DE10116610B4

DE10116610B4 - Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie

Info

Publication number: DE10116610B4
Application number: DE2001116610
Authority: DE
Inventors: Leif Brand
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2001-04-03
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2021-04-04
Also published as: DE10116610A1

Abstract

Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, mit den Schritten:
– Bestrahlen der Probe mit elektromagnetischer Strahlung, wobei die Strahlung mit Hilfe einer Optikeinrichtung in der Probe fokussiert wird, so dass ein begrenztes Bestrahlungsvolumen erzeugt wird,
– Anregen von durch das Bestrahlungsvolumen diffundierenden, in der Probe enthaltenen Farbstoffmarkern zur Lumineszenz durch die elektromagnetische Strahlung und
– Messen der abgegebenen Lumineszenz mit Hilfe einer Detektionseinrichtung, wobei zur verbesserten Erfassung von Teilchen mit unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten das Bestrahlungsvolumen während des Messvorgangs mit einer Relativgeschwindigkeit relativ zu der Probe bewegt wird,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Relativgeschwindigkeit zwischen dem Bestrahlungsvolumen und der Probe mindestens 50% der Diffusionsgeschwindigkeit der kleinsten mit einem Farbstoffmarker verbundenen zu messenden Teilchen ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektros kopie gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, wie aus WO 99/34195 A1 bekannt.

Mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie wird beispielsweise das Bindungsverhalten von zwei Stoffen in einer Lösung untersucht. Hierzu ist zumindest einer der beiden Stoffe mit einem Farstoffmaker markiert. Zur Untersuchung des Bindungsverhaltens oder anderer Effekte wird die Probe mit elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise mit Laserlicht bestrahlt. Hierdurch wird der Farstoffmaker zur Lumineszenz angeregt. Aus der gemessenen Lumineszenz, die sich beispielsweise hinsichtlich der Intensität dahingehend unterscheidet, ob der Stoff in Bindung oder alleine vorliegt, lassen sich Rückschlüsse auf das Bindungsverhalten von Substanzen und dgl. ziehen.

Die Lumineszenz-Spektroskopie ist ein weit verbreitetes Verfahren zur Untersuchung chemischer und/oder biologischer Proben. Hierbei werden jeweils eine oder mehrere Farstoffmaker verwendet, die Probe mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt und die Lumineszenz, vorzugsweise Fluoreszenz, der Probe beobachtet. Gemessen wird hierbei beispielsweise die Gesamt-Fluoreszenz-Intensität, die totale Translations- und Rotations-Diffusionszeit, die Gesamt-Polarisation, die mittlere Fluoreszenz-Lebensdauer, die mittlere FRET-Effizienz, die Gesamt-Koinzidenz etc.

Die eingangs genannte WO 99/34195 A1 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Reaktionen sowie Konformationsänderungen von Analyten in einer Probe mittels Koinzidenzanalyse, wobei die Probe mit mindestens zwei unterschiedlichen Farbstoffmarkern markiert wird und zur Anregung von Fluoreszenzemission von mindestens einem Laser bestrahlt wird, die Fluoreszenzsignale mittels mindestens zweier Detektionseinheiten detektiert werden, und die Signale in beliebige, simultane Zeitabschnitte mit frei wählbaren Zeitkanalbreiten zerlegt werden. Die für die Koinzidenzanalyse nötige Fluoreszenzfluktuation kann durch eine kontrollierte Bewegung der Probenmoleküle relativ zum konfokalen Beobachtungsvolumen bewirkt werden. Technisch wird dies entweder durch eine Bewegung der Probe oder durch Bewegung des Messfokus in der stationären Probe oder durch Kombination von beidem erreicht. Durch die kontrollierte Bewegung wird die gezielte Einstellung der für die Fluoreszenzdetektion optimalen Aufenthaltsdauer eines Moleküls im Fokus möglich.

Ein Nachteil der Lumineszenz-Spektroskopie besteht darin, dass die Messergebnisse aufgrund von Photozerstörung verfälscht werden können. Photozerstörung tritt dann auf, wenn ein Farstoffmaker durch die elektromagnetische Strahlung zu stark angeregt wird, so dass eine Zerstörung des Farstoffmakers erfolgt oder dessen Lumineszenzeigenschaften beeinträchtigt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie zur Verfügung zu stellen, das die unterschiedlich starke Photozerstörung verringert.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Merkmale des Patentanspruchs 1.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass das Maß der Photozerstörung davon abhängig ist, wie lange sich ein Teilchen innerhalb eines Beleuchtungsvolumens in einer Probe befindet, d. h. wie lange ein mit einem lumineszierenden Farbstoffmarker verbundener Partikel von elektromagnetischer Strahlung bestrahlt wird. Ebenso können Probenpartikel selbst lumineszierend sein, so dass die Probenpartikel selbst als, Farbstoffmarker fungieren. Versuche haben gezeigt, dass insbesondere bei Proben, die Substanzen mit hohen Molekulargewichten enthalten, eine erhöhte Photozerstörung auftritt. Dies liegt darin begründet, dass Partikel mit höheren Molekulargewichten gegenüber Partikeln mit geringeren Molekulargewichten höhere Diffusionszeiten aufweisen. Partikel mit höheren Molekulargewichten verweilen somit länger innerhalb des Bestrahlungsvolumens und sind daher über einen größeren Zeitraum der elektromagnetischen Strahlung ausgesetzt. Die durch Photozerstörung auftretende Intensitätsreduktion der Lumineszenz tritt sowohl bei der Einphotonen- als auch bei der Mehrphotonen-Anregung auf.

Insbesondere bei Substanzgemischen von Substanzen mit unterschiedlichen Molekulargewichten führt die unterschiedlich starke Photozerstörung zu systematischen Falschbestimmungen der durch Lumineszenz bestimmten Eigenschaften. So ist der Einfluss der Photozerstörung bei schnell diffundierenden Partikeln mit geringem Molekulargewicht äußerst gering und bei langsam diffundierenden Partikeln mit hohem Molekulargewicht sehr stark. Dies führt zu fehlerhaften Gewichtungen absoluter und/oder prozentualer Komponentenanteile. Insbesondere erfolgt durch die Photozerstörung eine Missinterpretation biochemisch relevanter Größen, wie beispielsweise dem Bindegrad, dem K_d-Wert (mittlerer Bindewert der Moleküle) etc.

Erfindungsgemäß wird zur besseren Erfassung von Teilchen mit unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten das Bestrahlungswolumen während des Messvorgangs relativ zu der Probe bewegt. Die Relativ bewegung kann durch Bewegung der Probe selbst und/oder durch Bewegung des Bestrahlungsvolumens erfolgen. Durch das Bewegen des Bestrahlungsvolumens verringert sich die Verweildauer der einzelnen Moleküle innerhalb des Bestrahlungsvolumens und zwar beispielsweise bei Partikeln mit hohem Molekulargewicht anteilsmäßig stärker als bei Partikeln mit geringem Molekulargewicht. Dies hat zur Folge, dass die statistische Verweildauer von Teilchen mit unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten innerhalb des Bestrahlungsvolumens annähernd gleich groß ist. Die auftretende Photozerstörung ist gegenüber längeren Verweildauern geringer. Insbesondere ist der Einfluss der Photozerstörung aufgrund der annähernd gleich langen Verweildauer unabhängig von der Diffusionsgeschwindigkeit der Partikel erheblich geringer, da die Wahrscheinlichkeit der Photozerstörung von der Diffusionsgeschwindigkeit der Partikel unabhängig ist. Der Einfluss der Photozerstörung ist somit bei allen Partikeln annähernd gleich. Der Einfluss der Photozerstörung auf die Qualität der Messergebnisse ist somit erheblich geringer. Dies hat zur Folge, dass mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bessere Messergebnisse erzielt werden können. Erfindungsgemäß beträgt die Relativbewegung zwischen dem Bestrahlungsvolumen und der Probe mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 90%, der Diffusionsgeschwindigkeit der kleinsten mit einem Farbstoffmarker verbundenen zu messenden Teilchen. Unter kleinsten Teilchen sind hierbei die Teilchen mit der größten Diffusionsgeschwindigkeit, d. h. im Allgemeinen die Teilchen mit dem kleinsten Molekulargewicht zu verstehen. Durch eine derart hohe Relativgeschwindigkeit bezüglich der Bewegungsgeschwindigkeit der Teilchen ist auch bei langsam diffundierenden Teilchen eine kurze Verweildauer innerhalb des Bestrahlungsvolumens gewährleistet. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit der Photozerstörung auch bei dieser Art von Partikeln.

Vorzugsweise weist das Bestrahlungsvolumen einen Durchmesser von 0,5–5 μm, insbesondere von 0,8–1,2 μm, auf.

Erfindungsgemäß wird somit die chemische und/oder biologische Probe, die mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie untersucht werden soll, mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt, wobei die Strahlung mit Hilfe einer Optikeinrichtung in der Probe fokussiert wird, so dass ein begrenztes Bestrahlungsvolumen innerhalb der Probe erzeugt wird. Durch die Strahlung werden Farbstoffmarker, die durch das Bestrahlungsvolumen diffundieren zur Lumineszenz angeregt. Die von der Probe abgegebene Lumineszenz wird mit Hilfe einer Detektionseinrichtung gemessen. Erfindungsgemäß wird während des Messvorgangs das Bestrahlungsvolumen relativ zur Probe bewegt. Die Relativbewegung kann durch Bewegung der Probe selbst und/oder durch Bewegung des Bestrahlungsvolumens erfolgen.

Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Messung der Lumineszenz unabhängig von dem tatsächlichen Ort, an dem die Lumineszenz in der Probe auftritt gemessen wird, ist der tatsächliche Ort des Beleuchtungsvolumens in der Probe zu einem bestimmten Zeitpunkt unerheblich.

Um ein Beeinträchtigen der Messergebnisse zu vermeiden, erfolgt die Bewegung des Bestrahlungsvolumens derart, dass das Bestrahlungsvolumen die Wände des Gefäßes, in dem sich die Probe befandet nicht berührt; so dass durch ein derartiges Berühren keine Reflexionen oder andere Verfälschungen der abgegebenen Strahlung erfolgen.

Vorzugsweise ist die Relativbewegung derart bestimmt, dass die durch die Relativbewegung hervorgerufene Diffusionszeit eines Teilchens durch das Bestrahlungsvolumen kleiner ist als die mittlere Diffusionszeit des Teilchens bei statischem Bestrahlungsvolumen. Dies führt ebenfalls zu einer erheblichen Verbesserung der Messergebnisse.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Probe, insbesondere mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt werden, die zur einfarbigen und/oder räumlich überlagerten mehrfarbigen Lumineszenzanregung, insbesondere Fluoreszenzanregung, geeignet ist. Der Einsatz der Lumineszenz-Spektroskopie erfolgt vorzugsweise in konfokalen Messaufbauten. Die elektromagnetische Strahlung kann sowohl kontinuierlich als auch gepulst sein.

Zur Erzeugung der Relativbewegung zwischen dem Bestrahlungsvolumen und der Probe kann beispielsweise der Tisch eines Mikroskops, auf dem sich die Probe, die sich beispielsweise in einem Well einer Titerplatte befindet, bewegt werden. Um ein Bewegen der Probenflüssigkeit innerhalb des Probenbehälters durch starke Beschleunigungen zu vermeiden, ist es vorteilhaft, das Bestrahlungsvolumen zu bewegen. Hierzu können beispielsweise geeignete Klappspiegel oder Ähnliches vorgesehen sein. Eine bevorzugte Möglichkeit zur Bewegung des Bestrahlungsvolumens in der Probe besteht durch das Vorsehen eines Taumelspiegels. Bei einem derartigen Mikroskop ist ein die elektromagnetische Strahlung in die Probe lenkender Spiegel auf einer Drehachse gelagert. Der Spiegel ist in einem Winkel von ungleich 90° zur Drehachse angeordnet, so dass der Spiegel beim Drehen eine Taumelbewegung ausführt.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Versuchen unter Bezugnahme auf die anliegenden Grafiken näher erläutert.
Es zeigen:
1 einen Bindungsverlauf von Cy5-markiertem Pleuromutilin an Ribosomen bezüglich der Fluoreszenz-Lebensdauer,
2 einen Bindungsverlauf von Cy5-markiertem Pleuromutilin an Ribosomen bezüglich der Fluoreszenz-Intensität,
3 den Bindungsverlauf eines TAMRA-markierten Liganden an Immunglobulin G – Antikörpern. bezüglich der Fluoreszenz-Polarisation und
4 den Bindungsverlauf eines TAMRA-markierten Liganden an Immunglobulin G – Antikörpern bezüglich der Fluoreszenz-Intensität.
In den 1 und 2, in denen der Bindungsverlauf von Cy5-markiertem Pleuromutilin an Ribosomen dargestellt ist, wurden die Ribosomen in steigender Konzentration bei gleichbleibender Konzentration Cy5-markierten Pleuromutilin zutittiert. Die Konzentration der Ribosomen wurde somit im Laufe der Zeit erhöht. In beiden Fign. handelt es sich bei der mit Rauten versehenen Kurve um die Messkurve bei einem statischen, d. h. nicht bewegten Bestrahlungsvolumen. Die mit Quadraten markierte Kurve entspricht den Messergebnissen bei bewegtem Bestrahlungsvolumen.
Die 1 zeigt den Verlauf der mittleren Fluoreszenz-Lebensdauer der durch elektromagnetische Strahlung angeregten. Farbstoffmarker. Aus dem Diagramm ist entnehmbar, dass insbesondere die relativ schweren Pleuromutilin-Ribosomen-Komplexe, deren Konzentration über die Zeit zunimmt, ausbleichen, d. h. photozerstört werden. Dies ergibt sich daraus, dass bei der Kurve des statischen Bestrahlungsvolumens bei steigender Anzahl an schweren Teilchen, d. h. im rechten Bereich der Diagramme die Fluoreszenz-Lebensdauer bei statischem Bestrahlungsvolumen erheblich geringer ist als bei bewegtem Bestrahlungsvolumen. Dies führt zu einer erheblichen Fehlinterpretation hinsichtlich der Konzentration der Pleuromutilin-Ribosomen-Komplexe. Die ferner in der Probe befindlichen leichteren Pleuromutilin-Liganden werden wenig beeinflusst. Da diese eine, verglichen mit den Pleuromutilin-Ribosomen-Komplexen, höhere Diffusionsgeschwindigkeit aufweisen, ist die Wahrscheinlichkeit der Photozerstörung erheblich geringer, da die Verweilzeit innerhalb des Beleuchtungsvolumens sowohl bei einem bewegten als auch bei einem unbewegten Beleuchtungsvolumen sehr kurz ist. Wie sich aus 1 ergibt, führt die von der Verweilzeit im Bestrahlungsvolumen abhängige Photozerstörung zu einer Fehlbestimmung des K_d-Werts.
Auch aus der 2, bei der bei denselben Probenbedingungen wie in 1 beschrieben, die Fluoreszenzintensität gemessen wurde, ergibt sich eine Fehlinterpretation bei statischem Bestrahlungsvolumen. Die Kurve der Fluoreszenz-Intensität muss qualitativ der Kurve der Fluoreszenz-Lebensdauer entsprechen. Eine steigende Anzahl an länger lebenden Teilchen muss zu einer erhöhten Intensität führen. Anhand des im rechten Bereich des Diagramms in 2 ersichtlichen starken Abfalls der Kurve bei statischem Bestrahlungsvolumen ist ersichtlich, dass eine Vielzahl von Teilchen mit großer Molekülmasse photozerstört werden. Bei bewegtem Bestrahlungsvolumen entspricht die erhaltene Kurve qualitativ der erwarteten Kurve, die dem qualitativen Verlauf der Fluoreszenz-Lebensdauer entsprechen muss.
Die 3 und 4 zeigen ein weiteres Experiment. Dargestellt ist jeweils der Bindungsverlauf eines TAMRA-markierten Liganden an Immunglobulin G (IgG) Antikörper, wobei das eingesetzte Mengenverhältnis von freiem Liganden zu an Antikörper gebundenem Liganden in den Diagrammen von links nach rechts ansteigend variiert. In beiden Fign. ist wiederum die Kurve mit statischem Bestrahlungsvolumen durch Rauten und die mit bewegtem Bestrahlungsvolumen durch Quadrate gekennzeichnet.
Da sich die Molekulargewichte von den in der Probe vorhandenen Substanzen und damit auch deren Diffusionsgeschwindigkeiten unterscheiden, ergeben sich voneinander abweichende Kurven. Aus 3 ist insbesondere ersichtlich, dass bei ähnlichen Mengenverhältnissen von freien Liganden und gebundenen Liganden (Ligand-IgG) Fehlinterpretationen auftreten.
Die Fehlinterpretationen sind bei der Messung der Fluoreszenz-Intensität bei diesen Experimenten noch eklatanter. Bei dem bewegten Bestrahlungsvolumen folgt eine photophysikalisch korrekte Erhöhung der Fluoreszenz aufgrund der biochemischen Bindung. Bei dem statischen Anregungsvolumen kompensiert der Ausbleichungsprozess, d. h. die Photozerstörung die tatsächliche Fluoreszenzerhöhung vollständig.

Claims

Verfahren zum Messen chemischer und/oder biologischer Proben mit Hilfe der Lumineszenz-Spektroskopie, mit den Schritten: – Bestrahlen der Probe mit elektromagnetischer Strahlung, wobei die Strahlung mit Hilfe einer Optikeinrichtung in der Probe fokussiert wird, so dass ein begrenztes Bestrahlungsvolumen erzeugt wird, – Anregen von durch das Bestrahlungsvolumen diffundierenden, in der Probe enthaltenen Farbstoffmarkern zur Lumineszenz durch die elektromagnetische Strahlung und – Messen der abgegebenen Lumineszenz mit Hilfe einer Detektionseinrichtung, wobei zur verbesserten Erfassung von Teilchen mit unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten das Bestrahlungsvolumen während des Messvorgangs mit einer Relativgeschwindigkeit relativ zu der Probe bewegt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Relativgeschwindigkeit zwischen dem Bestrahlungsvolumen und der Probe mindestens 50% der Diffusionsgeschwindigkeit der kleinsten mit einem Farbstoffmarker verbundenen zu messenden Teilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 , bei welchem die Relativgeschwindigkeit mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 90%, der Diffusionsgeschwindigkeit der kleinsten mit einem Farbstoffmarker verbundenen zu messenden Teilchen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die Lumineszenzmessung unabhängig von der Position des Bestrahlungsvolumens in der Probe erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei welchem die durch die Relativbewegung zwischen dem Bestrahlung Volumen und der Probe hervorgerufene Durchtrittszeit eines Teilchens durch das Bestrahlungsvolumen kleiner ist als die mittlere Diffusionszeit des Teilchens ohne Relativbewegung.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–4, bei welchem die Messung in Kleinstproben, insbesondere von weniger als 500 μl, besonders bevorzugt von weniger als 100 μl, erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, bei welchem die Probe Teilchen mit unterschiedlichem Gewicht enthält.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem das Gewichtsverhältnis der schwersten mit einem Farbstoffmarker verbundenen Teilchen zu den leichtesten mit einem Farbstoffmarker verbundenen Teilchen mindestens 2:1, vorzugsweise mindestens 100:1, besonders bevorzugt mindestens 1000:1, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–7, bei welchem die Probe mit elektromagnetischer Strahlung bestrahlt wird, die zur einfarbigen und/oder räumlich überlagerten mehrfarbigen Lumineszenzanregung geeignet ist.
Verfahreiz nach einem der Ansprüche 1–8, bei welchem zum Bestrahlen und/oder Detektieren eine konfokale Optik eingesetzt wird.