JP5551907B2 - 顕微鏡を用いて試料を撮像するための方法、顕微鏡、およびデータ記憶キャリア - Google Patents

Description

本発明は、走査顕微鏡、特に請求項１のプリアンブルによる走査顕微鏡を用いて試料を撮像するための方法に関する。このような方法では、照射ビーム経路を介して励起光によって試料を照射し、検出ビーム経路を介して試料から放出された光を記録し、調整可能な閾値波長を有する少なくとも１つの調整可能なビーム・スプリッタ、特に勾配フィルタを検出ビーム経路内または／および照射ビーム経路内に配置し、試料から放出された光を少なくとも１つの検出チャンネル内で検出する。

さらなる態様においては、本発明は、走査顕微鏡と、走査顕微鏡の制御ユニットを駆動するためのプログラムが記憶されたデータ記憶キャリアとに関する。

欧州特許出願公開第１８８２９６９Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００８／００２４７８２Ａ１号明細書では、透過と反射の間の閾値波長に関して空間的に可変である少なくとも１つの勾配フィルタを有するレーザ走査顕微鏡が開示されている。勾配フィルタは、検出波長を選択するために検出ビーム経路内に設けられる。このフィルタ・タイプによって、サンプリング条件が変化したときに顕微鏡のスペクトル設定を容易に変えることができるため、汎用性の高い顕微鏡が得られる。

独国特許出願公開第１０２００４０２９７３３Ａ１号明細書では、検出ビーム経路内にバンド・パス・フィルタを有する走査顕微鏡が開示されている。バンド・パス・フィルタには、ロー・パス・フィルタとハイ・パス・フィルタとの組み合わせが含まれている。ロー・パス・フィルタおよびハイ・パス・フィルタは、スペクトル勾配フィルタとすることができる。

米国特許出願公開第２００８／００６２５１１Ａ１号明細書では、狭角メイン・ビーム・スプリッタを伴うレーザ走査顕微鏡が開示されている。

本発明の目的は、固有かつ有意義な分光学データを、特に光損失が低い状態で、正確に、柔軟に、および容易に収集することができる新しい形態のスペクトル取得を提供することである。

本願の目的は、請求項１に記載した試料を撮像するための方法によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項において、それとともに以下の説明において、特に添付図に関連して与えられる。

本発明の方法は、少なくとも１つの所定の試料領域に対して、少なくとも１つの検出チャンネル内で検出した光の信号強度を、調整可能なビーム・スプリッタにおいて設定した複数の閾値波長に対して記録して、所定の試料領域の信号／閾値依存関係を得ることを特徴とする。

本発明の基本的な考え方は、可変の閾値波長（すなわちカットオフ波長）を有する少なくとも１つの可変のビーム・スプリッタを、光学走査顕微鏡の走査ビーム経路内に配置するということ、少なくとも１つの撮像箇所に対して、ビーム・スプリッタの閾値波長を変えて、前記箇所に対して、検出信号強度対閾値波長の依存関係、すなわち信号強度／閾値波長依存関係、または手短に言えば信号／閾値依存関係が取得されるようにするということにある。「微分ラムダ・スタック」（ＤＬＳ）という名前で呼ぶこともできる信号強度／閾値波長依存関係の取得は、励起のスペクトルを変えることによって、および／またはスペクトルの検出部分を変えて検出チャンネル内の信号の変化をモニタすることによって行なう。こうして、本発明によれば、変化する形態のスペクトル分割を、励起側および／または検出側で用いる。

本発明の形態のスペクトル取得によって、スペクトル情報を１つまたは複数のチャンネル内に、単純で、信頼性が高く、費用対効果が高い仕方で収集することを、もしあったとしても感度損失がほとんどない方法で行なうことができる。２チャンネル以上のシステムにおいてビーム・スプリッタによって個々のチャンネルを分割する場合、スペクトルを分割するときに光の損失が無いことおよび完全に効率的なシステムを有することが可能である。たとえば、２チャンネル・システム上での発光ＤＬＳの場合、閾値波長をスペクトル全体に動かすと、一方のチャンネルにおける信号減少は、他方のチャンネルにおける対応する増加によって匹敵されるはずである。このようにして、チャンネル内で付加的なフィルタを用いない限り、光は常に２つのチャンネルの一方まで進み、決して損失されない。

本発明の方法を行なうためには、走査顕微鏡、特に共焦点走査顕微鏡を用いることが一般的に好ましい。共焦点顕微鏡は、たとえば単一光子レーザ走査顕微鏡とすることもできるし、多光子レーザ走査顕微鏡とすることもできる。レーザ走査顕微鏡が一般的には好ましいが、本発明の方法は、全視野が同時に撮像されて走査が必要ではない広視野顕微鏡を用いる優位な方法で行なうこともできる。この場合、広視野顕微鏡に伴う大きいビーム直径を考慮するために、大きいビーム・スプリッタを用いることが好ましい場合がある。

本発明によれば、閾値波長の変更を、放出光（すなわち検出ビーム経路）に適用することもできるし、励起光（すなわち照射ビーム経路）に適用することもできる。後者は、白色光源を用いた場合に特に有用であり得る。閾値波長の変更は、放出光および励起光の両方に適用することもでき、その結果、「ラムダ２乗スタック」となる。

本発明の顕微鏡は、光学顕微鏡、特に走査顕微鏡であり、好ましくは共焦点走査顕微鏡である。試料を好ましくは、照射ビーム経路を介してレーザ光によって照射する。測定した検出器信号を好ましくは、検出チャンネル内に存在する光強度に関連付ける。本発明の検出チャンネルは、検出ビーム経路に配置される。

調整可能なビーム・スプリッタは、特に２色性要素とすることができ、またロング・パス・フィルタとすることもできるし、ショート・パス・フィルタとすることもできる。閾値波長は、透過が始まる波長、特に透過と反射の間の波長であると考えることができる。好ましくは、調整可能なビーム・スプリッタは、透過用の閾値波長がフィルタ上の位置に依存して変化する色勾配フィルタであり、そのため、たとえば透過用の閾値が、フィルタ表面のある場所では５００ｎｍで、フィルタ表面の別の場所では６００ｎｍである。

好ましくは、顕微鏡は、調整可能なビーム・スプリッタを設定するための制御装置を備える。したがって閾値波長の変更を自動化することが、特にソフトウェアによって可能である。勾配フィルタが設けられている場合、制御装置に、閾値波長を設定するための空間内で勾配フィルタを動かすためのアクチュエータを設けることができる。しかしながら、原理的には、調整可能なフィルタの設定は、スペクトル分割の視覚的印象を得るために非自動的に（すなわち、ユーザ頼みで）行なうこともでき、すなわち、走査する間に滑動部を移動させることによって行なうことができる。

本発明の別の態様によれば、試料上または試料内の少なくとも１種の蛍光色素を励起光によって励起し、放出光を蛍光色素によって放出する。すなわち信号／閾値依存関係を得るために、調整可能なビーム・スプリッタを、蛍光色素の放出光が生じる波長領域内の複数の閾値波長に設定する。閾値波長を蛍光色素の発光構造付近に設定することによって、発光構造のスペクトル形状についての情報を収集することができる。典型的な場合には、２種以上の蛍光色素が試料上または試料内に存在する。この場合、閾値波長を蛍光色素のスペクトルの発光構造付近に選択することによって、異なる蛍光色素の発光構造のスペクトルの重なりについての情報、すなわち滲み出しについての情報を取得することができる。

本説明によれば、用語「蛍光色素」は広い意味で理解しなければならない。蛍光色素は、蛍光色素分子、蛍光染料、蛍光タンパク質、非生物学的な蛍光標識（たとえば量子ドット）、または光に暴露されたときに既知でかなり予測可能な蛍光応答をもたらす任意の物質とすることができる。蛍光ではないが、他の予測可能なスペクトル応答、たとえば反射、高調波、たとえば第２高調波発生法および第３高調波発生法、２光子効果、および吸収を、本開示のすべての目的に対して、蛍光色素と同じであると扱わなければならない。

１つの検出チャンネルのみを有する解決方法が、コストに関して好ましい可能性があるが、本発明の別の好ましい実施形態は、調整可能なビーム・スプリッタによって、検出ビーム経路を２つの検出チャンネルに分割し、信号／閾値依存関係を２つの検出チャンネルのそれぞれに対して記録することを特徴とする。この実施形態は、感度に対して特に優位である。２チャンネル・システムでは、光の損失を防止することができる。なぜならば、一方のチャンネルからフィルタリング除去されたスペクトルが反射されて他方のチャンネルに行き、逆もまた同様だからである。その結果、一方のチャンネルにおける信号減少は一般的に、他方のチャンネルにおける対応する増加によって匹敵されるはずである。優先的に、両方のチャンネルの信号／閾値依存関係は共通に評価する。１つのチャンネルにおけるビーム・スプリッタの透過光と別のチャンネルにおけるビーム・スプリッタの反射光との両方を収集すれば、付加的なデータ処理技術がさらに可能になる。これについては、以下でさらに説明する。

さらに高性能な分光学技術に対しては、検出ビーム経路内に複数のビーム・スプリッタを有することができ、その結果、２つの検出チャンネルをさらにサブ・チャネルに分割して、３つ以上の検出チャンネルにする。

用途によっては、信号／閾値依存関係を単一の試料領域のみに対して記録するだけで十分な場合がある。しかし、本発明の好ましい実施形態によれば、信号／閾値依存関係を複数の所定の試料領域において記録する。したがって個々の依存関係を、別個に評価することもできるし、さらなる処理を行なう前に平均化することもできる。依存関係の記録を複数の所定の試料領域において行なうことによって、空間分解された信号／閾値依存関係を得ることができる。優先的に、信号／閾値依存関係の記録を、すべての走査画素に対して、すなわち走査中に連続して撮像されたすべての試料領域に対して行なう。

信号／閾値依存関係を複数の所定の試料領域において記録すべきである場合、測定する試料領域を第１の箇所に固定したままですべての所望の閾値波長を経ること、その後に、測定する試料領域を第２の箇所にシフトすること、そしてこの第２の箇所に対して再びすべての所望の閾値波長を経ること、そして第３の箇所にシフトすることなどが可能である。あるいは、閾値波長を第１の値に固定したままで、対象とするすべての試料領域に対してこの設定を用いて信号強度を取得すること、そして閾値波長を第２の閾値に設定して、この第２の値を用いて対象とするすべての試料領域に対して信号強度を収集することなどが可能である。試料の走査が、調整可能なビーム・スプリッタの設定と比べて速く行なえる場合には、後者の動作モードが通常、好ましい。

こうして、本発明の好ましい実施形態によれば、調整可能なビーム・スプリッタにおいて設定する閾値波長を、画素、ライン、フレーム、またはｚスタックを走査したら変更する。スプリッタの設定が走査速度と比べて遅い場合には、フレームを走査したらビーム・スプリッタにおける波長を変えることが好ましい。

２種の蛍光色素が、重なる発光スペクトルを伴って存在する場合には、２種の蛍光色素の輝線が示す強度が同程度となるスペクトル点が存在する。したがってこのスペクトル点は、両方の蛍光色素に対するスペクトル発光を取得する一方で以後の走査画像の非混合に対して必要となる手間を減らすように、調整可能なビーム・スプリッタのようなスペクトル分割手段を設定するための最良点となるであろう。２種の蛍光色素の発光スペクトル間の重なりが小さい場合には、走査中にスペクトル分割手段をこの波長に設定するならば、非混合はなくても済むようになる場合さえある。スペクトルにおけるこの最良点は、取得した信号／閾値依存関係から決定することができる。したがって本発明の別の好ましい実施形態によれば、信号／閾値依存関係から、少なくとも１つの設定波長を決定する。設定波長は、重なる発光スペクトルを伴う蛍光色素を分解または区別するために、スペクトル分割手段（特に調整可能なビーム・スプリッタ）の最良の設定を表わす。

設定波長を、信号／閾値依存関係の傾きを分析することによって決定することが特に好ましい。信号／閾値依存関係から、閾値波長の増加とともに各チャンネルの信号が上昇または降下する場合があるグラフを形成することができる。グラフの形状は、試料中の異なる蛍光色素の数についての情報と、それらがどれほど重なっているかについての情報を与える。たとえば、降下するグラフの場合には、各蛍光色素は、より急な勾配を伴う領域（くぼみ）として見ることができる。対照的に、蛍光色素間の最大分離を伴う各点、すなわちスペクトル分割の設定に対して最適な各点は、それほど急ではない曲線として、すなわち勾配の絶対値における極小（隆起）として見られる。こうして、曲線内の「隆起」が起こる波長に対して信号／閾値依存関係を分析すること、およびこれらの点を設定波長に割り当てることができる。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、２つのチャンネル内の画素の強度をその２つの軸として用いる閾値波長依存性の散布プロットが、信号／閾値依存関係から生成される。散布プロット（蛍光像と言うこともできる）は、一対の画像（各画像は、異なるチャンネルにおいて取られる）における画素の強度分布を視覚化する統計図表である。散布プロットでは、２つのチャンネルのそれぞれにおける（すなわち、２つの画像のそれぞれにおける）画素の強度を、その２つの軸として用いる。各画素は、プロット内に、両方のチャンネルにおけるその強度に従って配置される。チャンネル間に滲み出しがない場合には、２種の蛍光色素によって、散布プロットの軸上にまたはその非常に近くに、２本の線が与えられる。しかし検出チャンネルの２つの間に滲み出しがある場合には、一方のチャンネルにおける与えられた強度に対して、蛍光色素は、他方のチャンネルにおいても検出可能な存在を有する。これは、散布プロットにおいて、プロット軸からのずれとして目に見える。したがって、散布プロットは従来、蛍光画像における染料の組み合わせ間のスペクトルの滲み出しを分析する方法として用いられている。特に、散布プロットは、共局在化分析に対して用いられ、グラフ軸からの純粋な蛍光色素成分のずれをチェックするために用いられる。従来、これは、オフラインで、固定した光学的構成に対して行なわれる。

しかし本発明によれば、信号／閾値依存関係を取得するときには、閾値波長依存性の散布プロットも生成することができる。これらの閾値波長依存性の散布プロットは、ビーム・スプリッタを調整するときに、ライブで生成してモニタすることができる。本発明の波長依存性の散布プロットを用いて、第１および第２の蛍光色素にそれぞれ対応する最外部の画素（すなわち軸に最も近い画素）に割り当てられた線の間の領域が最大になる（滲み出しが最小であるという意味を含む）波長を探すことができる。これが起こる波長を、前述した設定波長に割り当てることができる。

したがって、本発明の別の好ましい実施形態は、設定波長を波長依存性の散布プロットを分析することによって決定することを特徴とする。
その代わりにまたはそれに加えて、２種の蛍光色素間の領域、特にこれらの蛍光色素に関係づけられる最外部の画素によって与えられる線の間の領域をプロットすることができる。なぜならば、これは２種の蛍光色素間の分離の程度に関連するからである。またこれによって、ユーザが、線間の角度を広げることが信号の低下を補うかどうかを評価することが、付加的な蛍光フィルタを用いて２つのチャンネル間の滲み出しをさらに減らすときに、可能となるであろう。

従来の散布プロットは通常、ｘ軸およびｙ軸を、信号のグレー・レベルに関して較正する。本発明のシステムが良好に較正された場合、これらの軸を、画素当たりの実光子に関してプロットすることもできるであろう。

設定波長を決定した後に、調整可能なビーム・スプリッタを設定波長に設定し、その後に、ビーム・スプリッタを設定波長に固定設定した状態で、試料または別の試料を撮像することがさらに好ましい。この実施形態によれば、重なる蛍光色素を撮像するためのビーム・スプリッタの最良の設定を、信号／閾値依存関係データに基づいて第１のステップにおいて決定し、以下のステップにおいて、この設定を、同じまたは別の試料を撮像するために用いる。この撮像方法によって、特に速い撮像が実現される。特に、典型的な試料の信号／閾値依存関係を取得して設定波長を得ること、およびこの波長を同様の試料に対して、別の信号／閾値依存関係を取得することを必要とせずに用いることができる。

前記実施形態では、特に戻り信号の信号対雑音比が良好であるならば、限られたサブ組の画像を取得しただけの後に、必要に応じて画像に対してチャンネルを混合しないことが、撮像に対しては十分であり得るということを利用している。２種の蛍光色素を伴って２つのチャンネル検出システムがある単純な場合には、混合しない後に高品質画像を得るのに十分な情報を取得するために、ビーム・スプリッタの最適な位置（すなわち前述した設定波長）が存在する。したがって、全部の試料箇所において信号／閾値依存関係を取得する代わりに、固定した波長を選択してビーム・スプリッタにおいて光を分割し、そして単に各チャンネルにおいて単一の画像を取得し、そして得られたデータに対してチャンネルを混合しないことが好ましい場合がある。ビーム・スプリッタの設定波長を決定するために、典型的な試料の信号／閾値依存関係を取得することができる。したがって顕微鏡によって、閾値波長に依存して、対になった混合しない画像を自動的に生成することができる。したがってユーザは、次の試料の信号／閾値依存関係を取得することを必要とせずに、どの波長が最良の結果を与えるかを見ることができる。この方法は、試料が移動しているかまたは光退色を起こす傾向がある場合に特に好適である。なぜならば、この方法によって、速い撮像が、多数の画像を取得することを必要とせずに可能であり、その結果、全照射時間が短くなるからである。

また本発明によれば、信号／閾値依存関係から、試料から放出された放出光の少なくとも１つのスペクトル対放出光の波長の計算を、特に信号／閾値依存関係を微分することによって行なうことが好ましい。この実施形態によれば、得られた信号／閾値依存関係を変換して「従来の発光スペクトル」にし、このスペクトルによって信号強度対波長または周波数を示す。放出光の「従来の」スペクトルは、信号／閾値依存関係から段階的に計算することができる。

信号／閾値依存関係が複数の試料領域において、特にすべての画素に対して取られている場合、「従来の」スペクトルを得るための逆算を、空間的に分離されたすべての依存関係に適用することができる。したがって、逆算技術を実際の画像に適用することによって、「従来の」機器に対して収集されたスペクトル系列の外観を有する逆算されたスペクトル系列を形成することができる。

未処理の信号／閾値依存関係から決定した未処理のスペクトルを、スペクトル非混合ステップに対する入力データとして用いることができる。このような非混合ステップには、発光構造間の滲み出しのレベルを数学的な処理ステップで決定して、スペクトルの滲み出しを正しい発光構造に再割り当てすることが含まれる。

こうして、逆算したスペクトルを、逆算したスペクトル系列画像から得られる混合されていない純粋な蛍光色素に対する基準スペクトルとして用いることができる。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、少なくとも１つの付加的なフィルタが検出ビーム経路内および／または照射ビーム経路内に、特に、調べるべき閾値波長領域における検出チャンネル内に配置された検出器の性能を高めるために存在する。高めるべき性能は好ましくは、検出器のダイナミック・レンジである。このようなフィルタを用いることで、対象としないスペクトル領域における放出光に起因する検出器の過負荷を、不要なスペクトル寄与の抑制を通して防止することができる。追加のフィルタは、ロング・パス・フィルタとすることもできるし、ショート・パス・フィルタとすることもできるし、バンド・パス・フィルタとすることもできる。フィルタを、たとえば、検出器のすぐ前に配置して、検出されるスペクトル・レンジを制限することができる。信号／閾値依存関係を取得する間にフィルタを含めることまたは除くことおよび／または変えることによって、依存関係のダイナミック・レンジを広げることができる。その結果、より多くの蛍光色素を検出することおよび／または信号レベルが著しく異なる蛍光色素を検出することが可能になる場合がある。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、２つの検出チャンネルのそれぞれに少なくとも１つの検出器を設け、検出器のレンジ（特に検出器のダイナミック・レンジ）を設定するために、調整可能なビーム・スプリッタの閾値波長を第１の検出器における強度が最大になるような第１の極限波長に設定した後で、第１の検出器のレンジを設定する。なるべくなら、その後に、調整可能なビーム・スプリッタの閾値波長を第２の検出器における強度が最大になるような第２の極限波長に設定した後で、第２の検出器のレンジを設定する。この実施形態によって、２つの検出器のレンジの特に容易で、速くて、信頼性の高い設定が可能になる。特に、全体のスペクトル系列に対するダイナミック・レンジの設定が２回の走査のみで可能である。実施形態では、２つのチャンネル設定においてすべての光が２つのチャンネル間で分割されるということを利用している。実施形態によれば、ビーム・スプリッタを最初に一方の極限まで動かして、すべての光の進路を第１のチャンネルに変えるようにする。次に第１のチャンネルを較正して、ダイナミック・レンジが満たされているが飽和していないことを確実にする。後に、ビーム・スプリッタを他方の極限まで動かして、すべての光が他方の検出器に入るようにする。

次に他方の検出器を較正して、他方の検出器のダイナミック・レンジも満たされているが飽和していないことを確実にする。
状況によっては、第２の較正ステップを省くことが、すなわち第２の検出器のレンジを設定するためにビーム・スプリッタの閾値波長を第２の極限波長に設定することを省くことが、可能でさえある。これは、検出器応答（たとえばゲイン応答）が２つの検出器間で良好に較正されているために、一方の検出器の較正を他方の検出器に適用することができる場合には、特に可能である。この場合、検出器較正を１回の走査で行なうことさえ可能であるため、レンジを設定するために必要な事前のシリーズの数がさらに減る。これは、試料が光退色を起こす傾向にある場合に特に有用である。

本発明のデータ取得の性質に起因して、調整可能なビーム・スプリッタの閾値波長をデータ取得中に徐々に大きくするかまたは徐々に小さくしたときに、信号は、一方の検出器において上昇し、存在するならば他方の検出器において減少する。検出器応答（すなわちゲイン応答、照射時間など）が分かっている場合には、各スペクトル・ステップに対する検出器の感度を増加または減少させて、シリーズを実行したときにダイナミック・レンジを適合させることができる。したがって、本発明の別の好ましい実施形態によれば、特に検出器応答の情報に基づいて、検出ビーム経路の少なくとも１つの検出器の検出器感度を、調整可能なビーム・スプリッタの閾値波長を変えたときに変更する。

また本発明によれば、調整可能なビーム・スプリッタにおいて設定する閾値波長をステップ刻みで変更して、ステップのサイズを現在の閾値波長に依存して変えることが好ましい。特に、ステップのサイズを小さくすることが、少なくとも１種の蛍光色素の放出光が生じる波長領域および／または信号／閾値依存関係における信号勾配が急である波長領域において可能である。その代わりにまたはそれに加えて、ステップ・サイズは、２つのチャンネル間の比率シフトが小さいときには大きくすることができ、２つのチャンネル間の比率シフトがより大きいときには小さくすることができる。このようにして、より高い信号対雑音比を得ることができ、密接して重なるスペクトルを区別することができる。

したがって、ステップのサイズを、信号／閾値依存関係の曲線形状についての情報に基づいて変えることが特に好ましい。好ましくは、ステップのサイズを、波長間隔当たりのステップの密度が信号／閾値依存関係の傾きの絶対値とともに大きくなるように選択する。

別の好ましい実施形態においては、ステップのサイズを決定するために用いる信号／閾値依存関係を、励起光の強度を低くした測定によって取得する。この実施形態によれば、ステップ・サイズを決定するために用いるデータ取得（通常、実際の撮像を行なう前に実行される）は、実際の撮像と比べて低い強度を用いて行なわれる。これは、光退色の危険性がある場合には特に優位である。

蛍光顕微鏡では、試料から放出される光の信号強度に対する関心が高い。信号強度を測定するための有用な計量は、検出した画素当たりの光子（ＰＰＰ）の数である。しかし画素当たりの光子を決定する場合には、ショット・ノイズによって測定の確度が制限されるという問題がある。ショット・ノイズはカウントの平方根に比例している。したがって、画素数当たりの光子がたとえば１００である場合には、誤差は√１００＝１０である。これは、ショット・ノイズの結果として、９０と１１０と間の任意の値を得る場合があることを意味する。

正確なＰＰＰ値を計算するために理想的に必要なのは、同じ画素について複数の測定を行なって平均値を決定することである。この態様は、本発明の別の好ましい実施形態において利用することができる。なぜならば、本発明の信号／閾値測定には、試料が複数回走査されること、および同じ画素が複数回記録されることが含まれるからである。したがって、これらの依存関係の評価を用いて、ショット・ノイズを減らすことができる。

しかし、信号強度を決定するために信号／波長依存関係を用いる場合には、ビーム・スプリッタによって全信号強度（すなわち対象とする値）がチャンネル間で分割されるということを考慮する必要がある。したがって、全信号強度を表わす目安を得るために、個々のチャンネルの信号を一緒に加算することが好ましい。したがって、本発明の好ましい実施形態の方法として、少なくとも１つの調整可能なビーム・スプリッタによって、検出ビーム経路を複数の検出チャンネルに分割し、信号／閾値依存関係を検出チャンネルのそれぞれに対して記録し、すべてのチャンネルの信号／波長依存関係から、共通の閾値波長において存在する信号値を抽出し、共通の閾値波長において存在する信号値を加算して、共通の閾値波長における合計信号値を与え、合計信号値を信号強度の目安として用いる方法が与えられる。たとえば、２チャンネル・システムにおいては、すべての光が常に２つのチャネルの一方に方向付けられるため、種々の異なる共通の閾値波長において信号が一緒に加算される場合には、ショット・ノイズ効果は別として、一定の信号レベルが得られるはずである。

また、合計信号値を複数の共通の閾値波長に対して決定し、合計信号値を平均化して、相対的なショット・ノイズが低減された信号強度の目安を得ることが好ましい。好ましくは、合計信号値を信号／波長依存関係全体に渡って平均化する。これは、記録したすべての閾値に対する合計信号値を平均化することを意味する。この平均化処理に起因して、利用可能な測定数が増えるため、相対的なショット・ノイズが減る。

下の表１に、合計信号値をＤＬＳ（信号／波長依存性）全体で平均化する効果を示す。表１には、画素測定当たりの光子が、（理論上の）信号／波長依存関係シリーズ全体で向上する様子を示す。この例では、画素当たり１００光子の強度の単一の蛍光色素が検出され、信号／波長依存関係が１１ステップで記録されている（すなわち、ビーム・スプリッタの１１個の波長）。閾値波長を変えると、２つのチャンネル（ＰＭＴ１およびＰＭＴ２）間の信号の分布が変わり、一方のチャンネルにおいて信号が減少する間に、他方のチャンネルにおいて増加する。この例では、単一走査であれば１０％の誤差が付随するであろう。平均値を依存関係全体に渡って測定するならば、誤差を単に３％まで減らすことができる。これを表の最後の列に示す。

本発明の別の好ましい実施形態においては、メイン・ビーム・スプリッタを、照射ビーム経路と検出ビーム経路とを空間分離するために設ける。優位なことに、メイン・ビーム・スプリッタの光学濃度は高い。光学濃度が十分に高いメイン・ビーム・スプリッタを用いることによって、戻り反射光をさらに防ぐことを行なわなくても済むようになる場合がある。狭角メイン・ビーム・スプリッタを用いることが特に好ましい。光学濃度が高いメイン・ビーム・スプリッタを用いることは、スペクトル系列の設計に対する潜在的な制約を取り除くことに役立つ可能性がある。特に、過剰の光学濃度を加えるための付加的な構成要素を必要としない場合がある。構成要素があると、取得される放出に対する不要なスペクトル効果が導入される場合がある。この場合もやはり、励起波長および発光収集波長を、比較的自由に規定することができる。高光学濃度のメイン・ビーム・スプリッタを用いるということは、検出のダイナミック・レンジが反射によって危うくされることはないということも意味する。

また本発明には、本発明の方法を自動的に実行するように構成された走査顕微鏡も含まれる。この目的を実現するために、走査顕微鏡には好ましくは、制御装置（すなわちコントローラ）が設けられている。制御装置は、ビーム・スプリッタの調整可能な閾値を設定するための設定装置に作動接続されている。調整可能なビーム・スプリッタが、空間的に可変の閾値波長を伴う勾配フィルタである場合には、設定装置は、たとえば、調整可能なビーム・スプリッタを空間内で動かすためのアクチュエータとすることができる。制御装置を、励起光を発生する光源および／または顕微鏡の走査機と作動接続することもできる。制御装置を、検出チャンネル内に設けられた検出器と信号接続することもできる。好ましくは、制御装置は本発明の方法を自動的に行なうように構成されている。

また本発明は、データ記憶キャリアおよびコンピュータ・プログラム製品に関する。それぞれ、プログラムを走査顕微鏡のコントローラまたは制御ユニット上で実行したときに本発明の方法を行なうためのプログラム・コードを含んでいる。

本発明の優位性は、以下のようにまとめることができる。
１．蛍光色素の特徴付けに関して、
ａ．十分に高いレーザ抑制を、スペクトル・システムから離れたところで、特にメイン・ビーム・スプリッタにおいて行なうことによって、スペクトル・システムはその位置決めにおいて自由かつ柔軟である。
ｂ．カバーされるスペクトル・ステップ・サイズおよびレンジを、本発明のアプローチにおいて非常に柔軟なものにすることができる。
ｃ．再現性は、構成要素（特に、調整可能なビーム・スプリッタおよび／またはそのアクチュエータ）の機械的な確度のみによって制限され、したがって非常に高くすることができる。

２．スペクトル取得に関して、
ａ．スペクトル取得の新しい第３の形態、ＤＬＳ取得（信号強度対閾値波長依存関係の取得）によって、蛍光をすべて取得することができるため、システムの高感度を実現することが可能となる。これは、通常マルチ・アレイ検出器を用いることに付随するコストおよび性能の問題点を伴うことなく実現することができる。
ｂ．ＤＬＳデータ（信号強度対閾値波長）を、新しくて強力な方法で分析して、重なる蛍光色素を非混合するための最良の設定を決定することができる。これには、信号／閾値依存関係の傾きおよび形状とともに複数のチャンネル間の散布プロットを分析することが含まれる。
ｃ．システムのダイナミック・レンジの設定が、代替的な順次的な技術と比べてはるかに簡単である。
ｄ．画素当たりの光子という点での信号強度を、ＤＬＳを分析することによって非常に正確に決定することができる。

３．スペクトルの滲み出しが無い「純粋な」画像の作成に関して最終画像（未処理または非混合のどちらも）の確度は、入力画像の品質によって決定される。本明細書で提案するアプローチは、柔軟性が大きいため、スペクトル分割を最適に分離する設定が可能であり、それを光効率に関して犠牲を伴うことなく行なうことができる。この結果、最終的な画像の品質は現在の代替案よりも高くなる。

本発明を、添付図面に示す好ましい実施形態を参照して、以下でさらに説明する。

本発明の方法を実施するのに好適なレーザ走査顕微鏡の第１の実施形態を示す図であり、顕微鏡に可変の閾値ビーム・スプリッタと単一の検出チャンネルとが検出ビーム経路内に設けられている。 本発明の方法を実施するのに好適なレーザ走査顕微鏡の第２の実施形態を示す図であり、顕微鏡に可変の閾値ビーム・スプリッタと２つの検出チャンネルとが検出ビーム経路内に設けられている。 本発明の方法を実施するのに好適なレーザ走査顕微鏡の第３の実施形態を示す図であり、顕微鏡に２つの可変の閾値ビーム・スプリッタと３つの検出チャンネルとが検出ビーム経路内に設けられている。 本発明の方法を実施するのに好適なレーザ走査顕微鏡の第４の実施形態を示す図であり、顕微鏡に２つの可変の閾値ビーム・スプリッタと３つの検出チャンネルとが検出ビーム経路内に設けられており、顕微鏡にはさらに照射ビーム経路内の可変の閾値ビーム・スプリッタが設けられている。 ２種の試料蛍光色素（ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ）の発光スペクトルの比較を示す図である。 ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ蛍光色素を含む試料に対する２チャンネル・システムにおける信号／閾値依存関係の例を示す図である。 図６の第２のチャンネルの信号／閾値依存関係を示す図であり、スペクトル情報を依存関係の形状からどのように収集することができるかを説明するためのものである。 図７の信号／閾値依存関係から導き出される「従来の」信号対波長スペクトルを示す図である。

図１〜４に、本発明の方法を実行するのに好適なレージング走査機顕微鏡の実施形態を記載する。すべての実施形態に共通する要素について、図１のみに関連して詳細に説明する。しかしそれらは、すべての実施形態において存在する。

図１の実施形態には光源３０があり、これには２つのレーザ（すなわち５５５ｎｍレーザ３１および４８８ｎｍレーザ３１’）が含まれている。両方のレーザ３１および３１’とも、ＡＯＴＦ３２を介して照射ビーム経路３に結合されている。顕微鏡はさらに、メイン・ビーム・スプリッタ３５を備えている。これは、４８８／５６１ノッチのメイン・ビーム・スプリッタによって構成されている。メイン・ビーム・スプリッタによって、照射ビーム経路３は顕微鏡の光軸１０内に方向付けられ、最終的に、図示していない試料上に至っている。

メイン・ビーム・スプリッタ３５と顕微鏡コネクタ１１（顕微鏡光学系、試料ステージなどを接続するのに役立つ）との間に、顕微鏡の走査機１７と走査対物レンズ１８とが配置されている。

検出ビーム経路４は、試料において始まり、走査対物レンズ１８、走査機１７、およびメイン・ビーム・スプリッタ３５を通って、ピンホール光学系１９に至っている。ピンホール光学系１９によって、共焦点顕微鏡法の実行が可能になっている。

検出ビーム経路４には、メイン・ビーム・スプリッタ３５の試料から遠い側に、調整可能なビーム・スプリッタ１４が設けられている。ビーム・スプリッタ１４には、反射と透過との間で調整可能な閾値波長が備わっている。ビーム・スプリッタ１４は、ロー・パス・フィルタとすることもできるし、ハイ・パス・フィルタとすることもできる。ビーム・スプリッタ１４は、色勾配フィルタによって形成されている。色勾配フィルタは、その表面に渡って種々の閾値波長を有している。そのため、検出ビーム経路４内の閾値波長を、検出ビーム経路４内のビーム・スプリッタ１４の空間位置を変えることによって設定することができる。

ビーム・スプリッタ１４を通過した光は、検出チャンネル２０に入って、検出器２１に達する。図１の実施形態においては、１つの検出チャンネル２０のみ（すなわち、１つの検出器２１のみ）があり、ビーム・スプリッタ１４によって反射された光は失われる。調整可能なビーム・スプリッタ１４と検出器２１との間には、フィルタ・ホイールとして設計された任意的な付加的なフィルタ２３が設けられている。

図２に、本発明の方法と関連して用いるのに好適な顕微鏡の別の実施形態を示す。図１では、１つの検出チャンネルを伴うシステムを示していたが、これとは対照的に、図２では、２つの検出チャンネルを伴うシステムを示す。図２の実施形態の場合には、調整可能なビーム・スプリッタ１４によって反射された光は、第１の検出チャンネル２０に導かれ、第１の検出器２１に至る。調整可能なビーム・スプリッタ１４を通過した光は、第２の検出器２１’を伴う第２の検出チャンネル２０’に導かれる。両方の検出チャンネル２０、２０’において、任意的な付加的なフィルタ２３、２３’が設けられている。フィルタ２３、２３’は、フィルタ・ホイールとして設計されていても良い。

また、図２の実施形態の光源３０は、図１の実施形態と比べて多くのレーザを有している。図２の実施形態によれば、３つのレーザ（６３５ｎｍレーザ３１、５５５ｎｍレーザ３１’および４８８ｎｍレーザ３１”）が設けられている。これらは、ＡＯＴＦ３２を介して照射ビーム経路３に結合されている。また第３の４０５ｎｍレーザ３３が設けられている。レーザ３３は、照射ビーム経路３内のＡＯＴＦ３２とメイン・ビーム・スプリッタ３５との間に結合されている。後者は、４０５／４８８／５５５／６３５ノッチのビーム・スプリッタとして設計されている。

図１および２では、発光波長を決定するために単一の調整可能なビーム・スプリッタ１４を用いる１チャンネル・システムと２チャンネル・システムとを示しているが、図３に示す実施形態では、発光波長を決定するために２つの調整可能なビーム・スプリッタを用いる３チャンネル・システムを示す。

図３の実施形態の場合には、検出ビーム経路４内に２つのビーム・スプリッタ１４および１４’が連続して設けられている。第１のビーム・スプリッタ１４から反射された光は、第１の検出チャンネル２０内に進んで、第１の検出器２１に当たる。第１のビーム・スプリッタ１４を通過した放出光は、第２の調整可能なビーム・スプリッタ１４’に当たる。この第２のビーム・スプリッタ１４’によって反射された光は、第２の検出チャンネル２０’内に進んで、第２の検出器２１’に当たる。両方のビーム・スプリッタ１４および１４’を通った光は、第３の検出チャンネル２０”内に進んで、第３の検出器２１”に当たる。すべての検出チャンネル２０、２０’、２０”において、付加的なフィルタ２３、２３’、２３”を任意的に設けることができる。図３の実施形態の光源３０は、可変のコリメーション３９を有する付加的なＴａｉＳａｐレーザ３４がある以外は、図２の実施形態の光源と同じである。ＴａｉＳａｐレーザ３４は、照射ビーム経路３内のＡＯＴＦ３２とメイン・ビーム・スプリッタ３５との間に結合されている。図３の実施形態の場合、メイン・ビーム・スプリッタ３５は４０５／４８８／５５５／６３５ノッチであり、７００ショート・パスビーム・スプリッタである。

図４に、励起および発光の両方がスペクトル的に調整可能である顕微鏡の実施形態を示す。図４の実施形態は、光源３０および照射ビーム経路３以外は、図３の実施形態と同じである。図４の実施形態によれば、光源３０は、広波長光源３７（たとえばＨＢＯまたは白色光レーザ）を有する。広波長光源３７は、ＡＯＴＦ３２を介して照射ビーム経路３内に結合されている。励起波長の選択用に、２つの調整可能なビーム・スプリッタ１３、１３’が、照射ビーム経路内のＡＯＴＦ３２とメイン・ビーム・スプリッタ３５との間に設けられている。これらのビーム・スプリッタ１３、１３’は、ロング・パス・フィルタまたはショート・パス・フィルタとして構成することができる。好ましくは、ビーム・スプリッタ１３、１３’の一方はロング・パス・フィルタであり、他方はショート・パス・フィルタである。

図５に、２種の蛍光色素例（すなわちＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣ）の発光スペクトルの比較を示す。ＦＩＴＣの発光ピークは約５２０ｎｍである一方で、ＴＲＩＴＣの発光ピークは約５７０ｎｍである。

図６に、２チャンネル・システム（たとえば図２に示したもの）において取得された信号／閾値依存関係とチャンネル当たりの蓄積された合計との例を示す。この例では、調整可能なビーム・スプリッタの閾値波長を１０ｎｍステップで変えて、２チャンネル１０ｎｍの区別的発光系列を与えている。ラインＦＩＴＣＰ１は、第１のチャンネルに対するＦＩＴＣ発光の相対的な寄与を示す。ラインＴＲＩＴＣＰ１は、第１のチャンネルに対するＴＲＩＴＣ発光の相対的な寄与を示す。同様の仕方で、ラインＦＩＴＣＰ２およびＴＲＩＴＣＰ２は、第２のチャンネルに対するＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣの相対的な寄与をそれぞれ示している。

チャンネル１において、両方の寄与ＦＩＴＣＰ１およびＴＲＩＴＣＰ１を合計して、ＰＭＴ１と標示される第１のチャンネルの信号／閾値依存関係を与えている。同様に、第２のチャンネルにおいて寄与ＦＩＴＣＰ２およびＴＲＩＴＣＰ２を合計して、第２のチャンネルの信号／閾値依存関係ＰＭＴ２を与えている。

図７に、図６の第２のチャンネルの信号／閾値依存関係（ＰＭＴ２）、すなわちＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣの発光系列に対する蓄積された総量を、より詳細に示す。図７において、最外部の矢印５２、５４は、グラフの最も急な低下を示している。これらは、ＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣの発光ピークにそれぞれ対応している。中央部の矢印５０は、依存関係の勾配の絶対値が局所最小を有する領域、すなわち曲線が隆起を有する領域を示している。この中央部の矢印５０の位置は、２種の蛍光色素に対するスペクトル発光の取得を、画像の以後の非混合に対して必要な手間が最小の状態で行なうようにスペクトル分割手段を設定するための最良点を表わす。２種の蛍光色素の発光スペクトル間に重なりがない場合には、グラフのこの部分はまったく平坦であろう。

図７に示す信号／閾値依存関係から、「従来の」発光スペクトルに逆算して、発光波長上での発光信号を示すことが可能である。図８に、図７の依存関係のこのような「逆算」（すなわち微分スペクトル系列）に由来するスペクトルまたはスペクトル曲線を示す。図８に示す曲線は、測定した画素中の蛍光色素成分の合計に相当する。これは、図７に示すデータから、あるステップから次のステップへの信号の変化を計算することによって計算される。

図８に示すスペクトル例は、等しい強度のＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣを含む画素に対するものである。第２のピークの方が高く、その理由は、第２のピークはＴＲＩＴＣに対するピーク発光波長にＦＩＴＣの滲み出しを足したものである一方で、第１のピークはほとんど完全にちょうどＦＩＴＣだからであることに注意されたい。単一の蛍光色素のみを含む画素の場合、逆算したスペクトル系列は、「従来の」スペクトル・システムで取得したスペクトル曲線と正確に同じ形状のはずである。

３：照射ビーム経路、 ４：検出ビーム経路、 １３，１４：ビーム・スプリッタ、 ２０：検出チャンネル、 ２１：検出器

Claims (20)

1. 顕微鏡を用いて試料を撮像するための方法であって、
   照射ビーム経路（３）を介して励起光で前記試料を照射すること、
   検出ビーム経路（４）を介して前記試料から放出された光を記録すること
   を備え、調整可能な閾値波長を有する少なくとも１つの調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）を、前記検出ビーム経路（４）内および前記照射ビーム経路（３）内の少なくとも１方に配置し、
   前記試料から放出された光を、少なくとも１つの検出チャンネル（２０）内で検出する方法であって、
   前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）は、ロー・パス・フィルタまたはハイ・パス・フィルタであり、
   少なくとも１つの所定の試料領域に対して、前記少なくとも１つの検出チャンネル（２０）内で検出した光の信号強度を、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）において設定した複数の閾値波長に対して記録して、所定の試料領域の信号／閾値依存関係を得、
   前記信号／閾値依存関係から、少なくとも１つの設定波長を決定し、前記設定波長は、重なる発光スペクトルを用いて蛍光色素を分解するための前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）の最良の設定を表わすことを特徴とする方法。
2. 前記試料上または試料内の少なくとも１種の蛍光色素を前記励起光によって励起し、
   放出光を前記蛍光色素によって放出すること、
   前記信号／閾値依存関係を得るために、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）を、前記蛍光色素の放出光が生じる波長領域内の複数の閾値波長に設定すること
   を特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）によって、前記検出ビーム経路（４）を２つの検出チャンネル（２０）に分割し、
   信号／閾値依存関係を前記２つの検出チャンネル（２０）のそれぞれに対して記録すること
   を特徴とする、前記請求項の１つに記載の方法。
4. 信号／閾値依存関係を、複数の所定の試料領域に対して記録すること
   を特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）において設定した前記閾値波長を、画素、ライン、フレーム、またはｚスタックを走査する度に変更すること
   を特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記設定波長を、前記信号／閾値依存関係の傾きを分析することによって決定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 前記２つのチャンネル（２０）における画素の強度を２つの軸とする閾値波長依存性の散布プロットを、信号／閾値依存関係から生成すること、
   前記設定波長を前記波長依存性の散布プロットを分析することによって決定すること
   を特徴とする、請求項３に記載の方法。
8. 前記設定波長を決定した後に、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）を前記設定波長に設定すること、
   その後に、前記ビーム・スプリッタ（１４、１３）を前記設定波長に固定設定した状態で、前記試料または別の試料を撮像する
   ことを特徴とする、請求項１、６及び７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記信号／閾値依存関係に基づき、前記試料から放出された放出光の少なくとも１つのスペクトル対前記放出光の波長を、前記信号／閾値依存関係を微分することによって計算すること
   を特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 調べるべき閾値波長領域における前記検出チャンネル（２０）内に配置された検出器（２１）の性能を高めるために、少なくとも１つの付加的なフィルタ（２３）が検出ビーム経路（４）内に存在すること
    を特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記２つの検出チャンネル（２０）のそれぞれに少なくとも１つの検出器（２１）を設け、
    前記検出器（２１）のレンジを設定するために、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）の前記閾値波長を第１の極限波長に設定して第１の検出器（２１）における強度が最大になるようにした後で、前記第１の検出器（２１）のレンジを設定し、
    その後に、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）の前記閾値波長を第２の極限波長に設定して第２の検出器（２１’）における強度が最大になるようにした後で、前記第２の検出器（２１’）のレンジを設定すること
    を特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 検出器応答の情報に基づいて、前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）の前記閾値波長を変更することに伴い、前記検出ビーム経路（４）の少なくとも１つの検出器（２１）の検出器感度を変更すること
    を特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）において設定される前記閾値波長をステップ刻みで変更すること、
    前記ステップのサイズを現在の閾値波長に依存して変更すること
    を特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ステップのサイズを、信号／閾値依存関係の曲線形状についての情報に基づいて変更すること、
    前記ステップのサイズを、ステップ密度／波長間隔が前記信号／閾値依存関係の傾きの絶対値とともに増加するように選択すること
    を特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ステップのサイズを決定するために用いる前記信号／閾値依存関係を、励起光の強度を低くした測定によって取得すること
    を特徴とする、請求項１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つの調整可能なビーム・スプリッタ（１４、１３）によって、前記検出ビーム経路（４）を複数の検出チャンネル（２０）に分割すること、
    信号／閾値依存関係を前記検出チャンネル（２０）のそれぞれに対して記録すること、
    すべてのチャンネル（２０）の前記信号／波長依存関係に基づいて、共通の閾値波長おける信号値を抽出すること、
    前記共通の閾値波長における前記信号値を加算して、前記共通の閾値波長における合計信号値を与えること、
    前記合計信号値を信号強度の基準として用いること
    を特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 合計信号値を複数の共通の閾値波長に対して決定し、
    前記合計信号値を平均化して、相対的なショット・ノイズを低減した信号強度の基準を取得すること
    を特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法を自動的に実行するように構成された顕微鏡。
19. 走査顕微鏡、共焦点レーザ走査顕微鏡、または広視野顕微鏡である、請求項１８に記載の顕微鏡。
20. 走査顕微鏡の制御ユニットを駆動するためのプログラムが記憶されたデータ記憶キャリアであって、
    前記プログラムによって、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法による顕微鏡の動作が可能になるデータ記憶キャリア。

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