CN108707577B - 一种细胞或生物分子的洗脱方法及捕获方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞或生物分子的洗脱方法及捕获方法，洗脱方法包括如下步骤：用洗脱液孵育结合有目标细胞或生物分子的多孔道网状基体以使所述目标细胞或生物分子自所述的多孔道网状基体上脱离；其中，所述的洗脱液包括占洗脱液总质量0.1～10％的胰酶、浓度0.1～500mM的乙二胺四乙酸以及余量的PBS溶液；向所述的洗脱液中加入中和液，其中，所述的中和液为胎牛血清；收集所述的目标细胞或生物分子。本发明能够有效地将目标细胞或生物分子从多孔道网状基体上洗脱下来，并且避免了对目标细胞或生物分子的伤害，使得收集的目标细胞或生物分子能够用于下游检测和分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞或生物分子的洗脱方法及捕获方法。
背景技术
在血液和生物样本的检测中，常常针对检测样本中的稀有细胞、稀有分子进行检测，这些稀有目标物或分子的成功分离、富集是检测能否准确的关键。例如在人类生产和生活中，需要对人的体液、食品以及自然环境中的检测对象进行检测，如在医疗实践、食品安全、环境监测中常需要检测细胞(如循环肿瘤细胞、有核红细胞)；微生物(如医疗检测人体液中的肺炎链球菌、军团菌、真菌及特殊病原体如支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、病毒等；食品安全领域中检测的微生物如大肠菌群、致病菌(包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、致病性链球菌等)、霉菌及其毒素(如曲霉属的黄曲霉、寄生曲霉等，青霉属的橘青霉、岛青霉等，镰刀霉属的串珠镰刀霉、禾谷镰刀霉等)，在食品安全中其他微生物还包括病毒(如肝炎病毒、猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、马芷克氏病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒，猪水泡病毒等)，另外在食品安全检测中，寄生虫也被很多学者列为微生物检验的指标(如旋毛虫、囊尾蚴))。除此之外，某些蛋白质、核酸等也常常作为检测对象，如临床上常见的早期诊断标志物筛查和基因诊断等等。对不同的检测对象需要应用不同的检测方法和检测平台，由于部分检测对象的浓度很低，这对检测方法提出了很高的要求。
以有核红细胞检测为例，有核红细胞在正常成人外周血中不能见到，在出生1周之内的新生儿外周血中可见到少量有核红细胞。成人外周血中出现有核红细胞均属病理现象，有核红细胞和增生性贫血、红血病、髓外造血、其他如骨髓转移癌、严重缺氧等相关。在生产和生活中的检测项目中，需要一种高灵敏度、成本低、快速的检测方法和平台。
以循环肿瘤细胞检测为例，循环肿瘤细胞即血液循环中的肿瘤细胞，被认为和肿瘤的远端转移等问题有关系。一般癌症患者的10ml血液中仅有1-10个循环肿瘤细胞，其捕获速度慢或特异性差是快速检测病人血样所迫切需要解决的难题。对于循环肿瘤细胞的检测中，需要高灵敏度、高准确性、快速的检测方法和检测平台。
本发明针对生物样本中细胞或目标分子的富集，采用微流控富集机构技术，可对细胞、蛋白、核酸、微生物(包括病毒及细菌)等不同的多种类型的检测对象进行快速的检测，下面进行详细说明。
另与本发明相类似的发明CN 107338185A公开了一种细胞或生物分子的捕获方法，该专利采用含有胰蛋白酶的细胞分离缓冲液使细胞或生物分子脱离捕获机构，但是，该细胞分离缓冲液的洗脱效果不佳，且容易对细胞本身造成伤害，从而使得收集的细胞无法用于下游检测和分析。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是克服现有技术的不足，提供一种洗脱效果好且不会对细胞或生物分子本身造成伤害的细胞或生物分子的洗脱方法。
本发明所要解决的另一技术问题是提供一种细胞或生物分子的捕获方法。
为解决上述技术问题，本发明采取的一种技术方案如下：
本发明的一个目的在于提供一种细胞或生物分子的洗脱方法，包括如下步骤：
(1)、用洗脱液孵育结合有目标细胞或生物分子的多孔道网状基体以使所述目标细胞或生物分子自所述的多孔道网状基体上脱离；其中，所述的洗脱液包括占洗脱液总质量0.1～10％的胰酶、浓度0.1～500mM的乙二胺四乙酸(EDTA)以及余量的PBS溶液；
(2)、向所述的洗脱液中加入中和液，其中，所述的中和液为胎牛血清；
(3)、收集所述的目标细胞或生物分子。
本发明中，胰酶是指自猪胰中提取的多种酶的混合物，主要为胰蛋白酶、胰淀粉酶与胰脂肪酶，本发明中的胰酶可市购获得。
优选地，步骤(3)中，所述的多孔道网状基体在所述的洗脱液中孵育的温度为0～60℃。
优选地，步骤(3)中，所述的多孔道网状基体在所述的洗脱液中孵育的时间为1～60分钟。
优选地，步骤(3)中，所述的多孔道网状基体在所述的洗脱液中孵育结束后，震荡1～60秒。
优选地，所述的洗脱液和所述的中和液的添加体积比为1:0.1～2。
本发明中的洗脱方法采用富集筛选机构进行，富集筛选机构包括一个或多个平行设置的所述的多孔道网状基体，所述的多孔道网状基体包括由多条相互交叉设置的网线形成的网状基体、由所述的多条相互交叉设置的网线形成的多个筛孔、形成在所述的网状基体上的捕获层，所述的捕获层包括能够与目标细胞或生物分子特异性结合的捕获物。
优选地，富集筛选机构包括多个平行设置的所述的多孔道网状基体，相邻两层所述的多孔道网状基体的筛孔部分错开设置。
本发明中的相邻两层多孔道网状基体的筛孔部分错开设置是指一层多孔道网状基体的筛孔部分被另一层多孔道网状基体的网线遮挡，即从该富集筛选机构的俯视图来看，多个多孔道网状基体不完全重合。
具体地，相邻两层所述的多孔道网状基体中下层多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体旋转5～180°。
优选地，相邻两层所述的多孔道网状基体中下层多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体旋转10～90°。
进一步优选地，相邻两层所述的多孔道网状基体中下层多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体旋转30～60°。
具体地，每个所述的多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体的旋转方向一致。
本发明中的旋转方向一致是指每个多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体可以顺时针旋转或者逆时针旋转。当第N+1层多孔道网状基体相对于第N层多孔道网状基体为顺时针旋转时，则捕获装置中所有的多孔道网状基体相对于上层多孔道网状基体均为顺时针旋转；当第N+1层多孔道网状基体相对于第N层多孔道网状基体为逆时针旋转时，则捕获装置中所有的多孔道网状基体相对于上层多孔道网状基体均为逆时针旋转。本发明中的N为层数。
具体地，每个所述的多孔道网状基体相对上层多孔道网状基体的旋转角度相同。
本发明的旋转角度是指多孔道网状基体相对于上层多孔道网状基体以多孔道网状基体的中心为旋转中心，旋转平面的法线方向垂直于多孔道网状基体平面，顺时针或者逆时针旋转的角度；旋转角度相同是指第N+2层多孔道网状基体相对于第N+1层多孔道网状基体旋转的角度与第N+1层多孔道网状基体相对于第N层多孔道网状基体旋转的角度相同。
本发明中网线的粗度是指，多孔道网状基体的俯视图中网线的宽度；具体地，所述的网线的粗度为10μm～500μm；优选地，所述的网线的粗度为20μm～200μm；进一步优选地，所述的网线的粗度为20～50μm；更优选地，所述的网线的粗度为40～50μm。
本发明中网线的厚度是指，多孔道网状基体的上下两面之间的距离；具体地，所述的网线的厚度为10μm～500μm；优选地，所述的网线的厚度为20μm～200μm；进一步优选地，所述的网线的厚度为20～50μm；更优选地，所述的网线的厚度为40～50μm。
具体地，所述的筛孔的横截面面积为10～6000μm2；优选地，所述的筛孔的横截面面积为20～3000μm2；进一步优选地，所述的筛孔的横截面面积为700～3000μm2；更为优选地，所述的筛孔的横截面面积为700～2000μm2。
相邻两层多孔道网状基体的间距是指上层多孔道网状基体的下表面到下层多孔道网状基体的上表面之间的距离；具体地，相邻两层所述的多孔道网状基体的间距为0.1～10mm，优选地，相邻两层所述的多孔道网状基体的间距为0.5～1.5mm。
具体地，所述的多孔道网状基体的个数为2～30个，优选地，所述的多孔道网状基体的个数为5～10个。
具体地，所述的筛孔的横截面的形状为正方形、长方形、三角形、多边形、圆形、平行四边形、梯形中的一种或多种。
本发明中，所述的多边形为由五条及以上的边形成的封闭图形。
优选地，本发明的富集筛选机构中至少两层所述的多孔道网状基体上的捕获物不同。
进一步优选地，所述的富集筛选机构中至少三层所述的多孔道网状基体上的捕获物不同。更优选地，所述的富集筛选机构中至少四层所述的多孔道网状基体上的捕获物不同。最优选地，每层所述的多孔道网状基体上的捕获物不同。
根据一个实施方案，所述的富集筛选机构中至少两层所述的多孔道网状基体上的捕获物分别与同一种目标细胞或生物分子特异性结合，从而使得所述的富集筛选机构的特异性增加，假阴性和假阳性降低，对该种目标细胞或生物分子的捕获率进一步提高。
优选地，至少三层所述的多孔道网状基体上的捕获物分别与同一种目标细胞或生物分子特异性结合；更进一步优选地，至少四层所述的多孔道网状基体上的捕获物分别与同一种目标细胞或生物分子特异性结合；最为优选地，每层所述的多孔道网状基体上的捕获物分别与同一种目标细胞或生物分子特异性结合。
根据另一种实施方案，所述的多个多孔道网状基体的至少一个多孔道网状基体的捕获物与一种目标细胞或生物分子特异性结合，至少另一个多孔道网状基体的捕获物与另一种目标细胞或生物分子特异性结合，从而使得在筛选结束后，将各个多孔道网状基体拆下后，能够分离各个多孔道网状基体上的目标细胞或生物分子，从而实现一次性筛选多个目标细胞或生物分子，提高了筛网的工作效率和应用范围。
优选地，至少三个多孔道网状基体的捕获物分别针对三种不同的目标细胞或生物分子。进一步优选地，至少四个多孔道网状基体的捕获物分别针对四种不同的目标细胞或生物分子。更为优选地，至少五个多孔道网状基体的捕获物分别针对五种不同的目标细胞或生物分子。最优选地，所述的每个多孔道网状基体的捕获物分别与不同的目标细胞或生物分子特异性结合。
具体地，所述的捕获物为针对目标细胞或目标分子的特异性抗体或其他类型的特异性识别分子，所述的目标分子为选自以下多种类型中的一种或多种：EpCAM、EphB4、EGFR、HER2、HER-2/neu、MUC-1、叶酸受体、AFP、CEA、Cyfra21-1、TPA、TPS、NMP22、β2-MG、甲状腺球蛋白、铁蛋白、CA19-9、CA125、CA50、CA72-4、CA242、CA15-3、SCC、LDH、NSE、PSA、ER、孕激素受体、HCG、β-hCG、催乳素、ACTH、降钙素、ras基因、P53、myc-基因、DHEA-S、皮质醇、醛固酮、uPA/PAI-1、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、HGH、FSH、LH、TSH、副蛋白、胸腺嘧啶激酶、新蝶呤、SEA、蛋白S-100、M2-PK、嗜铬粒蛋白A、骨特异性碱性磷酸酶、脱氧吡啶啉、CASA、肾上腺素类物质、儿茶酚胺、高香草酸、肾上腺素类、香草扁桃酸、f-PSA、PCA3、AFP、胎盘碱性磷酸酶、降钙素、胃泌素、TSA、AFU、γGT、ALP、CA549、PAP、本-周蛋白。
具体地，所述的捕获物通过物理吸附和/或化学键结合至所述的网状基体上。
优选地，所述的捕获物通过采用traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接至所述的网状基体上。
本发明的富集筛选机构还包括具有用于进液的入口、用于出液的第一出口和位于所述的入口和所述的第一出口之间的腔体的主体，所述的多个多孔道网状基体固定在所述的腔体内，所述的入口和所述的第一出口与所述的腔体相连通。所述的主体优选采用现有的制造技术如注塑成形技术制造。主体的材料应该兼容溶剂。例如，PEEK满足上述条件。
优选地，所述的腔体被所述的多个多孔道网状基体分隔为第一腔体和第二腔体两个部分。
进一步优选地，所述的多孔道网状基体水平设置，所述的入口位于所述的富集筛选机构的上方并与所述的第一腔体相通，所述的第一出口位于所述的富集筛选机构的下方并与所述的第二腔体相通。
进一步优选地，所述的入口和所述的第一出口的中心线垂直于所述的多孔道网状基体所处的平面。
优选地，所述的主体进一步具有第二出口，所述的主体内形成有和与所述的腔体及所述的第二出口相通的用于收集被捕获的细胞或生物分子的微流体通道。
优选地，所述的富集筛选机构进一步包括设置于所述的微流体通道内的用于对被捕获的细胞或生物分子进行计数的计数机构。
进一步优选地，所述的计数机构包括阻抗测量电极。本发明的另一个目的在于提供一种细胞或生物分子的捕获方法，包括所述的洗脱步骤。
具体地，所述的捕获方法还包括如下步骤：
(1)、使含有目标细胞或生物分子的介质流经富集筛选机构的多孔道网状基体，以使所述目标细胞或生物分子结合至所述的多孔道网状基体上；
(2)、去除未特异性结合至所述的多孔道网状基体上的杂物、细胞或生物分子。
优选地，步骤(1)中所述的多孔道网状基体为经过预处理后的多孔道网状基体，所述的预处理的方法为：将所述的多孔道网状基体用牛血清白蛋白溶液孵育，所述的牛血清白蛋白溶液包括占所述的牛血清白蛋白溶液总质量0.5～10％的牛血清白蛋白以及余量的PBS溶液。本发明通过采用牛血清白蛋白溶液对多孔道网状基体进行孵育，一方面降低了白细胞的非特异性吸附，另一方面不影响多孔道网状基体对循环肿瘤细胞的特异性捕获效率。
进一步优选地，所述的多孔道网状基体在所述的牛血清白蛋白溶液中的孵育时间为1～60分钟。
进一步优选地，所述的多孔道网状基体在所述的牛血清白蛋白溶液中的孵育温度为0～60℃。
进一步优选地，所述的牛血清白蛋白溶液和所述的洗脱液的添加体积比为1:1～2.5:1。
根据一个具体且优选地实施方式，所述的捕获方法的具体实施方式包括如下步骤：
(a)、将所述的多孔道网状基体在牛血清白蛋白溶液中，在0～60℃下孵育1～60分钟；
(b)、将孵育后的多孔道网状基体固定在富集筛选机构的腔体中；
(c)、使含有目标细胞或生物分子的介质以90～110微升每分钟的速度反复多次流经所述的富集筛选机构的多孔道网状基体，以使所述目标细胞或生物分子结合至所述的多孔道网状基体上；
(d)、使PBS溶液以90～110微升每分钟的速度流经所述的富集筛选机构的多孔道网状基体，以去除未特异性结合至所述的多孔道网状基体上的杂物、细胞或生物分子；
(e)、将所述的多孔道网状基体从所述的富集筛选机构的腔体中取出，置于洗脱液中，在0～60℃下孵育1～60分钟，然后震荡1～60秒，以使所述目标细胞或生物分子自所述的多孔道网状基体上脱离；
(f)、加入中和液，取出所述的多孔道网状基体；
(g)、以250～350g的速度对液体进行离心1～15分钟，吸去上清液后，使用PBS溶液或细胞培养液对收集的目标细胞或生物分子进行重悬。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的洗脱液能够有效破坏捕获物与目标细胞或生物分子的结合作用，从而能够有效地将目标细胞或生物分子从多孔道网状基体上洗脱下来，本发明通过洗脱液和中和液的配合使用，避免了对目标细胞或生物分子的伤害，使得收集的目标细胞或生物分子能够用于下游检测和分析。
附图说明
附图1为实施例2的富集筛选机构对单核细胞非特异性吸附图；
附图2为实施例3的荧光显微镜图；
附图3为实施例4的荧光显微镜图；
附图4为本发明的富集筛选机构的结构示意图；
附图5为本发明的爆炸图；
附图6为附图5的第一局部放大图；
附图7为附图5的第二局部放大图；
附图8为本发明的带有被捕获的目标细胞或生物分子的多孔道网状基体的示意图；
附图9为本发明的筛孔部分错开设置的多孔道网状基体的示意图。
其中：11、入口；12、第一出口；20、多孔道网状基体；21、捕获物；22、筛孔；23、网线；3、目标细胞或生物分子。
具体实施方式
一种富集筛选机构，包括主体、腔体、计数机构以及多个多孔道网状基体20。主体包括入口11、第一出口12、第二出口、微流体通道。主体优选采用现有的制造技术如注塑成形技术制造。主体的材料应该兼容溶剂。例如，PEEK满足上述条件。微流体通道与腔体及第二出口相通且用于收集被捕获的目标细胞或生物分子3。
如附图1所示，入口11位于多个多孔道网状基体20的上方，第一出口12位于多个多孔道网状基体20的下方。优选地，入口11和第一出口12的中心线垂直于多孔道网状基体20所处的平面。
腔体位于入口11与第一出口12之间，多个多孔道网状基体20固定在腔体内，入口11和第一出口12和腔体相连通。优选地，腔体被多个多孔道网状基体20分隔为第一腔体和第二腔体两个部分。入口11与第一腔体相连通，第一出口12与第二腔体相连通。
计数机构设置于微流体通道内且用于对被捕获的目标细胞或生物分子3进行计数。优选地，计数机构包括阻抗测量电极。
如附图2所示，多个多孔道网状基体20平行设置。优选地，本发明中，多孔道网状基体20的个数为2～30个，优选为5～10个。
多孔道网状基体20包括由多条相互交叉设置的网线23形成的网状基体、由多条相互交叉设置的网线23形成的多个筛孔22、形成在网状基体上的捕获层。
为了能够与目标细胞或生物分子3特异性结合，捕获层包括能够与目标细胞或生物分子3特异性结合的捕获物21。具体地，捕获物21通过物理吸附和/或化学键结合至网状基体上。优选地，捕获物21通过采用traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接至网状基体上。
本实施例中的目标细胞或生物分子3即循环肿瘤细胞(CTCs)，以下简称CTCs。
为了能保证高通量的情况下同时提高捕获率，增加目标细胞或生物分子3与多孔道网状基体20的接触概率。相邻两层多孔道网状基体20的筛孔22部分错开设置。
以下重点阐述如何实现筛孔22部分错开设置。如附图2、3、6所示，以相邻多孔道网状基体20的中心为旋转中心，旋转平面的法线方向垂直于多孔道网状基体20的平面，相邻的上层多孔道网状基体20与下层的多孔道网状基体20之间有旋转角度α。相邻两层多孔道网状基体20中下层多孔道网状基体20相对上层多孔道网状基体20旋转5～180°，即α为5～180°；优选地，α为10～90°，进一步优选地，α为30～60°。
进一步的，每个多孔道网状基体20相对上层多孔道网状基体20的旋转方向一致。
进一步的，每个多孔道网状基体20相对上层多孔道网状基体20的旋转角度相同。
多个多孔道网状基体20的旋转角度参数表示为[0:m:n]，其中，0表示以第一层多孔道网状基体20为基准，第一层多孔道网状基体20的角度为0°；m为第N+1层多孔道网状基体20相对于第N层多孔道网状基体20所旋转的角度；n为最后一层多孔道网状基体20相对于第一层多孔道网状基体20所旋转的角度，多孔道网状基体20的数目为(n/m)+1。当n＝0时，多孔道网状基体20的数目为两层，第二层多孔道网状基体20相对于第一层多孔道网状基体20旋转m°。
如一种实施方式，多孔道网状基体20的旋转角度参数表示为[0:9:81]，是指多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20的旋转角度为9°，多孔道网状基体20的数目为10。根据另一种实施方式，多孔道网状基体20的旋转角度参数表示为[0:180]，是指多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转了180°，多孔道网状基体20的数目为2。
下面重点阐述网线23与筛孔22具体的规格。
筛孔22的横截面的形状为正方形、长方形、三角形、多边形、圆形、平行四边形或梯形中的一种或多种。本发明中，如附图6所示，网线23的粗度D为10～500μm，优选为20～200μm，进一步优选为20μm～50μm，更优选为40μm～50μm。
本发明中，网线23的厚度为10～500μm，优选为20～200μm，进一步优选为20μm～50μm，更优选为40μm～50μm。
筛孔22的横截面面积为10～6000μm2，优选为20～3000μm2，进一步优选为700～3000μm2，更优选为700～2000μm2。
相邻两层多孔道网状基体20的间距为0.1～10mm，优选为0.5～1.5mm。
为了能够与目标细胞或生物分子3特异性结合，捕获层包括能够与目标细胞或生物分子3特异性结合的捕获物21。具体地，捕获物21通过物理吸附和/或化学键结合至网状基体上。优选地，捕获物21通过采用traut’s试剂或带有生物素-亲和素的硫醇盐分子连接至网状基体上。如附图5所示，捕获物21能与目标细胞或生物分子3特异性结合。
本发明中捕获物21为针对目标细胞或目标分子的特异性抗体或其他类型的特异性识别分子，目标分子为选自以下多种类型中的一种或多种：：EpCAM、EphB4、EGFR、HER2、HER-2/neu、MUC-1、叶酸受体、AFP、CEA、Cyfra21-1、TPA、TPS、NMP22、β2-MG、甲状腺球蛋白、铁蛋白、CA19-9、CA125、CA50、CA72-4、CA242、CA15-3、SCC、LDH、NSE、PSA、ER、孕激素受体、HCG、β-hCG、催乳素、ACTH、降钙素、ras基因、P53、myc-基因、DHEA-S、皮质醇、醛固酮、uPA/PAI-1、5-羟色胺、5-羟吲哚乙酸、HGH、FSH、LH、TSH、副蛋白、胸腺嘧啶激酶、新蝶呤、SEA、蛋白S-100、M2-PK、嗜铬粒蛋白A、骨特异性碱性磷酸酶、脱氧吡啶啉、CASA、肾上腺素类物质、儿茶酚胺、高香草酸、肾上腺素类、香草扁桃酸、f-PSA、PCA3、AFP、胎盘碱性磷酸酶、降钙素、胃泌素、TSA、AFU、γGT、ALP、CA549、PAP、本-周蛋白。
不同的捕获物21能够特异性结合的目标细胞或生物分子3如下表所示。
为了能提高捕获效率以及增加多孔道网状基体20的特异性，本发明还可以设置富集筛选机构中两层多孔道网状基体20上的捕获物21不同，也可以三层多孔道网状基体20上的捕获物21不同。优选地，每层多孔道网状基体20上的捕获物21不同。
本发明中，富集筛选机构中至少两层多孔道网状基体20上的捕获物21分别与同一种目标细胞或生物分子3特异性结合；优选地，三层多孔道网状基体20上的捕获物21分别与同一种目标细胞或生物分子3特异性结合；更进一步优选地，四层多孔道网状基体20上的捕获物21分别与同一种目标细胞或生物分子3特异性结合；最为优选地，每层多孔道网状基体20上的捕获物21分别与同一种目标细胞或生物分子3特异性结合。
根据一种实施方式，多孔道网状基体20为5个，且每个多孔道网状基体20上的捕获物21均不同，五层的捕获物21分别为特异性结合EphB4、EGFR、HER2、CEA以及铁蛋白(ferritin)的抗体，这五种捕获物21均与同一种目标细胞即乳腺癌肿瘤细胞特异性结合。
本发明中，为了实现能够一次性筛选不同种的目标细胞或生物分子3，多个多孔道网状基体20的至少一个多孔道网状基体20的捕获物21与一种目标细胞或生物分子3特异性结合，至少另一个多孔道网状基体20的捕获物21与另一种目标细胞或生物分子3特异性结合。优选地，每个多孔道网状基体20的捕获物21分别与不同的目标细胞或生物分子3特异性结合。
根据另一种实施方式，多孔道网状基体20为10个，且每个多孔道网状基体20上的捕获物21均不同，10层的捕获物21特异性结合的目标分子3分别列举如下：HER-2/neu(血清、组织)-乳腺癌；叶酸受体(FR)-肺癌；NMP22(尿)-膀胱癌；催乳素(PRL)-垂体瘤；DHEA-S-肾上腺皮质；5-羟色胺(5-HT)-类癌；蛋白S-100-黑色素瘤；M2-PK-肾癌；嗜铬粒蛋白A(chromograninA,CGA)-神经内分泌瘤；PAP-前列腺癌。10种不同的捕获物21分别特异性结合10种不同的目标分子或者结合到不同的目标细胞表面上(当目标细胞的外表面上表达有目标分子)。
实施例1
(1)取4.6微升Traut’s reagent溶液(0.2毫克/毫升)，5微升anti-EPCAM抗体(Cat#ab32392,Abcam)，40.4微升PBS-EDTA(2.5毫摩尔，pH8.0)进行混合，在室温下孵育一小时。
(2)取面积为8厘米×8厘米的Au包被的多孔道网状基体20，将步骤1中的溶液滴加至多孔道网状基体20上，室温孵育一小时。
(3)向多孔道网状基体20加入1毫升PBS溶液润洗后，吸去残余溶液。
(4)重复步骤3。
(5)向多孔道网状基体20加入1毫升2％BSA溶液(牛血清白蛋白BSA占BSA溶液总质量2％，余量为PBS溶液)，室温孵育30分钟。
(6)将多孔道网状基体20固定于富集筛选机构的腔体中。
对比例1
(1)取4.6微升Traut’s reagent溶液(0.2毫克/毫升)，5微升anti-EPCAM抗体(Cat#ab32392,Abcam)，40.4微升PBS-EDTA(2.5毫摩尔，pH8.0)进行混合，在室温下孵育一小时。
(2)取面积为8厘米×8厘米的Au包被的多孔道网状基体20，将步骤1中的溶液滴加至多孔道网状基体20上，室温孵育一小时。
(3)向多孔道网状基体20加入1毫升PBS溶液润洗后，吸去残余溶液。
(4)重复步骤3。
(5)将多孔道网状基体20固定于富集筛选机构的腔体中。
实施例2
(1)分离6×106个单核细胞，PBS洗净后，用CFSE染色15分钟。使用等体积全培养基中和，再用PBS将细胞润洗两次后等分为两组，每组3×106个单核细胞，加PBS至总体积为0.5毫升。
(2)将两组含有3×106个单核细胞的细胞悬液分别上样于实施例1和对比例1的富集筛选机构，以100微升/分钟速度反复过筛三次，最后以0.5毫升PBS冲洗。
实验结果见图1，其中(a)为放大40倍的对比例1的富集筛选机构对单核细胞非特异性吸附图，(b)为放大100倍的对比例1的富集筛选机构对单核细胞非特异性吸附图，(c)为放大40倍的实施例1的富集筛选机构对单核细胞非特异性吸附图，(d)为放大100倍的实施例1的富集筛选机构对单核细胞非特异性吸附图。从图1可见，实施例1的富集筛选机构非特异性吸附的单核细胞数量明显少于对比例1。
对多孔道网状基体20上的单核细胞进行计数，发现对比例1的富集筛选机构对于单核细胞非特异性吸附总数为1680个，实施例1的富集筛选机构对于单核细胞非特异性吸附总数为620个。
实施例3
首先收集2×106个MCF7，PBS洗净后用CFSE染色15分钟。使用等体积全培养基中和，再用PBS润洗细胞两次。取50个染色后的MCF7细胞混入3×106个单核细胞，加PBS至总体积为0.5毫升作为一个实验组。之后将两组上述细胞悬液分别上样于实施例1和对比例1的富集筛选机构，以100微升/分钟速度反复过筛五次，最后以0.5毫升PBS冲洗。
实验结果见图2和表1，图2中(a)为在荧光显微镜下对对比例1的多孔道网状基体20进行观察，图中荧光亮点为捕获到的MCF7细胞，视野中可见2个细胞；图2中(b)为在荧光显微镜下对实施例1的多孔道网状基体20进行观察，图中荧光亮点为捕获到的MCF7细胞，视野中可见1个细胞。
表1
表中，对比例1-1至1-3表示对比例1的多孔道网状基体20进行三次实验，实施例1-1至1-2表示实施例1的多孔道网状基体20进行两次实验。
经过比较可发现，BSA处理不影响CTC特异性捕获效率。
实施例4
将实施例3中的两个多孔道网状基体20分别从富集筛选机构的腔体中取出，然后分别置于0.5毫升洗脱液(胰酶占洗脱液总质量0.25％、1mM EDTA以及余量的PBS溶液)中，在37℃下孵育2分钟，然后震荡10秒，以使所述目标细胞或生物分子3自所述的多孔道网状基体20上脱离；然后加入0.5毫升中和液胎牛血清，取出多孔道网状基体20。
实验结果见图3，其中(a)和(b)为未经洗脱液处理前的荧光显微镜下对多孔道网状基体20进行观察的图，图中荧光亮点为捕获到的MCF7细胞，视野下分别可见29个和27个；(c)和(d)为经洗脱液和中和液处理后的荧光显微镜下对多孔道网状基体20进行观察的图，视野下没有观察到细胞。
实施例5：
多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:36:324]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为36°，多孔道网状基体20总共有10个。
相邻多孔道网状基体20的间距为1mm，网线23的厚度为22μm、粗度为22μm，筛孔22的横截面呈正方形，筛孔22的横截面积为54×54μm2。
每个多孔道网状基体20上的捕获物均为EpCAM抗体，捕获物连接在多孔道网状基体20上的方法包括如下步骤：
(1)取4.6微升Traut’s reagent溶液(0.2毫克/毫升)，5微升EPCAM抗体(Cat#ab32392,Abcam)，40.4微升PBS-EDTA(2.5毫摩尔，pH8.0)并将三者混合，在室温下孵育一小时。
(2)将步骤1中孵育后的溶液滴加至多孔道网状基体20上，在室温下孵育一小时。
(3)向多孔道网状基体20加入1毫升PBS溶液润洗后，吸去残余溶液。
(4)重复步骤3。
(5)向多孔道网状基体20加入1毫升2％BSA溶液(占BSA溶液总质量2％的BSA以及占BSA溶液总质量98％的PBS溶液)，然后在室温下孵育30分钟。
(6)将多孔道网状基体20安装固定在主体的腔体内。
捕获循环肿瘤细胞的方法包括如下步骤：
⑴将0.5mL含10个肺癌细胞的细胞悬浮液注入富集筛选机构中；
⑵使0.5mL的细胞悬浮液流经富集筛选机构的入口11，速度为7.8×10-5m/s，细胞悬浮液依次流过10层多孔道网状基体20，以使肺癌细胞结合在富集筛选机构上；
⑶加入0.5毫升PBS溶液，以100微升每分钟的速度清洗多孔道网状基体20，去除未结合的杂物、细胞或分子；
⑷拆下多孔道网状基体20，将拆下的多孔道网状基体20置于0.5mL洗脱液(胰酶占洗脱液总质量0.25％、1mM EDTA以及余量的PBS溶液)中，在37℃下孵育2分钟，然后震荡10秒钟，以使肺癌细胞从富集筛选机构上分离；
⑸加入0.5mL中和液(胎牛血清)，取出多孔道网状基体20，以300g速度离心5分钟，吸去上清液后，使用PBS或细胞培养液把细胞沉淀重悬后并进行计数，截留的肺癌细胞数为8个。
实施例6：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:9:81]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为9°。
该实施例截留的肺癌细胞数为5个。
实施例7：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:180]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为180°。
该实施例截留的肺癌细胞数为2个。
实施例8：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:60:240]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为60°。
该实施例截留的肺癌细胞数为4个。
实施例9：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:60:240]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为60°。网线23的厚度为44μm、粗度为44μm。
该实施例截留的肺癌细胞数为7个。
实施例10：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:60:240]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为60°。筛孔22的横截面积为27×27μm2。
该实施例截留的肺癌细胞数为6个。
实施例11：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:60:240]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为60°。网线23的厚度为44μm、粗度为44μm，筛孔22的横截面积为27×27μm2。
该实施例截留的肺癌细胞数为10个。
实施例12：
与实施例5基本相同，不同之处在于：多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:36:324]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为36°。网线23的厚度为44μm、粗度为44μm，筛孔22的横截面积为27×27μm2。
该实施例截留的肺癌细胞数为10个。
实施例13
与实施例12基本相同，不同之处在于：横截面呈正方形的筛孔22的外接圆半径为27μm。
该实施例截留的肺癌细胞数为10个。
实施例14
与实施例12基本相同，不同之处在于：筛孔22的横截面呈三角形，且外接圆半径为27μm。
该实施例截留的肺癌细胞数为10个。
实施例15
与实施例12基本相同，不同之处在于：筛孔22的横截面呈六边形，且外接圆半径为27μm。
该实施例截留的肺癌细胞数为10个。
对比例2：
多孔道网状基体20总共10个，10个多孔道网状基体20平行设置且各层之间的旋转角度为0°，网线23的厚度为44μm、粗度为44μm，筛孔22的横截面积为27×27μm2。每个多孔道网状基体20上的捕获物均为EpCAM抗体。
按照实施例5的方法捕获循环肿瘤细胞，该对比例截留的肺癌细胞数为4个。
实施例16：
多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:36:324]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为36°，多孔道网状基体20总共有10个。
相邻多孔道网状基体20的间距为1mm，网线23的厚度为44μm、粗度为44μm，筛孔22的横截面呈正方形，筛孔22的横截面积为27×27μm2。
第一个多孔道网状基体20上连接的捕获物为EpCAM抗体，第二个多孔道网状基体20上连接的捕获物为EphB4抗体，第三个多孔道网状基体20上连接的捕获物为EGFR抗体，第四个多孔道网状基体20上连接的捕获物为HER2抗体，第五个多孔道网状基体20上连接的捕获物为MUC-1抗体，第六个多孔道网状基体20上的捕获物为CEA抗体，第七个多孔道网状基体20上的捕获物为铁蛋白抗体，第八个多孔道网状基体20上的捕获物为CA15-3抗体，第九个多孔道网状基体20上的捕获物为ER抗体，第十个多孔道网状基体20上的捕获物为孕激素受体抗体。捕获物连接至多孔道网状基体20上的方法与实施例1基本相同，不同之处在于，捕获物替换成对应的捕获物即可。
捕获循环肿瘤细胞的方法包括如下步骤：
⑴将0.5mL含10个乳腺癌细胞的细胞悬浮液注入富集筛选机构中；
⑵使0.5mL的细胞悬浮液流经富集筛选机构的入口11，速度为7.8×10-5m/s，细胞悬浮液依次流过10层多孔道网状基体20，以使乳腺癌细胞结合在富集筛选机构上；
⑶加入0.5毫升PBS溶液，以100微升每分钟的速度清洗多孔道网状基体20，去除未结合的杂物、细胞或分子；
⑷拆下多孔道网状基体20，将拆下的多孔道网状基体20置于0.5mL洗脱液(胰酶占洗脱液总质量0.25％、1mM EDTA以及余量的PBS溶液)中，在37℃下孵育2分钟，然后震荡10秒钟，以使乳腺癌细胞从富集筛选机构上分离；
⑸加入0.5mL中和液(胎牛血清)，取出多孔道网状基体20，以300g速度离心5分钟，吸去上清液后，使用PBS或细胞培养液重悬后并且进行计数，截留的乳腺癌细胞数为10个。
实施例17：
多个多孔道网状基体20的角度旋转参数为[0:36:324]，即下层多孔道网状基体20相对于上层多孔道网状基体20旋转的角度为36°，多孔道网状基体20总共有10个。
相邻多孔道网状基体20的间距为1mm，网线23的厚度为44μm、粗度为44μm，筛孔22的横截面呈正方形，筛孔22的横截面积为27×27μm2。
第一个多孔道网状基体20上连接的捕获物为EphB4抗体，第二个多孔道网状基体20上连接的捕获物为叶酸受体抗体，第三个多孔道网状基体20上连接的捕获物为AFP抗体，第四个多孔道网状基体20上连接的捕获物为NMP22抗体，第五个多孔道网状基体20上连接的捕获物为β2-MG抗体，第六个多孔道网状基体20上的捕获物为甲状腺球蛋白抗体，第七个多孔道网状基体20上的捕获物为PSA抗体，第八个多孔道网状基体20上的捕获物为催乳素抗体，第九个多孔道网状基体20上的捕获物为蛋白S-100抗体，第十个多孔道网状基体20上的捕获物为本-周蛋白抗体。捕获物连接至多孔道网状基体20上的方法与实施例1基本相同，不同之处在于，捕获物替换成对应的捕获物即可。
捕获循环肿瘤细胞的方法包括如下步骤：
⑴将5mL分别含10乳腺癌细胞、10个肺癌细胞、10个肝癌细胞、10个膀胱癌细胞、10个淋巴/粒细胞白血病细胞、10个甲状腺癌细胞、10个前列腺癌细胞、10个垂体瘤细胞、10个黑色素瘤细胞、10个骨髓瘤细胞的细胞悬浮液注入富集筛选机构中；
⑵使细胞悬浮液流经富集筛选机构的入口11，速度为7.8×10-5m/s，细胞悬浮液依次流过10层多孔道网状基体20，使目标细胞结合在富集筛选机构上；
⑶加入0.5毫升PBS溶液，以100微升每分钟的速度清洗多孔道网状基体20，去除未结合的杂物、细胞或分子；
⑷将10个多孔道网状基体20拆开，每个多孔道网状基体20分别置于0.5mL洗脱液(胰酶占洗脱液总质量0.25％、1mM EDTA以及余量的PBS溶液)中，在37℃下孵育2分钟，然后震荡10秒钟，以使目标细胞从富集筛选机构上分离；然后加入0.5mL中和液(胎牛血清)，取出多孔道网状基体20，以300g速度离心5分钟，吸去上清液后，使用PBS细胞培养液重悬细胞沉淀；
⑸收集每个多孔道网状基体20上的目标细胞并且进行计数，截留的乳腺癌细胞数为3个，截留的肺癌细胞数为4个，截留的肝癌细胞数为7个，截留的膀胱癌细胞数为6个，截留的淋巴/粒细胞白血病细胞数为4个，截留的甲状腺癌细胞数为6个，截留的前列腺癌细胞数为6个，截留的垂体瘤细胞数为4个，截留的黑色素瘤细胞数为5个，截留的骨髓瘤细胞数为7个。
如上所述，我们完全按照本发明的宗旨进行了说明，但本发明并非局限于上述实施例和实施方法。相关技术领域的从业者可在本发明的技术思想许可的范围内进行不同的变化及实施。
Claims (15)
1.一种细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的捕获方法采用富集筛选机构进行，所述的富集筛选机构包括多个平行设置的多孔道网状基体（20），所述的多孔道网状基体（20）包括由多条相互交叉设置的网线（23）形成的网状基体、由所述的多条相互交叉设置的网线（23）形成的多个筛孔（22）、形成在所述的网状基体上的捕获层，所述的捕获层包括能够与目标细胞或生物分子（3）特异性结合的捕获物（21），相邻两层所述的多孔道网状基体（20）的筛孔（22）部分错开设置；
相邻两层所述的多孔道网状基体（20）中下层多孔道网状基体（20）相对上层多孔道网状基体（20）旋转30~60°；
所述的网线（23）的粗度为20μm~50μm，所述的网线（23）的厚度为20μm~50μm，所述的筛孔（22）的横截面面积为700~3000μm2，相邻两层所述的多孔道网状基体（20）的间距为0.5~1.5mm；
所述捕获方法包括洗脱步骤以及在所述的洗脱步骤之前的如下步骤：
（a）、使含有目标细胞或生物分子（3）的介质流经所述富集筛选机构的多孔道网状基体（20），以使所述目标细胞或生物分子（3）结合至所述的多孔道网状基体（20）上；
（b）、去除未特异性结合至所述的多孔道网状基体（20）上的杂物、细胞或生物分子；所述洗脱步骤包括如下步骤：
（1）、用洗脱液孵育结合有目标细胞或生物分子（3）的多孔道网状基体（20）以使所述目标细胞或生物分子（3）自所述的多孔道网状基体（20）上脱离；其中，所述的洗脱液包括占洗脱液总质量0.1~10%的胰酶、浓度0.1~500mM的乙二胺四乙酸以及余量的PBS溶液；
（2）、向所述的洗脱液中加入中和液，其中，所述的中和液为胎牛血清；
（3）、收集所述的目标细胞或生物分子；
其中，步骤（a）中所述的多孔道网状基体（20）为经过预处理后的多孔道网状基体（20），所述的预处理的方法为：将所述的多孔道网状基体（20）用牛血清白蛋白溶液孵育，所述的牛血清白蛋白溶液包括占所述的牛血清白蛋白溶液总质量0.5~10%的牛血清白蛋白以及余量的PBS溶液。
2.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的多孔道网状基体（20）在所述的洗脱液中孵育的温度为0~60℃，孵育的时间为1~60分钟。
3.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：步骤（1）中，所述的多孔道网状基体（20）在所述的洗脱液中孵育结束后，震荡1~60秒。
4.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的洗脱液和所述的中和液的添加体积比为1:0.1~2。
5.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：每个所述的多孔道网状基体（20）相对上层多孔道网状基体（20）的旋转方向一致。
6.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：每个所述的多孔道网状基体（20）相对上层多孔道网状基体（20）的旋转角度相同。
7.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的多孔道网状基体（20）的个数为2~30个。
8.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的筛孔（22）的横截面的形状为三角形、多边形、圆形中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的多边形为平行四边形、梯形、五条及以上的边形成的封闭图形中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：至少两层所述的多孔道网状基体（20）上的捕获物（21）不同。
11.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：至少两层所述的多孔道网状基体（20）上的捕获物（21）分别与同一种目标细胞或生物分子（3）特异性结合。
12.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的多个多孔道网状基体（20）的至少一个多孔道网状基体（20）的捕获物（21）与一种目标细胞或生物分子（3）特异性结合，至少另一个多孔道网状基体（20）的捕获物（21）与另一种目标细胞或生物分子（3）特异性结合。
13.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的多孔道网状基体（20）在所述的牛血清白蛋白溶液中的孵育时间为1~60分钟，孵育温度为0~60℃。
14.根据权利要求1所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的牛血清白蛋白溶液和所述的洗脱液的添加体积比为1:1~2.5:1。
15.根据权利要求1、13至14中任一项所述的细胞或生物分子的捕获方法，其特征在于：所述的捕获方法的具体实施方式包括如下步骤：
（a）、将所述的多孔道网状基体（20）在牛血清白蛋白溶液中，在0~60℃下孵育1~60分钟；
（b）、将孵育后的多孔道网状基体（20）固定在富集筛选机构的腔体中；
（c）、使含有目标细胞或生物分子（3）的介质以90~110微升每分钟的速度反复多次流经所述的富集筛选机构的多孔道网状基体（20），以使所述目标细胞或生物分子（3）结合至所述的多孔道网状基体（20）上；
（d）、使PBS溶液以90~110微升每分钟的速度流经所述的富集筛选机构的多孔道网状基体（20），以去除未特异性结合至所述的多孔道网状基体（20）上的杂物、细胞或生物分子；
（e）、将所述的多孔道网状基体（20）从所述的富集筛选机构的腔体中取出，置于洗脱液中，在0~60℃下孵育1~60分钟，然后震荡1~60秒，以使所述目标细胞或生物分子（3）自所述的多孔道网状基体（20）上脱离；
（f）、加入中和液，取出所述的多孔道网状基体（20）；
（g）、以250~350g的速度对液体进行离心1~15分钟，吸去上清液后，使用PBS溶液或细胞培养液对收集的目标细胞或生物分子进行重悬。
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