JPH06113899A

JPH06113899A - 酪酸菌の簡易同定方法及び同定キット

Info

Publication number: JPH06113899A
Application number: JP4285525A
Authority: JP
Inventors: Satoru Ishii; 哲石井; Setsu Sakaguchi; 摂坂口; Tomoko Kasagawa; 朋子笠川; Yutaka Suzuki; 豊鈴木
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1992-09-30
Publication date: 1994-04-26

Abstract

(57)【要約】【構成】酪酸菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いでｒ
ＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を特異的プライマーを用いる
ＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡを特定の制
限酵素で切断し、得られたｒＤＮＡ断片の長さを電気泳
動により解析、比較することからなる酪酸菌の簡易同定
方法。菌体からＤＮＡを抽出する試薬、ｒＤＮＡ特異的
プライマー、増幅したｒＤＮＡを切断するための制限酵
素、クロストリジウム・チロブチリカム(Clostoridium
tyrobutyricum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clost
oridium butyricum)及びクロストリジウム・スポロゲネ
ス(Clostoridium sporogenes)のｒＤＮＡの制限酵素切
断情報を含む酪酸菌の同定キット。【効果】チーズ膨張の原因菌であるクロストリジウム
属に属する細菌の同定を、簡便にしかも正確に行うこと
ができる。また、同定に複雑な装置、技術等が不要であ
るので、安価にしかも短時間で同定を行うことができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酪酸菌の簡易同定方法
及び酪酸菌の同定キットに関する。更に詳しく言うと、
本発明は、ＰＣＲ法を利用したクロストリジウム属細菌
の簡易同定方法及びその方法を行うための同定キットに
関する。

【０００２】

【従来の技術】ナチュラルチーズには、乳牛やその飼料
及び製造工程から混入する、好気性及び嫌気性の胞子形
成菌、酵母、カビ等の多種多様の微生物が含まれてい
る。これらの微生物により、ナチュラルチーズは、その
製造工程中または熟成中において、ガス発酵を起こすこ
とがある。ガス発酵を起こしたチーズは、内部にガスホ
ールや亀裂が生じて、組織が軟化し、変色したり、不快
臭を発生する等により、商品価値が低下する。特に、酪
酸発酵を行う酪酸菌は、チーズのガス膨張の原因となる
ことが広く知られ、搾乳管理の重要性が指摘されてい
る。このようなチーズ膨張菌の中でもクロストリジウム
に属する細菌は、最も多発する熟成中期以後のガス発酵
（Late gas-blowing）の主な原因菌とされており、原料
乳およびチーズ中でのこれらの菌の存在を明確にし、対
策を講じることはチーズ製造上の重要な技術的課題であ
る。

【０００３】クロストリジウム属に属する細菌の同定
は、一般に、蛋白質の分解性や糖の資化性などの生理学
的性状を調べることにより行われているが、これらの性
状試験は迅速性や客観性に欠け、恣意的な判断に基づく
分類・同定に陥りやすいという欠点がある。また，被検
菌の酵素活性、インドール酸性、糖発酵及び硝酸塩還元
等の試験を組み合わせて行うための簡易同定キットも市
販されているが、上記方法と同様、客観性に欠けるとい
う問題は、やはり解決されていない（「新しい分類学に
伴走する細菌同定法」、日本細菌学会教育委員会編、菜
根出版、(1987)）。

【０００４】一方、近年、分子生物学の発展に伴い、細
菌の分類同定のためにＤＮＡ／ＤＮＡホモロジー手法の
導入による新しい分類体系が確立され、その手法を用い
ると、従来の性状試験では正確に同定できなかった場合
でも、正確に同定できるようになってきた。しかし、こ
の手法には操作が煩雑であること等、いくつかの問題が
指摘されており、これらの点を解決するための方法とし
て、特異プローブを用いたハイブリダイゼーション法
（特開昭61-44000号公報及び特開昭60-110299号公報）
や、マイクロプレートを用いて染色体ＤＮＡの相同性を
簡便に測定して同定する方法（特開平1-196300号公報）
等が提案されている。前者の特異プローブは、特定菌群
の検出には有用ではあるが、日常の同定作業に用いるた
めには、多数の特異プローブを準備して、それぞれとハ
イブリダイゼーションさせる必要があるため、利便性に
乏しいという欠点がある。また、後者のマイクロプレー
トを用いた方法は、一度、同定用のマイクロプレートを
準備すれば、簡便に同定を行うことができるが，そのた
めには該当菌種すべての染色体ＤＮＡを準備しなければ
ならないという困難がある。

【０００５】さらに、微生物の分類指標として、リボソ
ームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びその遺伝子（ｒＤＮＡ）を
用いる方法が、利用されつつある（Nucleic Acid Techn
iques in Bacterial Systematics, John Wiley & Sons,
England, (1991)）。この方法は、16ＳｒＲＮＡ遺伝子
が細菌に普遍的に存在し、かつ指標となり得るだけの多
様性を有していることによるものである。この方法は、
一般的には、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの塩基配列を決定
してこれを対照の微生物のものと比較したり、ある分類
群に特異的な配列をＤＮＡプローブとして用いることか
らなる。また、ｒＤＮＡの制限酵素による切断後の電気
泳動パターンを同定に利用しようとする研究が行われて
おり（Ann. Inst. Pasteru Microbiol. 137B: 165-17
5）、いくつかの分類群についてはその有用性が認めら
れている。また、特表昭58-501496号公報には、ｒＤＮ
Ａを用いて、ハイブリダイゼーションプローブとの選択
的な結合を利用し、真核生物に共生する原核生物の検出
を行う方法が開示されている。

【０００６】このような、制限酵素切断ｒＤＮＡの電気
泳動パターンによる同定法は、簡便性および同定精度等
の点で、他の方法と比べて優れているが、クロストリジ
ウム属に属する細菌の同定法としては、未だ検討されて
いない。特に分類に使用する制限酵素の種類や、ＤＮＡ
の増幅に用いるプライマーの塩基配列、あるいは測定の
条件などはクロストリジウムに関しては一切不明であっ
た。

【０００７】尚、クロストリジウム属の中でも、ガス発
酵の原因としてクロストリジウム・チロブチリカム（Cl
ostoridium tyrobutyricum）、クロストリジウム・ブチ
リカム（Clostoridium butyricum）、クロストリジウム
・スポロゲネス（Clostoridium sporogenes）の３種が
確認されているが、これらを迅速に同定する方法は未だ
知られていない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、上
記の従来技術の問題点を解決した、酪酸菌、特にクロス
トリジウム属に属する細菌の同定を、特に、制限酵素切
断ｒＤＮＡの電気泳動パターンによって正確、迅速に行
う新規な方法、及びその方法を利用する同定キットを提
供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の上記の目的は、
酪酸菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次いでｒＲＮＡ遺伝
子（ｒＤＮＡ）を特異的プライマーを用いるＰＣＲ法に
より増幅させ、増幅したｒＤＮＡを特定の制限酵素で切
断し、得られたｒＤＮＡ断片の長さを電気泳動により解
析、比較することからなる酪酸菌の簡易同定方法によっ
て達成される。

【００１０】以下、本発明の酪酸菌の同定方法を詳しく
説明する。最初に、酪酸菌から染色体ＤＮＡを抽出す
る。酪酸菌とは、酪酸発酵を行う細菌であり、これに限
定されるものではないが、クロストリジウム属に属する
細菌の多くは、酪酸菌である。また、本発明はこれらに
限定されるものではないが、クロストリジウム・チロブ
チリカム（Clostoridium tyrobutyricum）、クロストリ
ジウム・ブチリカム（Clostoridium butyricum）及びク
ロストリジウム・スポロゲネス（Clostoridium sporoge
nes）の３種及びその類縁菌種は、酪酸菌の代表例であ
る。

【００１１】従って、上記３種の細菌及びその類縁菌種
の細菌であると判断される被検菌から、染色体ＤＮＡを
抽出する。この抽出は、公知のいずれの染色体ＤＮＡ抽
出法を使用しても行うことができるが、例えば、菌体を
緩衝液に懸濁し、リゾチームなどの溶菌酵素を作用させ
て溶菌し、フェノール処理、エタノール沈澱を繰り返
し、得られる沈澱を緩衝液に溶解する方法によって、染
色体ＤＮＡ溶液を得ることができる。抽出された染色体
ＤＮＡから酵素的遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）によって、
ｒＲＮＡ遺伝子、即ち、ｒＤＮＡを特異的に増幅する。

【００１２】このようなＰＣＲ法による増幅には、クロ
ストリジウム属細菌のｒＤＮＡを特異的に増幅させるプ
ライマーが必要である。本発明においては、２種類のプ
ライマー、５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’
（配列番号１）及び５’−ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧ
ＴＡＣＡＡ−３’（配列番号２）を用いて行うことが好
ましいことが確認されている。しかしながら、これ以外
の塩基配列を有する合成プライマーであっても、クロス
トリジウム属細菌のｒＤＮＡを特異的に増幅させるため
に必要な塩基配列を有するものであれば使用することが
できる。

【００１３】次に、増幅されたｒＤＮＡを特定の制限酵
素で切断する。ここでの特定の制限酵素は、酪酸菌のｒ
ＤＮＡを特異的に切断し、電気泳動に付した場合に、菌
種特有のパターンを呈するものであれば、いずれの種類
のものであってもよいが、Hha I、Rsa I及びSau3A Iの
組み合わせは、特に好ましい。

【００１４】次に、切断されたｒＤＮＡ断片を解析、比
較する。解析の方法としては、アガロース電気泳動を用
いることが好ましい。本発明の上記の方法により得られ
る切断ｒＤＮＡ断片の長さを標準株のものと比較し, 標
準株と一致する泳動パターンを示す被検菌が、標準株と
同一菌種に含まれるものであるとすることによって同定
することができる。従来の生化学的同定方法によれば、
酪酸菌の同定に約２ケ月要していたのに比べ、本発明に
よる酪酸菌の同定に必要な時間は、微生物の分離からわ
ずか約２４時間である。

【００１５】本発明の方法は、菌体からＤＮＡを抽出す
る試薬、ｒＤＮＡ特異的プライマー、増幅したｒＤＮＡ
を切断するための制限酵素、クロストリジウム・チロブ
チリカム(Clostoridium tyrobutyricum)、クロストリジ
ウム・ブチリカム(Clostoridium butyricum)及びクロス
トリジウム・スポロゲネス(Clostoridium sporogenes)
のｒＤＮＡの制限酵素切断情報を含むキットを使用すれ
ば、当業者が容易にその実施をすることができる。従っ
て、本発明は、上記の同定キットをも提供するものであ
る。

【００１６】本発明は、従来の酪酸菌の各種同定方法に
比べて、下記のような長所を有している。即ち；（１）同定のための指標として、ＤＮＡ断片の長さと
いう絶対値を用いているため、他の同定方法では必要と
される標準サンプルを必要とせず、被験菌のみを用い
て、確実に、しかも客観的に酪酸菌を同定することがで
きる。（２）高度な設備や、技術、訓練を必要としないた
め、安価にしかも簡便に同定することができる。また、
同定に要する時間も著しく短くてすむ。（３）１種の被験菌について実施する場合と、複数種
の被験菌について実施する場合とで、要する労力、時間
に大差がなく、多数の被験菌の同定を行うことができ
る。

【００１７】本発明によれば、チーズ膨張菌の原因であ
るクロストリジウム属に属する微生物の同定が容易に実
施できる。また、当該微生物の存在を早期に確認するこ
とができるので、ガス膨張チーズの発生対策が可能とな
る。例えば、チーズの原料乳について酪酸菌が存在する
ことが確認されれば、酪酸菌の増殖を抑制させるような
pHにおいてチーズ製造を行う等、膨張チーズの発生を予
防することが可能となる。

【００１８】

【実施例】以下、本発明を下記の実施例により、詳しく
説明する。実施例１本実施例では、標準菌株のｒＤＮＡの制限酵素による切
断後の電気泳動による菌種の確認例を示す。（実験方法）本実施例において使用したクロストリジウ
ム・チロブチリカム（Clostoridiumtyrobutyricum）、
クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium butyric
um）及びクロストリジウム・スポロゲネス（Clostoridi
um sporogenes）の４菌株を表１に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】これらの菌株を、400mlのGAMブイヨン（日
水製薬製）にて、３７℃で１６時間嫌気培養した。得ら
れた菌体をＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、１mM EDTA、
pH8.0）により洗浄した後、５mg/mlのリゾチームと250
mM EDTAとを含むトリス緩衝液（pH8.0）３６ml中に懸濁
させて、３７℃で３０分間反応させた。これに２０％Ｓ
ＤＳ１mlと２mg/mlプロテイナーゼＫ２mlを加え、３７
℃で２時間反応させた。さらに、２０％ＳＤＳ３mlを加
えて、６０℃で２時間反応させた。フェノール／クロロ
フォルム処理を２回行った後、２倍容のエタノールを加
え、染色体ＤＮＡをガラス棒に巻き取り、回収した。染
色体ＤＮＡは、７０％エタノールですすいだ後、１０μ
g/mlのＲＮaseを含むＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、１
mM EDTA、pH8.0）５ml中に溶解した。溶解後、一晩、Ｔ
Ｅ緩衝液（１０mM Tris-HCl、１mM EDTA、pH8.0）で透
析を行ったものを染色体ＤＮＡ溶液とした。

【００２１】調製した染色体ＤＮＡを鋳型とし、二種類
のプライマー、５’−ＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−
３’（配列番号１）及び５’−ＧＡＣＧＧＧＣＧＧＴ
ＧＴＧＴＡＣＡＡ−３’（配列番号２）を用いてＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction）反応を行った。反応
は、２.５ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（「Ampli
Taq DNA Polymerase」としてパーキンエルマーシータス
（PERKIN ELMER CETUS）社から販売）、５０mM塩化カリ
ウム、１０mM Tris-HCl（pH8.3）、１.５mM塩化マグネ
シウム、それぞれ０.５μM の上記プライマー、200μMd
ATP、200μMdCTP、200μMdGTP及び200μMdTTPを含む全
量100μlの反応液で、９４℃−１分間、５０℃−２分
間、７２℃−３分間、４０サイクルの条件で行い、16Ｓ
ｒＤＮＡ遺伝子内の約１.２Kbp 断片を増幅した。

【００２２】得られたＤＮＡ溶液をクロロホルムで処理
し、エタノールにより沈澱させた。これらのＤＮＡ約２
μgを制限酵素Hha I、Rsa I及びSau3A I等とともに、そ
れぞれの至適pHおよび塩濃度において３７℃で１時間反
応させた。これらの反応液を４％のシーカム３：１アガ
ロースゲル（FMCバイオプロダクツ（Bioproducts）社
製）電気泳動に供した。ＤＮＡの染色は１μg/mlのエチ
ジウムブロマイド溶液により行った。

【００２３】（実験結果）上記の手順を経て得られた結
果を図１並びに表２、３及び４に示す。

【００２４】

【表２】

【００２５】

【表３】

【００２６】

【表４】

【００２７】図１の電気泳動パターンにより、クロスト
リジウム・チロブチリカム（Clostoridium tyrobutyric
um）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium b
utyricum）及びクロストリジウム・スポロゲネス（Clos
toridium sporogenes）を同定することができた。

【００２８】参考例１制限酵素Sal I、Puv II、Sph I、Hae III、EcoRI、EcoR
V、HindIII、Alu I、Msp Iを用いること以外は、実施例
１と同様に、操作を行った。その結果、クロストリジウ
ム・チロブチリカム（Clostoridium tyrobutyricum）、
クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium butyric
um）及びクロストリジウム・スポロゲネス（Clostoridi
um sporogenes）の３菌種のいずれも切断しない酵素、
３菌種とも切断して同一のパターンを示す酵素、一部の
菌種のみを切断する酵素、さらに、３菌種とも切断する
が一部の菌種のみに特異的パターンが現れる酵素に分か
れた。これらの結果を表５に示す。

【００２９】

【表５】

【００３０】これらの結果より、本発明の方法において
使用される制限酵素としては、HhaI、Rsa I及びSau3A I
の３種類が適当であることが明らかとなった。実施例２本実施例では、ガス膨張したチーズからクロストリジウ
ム属菌を分離し、従来技術による方法と本発明の方法と
により、それらの同定を行い、比較した例を示す。表
６，７，８，９，１０，１１にゼラチン液化陰性１８株
とゼラチン液化陽性１５株の性状を整理した。ゼラチン
液化陰性１８株は、すべてクロストリジウム・チロブチ
リカムと従来法で同定した。また、ゼラチン液化陽性１
５株中No.１３がクロストリジウム・オセアニカム（Cl.
oceanicum）とNo.１４がクロトリジウム・プトリフィ
カム（Cl. putrificum）、No.１５がクロトリジウム・
リタセバレンス(Cl.liturseburense)であり、その他の1
2株はクロストリジウム・スポロゲネスと同定した。

【００３１】

【表６】

【００３２】

【表７】

【００３３】

【表８】

【００３４】

【表９】

【００３５】

【表１０】

【００３６】

【表１１】

【００３７】これらの３３株を用い、実施例１と同様に
操作を行い、ｒＤＮＡの制限酵素切断断片を調製し、ア
ガロース電気泳動をおこなった。泳動パターンから、ゼ
ラチン液化陰性１８株は、すべてクロストリジウム・チ
ロブチリカムと同定された。また、ゼラチン液化陽性１
５株は、No.１３、１４、１５を含めてすべてクロスト
リジウム・スポロゲネスと同定された。No.１３、１
４、１５は、標準株と一部性状が異なるクロストリジウ
ム・スポロゲネスの変異株と考えられる。これらの結果
から試料として用いたチーズの膨張は、クロストリジウ
ム・チロブチリカムとクロストリジウム・スポロゲネス
が原因であることが明らかになった。

【００３８】実施例３本実施例では、クロストリジウム属菌からの染色体の抽
出及びｒＤＮＡの増幅、制限酵素切断断片の調製をより
多数の試料から短時間に行う方法を示す。（実験方法）実施例１と同じ培養物1.５mlから菌体を遠
心分離により回収し、ＴＥ緩衝液（１０mM Tris-HCl、
１mM EDTA、pH8.0）565μl中に懸濁した。そこに、１０
％ＳＤＳ３０μlと２０mg/mプロテイナーゼＫ５μlを添
加し、３７℃で１時間反応させた。さらに、５ＭのNaCl
を100μl、 CTAB/NaClを800μl加え、６５℃で10分間加熱
した。クロロホルム−イソアミルアルコール（24:1）処
理後, ０.６容のイソプロパノールを加え、遠心分離に
より染色体DNA を回収した。次いで、７０％のエタノー
ルですすいで乾燥させ、１00μlの蒸留水中に溶解した
ものを染色体ＤＮＡとした。この方法で調製した染色体
ＤＮＡを用いることにより、実施例１と同様の手順でよ
りｒＤＮＡの増幅、制限酵素切断断片を調製することが
できた。

【００３９】実施例４チーズ膨張菌同定キットを、下記の成分から構成した
（１０検体分）。菌体からＤＮＡを抽出する試薬ＴＥ緩衝液（10mM Tris-HCl、１mM EDTA、pH8.0） 40ml １０％ＳＤＳ 300μl 酵素溶液（20mg/mlプロテイナーゼＫ) 200μl ５ＭのNaCl 5ml CTAB/NaCl 100μl クロロホルム−イソアミルアルコール(24:1) 10ml イソプロパノール 10ml ７０％エタノール 5ml 16ＳｒＤＮＡを特異的に増幅するための試薬プライマー１（配列番号１） 5'-GATCCTGGCTCAG-3' 100pmole プライマー２（配列番号２） 5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3' 100pmole

【００４０】増幅16ＳｒＤＮＡを切断するための試薬制限酵素Hha I (5U/ml) 10μl 制限酵素Rsa I (5U/ml) 10μl 制限酵素Sau3A I (5U/ml) 10μl 標準サンプル Clostoridium tyrobutyricum ATCC25755のDNA(1mg/ml) 20μl Clostoridium butyricum ATCC19398のDNA(1mg/ml) 20μl Clostoridium sporogenes ATCC3584のDNA(1mg/ml) 20μl 尚、ＤＮＡは実施例１の方法により抽出した。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、ＤＮＡのＰＣＲ法を利
用することにより、チーズ膨張の原因菌であるクロスト
リジウムに属する細菌の同定を、簡便にしかも正確に行
うことができる。また、同定に要する費用も時間も少な
くてすむ。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：13 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GATCCTGGCT CAG 13 配列番号：2 配列の長さ：18 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列： GACGGGCGGT GTGTACAA 18

【図面の簡単な説明】

【図１】標準株の各切断酵素による電気泳動パターンを
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:145） (72)発明者鈴木豊札幌市東区北26条東８丁目２−１サンシャイン85 307号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】酪酸菌から染色体ＤＮＡを抽出し、次い
でｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）を特異的プライマーを用
いるＰＣＲ法により増幅させ、増幅したｒＤＮＡを特定
の制限酵素で切断し、得られたｒＤＮＡ断片の長さを電
気泳動により解析、比較することからなる酪酸菌の簡易
同定方法。
【請求項２】酪酸菌が、クロストリジウム属に属する
細菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】酪酸菌が、クロストリジウム・チロブチ
リカム(Clostoridium tyrobutyricum)、クロストリジウ
ム・ブチリカム(Clostoridium butyricum)、クロストリ
ジウム・スポロゲネス(Clostoridium sporogenes) 及び
その類縁菌種からなる群から選択される細菌であり、特
定の制限酵素が、制限酵素Hha I、RsaI及びSau3A Iであ
る請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】菌体からＤＮＡを抽出する試薬、ｒＤＮ
Ａ特異的プライマー、増幅したｒＤＮＡを切断するため
の制限酵素、クロストリジウム・チロブチリカム(Clost
oridium tyrobutyricum)、クロストリジウム・ブチリカ
ム(Clostoridium butyricum)及びクロストリジウム・ス
ポロゲネス(Clostoridium sporogenes) のｒＤＮＡの制
限酵素切断情報を含む酪酸菌の同定キット。