WO2007032266A1 - 蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法を用いた抗原の迅速検出法 - Google Patents

蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法を用いた抗原の迅速検出法 Download PDF

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WO2007032266A1
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antibody
fluorescence
detection
labeled
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Kenta Saito
Hiroshi Sakata
Fumihiko Fujii
Masataka Kinjo
Mamoru Tamura
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Japan Science And Technology Agency
National University Corporation Hokkaido University
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    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to a rapid detection method of an antigen using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) or fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS), in particular, an antigen of any concentration in a sample, a detection reagent and a detection antigen.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • the present invention relates to a method for rapid detection using fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy without considering the concentration ratio of the two in multiple stages.
  • harmful proteins include allergen proteins that are a problem in food materials such as buckwheat, wheat, and rice
  • pathogenic proteins include, for example, raw materials for meat and meat-and-bone meal.
  • a pathogenic protein such as an abnormal prion (infectious type) is included as a problem.
  • abnormal prions which are typical examples of pathogenic proteins that have become a problem in recent years, are proteins that cause prion diseases represented by bovine spongiform encephalopathy (BSE). is there.
  • the normal prion protein normally present on the surface of animal brains and nerve cell membranes is a glycoprotein with a molecular weight of approximately 3.3 to 350,000 (33 to 35 kDa), and is contained in cells in the brain as an infectious prion protein. (Lait, 76: 571-578, 1996) o
  • an abnormal prion enters the animal body, it converts normal prion produced at a specific site in the body to abnormal prion, As a result, abnormal prions accumulate at these specific sites.
  • abnormal prions accumulate in the brain, the brain becomes spongy and the animal dies.
  • ELISA can be used, for example, to denature the proteinase K-treated sample with guazin thiocyanate and remove the prion protein from the aggregated state.
  • a method in which a magnetic antibody is used as an abnormal prion immunoassay reagent by immobilizing a first antibody or antigen-binding fragment thereof that undergoes an antigen-antibody reaction with an abnormal prion treated with a denaturant.
  • FCS Fluore SC ence correlation spectroscopy
  • FCS Fluorescence Correlation Spectyoscopy. Theory and Applications, Springer, Berlin, 2001.
  • FCS uses the laser confocal microscope system to capture the Brownian motion of target molecules labeled with fluorescence in a minute region, and then analyzes the fluctuation force of the fluorescence intensity and the diffusion time. FCS analysis that captures molecular fluctuations in such a small region is an effective means for detecting intermolecular interactions with high sensitivity and specificity. Yes.
  • the fluorescence intensity of a minute region in the measurement by FCS, the fluorescence intensity of a minute region (diameter: about 400 nm, axial length: about 10 to 16 L) in the sample can be detected by using a confocal optical system. Since this region is an open system, molecules enter and exit the region, and the fluorescence intensity fluctuates according to the number of molecules. This fluctuation becomes smaller as the number of molecules increases, and becomes faster as the diffusion rate of molecules increases. By analyzing this using a correlation function, information on the number and size of the molecules can be obtained. In the measurement by FCS, it is possible to analyze information on molecules in real time without separation and purification, so it is possible to screen a small amount of target molecules from a huge sample.
  • FCS measurement When FCS measurement is used to detect and measure proteins contained in biological samples, the concentration of target molecules labeled with fluorescence in the solution and the interaction between molecules are physically separated. It is to be able to monitor almost in real time without going through. Therefore, in the detection system using FCS, the complicated BoundZFree separation process that has been necessary in the analytical means such as ELISA, which has been used as the mainstream of biomolecule detection systems, can be omitted. It is possible to measure a large amount of samples with high sensitivity and is suitable for automated measurement.
  • a fluorescently labeled antibody molecule is used, and the fluorescent antibody is used by utilizing an antigen-antibody reaction between the fluorescently labeled antibody and the antigenic protein.
  • Analysis is performed using the difference in diffusion rate depending on the shape and molecular weight of the antigen-antibody complex molecule formed by the antigen-antibody reaction between the labeled antibody and the fluorescently labeled antibody and the antigen protein. Is done.
  • the diffusion rate (diffusion constant or D) refers to the area where molecules freely diffuse per unit time.
  • diffusion time Diffusion Time: (DT) or ⁇ ) is the time required for molecules to pass through the focal region determined by the device.
  • FCCS Fluorescence and ross Correlation spectroscopy
  • FCCS measurement only signals that are correlated with each other are analyzed, and it has been proved that the sensitivity is about an order of magnitude higher than in FCS measurement.
  • FCCS Fluorescence-Activated Cell Sorting
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 10-267928.
  • Patent Document 2 JP 2001-272404 A.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-130880.
  • Patent Document 4 JP-A-2005-43317.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-98876.
  • Patent Document 6 Japanese Patent No. 3517241.
  • Non-patent literature l Lait, 76: 571-578,1996
  • Non-Patent Document 2 Chem. Phys., 4,390-401, 1974.
  • Non-Patent Document 3 Biopolymers, 13, l-27, 1974.
  • Non-Patent Document 4 Physical Rev. A, 10: 1938-1945, 1974.
  • Non-Patent Literature 5 in Topics in Fluorescence bpectyoscopy, 1, pp. «337-378, Plenum Press. New York and London, 1991.
  • Non-Patent Document 6 R. Rigler, E. S. Elson (Eds., Fluorescence Correlation Spectyoscopy. Theory and Applications, Springer, Berlin, 2001.
  • Non-Patent Document 7 Biophysical Journal, 72: 1878-1886, 1997.
  • Non-Patent Document 8 Current Pharmaceutical Biotechnology, 5: 199-204, 2004.
  • An object of the present invention is to use fluorescence correlation spectroscopy (FCS) or fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCCS fluorescence cross correlation spectroscopy
  • the present inventor is a method for rapidly detecting pathogenic protein antigens in biological protein samples and harmful protein antigens contained in food materials using FCS or FCCS using antigen-antibody reaction.
  • (1) A series in which only detection reagents such as fluorescently labeled antibodies are added, and (2) a series in which the concentration of antigen and antibody-trimbling trimers is maximized and detection reagents are added.
  • the concentration of the antigen is unknown, detect any concentration of antigen in the antigen sample quickly using FC S or FCCS without considering the concentration ratio of detection reagent to detection antigen in multiple stages. And that the present invention is completed It came to be.
  • the present invention relates to a fluorescence-labeled fluorescent-labeled complete antibody or fluorescent-labeled antibody fragment that targets an epitope of an antigen to be detected and non-fluorescent labeling that targets another epitope of the antigen.
  • a fluorescent-labeled complete antibody or fluorescent-labeled antibody fragment Determine the dissociation constant Kd of the antigen to be detected and the non-fluorescent labeled complete antibody or fluorescent labeled complete antibody or fluorescent labeled antibody fragment, and the concentration of detection reagent and antigen that maximizes the trimer concentration. A ratio is set, and based on the concentration ratio, the antigen with the highest trimer concentration is detected. Prepare a series of "adding reagent".
  • the rapid detection method of an antigen of the present invention was developed by the present inventor and applied for a patent "rapid detection and Z or measurement method of an antigen by FCS", that is, targeting an epitope of an antigen.
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the rapid detection method for antigens of the present invention is based on fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) using fluorescently labeled antibodies or fluorescently labeled antibody fragments that target different epitopes of the antigen. It can also be applied to the detection of antigens.
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • FCS measurement by using a confocal optical system, it is possible to detect the fluorescence intensity of a minute region (diameter: about 400 nm, axial length: about 2 m, volume: ⁇ 10_16 L) in the sample . Since this region is an open system, molecules enter and exit the region, and the fluorescence intensity fluctuates according to the number of molecules. This fluctuation is averaged and reduced as the number of molecules increases, and increases as the diffusion rate of molecules increases. This can be analyzed using correlation functions to obtain information on the number and size of molecules. In FCS measurement, it is possible to analyze information on molecules in real time without separation and purification, so it is possible to screen a small amount of target molecules with a huge sample force.
  • Antigen detection using FCS utilizes the fact that the fluorescence-labeled antibody captures the antigen to increase the molecular weight, resulting in a delay in the speed of passing through the confocal region.
  • a fluorescently labeled antibody fragment and (2) an antibody that recognize different epitopes for the antigen ( Figure 1).
  • Figure 1 an antibody that recognize different epitopes for the antigen
  • FCCS measurement by using two types of lasers and two detectors, it is possible to detect two types of fluorescence intensities in a small region in the sample. By analyzing this signal using the cross-correlation function, the correlation between the two signals can be seen. In FCCS measurement, only signals that are correlated with each other are analyzed, and it has been proved that the sensitivity is about an order of magnitude higher than FCS measurement.
  • Antigen detection using FCCS requires the use of (1) a fluorescently labeled antibody and (2) a fluorescently labeled antibody that recognizes a different epitope site regardless of the molecular weight of the antigen ( Figure 2).
  • the concentration of the antigen is low, in which case the concentration of the trimer is low.
  • the concentration of the trimer is also low (Fig. 3). Therefore, if the concentration of the antigen is unknown, it will be necessary to dilute each sample in order to avoid false negatives and examine the presence or absence of antigen. As a result, the speed of measurement is greatly reduced.
  • the following method is adopted in the present invention. That is, if the dissociation constant Kd values of antigen and antibody fragment are known in advance, it is possible to derive the concentration ratio of the detection reagent and antigen that maximizes the concentration of the trimer. Based on this, prepare (1) a series that covers only the detection reagent for each sample, and (2) a series that adds the antigen and detection reagent that maximize the concentration of the trimer.
  • the antigen rapid detection method of the present invention is effectively used for detecting pathogenic protein antigens in biological protein samples, particularly abnormal prions, or detecting harmful protein antigens contained in food materials. can do.
  • the present invention relates to [1] a fluorescence-labeled fluorescent-labeled complete antibody or a fluorescent-labeled antibody fragment targeting an epitope of an antigen to be detected, and another antigen of the antigen.
  • Non-fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment targeting epitopes as a detection reagent and antigen correlation by fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • the detection method (1) a series in which only the detection reagent is added, and (2) a series in which the antigen and detection reagent with the highest trimer concentration are prepared, and fluorescence spectroscopic analysis is performed.
  • the reagent is added in advance to obtain the dissociation constant Kd between the fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment and the antigen to be detected and the non-fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment.
  • the concentration ratio of the detection reagent and the antigen that maximizes the concentration of the trimer is set, and based on the concentration ratio, the setting is performed based on the set amount of the antigen and the detection reagent.
  • the rapid detection method of an antigen described in [1] or [3] the detection method of an antigen targets a fluorescently labeled fluorescent antibody fragment targeting an epitope of the antigen to be detected and another epitope of the antigen It comprises the method for rapid detection of an antigen according to the above [1], which is fluorescence correlation spectroscopy using a non-fluorescently labeled antibody.
  • the present invention also provides: [4] a method for detecting an antigen, wherein a fluorescently labeled fluorescently labeled complete antibody or a fluorescently labeled antibody fragment targeting an epitope of the antigen to be detected;
  • a fluorescently labeled fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment that targets an epitope of the antigen to be detected is prepared from a monoclonal antibody prepared using the antigen as an immunogen.
  • Non-fluorescently labeled antibody or fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment targeting other epitopes is a monoclonal antibody prepared using the antigen to be detected as an immunogen or the antibody strength prepared The method for rapid detection of an antigen according to any one of the above [1] to [4], or [6] (1) fluorescent labeling that targets an epitope of the antigen to be detected in the test sample Fluorescently labeled complete antibody or Alternatively, a fluorescently labeled antibody fragment and a non-fluorescent labeled complete antibody or a fluorescently labeled fluorescent labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment that targets other epitopes of the antigen are added as detection reagents, Performing antigen-antibody reaction and detecting the formed antigen-antibody trimer by fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy; and (2) the concentration of the trimer in the test sample in advance.
  • the maximum concentration ratio of the detection reagent and antigen was also determined.
  • the antigen and detection reagent with the highest trimer concentration were added, the antigen-antibody reaction was performed, and the formed antigen-antibody trimer was correlated with fluorescence.
  • Antigen by correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy Consisting of rapid detection method.
  • the present invention provides [7] the method for rapid detection of an antigen according to [6] above, wherein the test sample is a biological protein sample, and the antigen to be detected is a pathogenic protein antigen, The method for rapid detection of an antigen according to [7] above, wherein the pathogenic protein antigen is an abnormal prion, [9]
  • the test sample is a food material, and the antigen to be detected is contained in the food material.
  • the antigen detection method according to [6] above characterized by being a harmful protein antigen contained in [10], and [10] antigen detection by fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy,
  • the method for rapid detection of an antigen according to any one of the above [6] to [9], which is performed without undergoing a physical separation process of contained antigens, and [11]
  • a detection reagent comprising a non-fluorescently labeled complete antibody or a fluorescently labeled fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment targeting another epitope of the antigen, and (2) a trimer of
  • the kit comprises a kit for rapid detection of an antigen by fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy, equipped with an antigen and a detection reagent having a maximum concentration
  • FIG. 1 In the description of the method for rapid detection of an antigen using FCS of the present invention, a model in the case where a trimer is formed with a fluorescently labeled antibody fragment, a non-fluorescently labeled complete antibody and an antigen.
  • FIG. 2 is a schematic view when a trimer is formed with a fluorescently labeled antibody, a fluorescently labeled antibody, and an antigen in the description of the rapid antigen detection method using FCCS of the present invention.
  • FIG. 3 In the description of the method for rapid detection of an antigen using FCS and FCCS of the present invention, when the concentration of the antigen is low or when the concentration of the antigen is extremely high, a trimer is formed between the antibody and the antigen. It is the schematic diagram explaining the condition to form.
  • FIG. 4 In the examples of the present invention, (1) a series in which only a detection reagent is added to each concentration of antigen, and (2) a series in which a detection reagent and an appropriate amount of antigen are added are prepared. It is a figure which shows the result of having detected the trimer with an antigen and determining negative or positive with respect to an antigen.
  • the rapid detection method of an antigen by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) or fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) of the present invention is a fluorescence-labeled fluorescent-labeled complete antibody targeting an epitope of the antigen to be detected.
  • fluorescence correlation using a fluorescently labeled antibody fragment and a non-fluorescently labeled complete antibody or a fluorescently labeled fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment that targets another epitope of the antigen as a detection reagent In the antigen detection method using spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy, (1) a series in which only the detection reagent is added, and (2) a series in which the antigen and detection reagent at which the concentration of the trimer is maximized are prepared are prepared. The fluorescence spectroscopic analysis is performed, and the presence or absence of the antigen in the detection sample is detected based on the presence or absence of the trimeric detection signal of the detector force in the cases (1) and (2).
  • the addition of an antigen that maximizes the concentration of a trimer and a detection reagent is performed in advance by adding a fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment, an antigen to be detected, and a non-fluorescently labeled completely Dissociation constant Kd of type antibody or fluorescent labeled complete antibody or fluorescent labeled antibody fragment Kd
  • concentration ratio between the detection reagent and the antigen that gives the maximum trimer concentration is set, and based on the concentration ratio, the set amount of the antigen and detection reagent can be set.
  • a fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled antibody fragment, an antigen to be detected, and a non-fluorescently labeled complete antibody or fluorescently labeled complete antibody or fluorescent are previously used.
  • an antibody that specifically binds to an antigen is prepared in order to prepare a fluorescently labeled antibody, a fluorescently labeled antibody fragment, and a non-fluorescently labeled complete antibody used as a detection reagent.
  • a polyclonal antibody and a monoclonal antibody can be exemplified. Among them, a monoclonal antibody is more preferable in terms of its specificity.
  • the antigen to be detected is first purified and obtained.
  • the antigen can be prepared by isolation and purification using a known purification means, and if the antigen is an antigen protein and the amino acid sequence of the antigen protein is known, genetic engineering is possible.
  • the antigenic protein can be produced using microorganisms, animal cells, etc., and purified and obtained by a conventional technique.
  • the antigenic protein can be prepared by chemical peptide synthesis.
  • Known chemical means can be employed for chemical synthesis of the peptide. For example, azide method, acid chloride method, acid anhydride method, mixed acid anhydride method, DCC method, active water steal method, force Examples include the lupoimidazole method and the oxidation-reduction method.
  • the antigen is used to sensitize an animal or plant using a conventional protocol.
  • monoclonal antibodies can be prepared using the hyperprideoma method (Nature 256, 495-497, 1975), the trioma method, the human B cell hyperprideoma method (Immunology), which results in antibodies produced by cultures of continuous cell lines. Today 4, 72, 1983) and EBV-Hypridoma method (MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCE R THERAPY, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985) can be used.
  • the antigen protein is used as an antigen to a mammal such as a rat, mouse, or rabbit and sensitized.
  • Adjuvants such as Freund's complete adjuvant (FCA) and Freund's incomplete adjuvant (FIA) can be used as necessary.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injection into the vein, subcutaneous, or intraperitoneal cavity. The interval between immunizations is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times at intervals of several days to several weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days after the final immunization day.
  • antibody-producing cells examples include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells and the like.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • Generally available cell lines can be used as myeloma cells to be fused with antibody-producing cells.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells. What has is used.
  • the target hyperidoma is selected from the cells after the cell fusion treatment.
  • a method for collecting an established hybridoma force monoclonal antibody a normal cell culture method or ascites formation method can be employed.
  • antibody purification is required in the above antibody collection method, a known method such as ammonium sulfate salting-out, ion exchange chromatography, gel filtration, or affinity chromatography is appropriately selected, or these are used. It can be purified by combining.
  • the antigen protein antibodies used in the present invention include those prepared as described above, as well as commercially available antibodies that have already been prepared. Antibodies can be used.
  • a fluorescently labeled antibody and a fluorescently labeled antibody fragment prepared from the antigen are used as a detection reagent for detecting by performing an antigen-antibody reaction with the antigen.
  • the antibody used for the preparation of the fluorescently labeled antibody and the fluorescently labeled antibody fragment is the same as the non-fluorescently labeled antibody or the fluorescently labeled antibody or the fluorescently labeled antibody fragment used in the present invention. Antigens with different antigen epitopes are selected.
  • the complete antibody or the complete antibody of the antigen is fragmented with an enzyme such as pepsin or papain, and this is fragmented with 2-mercaptomethylamine or 2-mercaptoethanol.
  • an enzyme such as pepsin or papain
  • 2-mercaptomethylamine or 2-mercaptoethanol After reducing to monomer, prepare by labeling.
  • a fluorescent dye is used.
  • a fluorescent dye such as fluorescein sothiocyanate (FITC) or Alexa532 is used.
  • FCS is a method of obtaining physical quantities such as “size” and “number” of molecules using the Brownian motion of fluorescent molecules in solution. The feature of FCS is that the concentration of fluorescent molecules in the solution and the interaction between molecules can be monitored almost in real time without going through a physical separation process.
  • FCCS has various known forces
  • the detection and measurement of the present invention Any method can be used as long as it does not interfere with the detection and measurement of the subject (Biophysical Journal, 72, 1878—188; 1997; urrent Pharmaceutical Biotechnol ogy, 5, 199-204, 2004; Biochem. Biophys. Res. Comm., 329, 1200-1207, 2005; Special Table 2001-517800).
  • MF20 (manufactured by Olympus Corporation) was used as a device for measuring FCS and FCCS.
  • a plate for measurement a 384-well plate (manufactured by Olympus) that was blocked with N101 (Nippon Yushi) was used.
  • Detection reagents are Alexa488—anti-prion antibody (1.0E-10M), Alexa
  • a 633-anti-prion antibody (1.0E-10M) was used. Recombinant bovine prion protein was used as the antigen. For each concentration of antigen, (1) a series in which only the detection reagent was added and (2) a series in which the detection reagent and an appropriate amount of antigen were added were prepared.
  • the concentration of the antigen with the maximum trimer concentration is determined to be about 4.8 nM, and the antigen and detection reagent are added to the sample to obtain this concentration. It was prepared as “(2) Detection reagent and antigen added series”.
  • a series in which only the detection reagent was added and (2) a series in which the detection reagent and an appropriate amount of antigen were added were prepared.
  • the detection reagent and the antigen were put into a plate at a predetermined concentration, and then stirred with a pipette. After standing at 37 ° C for 1 hour, the laser power was set to 100 W for 488 nm and 100 W for 633 nm, and three measurements were taken for 60 seconds.
  • various parameters including the number of molecules were derived using the software provided with MF20.
  • the horizontal axis of the graph in Fig. 4 indicates the antigen concentration, and the vertical axis indicates the ratio of the trimer to the total fluorescent molecule.
  • the detection limit value by FCCS is about 5 X 10 _1 ° M, so samples with a prion protein concentration of 5 X 10 _1 M or less are assumed to be negative. In addition, based on the signal intensity of the negative control, about 2% or less is considered as no signal in this data. If a new amount of antigen is not added [(-) PrP in the figure], the antigen concentration is 1 to: When LOnM, the number of molecules of the antigen and the two types of labeled antibodies is equal, so the trimer The percentage of is increasing (Fig.
  • the concentration of the antigen in the sample to be tested is appropriate. It was necessary to adjust the concentration to a low level or to adjust the concentration to a multi-step concentration for each sample, and it was necessary to perform multi-step dilution. As a result, the speed of measurement was greatly reduced. Therefore, the detection method of the present invention solves this problem and enables a rapid detection method using FCS and FCCS without performing a multistage dilution method on a sample of unknown concentration.
  • the detection method of the present invention is a rapid and simple test method with a small number of steps, can be applied to a fully automated system, and is currently being tested for bovine spongiform encephalopathy (BSE), a social problem. In addition, it can be expected to be applied to testing of foods, pharmaceuticals, cosmetics, etc. based on antigen antibody reactions.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy

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Abstract

 蛍光相関分光法（ＦＣＳ）又は蛍光相互相関分光法(ＦＣＣＳ)を用いた抗原の検出法において、特に、試料中の抗原の濃度が不明な場合において、抗原試料中の任意の濃度の抗原を、検出試薬と検出抗原の濃度比を多段階に検討することなく、迅速に検出する方法を提供するものである。検出する抗原のエピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のエピトープを標的とする非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片とを検出試薬として用いたＦＣＳ又はＦＣＣＳによる抗原の検出法において、（１）検出試薬のみを加える系列と、（２）３量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（１）及び（２）の場合における検出器からの３量体検出信号の有無により、検出試料中の抗原の有無を迅速に検出する。

Description

明 細 書
蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法を用いた抗原の迅速検出法 技術分野
[0001] 本発明は、蛍光相関分光法 (FCS)又は蛍光相互相関分光法 (FCCS)を用いた抗 原の迅速検出法、特に、試料中の任意の濃度の抗原を、検出試薬と検出抗原の濃 度比を多段階に検討することなぐ蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法を用 いて、迅速に検出する方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、天然物由来の食品素材や飼料素材の利用に際して、それらの素材中に含ま れる有害タンパク質や、病原性タンパク質等の存在が問題となっている。有害タンパ ク質としては、例えば、ソバ、小麦、米等の食品素材に含有され問題となっているァレ ルゲンタンパク質等が挙げられ、病原性タンパク質としては、例えば、食肉、肉骨粉 の原料に含まれ問題となって 、る異常型プリオン (感染型)のような病原性タンパク質 等が挙げられる。例示して説明すれば、近年問題となっている病原性タンパク質の代 表的な例として挙げられる異常型プリオンは、牛海綿状脳症 (BSE)に代表されるプリ オン病の原因となるタンパク質である。動物の脳や神経細胞膜表面に通常存在する 正常型のプリオンタンパク質は分子量約 3. 3〜3. 5万（33〜35kDa)の糖タンパク 質であり、感染型プリオン蛋白として脳内の細胞内に蓄積されているものである（Lait, 76:571-578,1996) o異常型プリオンは、動物体内に侵入すると、体内の特定部位で 生産される正常型プリオンを異常型プリオンに変換し、その結果、それらの特定部位 において異常型プリオンが蓄積する。脳に異常型プリオンが蓄積すると、脳がスポン ジ状になり、動物は死に至る。
[0003] このような食品素材や飼料素材の利用に際して、それらの素材中に含まれるアレル ゲンタンパク質のような有害タンパク質や、病原性タンパク質を、ヒトゃ動物が摂取す ることを防止するためには、該食品素材や飼料素材に含まれるアレルゲンタンパク質 のような有害タンパク質や、病原性タンパク質を検知、測定し、それらの有害タンパク 質や、病原性タンパク質を含むものの利用を防止する必要がある。 [0004] 従来より、プリオン (異常型）のような天然の生体タンパク質の測定には、 ELISA (固 相酵素免疫検定法)やウェスタンプロット法 (ィムノブロット法)のような免疫測定法が 用いられている。しかし、例えば、 ELISAやウェスタンブロット法のような従来法でプリ オンの検出、測定を行うには、従来法では正常型プリオンと異常型プリオンを区別し て検出するために、まず、被検試料から予め正常型プリオンをプロテインァーゼ I C 処理し、分解、除去しておくような処理を行っておく必要がある。また、ウェスタンプロ ット法は、電気泳動を行う必要があり、煩雑で時間が力かるので、多数の試料を短時 間に検査しょうとするためには適していないという問題がある。更に、 ELISAは、必要 な感度を達成するために、例えば、プロテインァーゼ K処理後の試料をグァ-ジンチ オシアン酸で変性処理し、プリオンタンパク質の凝集状態を解除する前に、 SDSによ る一次変性処理及びメタノール処理によるタンパク質濃縮操作を行う必要があり、該 メタノール処理の前及びグァ-ジンチォシアン酸処理の前にはそれぞれ遠心分離を 行う必要があり、そして、該遠心分離操作は時間がかかり、該方法はこのような煩雑 な処理を行わなければならないことから、多数の試料を短時間に検査しょうとするた めには適して!/ヽな ヽと ヽぅ問題がある。
[0005] そこで、これらのプリオンの検出、測定に用いられて 、る ELISAやウェスタンブロッ ト法の問題を改善するために、最近、いくつかの方法が提案されている。例えば、特 開平 10— 267928号公報には、異常プリオンタンパク質を高感度に検出するために 、抗プリオンタンパク質抗体を用い、該抗体を任意の DNA断片で標識して、該 DNA 断片を PCRにより検出するィムノ PCR法が開示されている。また、特開 2003— 130 880号公報には、従来法の ELISAやウェスタンブロット法の時間の力かる電気泳動 操作や遠心分離操作を行うことなく高感度に異常型プリオンを免疫測定する方法とし て、磁性粒子に、変性剤処理した異常型プリオンと抗原抗体反応する第 1抗体又は その抗原結合性フラッグメントを不動化して異常型プリオン免疫測定試薬として用い る方法が開示されている。
[0006] し力し、これらの方法は、従来法の ELISAやウェスタンブロット法を改良するもので あるが、依然として、各種の処理を経なければならず、プリオンのような抗原タンパク 質を、簡便かつ迅速に検出、測定するには必ずしも十分なものではない。また、これ らの検出、測定方法は、該検出、測定のための処理工程を、自動或いは半自動的に 行 、、大量の試料の測定を行うには適した方法とは 、えな 、。
[0007] 一方、近年、特に生物由来の分子の解析等に多く用いられ、例えば、タンパク質分 子の数や、大きさ、或いは形等の物理量を、試料の物理的な分離過程を経ずに、し 力も、ほぼ実時間で検出、測定できる分析法として蛍光相関分光法 (FCS : FluoreSC ence Correlation Spectroscopy)が知られている（Chem. Phys., 4,390— 401,1974; Biop olymers,13, l-27,1974;Physical Rev. A, 10: 1938— 1945, 1974; in Topics in Fluorescen ce Spectyoscopy, 1 , pp.337-378, Plenum Press, New York and London, 1991; R.Rigler,
E.S. lson(Eds.), Fluorescence Correlation Spectyoscopy.Theory and Applications, S pringer, Berlin,2001)。 FCSは、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるブラウン 運動をレーザー共焦点顕微鏡系により微小領域で捉えることによって、蛍光強度の ゆらぎ力 拡散時間を解析し、標的分子の物理量 (分子の数、大きさ）を測定すること により実行されるもので、このような微小な領域で分子ゆらぎを捕える FCSによる解析 は、高感度、特異的に分子間相互作用を検出する上で有効な手段となっている。
[0008] すなわち、 FCSによる測定では、共焦点光学系を用いることにより、試料中の微小 領域 (直径 約 400nm,軸長 約 体積 〜10_16L)の蛍光強度を検出するこ とが出来る。この領域は開放系であるため、分子が領域内を出入りし、分子数に応じ た蛍光強度のゆらぎが生じる。このゆらぎは、分子数の増加に伴い平均化されて小さ くなり、分子の拡散速度の増加に伴い速くなる。これを相関関数を使って解析し、分 子の数と大きさに関する情報を得ることが出来る。 FCSによる測定では、分子に関す る情報を実時間で分離精製を経ずに分析することが可能であるため、膨大な試料か らの微量な標的分子のスクリーニングが可能である。 FCS測定を、生体試料中に含 まれるタンパク質等の検出、測定に用いた場合の特徴としては、溶液に含まれる蛍光 で標識した標的分子の濃度や分子間相互作用を物理的な分離過程を経ずにほぼ 実時間でモニタできることにある。そのため、 FCSを用いた検出系では、これまで生 体分子の検出系の主流として用いられてきた ELISAなどの分析手段で必要であつ た煩雑な BoundZFree分離過程を省くことができ、したがって、短時間に多量のサン プルを高感度で測定することが可能であり、自動化測定にも向いている。 [0009] ところで、 FCSを用いて、抗原タンパク質等の検出を行うには、蛍光標識化した抗 体分子を用い、該蛍光標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応を利用して、 該蛍光標識化抗体と、該蛍光標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応によつ て形成された抗原抗体複合体分子の有する形状及びその分子量に依存する拡散速 度の差を利用して、分析が行われる。ここで、拡散速度 (拡散定数又は D)とは、単位 時間に分子が自由拡散する面積のことをいう。他方、拡散時間（Diffusion Time : (DT )または τ )とは、装置によって決まる焦点領域内を分子が通過するのに要する時間
D
のことをいう。
[0010] 従って、 FCSによって、試料中の抗原タンパク質等の正確な測定を行うためには、 標識化抗体の拡散速度と、該標識化抗体と抗原タンパク質との抗原抗体反応によつ て形成される抗原抗体複合体の拡散速度との間に有意な差を生じさせるような抗原 と抗体の組み合わせを用いる必要がある。したがって、従来、この必要性のため、 FC Sにより検出できる抗原タンパク質等の種類は非常に限られていた。この問題を解決 する手段として、従来、抗原と抗体との形状及び分子量を考慮して抗原抗体複合体 に対して種々の修飾を施し、拡散速度に有意な差を設けると ヽうことが行われて ヽた (特開 2001— 272404号公報、特許第 3517241号公報)。しかし、これらの方法を 用いても、 FCSの検出方法を適用検出対象には限度があった。
[0011] 近年、蛍光分光法を用いた物質の検出測定法として、 FCSとともに蛍光相互相関 力、光法 (Fluorescenceし ross Correlation spectroscopy : FCCS)力 S知りれて ヽ (Βιορ hysical Journal, 72:1878— 1886, 1997 ; Current Pharmaceutical Biotechnology , 5： 199-2 04,2004) o FCCS測定では、 2種類のレーザーと 2個の検出器を用いることにより、試 料中の微小領域の 2種類の蛍光強度を検出することが出来る。この信号を相互相関 関数を使って解析し、 2種類の信号の相関性をみることが出来る。 FCCS測定では、 相互に相関がある信号のみの解析を行うため、 FCS測定よりも約一桁高感度である ことが実証されている。 FCCSを用いた抗原の検出においては、抗原の分子量に関 係なく (1)蛍光標識抗体と (2)異なるェピトープ部位を認識する蛍光標識抗体を用い ることが必要である。
[0012] ところで、 FCSや FCCS測定を用いて、物質の検出、測定を行う場合に、通常は、 試料中の被検出物質の濃度が不明の場合が多い。しかし、 FCSや FCCS測定を用 いて、蛍光標識化物質と被検出物質との結合を検出し、被検出物質の測定を行う場 合には、蛍光標識化物質と被検出物質との適正濃度割合が設定されないと、正確な 被検出物質の検出、測定が行えないという問題がある。したがって、試料中の被検出 物質の濃度が不明の場合には、多段階希釈を行い、被検出物質の有無を検討する 必要があった (特開 2005—43317号公報；特開 2005 - 98876号公報)。その結果 、測定に時間を要することとなり、したがって、従来、このような場合には、 FCSや FC CS測定を用いても、迅速な検出、測定が難しいという問題があった。しかし、これま で有効な対策は成されて!/、な 、のが現状であった。
[0013] 特許文献 1：特開平 10— 267928号公報。
特許文献 2：特開 2001— 272404号公報。
特許文献 3 :特開 2003— 130880号公報。
特許文献 4 :特開 2005— 43317号公報。
特許文献 5：特開 2005 - 98876号公報。
特許文献 6：特許第 3517241号公報。
非特許文献 l : Lait, 76:571-578,1996
非特許文献 2： Chem. Phys. ,4,390- 401 , 1974。
非特許文献 3 : Biopolymers, 13,l- 27,1974。
非特許文献 4 : Physical Rev. A, 10: 1938- 1945 ,1974。
非特干文献 5 : in Topics in Fluorescence bpectyoscopy , 1, pp. «337-378, Plenum Pre ss.New York and London, 1991。
非特許文献 6 : R.Rigler, E.S.Elson(Eds. , Fluorescence Correlation Spectyoscopy.Th eory and Applications, Springer, Berlin, 2001。
非特許文献 7 : Biophysical Journal, 72: 1878-1886,1997。
非特許文献 8 : Current Pharmaceutical Biotechnology,5: 199-204,2004。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0014] 本発明の課題は、蛍光相関分光法 (FCS)又は蛍光相互相関分光法 (FCCS)を用 いた抗原の検出法において、特に、試料中の抗原の濃度が不明な場合において、 抗原試料中の任意の濃度の抗原を、検出試薬と検出抗原の濃度比を多段階に検討 することなぐ FCS又は FCCSを用いて、迅速に検出する方法を提供することにある 課題を解決するための手段
[0015] 本発明者は、生体タンパク質試料中における病原性タンパク質抗原や、食品素材 中に含まれる有害タンパク質抗原を、抗原抗体反応を利用して、 FCS又は FCCSを 用いて、迅速に検出する方法を鋭意検討する中で、（1)蛍光標識した抗体等の検出 試薬のみを加える系列と、（2)抗原及び抗体力 なる 3量体の濃度が最大になる抗 原と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（1)及び (2)の場 合における検出器からの 3量体検出信号の有無により、検出試料中の抗原の有無を 検出することにより、試料中の抗原の濃度が不明な場合において、抗原試料中の任 意の濃度の抗原を、検出試薬と検出抗原の濃度比を多段階に検討することなぐ FC S又は FCCSを用いて、迅速に検出することが可能であることを見い出し、本発明を 完成するに至った。
[0016] すなわち、本発明は、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍 光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的と する非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは 蛍光標識抗体断片とを検出試薬として用いた FCS又は FCCSによる抗原の検出法 において、（1)検出試薬のみを加える系列と、（2) 3量体の濃度が最大になる抗原と 検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（1)及び (2)の場合に おける検出器からの 3量体検出信号の有無により、検出試料中の抗原の有無を迅速 に検出することからなる。
[0017] 本発明において、上記（2)の「3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える 系列」を調製するには、予め、蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、検 出する抗原、及び、非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識完全型抗体或いは蛍 光標識抗体断片との解離定数 Kdを求め、 3量体の濃度が最大になる検出試薬と抗 原の濃度比を設定し、該濃度比に基づいて、「3量体の濃度が最大になる抗原と検 出試薬を加える系列」を調製する。
[0018] 本発明の抗原の迅速検出法は、本発明者が先に開発して、特許出願した「FCSに よる抗原の迅速検出及び Z又は測定法。」、すなわち、抗原のェピトープを標的とす る蛍光標識化された蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非 蛍光標識化完全型抗体を用いて、試料中の抗原を、簡便な操作で、迅速かつ正確 に検出及び Z又は測定する蛍光相関分光法 (FCS)による抗原の迅速検出及び Z 又は測定法 (特願 2004— 166440号）に、有利に適用することができる。また、本発 明の抗原の迅速検出法は、抗原の異なるェピトープをそれぞれ標的とする蛍光標識 化された蛍光標識抗体或!、は蛍光標識抗体断片を用いた蛍光相互相関分光法 (F CCS)による抗原の検出にも適用することができる。
[0019] 以下に、本発明の FCS又は FCCSによる抗原の迅速検出法の原理について説明 する：
[0020] (FCSによる測定）
FCS測定では、共焦点光学系を用いることにより、試料中の微小領域 (直径 約 400 nm,軸長 約 2 m、体積 〜10_16L)の蛍光強度を検出することが出来る。この領 域は開放系であるため、分子が領域内を出入りし、分子数に応じた蛍光強度のゆら ぎが生じる。このゆらぎは、分子数の増加に伴い平均化されて小さくなり、分子の拡 散速度の増加に伴い速くなる。これを相関関数を使って解析し、分子の数と大きさに 関する情報を得ることが出来る。 FCS測定では、分子に関する情報を実時間で分離 精製を経ずに分析することが可能であるため、膨大な試料力 の微量な標的分子の スクリーニングが可能である。
[0021] FCSを用いた抗原検出は、蛍光標識した抗体が抗原を捕捉することによって分子 量が増し、その結果共焦点領域を通過する速度が遅延することを利用している。任 意の分子量の抗原を対象にした場合、抗原に対して異なるェピトープ部位を認識す る（1)蛍光標識抗体断片と (2)抗体を用いることが必要である（図 1)。この場合、後 記 (抗原検出法とその問題点）の項で説明するように、抗原の濃度が極めて高い場 合もまた抗原なしと同様の結果を生じ、その 3量体の濃度が低くなつて、その検出に 問題を生じる。 [0022] (FCCSによる測定）
FCCS測定では、 2種類のレーザーと 2個の検出器を用いることにより、試料中の微 小領域の 2種類の蛍光強度を検出することが出来る。この信号を相互相関関数を使 つて解析し、 2種類の信号の相関性をみることが出来る。 FCCS測定では、相互に相 関がある信号のみの解析を行うため、 FCS測定よりも約一桁高感度であることが実証 されている。 FCCSを用いた抗原検出は、抗原の分子量に関係なく（1)蛍光標識抗 体と（2)異なるェピトープ部位を認識する蛍光標識抗体を用いることが必要である（ 図 2)。この場合、後記 (抗原検出法とその問題点)の項で説明するように、 FCS測定 と同様、抗原の濃度が極めて高い場合もまた抗原なしと同様の結果を生じ、その 3量 体の濃度が低くなつて、その検出に問題を生じる。
[0023] (FCS及び FCCSを用いた抗原検出法における問題点）
試料カゝら FCSを用いて分子量の制限なく抗原を検出する場合、抗原に対して異なる ェピトープ部位を認識する（1)蛍光標識抗体断片と (2)抗体を用いる。また、 FCSよ りも高感度化が期待される FCCSを用いて抗原を検出する場合は、（1)蛍光標識抗 体と（2)異なるェピトープ部位を認識する蛍光標識抗体を用いる。どちらの場合も、 抗体および抗体断片を用いて試料中の抗原をサンドイッチ状に捕捉し、その 3量体 を検出することになる（図 1、 2)。
[0024] これらの方法を用いた場合、抗原の濃度が低 、場合は 3量体の濃度が低くなる力 抗原の濃度が極めて高い場合もまた 3量体の濃度が低くなる（図 3)。したがって、抗 原の濃度が不明である場合、擬陰性を避けるために各試料に対して多段階希釈を 行い抗原の有無を検討する必要が生じる。その結果、測定の迅速性は大幅に減少 する。
[0025] (抗原の迅速検出法の原理）
FCS及び FCCSを用いた抗原検出法における上記問題点を解決するために本発明 では次のような方法を採用する。すなわち、予め抗原と抗体断片等の解離定数 Kd値 が分かれば、 3量体の濃度が最大になる検出試薬と抗原の濃度比を導出することが 可能である。それに基づき、各試料に対して（1)検出試薬のみをカ卩える系列と、 (2) 3 量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える系列を調製する。 [0026] 検出結果に対しては、く (1)：信号なし、 (2)：信号あり〉の場合は陰性に、 < (1)： 信号あり、（2) :信号ぁり>或ぃは< (1) :信号ぁり、（2) :信号なし >の場合は陽性に 、 < (1)：信号なし、 (2)：信号なし〉の場合は陽性と判定される。本発明の方法の使 用により、試料中の任意の濃度の抗原に対して、検査に供する試料中の抗原の濃度 を適切な濃度に調整する必要、或いは、多段階的な濃度に調製する必要がなくなり 、試料中の任意の濃度の抗原に対する迅速な検出が可能になる。
[0027] 本発明の抗原の迅速検出法は、生体タンパク質試料における病原性タンパク質抗 原、特に、異常型プリオンの検出に、或いは、食品素材中に含まれる有害タンパク質 抗原の検出等に有効に使用することができる。
[0028] すなわち具体的には本発明は、 [1]検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標 識化された蛍光標識完全型抗体或!ヽは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピト ープを標的とする非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型 抗体或いは蛍光標識抗体断片とを検出試薬として用いた蛍光相関分光法又は蛍光 相互相関分光法による抗原の検出法において、（1)検出試薬のみを加える系列と、 ( 2) 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分 析を行い、該（1)及び (2)の場合における検出器からの 3量体検出信号の有無により 、検出試料中の抗原の有無を検出することを特徴とする蛍光相関分光法又は蛍光 相互相関分光法による抗原の迅速検出法や、 [2]3量体の濃度が最大になる抗原と 検出試薬の添加が、予め、蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、検出 する抗原、及び、非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識完全型抗体或いは蛍光 標識抗体断片との解離定数 Kdを求め、 3量体の濃度が最大になる検出試薬と抗原 の濃度比を設定し、該濃度比に基づいて、設定された抗原と検出試薬の添加量によ つて行われることを特徴とする上記 [1]記載の抗原の迅速検出法や、 [3]抗原の検出 法が、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識抗体断片 と、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体を用いた蛍光相 関分光法であることを特徴とする上記 [1]記載の抗原の迅速検出法からなる。
[0029] また本発明は、 [4]抗原の検出法が、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光 標識化された蛍光標識完全型抗体或!ヽは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピ トープを標的とする蛍光標識完全型抗体或!ヽは蛍光標識抗体断片とを用いた蛍光 相互相関分光法であることを特徴とする上記 [1]記載の抗原の迅速検出法や、 [5]検 出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或い は蛍光標識抗体断片が、該抗原を免疫原として作製されたモノクローナル抗体から 調製されたものであり、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型 抗体又は蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片が、検出する抗原を免疫 原として作製されたモノクローナル抗体或いは該抗体力 調製されたものであること を特徴とする上記 [1]〜[4]のいずれか記載の抗原の迅速検出法や、 [6] (1)被検試 料に、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗 体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識化 完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片 とを検出試薬として添加して、抗原抗体反応を行わせ、形成された抗原抗体 3量体を 、蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法により検出する工程、及び、（2)被検試 料に、予め 3量体の濃度が最大になる前記検出試薬と抗原の濃度比力も求めた、 3 量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加え、抗原抗体反応を行わせ、形成され た抗原抗体 3量体を、蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法により検出するェ 程とを含み、両工程における 3量体検出信号の有無を組合わせて、被検試料中の抗 原の有無を判定することを特徴とする蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法に よる抗原の迅速検出法からなる。
さらに本発明は、 [7]被検試料が、生体タンパク質試料であり、検出する抗原が病原 性タンパク質抗原であることを特徴とする上記 [6]記載の抗原の迅速検出法や、 [8]病 原性タンパク質抗原が、異常型プリオンであることを特徴とする上記 [7]記載の抗原の 迅速検出法や、 [9]被検試料が、食品素材であり、検出する抗原が食品素材中に含 まれる有害タンパク質抗原であることを特徴とする上記 [6]記載の抗原の迅速検出法 や、 [10]蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法による抗原の検出が、被検試料 に含まれる抗原の物理的な分離過程を経ることなく行われることを特徴とする上記 [6] 〜[9]の 、ずれか記載の抗原の迅速検出法や、 [11] (1)検出する抗原のェピトープ を標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、 該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型抗体又は蛍光標識化さ れた蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片とからなる検出試薬、及び、 (2) 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬とを装備した、蛍光相関分光法又は蛍光 相互相関分光法による抗原の迅速検出用キットからなる。
図面の簡単な説明
[0031] [図 1]本発明の FCSを用いた抗原の迅速検出法の説明において、蛍光標識抗体断 片と非蛍光標識化完全型抗体と抗原とで、 3量体を形成した場合の模式図である。
[図 2]本発明の FCCSを用いた抗原の迅速検出法の説明において、蛍光標識抗体と 蛍光標識抗体と抗原とで、 3量体を形成した場合の模式図である。
[図 3]本発明の FCS及び FCCSを用いた抗原の迅速検出法の説明において、抗原 の濃度が低い場合、或いは、抗原の濃度が極めて高い場合に、抗体と抗原とで、 3 量体を形成する状況について説明した模式図である。
[図 4]本発明の実施例において、各濃度の抗原に対して（1)検出試薬のみを加えた 系列と、（2)検出試薬と適量の抗原を加えた系列を調製して、抗体と抗原との 3量体 を検出し、抗原に対しての陰性又は陽性を判定した結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0032] 本発明の蛍光相関分光法 (FCS)又は蛍光相互相関分光法 (FCCS)による抗原 の迅速検出法は、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標 識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非 蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標 識抗体断片とを検出試薬として用いた蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法に よる抗原の検出法において、（1)検出試薬のみを加える系列と、（2) 3量体の濃度が 最大になる抗原と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（1) 及び (2)の場合における検出器力 の 3量体検出信号の有無により、検出試料中の 抗原の有無を検出することからなる。
[0033] 本発明において、 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬の添加は、予め、蛍 光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、検出する抗原、及び、非蛍光標識 化完全型抗体又は蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片との解離定数 Kd を求め、 3量体の濃度が最大になる検出試薬と抗原の濃度比を設定し、該濃度比に 基づいて、設定された抗原と検出試薬の添加量によって行うことができる。
[0034] すなわち、本発明を実施するには、予め、蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗 体断片と、検出する抗原、及び、非蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識完全型抗 体或いは蛍光標識抗体断片との解離定数 Kdを求め、 3量体の濃度が最大になる検 出試薬と抗原の濃度比を設定し、該濃度比に基づいて、設定された抗原と検出試薬 の添加量によって、（1)検出試薬のみを加える系列と、（2) 3量体の濃度が最大にな る抗原と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（1)及び (2)の 場合における検出器からの 3量体検出信号の有無により、検出試料中の抗原の有無 を検出することによって行うことができる。
[0035] (3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える系列の調製）
予め、濃度既知の抗原、例えば、組換え牛プリオンタンパク質を用いた滴定曲線から 、 3量体の濃度が最大となる抗原の濃度を求め、この濃度の抗原を加えた（2)検出試 薬と抗原を加えた系列と、抗原を加えない（1)検出試薬のみを加えた系列を調製し、 濃度未知の試料中の抗原の有無を検出する。
[0036] (抗タンパク質抗体の調製）
本発明においては、検出試薬として用いる蛍光標識抗体、蛍光標識抗体断片及び 非蛍光標識化完全型抗体を調製するために、抗原に特異的に結合する抗体を調製 する。本発明において用いられる、抗原に特異的に結合する抗体としては、ポリクロ ーナル抗体及びモノクローナル抗体等を挙げることができる力 その中でもモノクロ ーナル抗体がその特異性の点でより好まし 、。力かる抗原に対する抗体を調製する には、まず、検出する抗原を精製し、取得する。該抗原は、公知の精製手段を用いて 供与源力ゝら単離'精製して調製することができ、また、抗原が抗原タンパク質で該抗 原タンパク質のアミノ酸配列が公知であれば、遺伝子工学的手法により、微生物や 動物細胞等を用いて該抗原タンパク質を産生させ、精製して取得することもできる。 可能な場合は、該抗原タンパク質を、ペプチドの化学合成法により調製することがで きる。ペプチドの化学合成は公知の合成手段を採用することができる。例えば、アジ ド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、 DCC法、活性ヱステル法、力 ルポイミダゾール法、酸化還元法等が挙げられる。
[0037] 該抗原に対する抗体を調製するには、該抗原を用い、慣用のプロトコールを用いて 、動物又は植物に感作させ、調製する。例えばモノクローナル抗体の調製には、連 続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイプリドーマ法 (Nature 256, 495-497, 1975)、トリオ一マ法、ヒト B細胞ハイプリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983)及び EBV—ハイプリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCE R THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985)など任意の方法を用いることができ る。
[0038] 抗原タンパク質のような抗原のモノクローナル抗体を調製するには、例えば、該抗 原タンパク質を抗原として、ラット、マウス、ゥサギなどの哺乳動物に投与し、感作する 。必要に応じてフロイント完全アジュバント (FCA)、フロイント不完全アジュバント (FIA )等のアジュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注 入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間 隔で、 1〜10回の免疫を行う。そして、最終の免疫日から 1〜60日後に抗体産生細 胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が 挙げられる。ノ、イブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合 を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、一般に入手可能な株化細 胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の 状態では HAT選択培地 (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存でき ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。
[0039] 細胞融合処理後の細胞から目的とするハイプリドーマを選別する。榭立したハイブ リドーマ力 モノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水 形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要 とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ァフィ-ティ 一クロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせるこ とにより精製することができる。
本発明においては、本発明において用いる抗原タンパク質の抗体としては、上記の ようにして調製されるものの他、既に調製されている市販の抗体がある場合には、該 抗体を用いることができる。
[0040] (蛍光標識抗体及び蛍光標識抗体断片の調製）
本発明の抗原の迅速検出法においては、抗原と抗原抗体反応を行い検出するため の検出試薬として、該抗原から調製された蛍光標識抗体及び蛍光標識抗体断片が 用いられる。本発明において、蛍光標識抗体及び蛍光標識抗体断片の調製に用い られる抗体は、同じく本発明にお 、て用いられる非蛍光標識ィ匕完全型抗体又は蛍光 標識抗体或いは蛍光標識抗体断片とはその結合する抗原のェピトープが異なる抗 体が選択される。該蛍光標識抗体又は蛍光標識抗体断片の調製には、抗原の完全 型抗体或いは完全型抗体をペプシンやパパインのような酵素で断片化し、これを 2— メルカプトメチルァミン或いは 2—メルカプトエタノール等で還元して単量体とした後、 標識化して調製する。該標識ィ匕には、蛍光色素が用いられ、例えばフルォレセインィ ソチオシァネート (FITC)、 Alexa532のような蛍光色素が用いられる。
[0041] (FCSによる検出、測定）
本発明の抗原の迅速検出及び Z又は測定法においては、被検試料に、検出試薬と して蛍光標識抗体断片及び非蛍光標識化完全型抗体を添加し、混合して、抗原抗 体反応を行った被検試料を、 FCSにより抗原の検出及び Z又は測定を行う。 FCSは 、溶液中の蛍光分子のブラウン運動を利用し、分子の「大きさ」や「数」といった物理 量を得る方法である。 FCSの特徴は、溶液に含まれる蛍光分子の濃度や分子間相 互作用を物理的な分離過程を経ずにほぼ実時間でモニタできることにある。そのた め、 FCSを用いた検出系では、これまで主流となっていた生体分子検出系（例えば E LISAなど）で必要であった煩雑な BoundZFree分離過程を省くことができる。従って 、短時間に多量のサンプルを高感度に、かつ自動的に測定することが可能となる。 F CSは、各種のものが知られている力 本発明においては、本発明の検出、測定対象 の検出、測定のために障害となることがない限り、いずれの方法も用いることができる (蛋白質 核酸 酵素、 Vol. 44、 No.9、 1431— 1438、 1999 ;バイオインダストリ一 4月 号、 p. 52-59、 2003 ;特開 2001— 272404号公報；特許第 3517241号公報）。
[0042] (FCCSによる検出、測定）
FCCSは、各種のものが知られている力 本発明においては、本発明の検出、測定 対象の検出、測定のために障害となることがない限り、いずれの方法も用いることが でさる (Biophysical Journal, 72,1878— 188り, 1997 ;し urrent Pharmaceutical Biotechnol ogy, 5, 199-204,2004； Biochem. Biophys. Res. Comm., 329, 1200-1207, 2005 ;特表 2001— 517800号公報）。
[0043] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0044] (材料と方法）
FCS及び FCCS測定用装置として、 MF20 (ォリンパス社製)を用いた。測定用のプ レートは、 N101 (日本油脂）でブロッキング処理した 384穴プレート（ォリンパス社製） を用いた。検出用試薬は、 Alexa488—抗プリオン抗体（1.0E- 10M)、 Alexa
633—抗プリオン抗体（1.0E-10M)を用いた。抗原は、組換え牛プリオン蛋白質を用 いた。各濃度の抗原に対して（1)検出試薬のみを加えた系列と、（2)検出試薬と適 量の抗原を加えた系列を調製した。
[0045] (検出試薬と適量の抗原を加えた系列の調製）
「（1)検出試薬のみを加えた系列」から、 3量体の濃度が最大となる抗原の濃度が約 4. 8nMと求められ、この濃度になるように抗原と検出試薬を試料にカ卩え、「（2)検出 試薬と抗原を加えた系列」として調製した。
[0046] (抗原の検出）
各濃度の抗原に対して（1)検出試薬のみを加えた系列と、（2)検出試薬と適量の抗 原を加えた系列を調製した。検出試薬と抗原を所定の濃度になるようにプレートに入 れた後、ピペットで攪拌した。 37°Cで 1時間放置した後、レーザーパワーを 488nmは 100 W、 633nmは 100 Wとして、 60秒間の 3回測定を行った。解析は、 MF20 付属のソフトフェアを用いて、分子数をはじめとする各種パラメータを導 ヽた。
[0047] (結果）
結果を、図 4に示す。図 4中のグラフの横軸は抗原濃度を示し、縦軸は全蛍光分子に 対する 3量体の割合を示している。現在、 FCCSでの検出限界値は約 5 X 10_1°Mで あるため、プリオン蛋白質の濃度が 5 X 10_1 M以下の試料を陰性と仮定している。 また、陰性コントロールの信号強度に基づき、本データでは約 2%以下を信号なしと している。新たに所定量の抗原を加えてない場合は [図中の（-) PrP]、抗原濃度が 1 〜： LOnMのときは、抗原と 2種類の標識抗体の分子数が等しいため、 3量体の割合が 高くなつている（図 4、黒色点)。しかし、抗原の濃度が低い場合は 3量体の割合が低 くなり、抗原の濃度が高い場合もまた 3量体の割合が低くなる（図 4、黒色点)。したが つて、抗原の濃度が高い場合も、陰性と判定される。
[0048] 一方、 3量体の割合が最大となる濃度の抗原をあら力じめ加えておいた場合は [図 中の (+) PrP]、抗原の濃度が低い場合は 3量体の割合が高くなり、抗原の濃度が高 い場合は 3量体の割合が低くなる（図 4、灰色点)。この場合には、抗原の濃度が高い 場合を真の陰性と区別できる。したがって、各試料に対して（1)検出試薬のみを加え る系列と、 (2) 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加える系列を組み合わ せれば、陰陽を分別可能である。つまり、 < (1)：信号なし、 (2)：信号あり〉の場合は 陰性、く (1)：信号あり、 (2)：信号あり〉あるいはく (1)：信号あり、 (2)：信号なし > の場合は陽性、 < (1)：信号なし、（2)：信号なし〉の場合は陽性、と判定可能である 産業上の利用分野
[0049] 最近、異常型プリオンタンパク質等の病原性タンパク質や有害タンパク質などの検 出が、社会的に要請されている。変性剤処理した異常型プリオン蛋白質を検出する 方法として、現在、ゥヱスタンプロット法や ELISA法などが使用されている力 ウェス タンプロット法では煩雑で時間の力かる電気泳動を行わなければならず、また、 ELA IS A法ではシグナル増幅や洗浄操作を必要とする。そこで、 FCS及び FCCS〖こよる 抗原検出は、関連する分野で行われている抗原検出方法と比べてステップ数が少な いため迅速であり、自動化に適している。また、測定のための試料体積は数 1〜数 十 1であることから、検出試薬が少なく経済的である。したがって、 FCS及び FCCS による抗原検出法を、病原性タンパク質抗原や有害タンパク質の検出に用いることは 極めて効果的である。
[0050] し力しながら、 FCS及び FCCSによる抗原検出法を用いて濃度不明の試料カも抗 原を検出する場合、擬陰性を避けるために、検査に供する試料中の抗原の濃度を適 切な濃度にするか、或いは、各試料に対して多段階的な濃度に調整する必要があり 、多段階希釈を行う必要があった。その結果として、測定の迅速性は大幅に減少した 。そこで、本発明の検出法は、この問題を解決し、濃度不明の試料に対し、多段階希 釈法を行うことなぐ FCS及び FCCSによる迅速検出法を可能とした。本発明の検出 法は、ステップ数が少なぐ迅速、簡便な検査法であり、全自動化システムへの適用 が可能であり、現在、社会問題ィ匕している牛海綿状脳症 (BSE)の検査をはじめ、抗 原抗体反応に基づく食品、医薬品、化粧品などの検査への適用が期待できるもので ある。

Claims

請求の範囲
[1] 検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或 いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識化完全 型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片とを 検出試薬として用いた蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法による抗原の検出 法において、（1)検出試薬のみを加える系列と、（2) 3量体の濃度が最大になる抗原 と検出試薬を加える系列を調製して、蛍光分光分析を行い、該（1)及び (2)の場合 における検出器からの 3量体検出信号の有無により、検出試料中の抗原の有無を検 出することを特徴とする蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法による抗原の迅 速検出法。
[2] 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬の添加が、予め、蛍光標識完全型抗体 或いは蛍光標識抗体断片と、検出する抗原、及び、非蛍光標識化完全型抗体又は 蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片との解離定数 Kdを求め、 3量体の 濃度が最大になる検出試薬と抗原の濃度比を設定し、該濃度比に基づいて、設定さ れた抗原と検出試薬の添加量によって行われることを特徴とする請求項 1記載の抗 原の迅速検出法。
[3] 抗原の検出法が、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標 識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識化完全型抗体を用 いた蛍光相関分光法であることを特徴とする請求項 1記載の抗原の迅速検出法。
[4] 抗原の検出法が、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標 識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする蛍 光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片とを用いた蛍光相互相関分光法である ことを特徴とする請求項 1記載の抗原の迅速検出法。
[5] 検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或 いは蛍光標識抗体断片が、該抗原を免疫原として作製されたモノクローナル抗体か ら調製されたものであり、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識ィ匕完全型 抗体又は蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片が、検出する抗原を免疫 原として作製されたモノクローナル抗体或いは該抗体力 調製されたものであること を特徴とする請求項 1〜4のいずれか記載の抗原の迅速検出法。
[6] (1)被検試料に、検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標 識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非 蛍光標識化完全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標 識抗体断片とを検出試薬として添加して、抗原抗体反応を行わせ、形成された抗原 抗体 3量体を、蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法により検出する工程、及び 、（2)被検試料に、予め 3量体の濃度が最大になる前記検出試薬と抗原の濃度比か ら求めた、 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬を加え、抗原抗体反応を行わ せ、形成された抗原抗体 3量体を、蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法により 検出する工程とを含み、両工程における 3量体検出信号の有無を組合わせて、被検 試料中の抗原の有無を判定することを特徴とする蛍光相関分光法又は蛍光相互相 関分光法による抗原の迅速検出法。
[7] 被検試料が、生体タンパク質試料であり、検出する抗原が病原性タンパク質抗原で あることを特徴とする請求項 6記載の抗原の迅速検出法。
[8] 病原性タンパク質抗原が、異常型プリオンであることを特徴とする請求項 7記載の抗 原の迅速検出法。
[9] 被検試料が、食品素材であり、検出する抗原が食品素材中に含まれる有害タンパク 質抗原であることを特徴とする請求項 6記載の抗原の迅速検出法。
[10] 蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法による抗原の検出が、被検試料に含まれ る抗原の物理的な分離過程を経ることなく行われることを特徴とする請求項 6〜9の V、ずれか記載の抗原の迅速検出法。
[11] (1)検出する抗原のェピトープを標的とする蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体 或いは蛍光標識抗体断片と、該抗原の他のェピトープを標的とする非蛍光標識化完 全型抗体又は蛍光標識化された蛍光標識完全型抗体或いは蛍光標識抗体断片と からなる検出試薬、及び、（2) 3量体の濃度が最大になる抗原と検出試薬とを装備し た、蛍光相関分光法又は蛍光相互相関分光法による抗原の迅速検出用キット。
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