KR20130121550A - 티로신 수산화효소 검출용 센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자; 및 (b) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자를 포함하는 티로신 수산화효소 검출용 센서에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명은 티로신 수산화효소 검출용 센서는 최초의 신경전달-관련 효소 검출용 센서이이며, 0.2 ng/㎖ 미만의 티로신 수산화효소도 검출할 수 있는 고도의 민감성을 제공한다. 따라서, 본 발명의 티로신 수산화효소 검출용 센서는 신속하고 용이하게 티로신 수산화효소를 검출하여 파킨슨씨 질병과 같은 신경질환을 조기에 진단할 수 있다.

Description

티로신 수산화효소 검출용 센서{Sensor for Detecting of Tyrosine Hydroxylase}

본 발명은 티로신 수산화효소 검출용 센서에 관한 것이다.

티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase; TH)는 중추신경계 및 말초신경계에서 카테콜아민의 합성경로 중 첫 번째 효소이면서 속도조절효소이다.¹ 티로신 수산화효소는 흑색질, 복측피개영역, 시상하부, 후 신경구의 도파민성 뉴런 및 청반 및 외측피개의 비아드레날린성 뉴런 및 뇌간의 아드레날린성 뉴런에서 발현된다.² 장력부전운동 및 탄도 운동과 관련된 심한 축성 저혈압 및 운동기능 감퇴증을 갖는 어린이에서 뇌척수액 신경전달물질 및 DNA 분석 후 티로신 수산화효소의 결핍으로 진단한다.² 혈청 내 티로신 수산화효소 농도는 매우 낮다(0.01-1 μM).³ 따라서, 파킨슨씨 질환의 분자적 진단, 치료법의 구상 및 약물 효능의 평가에 있어 티로신 수산화효소의 정확한 확인이 요구된다.⁴ 형광분석형광법, 크로마토그래피 및 RT-PCR 기술과 같은 단일의 세포로부터 티로신 수산화효소의 방출을 검출하기 위한 다양한 방법이 개발되었다.^5-7 티로신 수산화효소의 방출은 신속하게 이뤄지므로 티로신 수산화효소의 방출을 검출하기 위해서는 고도의 공간적/시간적 해결이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 저농도의 티로신 수산화효소를 검출할 수 있는 센서를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 티로신 수산화효소에 대한 항체가 결합된 자성입자 및 바코드 DNA와 상기 티로신 수산화효소에 대한 다른 에피토프를 갖는 항체가 결합한 금 나노입자를 이용하는 경우, 상기 자성입자 및 금 나노입자와 티로신 수산화효소가 복합체를 형성하고 상기 복합체의 바코드 DNA를 분리하여 유전자증폭 방법을 실시하여, 고도의 민감도를 갖는 티로신 수산화효소 검출용 센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 티로신 검출용 센서를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 신경전달-관련 물질의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 티로신 수산화효소 검출용 센서를 제공한다:

(a) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자; 및

(b) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자.

본 발명자들은 저농도의 티로신 수산화효소를 검출할 수 있는 센서를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 티로신 수산화효소에 대한 항체가 결합된 자성입자 및 바코드 DNA와 상기 티로신 수산화효소에 대한 다른 에피토프를 갖는 항체가 결합한 금 나노입자를 이용하는 경우, 상기 자성입자 및 금 나노입자와 티로신 수산화효소가 복합체를 형성하고 상기 복합체의 바코드 DNA를 분리하여 유전자증폭 방법을 실시하여, 고도의 민감도를 갖는 티로신 수산화효소 검출용 센서를 개발하였다.

본 발명의 티로신 수산화효소 검출용 센서는 (a) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자; 및 (b) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자로 구성된다.

본 명세서에서, 상기 티로신 수산화효소는 아미노산 L-티로신을 L-3,4-디히드록시페닐알라닌(L-3,4-dehydroxyphenylalanine; L-DOPA)로 전환하는 반응을 촉매한다. 상기 L-3,4-디히드록시페닐알라닌은 노르아드레날린(노르에피네프린) 및 아드레날린(에피네프린)의 전구체인 도파민의 전구체이며, 반응식은 다음과 같다:

본 발명의 주요한 구성 중 하나는 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자이다. 상기 자성입자는 티로신 수산화효소과 특이적으로 결합하는 제1항체가 결합된 형태이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 항체는 티로신 수산화효소에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 본 발명의 티로신 수산화효소에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 시르투인 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자를 제조하기 위해, 자성입자와 항체를 결합하기 위한 반응을 실시한다.

본 발명의 주요한 구성 중 하나는 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자이다. 상기 제2항체는 제1항체와 티로신 수산화효소에 대하여 특이적으로 결합하며, 상기 제1항체 및 제2항체가 결합하는 티로신 수산화효소의 에피토프(epitope)는 상이하다.

바람직하게는, 상기 제1올리고뉴클레오타이드는 티올기를 통하여 금 나노입자에 직접 결합한다.

본 발명의 금 나노입자는 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있다.

상기 제1올리고뉴클레오타이드 및 바코드 DNA의 서열은 티로신 수산화효소의 핵산서열에 기초하여 디자인된 1-100개의 염기로 구성된 핵산서열로, 바람직하게는 상기 제1올리고뉴클레오타이드의 서열은 서열목록 제1서열이고, 바코드 DNA의 서열은 서열목록 제2서열이다. 상기 바코드 DNA는 제1올리고뉴클레오타이드와 상보적(complementary) 서열이다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 상기 언급된 서열 이외에 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio . 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl. BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제2항체, 제1올리고뉴클레오타이드 및 금 나노입자를 결합반응한 이후에 상기 제1올리고뉴클레오타이드와 바코드 DNA의 혼성화를 진행한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 티로신 수산화효소 검출방법을 제공한다:

(a) (i) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자 및 (ii) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 자성을 인가(apply)하여 자성입자-티로신 수산화효소-금 나노입자 복합체를 분리하는 단계;

(c) 상기 복합체로부터 바코드 DNA-결합된 금 나노입자를 분리하는 단계;

(d) 상기 분리된 금 나노입자를 가열하여 바코드 DNA를 분리하는 단계; 및

(e) 상기 바코드 DNA을 유전자증폭 방법을 실시하여 분석하는 단계.

본 발명의 방법은 상기 티로신 수산화효소 검출용 센서를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 티로신 수사화효소 검출방법에 적용될 수 있는 시료는 세포생물학적 및 임상학적 시료를 모두 포함한다.

본 발명의 상기 자성입자-티로신 수산화효소-금 나노입자 복합체로부터 바코드 DNA-결합된 금 나노입자를 분리하기 위해, 세린 프로테아제(Serine proteases, 예컨대, 프로테아제 K), 트레오닌 프로테아제(Threonine proteases), 시스테인 프로테아제(Cysteine proteases), 아스파테이트(Aspartate proteases), 메탈로프로테아제(Metalloproteases) 또는 글루탐산 프로테아제(Glutamic acid proteases)를 처리하여 실시할 수 있으며, 바람직하게는, 프로테아제(protease) K를 처리하여 실시한다.

상기 바코드 DNA-결합된 금 나노입자의 바코드 DNA를 분석하기 위해 유전자 증폭 방법을 실시한다.

본 발명이 유전자 증폭 방법으로 실시되는 경우, 바람직하게는 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 명세서에 기재된 용어“증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

본 발명의 방법에 따른 티로신 수산화효소을 확인하기 위해, 바람직하게는, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 티로신 수산화효소을 검출한다.

상기 티로신 수산화효소는 파킨슨씨 질병의 주요한 마커로, 본 발명의 검출용 센서 또는 검출방법을 이용하는 경우, 파킨슨씨 질환을 조기에 진단할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 티로신 수산화효소 검출용 센서를 제공한다.

(b) 본 발명의 티로신 수산화효소 검출용 센서는 최초의 신경전달-관련 효소 검출용 센서이다.

(c) 본 발명의 티로신 수산화효소 검출용 센서는 0.2 ng/㎖ 미만의 티로신 수산화효소도 검출할 수 있는 고도의 민감성을 제공한다.

(d) 본 발명의 티로신 수산화효소 검출용 센서는 신속하고 용이하게 티로신 수산화효소를 검출하여 파킨슨씨 질병과 같은 신경질환을 조기에 진단할 수 있다.

도 1은 표면 고정화 바이오-바코드 분석법의 과정을 도식화하여 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 항-티로신 수산화효소 항체가 결합된 금 나노입자를 확인한 결과를 나타낸다. 도 2a는 항-티로신 수산화효소 항체가 결합된 금 나노입자의 SEM(Scanning Electron Microscopy) 이미지를 보여주고, 도 2b는 항-티로신 수산화효소 항체와 금 나노입자의 친화성을 보여준다.
도 3은 티로신 수산화효소 검출을 확인하기 위한 RT-PCR 산물의 아가로즈 젤 전기영동 이미지를 보여준다. 1열은 음성대조군, 2열은 0.156 ng/㎖, 3열은 0.312 ng/㎖, 4열은 0.625 ng/㎖, 5열은 1.25 ng/㎖, 6열은 2.5 ng/㎖, 7열은 5 ng/㎖, 8열은 10 ng/㎖, 9열은 알부민(비 특이적 단백질) 및 10열은 DNA 마커를 나타낸다. 모든 PCR 산물은 35 사이클로 PCR을 실시한 결과이며, 20 ㎕의 PCR 산물을 2% 아가로즈 젤에 전기영동하여 이티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)로 가시화하였다.
도 4a 및 도 4b는 도파민성 세포에서 검출한 티로신 수산화효소의 RT-PCR 결과를 보여준다. 도 4a는 도파민성 세포의 세포질에서 발현하는 티로신 수산화효소를 나타내고, 도 4b는 바이오-바코드 분석법을 이용하여 도파민성 세포의 티로신 수산화효소를 검출한 결과를 보여준다. 1열은 음성대조군, 2열은 도파민성 세포의 결과이며, 3열은 DNA 마커를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

DNA 올리고뉴클레오타이드, 바코드 DNA 및 PCR 프라이머

티오-캡핑된 올리고 뉴클레오타이드 및 바코드 DNA의 서열은 각각 5'-TTT GGG GAA CAC CGT GGA GGG GCA TAG CAT CTC-(A)₁₀-(CH₂)₃-SH-3' 및 5'-GAG ATG CTA TGC CCC TCC ACG GTG TTC CCC -3'이다. 정방향(5'-GAT GGA TGC CTC ATT GGG G-3') 프라이머 및 역방향 프라이머(5'-GCA GCT CCA GGC CCC CCA GC-3')를 이용하여 바이오-바코드 DNA(합성의뢰; 바이오니어, 대한민국)를 증폭하였다.

자성 프로브 준비

토실-활성형 자성 미세입자(Tosyl-activated magnetic microparticles, MyOne™ Dynabeads; 인비트로젠, 미국)을 래빗 폴리클로날 항체(abcam, 미국) 혼합물로 기능화 하였다. 간략하게, 10 ㎕ 티로신 수산화효소 폴리클로날 항체, 20 ㎕ 자성 미세입자, 84 ㎕ 3 M(NH₄)₂SO₄ 및 66 ㎕ 붕산염 버퍼를 0.2 ㎖ PCT 튜브에 조합하여 넣고 37℃에서 24시간 동안 1400 진동/분으로 반응하였다. 반응 후, 미세입자를 자성으로 분리하였다. 미세입자의 활성부위를 블로킹하기 위해 0.5% 소 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin; BSA) 및 0.05% 트윈20을 포함하는 pH 7.4의 PBS(Phosphate Buffered Saline)을 블로킹 버퍼로 제조하여 250 ㎕을 미세입자에 첨가하고 37℃에서 24시간동안 반응하였다. 반응 후, 미세입자를 다시 자성으로 분리하여 자성-프로브 용액(0.1% 소 혈청 알부민, 0.05% 트윈20을 포함하는 pH 7.4 PBS) 1 ㎖로 2회 세척하였다.

기능화된 금 프로브의 준비

당업계에 공지된 원-스텝 방법으로 항-티로신 수산화효소 항체 및 티올-캡핑된 올리고뉴클레오타이드를 금 나노입자에 결합하였다.¹¹ 항체- 및 티올-캡핑된 올리코뉴클레오타이드-결합 금 나노입자를 4 ㎖ PBS에 현탁하였다. 여기에 바이오-바코드 DNA 0.8 OD(Optical Density)를 첨가하여 4시간 동안 혼성화 하였다. 반응액을 4℃에서 원심분리(13,000×g, 30분)하고 완성된 티로신 수산화효소-나노입자-dsDNA 복합체를 NaCl(0.15 M)/PBS(0.01 M)에 현탁하여 4℃에 보관하였다. 항-티로신 수산화효소 및 DNA-결합 금 나노입자를 UV-가시 분광광도계를 이용하여 검출하였다. 금 나노입자 표면의 항체 활성은 ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 측정하였고 금 나노입자 상의 올리고뉴클레오타이드는 RT-PCR를 실시하여 검출하였다.

티로신 수산화효소의 포획

자성 면역프로브/티로신 수산화효소/금 면역프로브의 샌드위치 면역분석법을 수행하고 DNA 바이오-바코드를 자성 분리 및 열 혼성화를 실시하였다. 공지된 방법을 수정하여 기질 유전자에 대한 RT-PCR에 의해 티로신 수산화효소를 검출하였다.11 수득한 RT-PCR 산물을 2% 아가로즈 젤 전기영동을 실시하여 분석하였다.

세포 배양

SH-SY5Y 세포를 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS) 및 5% 항생제를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37℃의 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

결과 및 토론

항-티로신 수산화효소 항체의 결합

표적 항원을 인식하는 각 항체(폴리클로날)로 기능화된 60 ㎚ 금 나노입자 프로브를 바코드 분석에 이용하였다(도 1). 각 바코드 중 절반은 표적-리포팅 올리고뉴클레오타이드 프로브이고, 나머지 절반은 유니버설 서열이다. 금 프로브에 의해 인식되는 표적 항원의 에피토프와 상이한 에피토프에 대한 특이적인 모노클로날 항체를 자성 나노입자에 결합하고 표적 항원을 포획한다.¹² 표적-자성 나노입자 프로브 복합체는 자성 나노입자 프로브와 다른 영역에 결합하는 항체를 갖는 금 나노입자 프로브에 의해 샌드위치 형태가 된다(도 1). 이러한 복합체를 자성으로 분리하고 세척한다. 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 첨가하여 유도된 리간드 교환과정에 의해 바코드 가닥이 방출된다. 바이오-바코드 가닥을 RT-PCR법으로 확인한다. 금 나노입자 프로브는 항체 및 바코드 DNA 가닥(43 bp/입자)의 검출로 기능화된다. 금 나노입자 프로브를 0.8 OD의 농도로 저장하고 초과 바코드 DNA는 0.15 NaCl, 0.025% 트윈20, 0.1% BSA 및 10 mM 인산버퍼(pH 7.4) 용액으로 제거하였다.

고정화된 금 콜로이드성 나노입자의 SEM(Scanning Electron Microscopy) 이미지를 도 2a에 나타내었다. 입자의 평균 직경은 약 60 ㎚이다. 1차원적 패턴으로 무작위 분포된 근접한 금 나노입자는 서로 자기-조립하였다.¹³

티로신 수산화효소의 첨가 후, 고정화된 금 콜로이드성 나노입자의 UV-VIS(UltravioletVisible) 흡수 스펙트럼을 도 2b에 금 크기에 따라 나타내었다. 5 내지 100 ㎚ 범위의 크기를 갖는 금 나노입자는 면역 후 결합 친화성이 증가하고 60 ㎚ 금 나노입자가 최고의 친화성을 갖는 것을 보여준다. 50 및 60 ㎚의 직경을 갖는 금 나노입자로 제조한 결합체에 대한 결합 활성을 조사하였다. 항체 반응은 결합된 나노입자의 면역성을 결정하는 중요한 요소이다.

바코드 프로브를 이용한 티로신 수산화효소의 검출

DNA 바코드-기반 면역분석의 반응을 제한하는 많은 요소가 있다. 이러한 요소는 입자 또는 항체의 유형, 화학적 부착, 제거 및 세척 단계의 유효성 등을 포함한다. 이 가운데 면역프로브의 표적 분석물로의 면역학적 친화성이 가장 중요한 요소이다. 0.156 ng/㎖ 내지 10 ng/㎖ 범위의 모든 표적 농도는 음성 대조군(0 ng/㎖)과 용이하게 구별되었다. RT-PCR 상의 밴드 이미지는 농도 범위에 대해 표적 농도 및 진하기 간의 선형 관계를 보여준다.

자성 나노입자 면역프로브를 0.156 ng/㎖ 티로신 수산화효소와 반응하였다. 반응 후, 시료에 프로테아제 K를 처리하고 DNA 용리 키트를 이용하여 바코드 DNA를 분리하였다. 최종적으로, RT-PCR을 위해 50 ㎕ DNA-프리 워터를 첨가하여 DNA를 용해하였다. 도 4는 RT-PCR 산물의 젤 전기영동 이미지를 나타낸다. 면역분석 시, 세척 단계가 적절히 수행되지 않은 경우 허위음성결과를 나타내게 된다.

바코드 분석을 이용한 SH - SY -5Y 세포에서 티로신 수산화효소의 검출

신경세포 모델로부터 신경전달물질의 방출을 조사하기 위해, 티로신 수산화효소에 형광염료를 합성하였다. 면역형광 염색법으로 티로신 수산화효소의 표현형을 확인하였다(도 4a). 티로신 수산화효소의 발현은 SH-SY 5Y 세포의 세포질 부분에서 관찰되었다.

도 4b에서 확인할 수 있듯이, SH-SY 5Y 세포 추출물에 RIPA(RadioImmunoPrecipitation Assay) 단백질 용해 버퍼를 처리하였다. SH-SY 5Y 세포에서 바이오-바코드 분석법을 이용하여 10 nM 티로신 수산화효소 농도에서도 검출되는 결과를 보여주었다. 면역 프로브가 도파민성 세포로부터 분비되는 티로신 수산화효소를 포획할 수 있는지 확인하고자 하였다. 이를 확인하기 위해, 면역프로브의 유용성을 입증하기 위한 간단한 접근법으로 종래의 RT-PCR을 이용하였다. 이는 비드 및 티로신 수산화효소의 비-특이적 상호작용 또는 미세비드의 블로킹 효과를 때문이다. 면역프로브의 다른 카테콜아민과의 -특이적 상호작용은 면역프로브의 특이성을 평가하는데 중요하다. 임상에의 적용 가능성을 조사하기 위해, 회복실험을 실시하였다. 1×10⁶ 세포/㎖의 SH-SY 5Y 세포로부터 유래한 추출물의 티로신 수산화효소의 회복은 94.6% 내지 102% 이다.

결론

본 발명에서, 소량의 티로신 수산화효소를 검출하기 위해 면역흡착 바이오-바코드 분석에 항체 및 dsDNA를 갖는 금 나노입자의 이중-조작을 적용하였다. 이중-조작 금 나노입자를 UV-VIS 분광 광도계로 확인하고 항-도파민 및 올리고뉴클레오타이드를 결합하여 RT-PCR로 확인하였다. 이러한 실험은 조작된 금 나노입자가 우수한 안정성 및 반응성, 및 그 천연 대생물 활성을 유지하는 구체적인 증거를 제시한다, 조작된 금 나노입자를 사용하는 면역흡착 바이오-바코드 분석은 0.156 ng/㎖ 수준의 저농도의 티로신 수산화효소도 검출할 수 있는 고도의 민감성을 갖는다. 또한, 항체 및 올리고뉴클레오타이드의 분자비, 혼성화 온도 또는 실시간 PCR을 사용하여 최적화하면 민감도를 향상시킬 수 있다. 따라서, 면역흡착 바이오-바코드 분석법은 도파민성 세포 내의 티로신 수산화효소를 검출하기 위한 고속대량 스크리닝 방법이다.

참고문헌

1. J Mallet Tyrosine hydroxylase from cloning to neuropsychiatric disorderstes Brain Res Bull . 50, 381 (1999)

2. S.C. Daubner, T. Le, S and S. Wang Tyrosine hydroxylase and regulation of dopamine synthesis, Archives of Biochem . Biophy , 508,1 (2011)

3. E Oliverira, C. R. Pinheiro, A. P Santos-Silva, IH Trevensoli, Y Areu-Villaca, JF Nogueira Neta, AM Reis, M C F Passos, E G Moura and P C Lisbora, Nicotine exposure affects mothers and pops nutritional, biochemical and hormonal profiles during lactation in rats. J. Endocrinology , 205, 159 (2010)

4. W Yeung, V CN Wong, K Chan, J. Hui, C Hung E Yau, C Ko, C lam , C. M. Mak, S. Siu and L Low expanding Phenotype and Clinical analysis of trosine hydroxylase defiency , J Child Neurology 26, 179 (2011)

5.T Nagatsu and T Yamamoto, Flurescence Assay of tyrosine hydroxylase activity in tissues homegrnate, Cellular and molecular life Science 24, 1183 (1968)

6. T. Lloyd and M A Walega, Purification of tyrosine hydroxylase by high pressure liquid chromatography, Analy .l biochem, 116, 559 (1981)

7. ST Lee, YL Suh, Y Ko, C Ki, K W Sung, H Kim, J Kim, S Kim, H Chueh, S H Lee, K H Yoo, H H Koo, measure of tyrosine hydroxylase transcripts in bone marrow using biopsied tissue instread of aspirates for neuroblastoma, Pediatr Blood Cancer 55, 273 (2010)

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sogang University <120> Sensor for Detecting of Tyrosine Hydroxylase <130> PN120176 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> 1 oligonucleotide <400> 1 tttggggaac accgtggagg ggcatagcat ctcaaaaaaa aaa 43 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Barcod DNA <400> 2 aaaccccttg tggcacctcg tatcgta 27 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> forward primer <400> 3 gatggatgcc tcattgggg 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> reverse primer <400> 4 gcagctccag gccccccagc 20

Claims (8)

1. 다음을 포함하는 티로신 수산화효소 검출용 센서:
   (a) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자; 및
   (b) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1올리고뉴클레오타이드는 티올기를 통하여 금 나노입자에 직접 결합하는 것을 특징으로 하는 센서.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 제1올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열인 것을 특징으로 하는 센서.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 바코드 DNA의 서열은 서열목록 제2서열인 것을 특징으로 하는 센서.
   
5. 다음의 단계를 포함하는 티로신 수산화효소 검출방법:
   (a) (i) 티로신 수산화효소에 대한 제1항체가 결합된 자성입자 및 (ii) 상기 티로신 수산화효소에 대한 제2항체 및 제1올리고뉴클레오타이드가 결합되어 있고 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 갖는 바코드 DNA가 상기 제1올리고뉴클레오타이드에 혼성화 되어 있는 금 나노입자에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;
   (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 자성을 인가(apply)하여 자성입자-티로신 수산화효소-금 나노입자 복합체를 분리하는 단계;
   (c) 상기 복합체로부터 바코드 DNA-결합된 금 나노입자를 분리하는 단계;
   (d) 상기 분리된 금 나노입자를 가열하여 바코드 DNA를 분리하는 단계; 및
   (e) 상기 바코드 DNA을 유전자증폭 방법을 실시하여 분석하는 단계.
   
6. 상기 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 자성입자-티로신 수산화효소-금 나노입자 복합체의 분리는 프로테아제(protease) K를 처리하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 상기 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 유전자증폭 방법은 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 유전자증폭 방법은 서열목록 제3서열 및 제4서열의 프라이머쌍을 이용하여 실시하여 티로신 수산화효소을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.

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