｘＳＳＣ、２％阻害試薬、０．１％ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳお
よび５ｐｍｏｌ／ｍｌプローブで４時間６０℃で行われた。２ｘＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで２ｘ１５ｍｉｎ間６０℃で洗浄された。検出は標準方法にしたがって
抗ジゴキシゲニン／アルカリ性のホスファターゼ抱合体を利用して５-臭素-４- 塩素-３-リン酸インドリルおよび４-ニトロ-ブルー塩化テトラゾリウム（ベーリ
ンガー マンハイム社）の存在中で実施された。
長さ１６７ｂｐ（プライマ組合せ１）もしくは１６１ｂｐ（プライマ組合せ２）
の生成物は、サルモネラ菌属の菌株のＤＮＡが存在していた全ての場合で観察さ
れた（第１ａ表参照）が、試験された他の細菌のＤＮＡの存在では観察されなか
った（表１ｂ参照）。この経過の終了後、ゲルの中に含まれているＤＮＡが標準
方法を利用してナイロン-フィルタに移行され、かつ特に塩基に忠実な特異性を 検査するために５’末端でジゴキシゲニンで標識されたオリゴヌクレオチドＳＴ
１４（ＴＴＴＧＣＧＡＣＴＡＴＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＴＧＧ（ＷＯ９５／００６
６４請求項３参照）によりハイブリッド形成された。このハイブリッド形成は、
５ｘＳＳＣ、２％阻害試薬、０．１％ラウリルサルコシン、０．０２％ＳＤＳお
よび５ｐｍｏｌ／ｍｌプローブで４時間６０℃で行われた。２ｘＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳで２ｘ１５ｍｉｎ間６０℃で洗浄された。検出は標準方法にしたがって
抗ジゴキシゲニン／アルカリ性のホスファターゼ抱合体を利用して５-臭素-４- 塩素-３-リン酸インドリルおよび４-ニトロ-ブルー塩化テトラゾリウム（ベーリ
ンガー マンハイム社）の存在中で実施された。
【００３４】 フィルタでは、あらかじめアガロース-ゲルの帯域でも可視的であった場合のみ の帯域が観察された（第１ａ表参照）。これによりＰＣＲを利用してもハイブリ
ッド形成を利用しても７つの亜種の各々から成る試験された２９６のサルモネラ
菌株の存在が検出された。正のシグナルは前記菌株の各々に対しプライマ組合せ
１、プライマ組合せ２でも、各々それに続くプローブＳＴ１４によるハイブリッ
ド形成にする確定反応でも得られた。これに対し試験はされたが前記類属に含ま
れていない細菌株のいずれもこの系では検出されなかった。
ッド形成を利用しても７つの亜種の各々から成る試験された２９６のサルモネラ
菌株の存在が検出された。正のシグナルは前記菌株の各々に対しプライマ組合せ
１、プライマ組合せ２でも、各々それに続くプローブＳＴ１４によるハイブリッ
ド形成にする確定反応でも得られた。これに対し試験はされたが前記類属に含ま
れていない細菌株のいずれもこの系では検出されなかった。
【００３５】 表１ａ：両方のプライマ組合せ１または２によるＰＣＲ増幅と、それに続くオリ
ゴヌクレオチドＳＴ１４によるハイブリッド形成における正のサルモネラ菌株
ゴヌクレオチドＳＴ１４によるハイブリッド形成における正のサルモネラ菌株
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】
【表３】
【００３８】
【表４】
【００３９】
【表５】
【００４０】
【表６】
【００４１】
【表７】
【００４２】
【表８】
【００４３】
【表９】
【表１０】
【００４４】 購入先：ｂｇＶＶベルリン（ロベルト フォン オステルターク研究所、マリエ
ンフェルト）および微生物学および衛生学研究所、ハンブルク（Ａｌｅｋｓｉｃ
教授）。名称ＴＡをもつ菌株はエイムス試験に使用される菌株である（Ｍａｒｏ
ｎ、Ｄ．Ｍ．およびＡｍｅｓ、Ｂ．Ｎ．、突然変異研究 第１１３号、１７３−
２１５頁（１９８３年））。
ンフェルト）および微生物学および衛生学研究所、ハンブルク（Ａｌｅｋｓｉｃ
教授）。名称ＴＡをもつ菌株はエイムス試験に使用される菌株である（Ｍａｒｏ
ｎ、Ｄ．Ｍ．およびＡｍｅｓ、Ｂ．Ｎ．、突然変異研究 第１１３号、１７３−
２１５頁（１９８３年））。
【００４５】 表１ｂ：両方のプライマ組合せ１または２によるＰＣＲ増幅と、それに続くオリ
ゴヌクレオチドＳＴ１４によるハイブリッド形成における非サルモネラ菌種の負
の菌株
ゴヌクレオチドＳＴ１４によるハイブリッド形成における非サルモネラ菌種の負
の菌株
【表１１】
【表１２】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１１年１１月１５日（１９９９．１１．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【化１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ショイ， ピア ドイツ連邦共和国 Ｄ−12101 ベルリン、 ボエルケシュトラーセ 45 (72)発明者 ウィルボーン， フライムート ドイツ連邦共和国 Ｄ−14057 ベルリン、 ノイエ カントシュトラーセ ９ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA13 CA09 CA20 DA05 HA08 HA11 HA14 4B063 QA01 QQ06 QQ16 QQ17 QQ42 QQ52 QR08 QR31 QR55 QR62 QS16 QS25 QS34 QX01
Claims (22)
- 【請求項１】 サルモネラ エンテリカ サブスピーシーズ エンテリカ、サ ラマエ、アリゾナエ、ジアリゾナエ、フーテナエ、ボンゴリおよびインディカの
代表物質を検出するための方法において、これらの亜種の全代表物質を検出する
ことができる核酸分子セットであって、 （ａ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの代表物質の核 酸分離株を利用して第１核酸分子（核酸分子１）を取得または誘導し、この第1 核酸分子は特異的にこの代表物質または前記の１つのサルモネラ エンテリカ亜 種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に別のサルモネラ エ ンテリカ亜種の代表物質に追加して検出するためのプライマまたはプローブとし
て適しており、 （ｂ）自体公知の方法で前記サルモネラ エンテリカ亜種の１つの他の代表物質 の核酸分離株を利用して第２核酸分子（核酸分子２）を取得または誘導し、この
第2核酸分子は特異的に前記代表物質または前記の他のサルモネラ エンテリカ亜
種の別の代表物質または全代表物質および必要がある場合に前記サルモネラ エ ンテリカ亜種の別の代表質に追加して検出するためのプライマまたはプローブと
して適しており、かつ （ｃ）（ａ）および（ｂ）に基づき取得される核酸分子により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質がまだ検出できない場合、（ａ）および／または（
ｂ）記載の核酸分子の取得または誘導が、取得または誘導された核酸分子セット
により前記サルモネラ エンテリカ亜種の全代表物質を検出することができるま で長く継続すること、 により取得可能である、前記核酸分子セット。 - 【請求項２】 核酸分離株が系統発生的に保存された塩基配列またはこの塩
基配列の領域を含有または明示すること、を特徴とする、請求項１記載の核酸分
子セット。 - 【請求項３】 個々の核酸分子または核酸分子の各々が （ｉ）種々の系統発生的に保存された塩基配列で、または （ii）同一の系統発生的に保存された塩基配列自体に重なり合わない配列領域で
、または （iii）同一の系統発生的に保存された塩基配列自体に重なり合う配列領域で ハイブリッドを形成すること、を特徴とする、請求項１または２記載の核酸分子
セット。 - 【請求項４】 サルモネラ エンテリカ サブスピーシーズ エンテリカ、サ ラマエ、アリゾナエ、ジアリゾナエ、フーテナエ、ボンゴリおよびインディカの
代表物質を検出するための方法において、前記亜種の全代表物質を検出すること
ができる、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子セットであって、 個々の核酸分子、複数の該セットの個々の核酸分子または該セットの個々の核
酸分子の各々のためのセットがそれぞれ少なくとももう１つの別の核酸分子を含
有し、この核酸分子がそのヌクレオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオ
チドの領域で塩基配列の１００％未満、しかし少なくとも８０％で一致すること
を特徴とする、前記核酸分子セット。 - 【請求項５】 個々の核酸分子、複数の該セットの個々の核酸分子または該
セットの個々の核酸分子の各々のためのセットがそれぞれ少なくとももう１つの
別の核酸分子を含有し、この核酸分子がそのヌクレオチド鎖の少なくとも１０個
連続するヌクレオチドの領域で正確に１つの塩基位置で他のもしくは別の核酸分
子と異なることを特徴とする、請求項４記載のセット。 - 【請求項６】 セットが１つまたは複数の、ただし非排他的にＷＯ９５／０
０６６４記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の断片またはこの断片と相補的な配列にな るような核酸分子を含有することを特徴とする、請求項４または５記載のセット
。 - 【請求項７】 個々の核酸分子がサルモネラ エンテリカ亜種の代表物質の 核酸分離株の同一の鎖にハイブリッドを形成し、これらの核酸分子が該核酸分子
を検出するための方法に従うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載
のセット。 - 【請求項８】 核酸分子の配列が該核酸分子のヌクレオチド鎖の少なくとも
１０個連続するヌクレオチドの領域で正確に請求項１または４に記載のサルモネ
ラ エンテリカ亜種の少なくとも１つの代表物質の配列領域と一致し、その際こ の配列領域が系統発生的に保存された塩基配列またはこの配列領域の１領域を含
有または明示することを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載のセットに
属し、またはこのようなセットに使用可能の核酸分子。 - 【請求項９】 ヌクレオチド鎖の少なくとも１０個連続するヌクレオチドの
領域で、次の配列またはこの配列に相補的な配列の１つまたはそれ以上に相当す
る数で連続するヌクレオチドに対して１００％までまたは少なくとも８０％まで
同一であることを特徴とする、請求項８記載の核酸分子。 【化１】 - 【請求項１０】 核酸分子であって、その配列に関し請求項１〜９のいずれ
かに記載の核酸分子と同種であり、かつ該核酸分子のヌクレオチド鎖の少なくと
も１０個連続するヌクレオチドの領域において （ｉ）請求項１〜９のいずれかに記載の核酸分子と同一であり、または （ii）１つを超えないヌクレオチドで請求項１〜９のいずれかに記載の核酸分子
と異なり、または （iii）２つを超えないヌクレオチドで請求項１〜９のいずれかに記載の核酸分 子と異なること、 を特徴とする、前記核酸分子。 - 【請求項１１】 １０〜２５０個かつ好ましくは１５〜３０個のヌクレオチ
ド長であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分子。 - 【請求項１２】 核酸分子が一本鎖であり、または相補的な鎖を有すること
を特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子。 - 【請求項１３】 （ｉ）ＤＮＡとして、または （ii）（i）に相当するＲＮＡとして、または （iii）ＰＮＡとして存在し、その際この核酸分子が必要のある場合に分析的検 出方法、特にハイブリッド形成および／または増幅に基づき、自体公知の方法で
修飾または標識されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の核
酸分子。 - 【請求項１４】 修飾または標識された核酸分子であり、この核酸分子にお
いてプローブおよび／またはプライマのために自体公知であり、特に細菌では自
然に存在しないヌクレオチドを明示する該核酸分子のヌクレオチド鎖の少なくと
も１０個連続するヌクレオチドのうちヌクレオチドの２０％まで構成単位になる
ことを特徴とする、請求項１３記載の核酸分子。 - 【請求項１５】 修飾または標識された核酸分子または追加で修飾または標
識された核酸分子であり、この核酸分子が分析的検出方法のために自体公知の方
法で１つまたはそれ以上の放射性群、着色群、蛍光群、固相に不動化するための
群、間接的または直接的反応のための、特に酵素反応のための群が、好ましくは
抗体、抗原、酵素および／または酵素もしくは酵素複合体と親和性を有する物質
を利用して、および／または別様の自体公知の修飾するまたは修飾された群が核
酸に類似した構造を有することを特徴とする、請求項１３または１４記載の核酸
分子。 - 【請求項１６】 分析的検出方法、特にサルモネラ菌属の細菌を検出するた
めのキットであって、 （i）請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子セット、または （ii）請求項８〜１５のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の核酸分子 により特徴づけられる、前記キット。 - 【請求項１７】 核酸分子セットが合成で製造され、かつ該セットが少なく
とも２つの互いに分離した合成調合で製造されたことを特徴とする、請求項１６
記載のキット。 - 【請求項１８】 キットがまったく変性していない核酸分子を含有すること
を特徴とする、請求項１７記載のキット。 - 【請求項１９】 請求項１〜７のいずれかに記載の核酸分子セット、請求項
８〜１５のいずれかに記載の１つまたはそれ以上の核酸分子またはサルモネラ菌
属の細菌、特に請求項１または４記載のサルモネラ エンテリカ亜種の代表物質 の一群に属す細菌の存在または非在を検出するための、請求項１６〜１８のいず
れかに記載のキットの使用。 - 【請求項２０】 核酸ハイブリッド形成および／または核酸増幅が実施され
ることを特徴とする、請求項１９記載の使用。 - 【請求項２１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が核酸増幅として実施さ
れることを特徴とする、請求項２０記載の使用。 - 【請求項２２】 検出すべき細菌および検出しない細菌に関しこれらの細菌
のゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの差異が請求項８〜１５のいずれかに記載
の核酸分子の領域の少なくとも１つのヌクレオチド位置で確定され、かつサルモ
ネラ菌属の細菌の一群の代表物質、特に請求項１または４記載のサルモネラ エ ンテリカ亜種の代表物質が検出されることを特徴とする、請求項１９、２０また
は２１に記載の使用。
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