JPH0965898A - クラミジア属微生物種の同定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 この発明は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣ
Ｒ)を利用したクラミジア属微生物（４種）の識別法を
提供するものである。 【解決手段】 クラミジアの主要外膜蛋白遺伝子の一部
である配列をプライマーとしてＰＣＲ反応を行ない、反
応液から上記遺伝子に由来する増幅生産物を検索する
か、または制限酵素により消化して生成物を比較する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、ポリメラーゼ連
鎖反応(ＰＣＲ)を利用したクラミジア属微生物（４種）
の識別法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】クラ
ミジアは球菌様微生物であって、クラミジア科は単一の
属としてクラミジア属を含み、従来この属は次の３つの
種、すなわちクラミジア・トラコマチス(Ｃhlamydia t
rachomatis)、クラミジア・シッタシ(Ｃhlamydia psit
taci)およびクラミジア・ニューモニア(Ｃhlamydia pn
eumoniae)を含んでいることが知られていた。これら
は、宿主細胞の空胞内で増殖し、トラコーマ、封入体結
膜炎、性病性リンパ肉芽腫(ＬＧＶ)または肺炎等の原因
となる。ところで最近クラミジア菌株の遺伝学的分析の
結果により、クラミジア属の第４番目の種として、クラ
ミジア・ペコーラム（Ｃhlamydia pecorum）が新たに単
離された（インターナショナル・ジャーナル・オブ・シ
ステマティック・バクテリオロジー（Ｉnt．Ｊ．Ｓyst.
Ｂacteriol.）第４２巻第４号３０６−３０８頁、マイ
クロバイオロジカル・イミュノロジー（Ｍicrobiol．Ｉ
mmunol．）第３７巻５１５−５２２頁）。このものは、
散発性脳炎、感染性の多発性関節炎、肺炎および下痢を
含む種々の疾患を有するウシやヒツジから見いだされ
た。クラミジア・ペコーラムによる感染の臨床像は、不
顕性感染から重篤な感染まで様々であるが、主として中
枢神経系、呼吸器系および消化器系に作用し、脳脊髄
炎、肺炎および腸炎の原因となる。

【０００３】クラミジア感染症の病原体検出法として現
在最も信頼度が高いものは、分離培養法である。しか
し、この方法は判定までに数日の日数を要し、しかも操
作、判定に熟練を要するという欠点があった。また、酵
素免疫測定法を利用する方法もあるが、これは常在菌と
の交差反応の存在が問題であり、ＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法は感度がまだ満足できる程でない。さらに、
上記何れの方法においても、クラミジア属に属する前記
４種を識別することはできなかった。

【０００４】ＰＣＲ法は、ＤＮＡを高倍率で増幅できる
ので、最近微量のＤＮＡの検出に利用されている。クラ
ミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシおよびク
ラミジア・ニューモニアの３種の外膜蛋白遺伝子の塩基
配列については、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
(Ｎucleic Ａcids Ｒes．)第１７巻８３６６頁、同誌
第１８巻１０６１頁、同 ３４１４頁、同 ６１３６頁、
ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レタース(ＦＥＭＳ Ｍ
icrobiol．Ｌett．)第４２巻１８５−１９０頁、同誌第
５５巻２２９−２３４頁、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー(Ｊ．Ｂacteriol．)第１６８巻１２７７−１２
８２頁、インフェクション・アンド・イミュニテイ(Ｉn
fect．Ｉmmun．)第５９巻２１９５−２１９９頁、同２
８５３−２８５５頁、ジャーナル・オブ・ゼネラル・マ
イクロバイオロジー(Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol．)第１３７
巻４６５−４７５頁等に報告されている。

【０００５】また、ＰＣＲ法を利用したクラミジアの検
出法については、（１）感染症学雑誌第６５巻１１８３
−１１８７頁、（２）ジャーナル・オブ・インフェクシ
アス・デイジージズ(Ｊ．Ｉnfect．Ｄis．)第１６２巻
９８４−９８７頁および（３）モレキュラー・アンド・
セルラー・プローブス（Ｍol．Ｃell．Ｐrobes）第６巻
３８９−３９４頁、同誌３９５−４００頁に記載がある
が、（１）の方法はクラミジア・シッタシおよびクラミ
ジア・ニューモニアには適用できず(１１８５頁左欄１
１−１３行)、（２）の方法は３種のプライマー・ペア
ーを用いた結果を比較して識別するというわずらわしさ
があった。また、（３）の方法は、数種類の制限酵素を
用いた結果を比較するという煩わしさがあった。さら
に、（１）〜（３）のいずれの方法においても、クラミ
ジア・ペコーラム種の検出方法についての記載はまった
くない。

【０００６】本発明者らは、クラミジア属の検出・識別
法を提供する目的で、特定のプライマーを用いたＰＣＲ
法によるクラミジア属の検出について報告した（特願平
４−１２８５８１号）。しかし、係る方法は増幅生産物
を３種類の制限酵素を用いて消化するという点で煩わし
さがあり、未だ改良の余地があった。さらに、クラミジ
ア・ペコーラムの検出についての記載はまったくない。
このように、これまでは４種のクラミジアを検出・識別
する方法はまったく知られていなかった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、この発明は、
前述の特願平４−１２８５８１号に記載のプライマー、
すなわち、下記配列の化合物からなるプライマーを用い
て、より簡便な操作によるクラミジア種の検出・識別法
を提供するものである。 (１)下記配列

【化３】 で示されるヌクレオチド、または上記配列に(イ)５'側
の端から１または２個の塩基を削除すること、(ロ)３'
側の端から１または２個の塩基を削除するか、または端
に−Ｔもしくは−ＴＡを付加すること、(ハ)両端以外の
１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の
塩基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて
得られる誘導体。 (２)下記配列

【化４】 で示されるヌクレオチド、または上記配列に(ニ)５'側
の端から１または２個の塩基を削除するか、または端に
Ｇ−もしくはＣＧ−を付加すること、(ホ)３'側の端か
ら１または２個の塩基を削除すること、(ヘ)両端以外の
１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔから選ばれた他の
塩基に置きかえることの少なくとも１つの変更を加えて
得られる誘導体。

【０００８】(３) (１)または(２)記載の化合物からな
るプライマー。 (４)クラミジア属微生物の主要外膜蛋白遺伝子を含む媒
質に(３)記載のプライマーとＤＮＡポリメラーゼを加
え、熱変性・アニーリング・伸長サイクルを適用するこ
とを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応による塩基配列
増幅法。 (５) (４)記載の方法による増幅生産物であるヌクレオ
チド。 (６)クラミジア属微生物を含む疑のある試料に(４)記載
の増幅法を適用し、増幅生産物であるヌクレオチドを検
索することを特徴とする、クラミジア属微生物の外膜蛋
白遺伝子の検出法。 (７)さらに、増幅生産物であるヌクレオチドを制限酵素
Ａlu ＩおよびＰvu IIで消化し、生成物を相互にまたは
主要外膜蛋白質遺伝子を用いて得た増幅生産物の消化物
と比較することを特徴とする、クラミジア属微生物種の
同定法。

【０００９】この発明でプライマーとして使用するヌク
レオチドのうち、配列番号:１および配列番号:２のヌク
レオチドは、クラミジア・トラコマチス(Ｃlamydia tr
achomatis)の外膜蛋白遺伝子の一部をなすものである。
クラミジア・トラコマチスには少なくとも１５種類の血
清型(Ａ、Ｂ、Ｂa、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、
Ｋ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)が知られているが、配列番号:１
および配列番号:２(アンチセンス鎖)のセンス鎖(配列番
号:３で示す)の配列は少なくとも血清型Ｌ２とＨにおい
て完全に共通であり、これは下記配列表の比較から明ら
かである。なお、下記比較表中、配列番号:４は血清型
Ｌ２の外膜蛋白遺伝子配列の一部分であり、配列番号:
５は同じくＨの配列一部分である。

【化５】

【００１０】これらのプライマーは、クラミジア・トラ
コマチスの変性した外膜蛋白遺伝子にアニールできるこ
とはいうまでもないが、この発明によると、これらはク
ラミジア・シッタシ(Ｃ．psittaci)、クラミジア・ニュ
ーモニア(Ｃ．pneumoniae)およびクラミジア・ペコーラ
ム(Ｃ．pecorum)の変性した外膜蛋白質遺伝子にもアニ
ールできることが明らかになった。クラミジア・シッタ
シＡ２２／Ｍ株およびクラミジア・ニューモニア標準株
(アメリカで分離され、継代培養されているもの)につい
てこれらの関係を示すと下記比較表の通りである。配列
番号:４は上記比較表と同じくクラミジア・トラコマチ
ス血清型Ｌ２であり、配列番号:６はクラミジア・シッ
タシＡ２２／Ｍ株、配列番号:７はクラミジア・ニュー
モニア標準株である。なお、クラミジア・ペコーラムの
塩基配列については決定されていないので比較表には示
していない。

【化６】

【化７】

【００１１】これらの比較表から明らかなように、配列
番号:１に対応するクラミジア・シッタシの配列(配列番
号:８で示す)およびクラミジア・ニューモニアの配列
(配列番号:９で示す)は、配列番号:１の配列と一か所が
異なっている。この発明によると、このように１か所ま
たは２か所が異なっている場合にもアニールすることが
でき、プライマーとして使用し得ることが明らかになっ
た。また逆に、配列番号:１に前記(イ)、(ロ)、(ハ)に
示すような変更を加えたものおよび配列番号:２に前記
(ニ)、(ホ)、(ヘ)に示すような変更を加えたものも、ア
ニールすることができ、プライマーとして使用できるこ
とが明らかになった。プライマーとして好ましいものは
配列番号:１または配列番号:２そのものまたは(ハ)もし
くは(ヘ)の変更を加えたものまたは配列番号:８もしく
は配列番号:９(これらの配列は同一である)に示すもの
である。プライマーは、例えばＤＮＡ合成機を用いて、
当技術で知られた方法により合成することができる。合
成したプライマーは、例えば高速液体クロマトグラフィ
ーのような精製手段により精製するのが好ましい。

【００１２】ＰＣＲ反応による塩基配列の増幅は、例え
ば自動増幅装置を用いて、例えば緩衝液のような適当な
媒質中で鋳型ＤＮＡ、各塩基、プライマーおよびＤＮＡ
ポリメラーゼを温度変換サイクルにかける等の当技術で
知られた方法により行なうことができる。好ましい実施
方法の一例を示すと次の通りである。 (１)０.２mlの自動増幅器専用の遠心管に下記組成の反
応液を入れる。なお、自動増幅器の種類によっては、反
応液をミネラル・オイル(例えばシグマ社Ｍ−３５１６)
で覆う。 (組成) 鋳型ＤＮＡを含む試料 ０.５μＭの順方向プライマー ０.５μＭの逆方向プライマー １０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.３) ５０mＭ ＫＣl １.５mＭ ＭgＣl₂ ０.００１％ゼラチン ２５〜２５０μＭの各dＮＴＰ １.２５−２.５単位ＤＮＡポリメラーゼ 上記組成は適宜変更することができる。例えばマグネシ
ウム濃度はdＮＴＰの全濃度を０.５−２.５mＭ超える濃
度が好ましい。dＮＴＰ濃度は高すぎるとＤＮＡポリメ
ラーゼが誤まったdＮＴＰをとり込む可能性が増加す
る。ＤＮＡポリメラーゼが高すぎると非特異的な産物が
増えるが、低すぎると産物の収率が低下する。ＤＮＡポ
リメラーゼとしては、耐熱性のものが好ましく、例えば
パーキン・エルマー・シータス社、ストラタジーン社、
ニュー・イングランド・バイオラブス社等から販売され
ているＴaqＤＮＡポリメラーゼ[テルムス・アクアチク
ス(Ｔhermus aquaticus)から得たものまたはこれを大
腸菌で発現させたもの]が適当である。

【００１３】(２)自動増幅装置に反応液をセットし、熱
変性段階、アニーリング段階および伸長段階からなるサ
イクルを２０サイクル以上、好ましくは３０サイクル以
上行なう。熱変性温度は通常９０−９５℃、アニーリン
グ温度は通常４０−６０℃、伸長温度は通常７０−７５
℃が適当であるが、アニーリング温度はプライマーの長
さとＧＣ含量により異なる。アニーリング温度は、通常
Ｔm℃[但し、Ｔm℃＝４×(Ｇ＋Ｃ)＋２×(Ａ＋Ｔ)]から
Ｔm−２０℃が適当であり、Ｔm−５℃前後が好ましい。
熱変性時間は２０秒以上、アニーリング時間は２０秒以
上、伸長時間は３０秒以上が好ましい。自動増幅装置
は、例えばパーキン・エルマー・シータス社から販売さ
れている。

【００１４】増幅生産物は、前記の比較表（化５、６、
７）においてそれぞれ配列番号:１から３(クラミジア・
トラコマチス)、配列番号８から３(クラミジア・シッタ
シ)および配列番号９から３(クラミジア・ニューモニ
ア)にはさまれた塩基配列およびそのアンチセンス鎖で
あり、これらは例えばアガロースゲル電気泳動のような
分離手段により分離される。また、生産物はマーカーと
の比較によるバンドの長さにより検出されるが、さらに
標識プローブを用いるサザンハイブリダイゼーションに
より確認することができる。プローブとしては、例えば
前記比較表中に示した配列番号:１０、配列番号:１１、
配列番号:１２を用いることができる。標識としては、
³²Ｐ、ビオチン、ジゴキシゲニン等が用いられる。これ
らを用いる実験方法は文献に記載されている。増幅生産
物の存在は、クラミジア属微生物の外膜蛋白遺伝子の存
在を示し、したがって上記微生物存在の指標となる。

【００１５】さらに、この発明によると、増幅生産物を
異なる制限酵素により消化すると、クラミジア属微生物
の種に応じて異なる消化物を生じ、それによって４種の
微生物の識別が可能である。例えば、クラミジア・トラ
コマチス血清型Ｌ２の場合、生産物をＡlu Ｉで消化す
ると、それぞれ６８、８８および８９bpの３つの断片を
生ずるが、電気泳動上は２本のバンドがみられ、そのう
ちサイズの大きなバンドは２つの断片が重なっているた
め太く(または濃く)見える。また、Ｐvu IIでは消化さ
れない。クラミジア・シッタシの場合、Ａlu Ｉおよび
Ｐvu IIで消化されてそれぞれ等しくない２つの断片と
なる。クラミジア・ニューモニアの場合、Ａlu Ｉで消
化されて等しくない２つの断片となるが、Ｐvu IIでは
消化されない。また、クラミジア・ペコーラムの場合、
Ａlu ＩおよびＰvu IIでは消化されない。したがって、
消化パターンと断片の観察により、これら４種を識別す
ることができる。上記の識別法または同定法を実施する
には、実施に必要な試剤および器具をまとめてキットに
しておくのが便利である。このようなキットは、下記の
ものの中から選ばれたものを含むことができる。(１)順
方向プライマー、(２)逆方向プライマー、(３)緩衝液、
(４)ＫＣl、(５)ＭgＣl₂、(６)ゼラチン、(７)４種類の
dＮＴＰ、(８)ＤＮＡポリメラーゼ、(９)ミネラル・オ
イル、(１０)遠心管、(１１)発色試薬(例えばエチジウ
ムブロミド)、(１２)制限酵素(２種)、等。検体として
は、細胞、組織、粘膜、これらの破砕物、粘液、血液、
滲出液、培地等を挙げることができる。

【００１６】

【実施例】以下、この発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、実施例はこの発明を制限するものではな
い。 実施例１(プライマーの合成および精製) アプライド・バイオシステムズ・ジャパン株式会社製モ
デル３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用し、添
付のオペレーターズマニュアルに従って塩基の結合と脱
保護を行い、プライマーＣＭ−１（配列番号：１）およ
びＣＭ−２（配列番号：２）を合成した。さらに、同社
製オリゴヌクレオチド・ピューリフィケーション・カー
トリッジを使用し、得られたプライマーを精製した。

【００１７】実施例２(クラミジア感染ＨeＬa細胞から
の検出） クラミジアに感染したＨｅＬa細胞を、ラバーポリスマ
ンで剥がし、ウログラフィン（商標）不連続密度勾配法
によりクラミジアＥＢを粗精製した。そのＥＢ粗精製液
を、１００μg／mlのプロテイナーゼＫを含む溶解緩衝
液[１０mＭトリス・ＨＣl(pＨ８.０)、５mＭ ＥＤＴ
Ａ、０.５％ ＳＤＳ]中に加え、５５℃で６０分間反応
させた。その後、フェノール／クロロホルム抽出を施行
し、エタノール沈澱を行い緩衝液[１０mＭトリス・ＨＣ
l(pＨ８.０)、１mＭ ＥＤＴＡ]に再懸濁させた。その
溶液の一部を実施例３記載のＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ試
料とし反応を行った。

【００１８】実施例３(ＰＣＲ反応) ４種類のクラミジア属微生物を検出するために、ペアプ
ライマーＣＭ−１(配列番号:１)およびＣＭ−２(配列番
号:２)を使用した。ＰＣＲの反応には、タカラ・タック
(商標)ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔakara社製）を使用して
行った。ＰＣＲ混合液としては、１×反応緩衝液[１０m
Ｍ トリス・ＨＣl(pＨ８.３)、５０mＭ ＫＣl;１.５m
Ｍ ＭgＣl₂、０.００１％ゼラチン]、２５０μＭずつ
のdＧＴＰ、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＣＴＰ、０.５μＭの
ＣＭ−１およびＣＭ−２、１.２５単位のＴaq ＤＮＡ
ポリメラーゼを含ませ全量５０μlとした。鋳型ＤＮＡ
としては、クラミジア培養物または後記実施例４の溶液
を用いた。ＰＣＲ温度条件は、９４℃で３分間の長い変
性過程の後、９４℃の変性２０秒、５５℃のアニーリン
グ２０秒、７２℃の伸長３０秒を３５サイクル行った。
最終サイクルの後、７２℃の長い伸長を７分間行った。
ＰＣＲ反応終了後、ＰＣＲ生産物を分析するまで４℃で
保存した。

【００１９】実施例４(アガロースゲル電気泳動) ＰＣＲ反応後、その反応液(ＰＣＲ産物)の一部とその６
分の１量の６×ゲル・ローデイング緩衝液[０.２５％(w
／v)ブロモフェノールブルー、０.２５％(w／v)キシレ
ンシアノール、３０％(v／v)グリセリン]を混合し、Ｔ
ＡＥ[４０mＭトリス・アセテート、１mＭ ＥＤＴＡ]で
溶解した４％アガロースゲル[ＮuＳieve（商標）３：１
アガロース]に負荷した。電気泳動[条件:１００Ｖ、４
０〜６０分泳動（Ｍupid−２（商標）、コスモバイ
オ）]後、ＵＶトランスイルミネーターを使用してバン
ドを観察し、ポラロイドカメラにより写真を撮った。ク
ラミジア・トラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラ
ミジア・ニューモニアおよびクラミジア・ペコーラムの
ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応した電気泳動の結果を図１に
示す。すべてのクラミジア種で予想された長さの増幅産
物が認められ、クラミジア属の検出が可能であった。

【００２０】実施例５(クラミジア４種の識別) 実施例３で得られたクラミジア４種のＰＣＲ生産物を２
種の制限酵素によって消化することにより、その識別が
できた。制限酵素にはＡlu ＩおよびＰvu IIを使用し
た。ＰＣＲ反応液１０μlを取り、それぞれの酵素の緩
衝液１.２μlおよび８から１０ユニットの酵素を加え、
至適温度(３７℃)で１時間から２時間反応させた。その
後１.３μｌの１０×反応停止液［０.１％（w/v）ブロ
モフェノールブルー、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０.１Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７.５）、５０％（v/v）グリセリン］を
加えて３分間放置した後、電気泳動に供し分析を行っ
た。この分析の結果を図２、図３および表１に示す。

【表１】 クラミジア・ クラミジア・ クラミジア・ クラミジア・ トラコマチス シッタシ ニュ ーモニア ペコーラム Ａlu Ｉ ＋＋ ＋ ＋ −Ｐvu II − ＋ − − ＋＋:２本のバンドが観察され、そのうち１本は太く(濃く)見える。 ＋:等しくない２つの断片が観察される。 −:消化されない。

【発明の効果】本発明によれば、クラミジア属に属する
４種の微生物種の識別が可能となる。また、制限酵素は
２種類を用いるだけであるので、操作が簡便化される。

【００２１】

【配列表】

【００２２】配列番号:１ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：CAGGACATCT TGTCTGGCTT 20

【００２３】配列番号:２ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス:Ｙes 配列：CAAGGATCGC AAGGATCTCC 20

【００２４】配列番号:３ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｌ２ 配列：GGAGATCCTT GCGATCCTTG 20

【００２５】配列番号:４ 配列の長さ:２４５ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｌ２ 配列： CAGGACATCT TGTCTGGCTT TAACTAGGAC GCAGTGCCGC CAGAAAAAGA TAGCGAGCAC 60 AAAGAGAGCT AATTATACAA TTTAGAGGTA AGAATGAAAA AACTCTTGAA ATCGGTATTA 120 GTGTTTGCCG CTTTGAGTTC TGCTTCCTCC TTGCAAGCTC TGCCTGTGGG GAATCCTGCT 180 GAACCAAGCC TTATGATCGA CGGAATTCTA TGGGAAGGTT TCGGCGGAGA TCCTTGCGAT 240 CCTTG 245

【００２６】配列番号:５ 配列の長さ:２４６ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia trachomatis 株名 Ｈ 配列： CAGGACATCT TGTCTGGCTT TAACTAGGAC GCAGTGCCGC CAGAAAAAGA TAGCGAGCAC 60 AAAGAGAGCT AATTATACAA TCTTAGAGGT AAGAATGAAA AAACTCTTGA AATCGGTATT 120 AGTATTTGCC GCTTTGAGTT CTGCTTCCTC CTTGCAAGCT CTGCCTGTGG GGAATCCTGC 180 TGAACCAAGC CTTATGATCG ACGGAATTCT GTGGGAAGGT TTTGGCGGAG ATCCTTGCGA 240 TCCTTG 246

【００２７】配列番号:６ 配列の長さ:２５９ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia psittaci 株名 Ａ２２／Ｍ 配列： CAGGATATCT TGTCTGGCTT TAACTTGGAC GTGGTGCCGC CAGAAGAGCA AATTAGAATA 60 GCGAGCACAA AAAGAAAAGA TACTAAGCAT AATCTTTAGA GGTGAGTATG AAAAAACTCT 120 TGAAATCGGC ATTATTGTTT GCCGCTACGG GTTCCGCTCT CTCCTTACAA GCCTTGCCTG 180 TAGGGAACCC AGCTGAACCA AGTTTATTAA TCGATGGCAC TATGTGGGAA GGTGCTTCAG 240 GAGATCCTTG CGATCCTTG 259

【００２８】配列番号:７ 配列の長さ:２５８ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia pneumoniae 株名 標準株 配列： CAGGATATCT TGTCTGGCTT TAATTTGGAC GTCGTGTCGC CAAAATATGA GTAATAGCGA 60 GCACATAAAT AAAAGATACT AAGCATAATC TTTAGAGGTG AGTATGAAAA AACTCTTAAA 120 GTCGGCGTTA TTATCCGCCG CATTTGCTGG TTCTGTCGGC TCCTTACAAG CCTTGCCTGT 180 AGGGAACCCT TCTGATCCAA GCTTATTAAT TGATGGTACA ATATGGGAAG GTGCTGCAGG 240 AGATCCTTGC GATCCTTG 258

【００２９】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia psittaci 株名 Ａ２２／Ｍ 配列：CAGGATATCT TGTCTGGCTT 20

【００３０】配列番号:９ 配列の長さ:２０ 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:Ｇenomic ＤＮＡ フラグメント型:中間部フラグメント 起源:生物名 Ｃhlamydia pneumoniae 株名 標準株 配列：CAGGATATCT TGTCTGGCTT ２
０

【００３１】配列番号：１０ 配列の長さ:３０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：ATCGGTATTA GTGTTTGCCG CTTTGAGTTC 30

【００３２】配列番号:１１ 配列の長さ:３０ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：ATCGGCATTA TTGTTTGCCG CTACGGGTTC 30

【００３３】配列番号:１２ 配列の長さ:３３ 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：GTCGGCGTTA TTATCCGCCG CATTTGCTGG TTC 33

【図面の簡単な説明】

【図１】 クラミジア・トラコマチス、クラミジア・シ
ッタシ、クラミジア・ニューモニアおよびクラミジア・
ペコーラムに関する実施例４の電気泳動の写真である。

【図２】 クラミジア・トラコマチスおよびクラミジア
・シッタシに関する実施例５の電気泳動の写真である。

【図３】 クラミジア・ニューモニアおよびクラミジア
・ペコーラムに関する実施例５の電気泳動の写真であ
る。

【符号の説明】

Ｍａｒｋｅｒ：φＸ１７４／Ｈinc II消化Ｃ.tr：Chlam
ydia trachomatis、Ｃ.ps：Chlamydia psittaci、Ｃ.p
e：Chlamydia pecorum、Ｃ.pn：Chlamydia pneumonia
e、Ｍn：Ｍeningopneumonitis、６ＢＣ：ＡＴＣＣ ＶＲ
−１２５、Ｅ５８：Ｅncephalitis、ＴＷ：Ｔaiwan、Ａ
Ｃ：Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉田 洋 大阪府大阪市城東区森之宮２丁目３番30号 扶桑薬品工業株式会社研究開発センター 内

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記配列 【化１】 で示されるヌクレオチド、または上記配列に (イ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
   と、 (ロ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
   または端に−Ｔもしくは−ＴＡを付加すること、 (ハ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
   ら選ばれた他の塩基に置きかえることの少なくとも１つ
   の変更を加えて得られる誘導体。
2. 【請求項２】 下記配列 【化２】 で示されるヌクレオチド、または上記配列に (ニ)５'側の端から１または２個の塩基を削除するか、
   または端にＧ−もしくはＣＧ−を付加すること、 (ホ)３'側の端から１または２個の塩基を削除するこ
   と、 (ヘ)両端以外の１または２個の塩基をＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔか
   ら選ばれた他の塩基に置きかえることの少なくとも１つ
   の変更を加えて得られる誘導体。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の化合物からなる
   プライマー。
4. 【請求項４】 クラミジア属微生物の主要外膜蛋白遺伝
   子を含む媒質に請求項３記載のプライマーとＤＮＡポリ
   メラーゼを加え、熱変性・アニーリング・伸長サイクル
   を適用することを特徴とする、ポリメラーゼ連鎖反応に
   よる塩基配列増幅法。
5. 【請求項５】 請求項４記載の方法による増幅生産物で
   あるヌクレオチド。
6. 【請求項６】 クラミジア属微生物を含む疑のある試料
   に請求項４記載の増幅法を適用し、増幅生産物であるヌ
   クレオチドを検索することを特徴とする、クラミジア属
   微生物の外膜蛋白遺伝子の検出法。
7. 【請求項７】 さらに、増幅生産物であるヌクレオチド
   を制限酵素Ａlu ＩおよびＰvu IIで消化し、生成物を相
   互にまたは主要外膜蛋白質遺伝子を用いて得た増幅生産
   物の消化物と比較することを特徴とする、クラミジア属
   微生物種の同定法。