TWI530561B - 抗α－甲醯基輔酶Ａ消旋酶之適體及其檢測套組 - Google Patents

抗α－甲醯基輔酶Ａ消旋酶之適體及其檢測套組 Download PDF

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Description

抗α-甲醯基輔酶A消旋酶之適體及其檢測套組
本發明係關於一種適體(aptamer)。更特定而言，本發明係關於一種結合至α-甲醯基輔酶A消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase，簡稱AMACR)之適體。本發明亦關於以上述適體檢測AMACR及癌症的套組。
α-甲醯基輔酶A消旋酶(alpha-methylacyl-CoA racemase，簡稱AMACR或P504S)係一催化掌性轉換(chiral conversion catalysis)重要的代謝酵素於粒線體中脂肪酸異化代謝之β氧化作用(β-oxidation)路徑上及轉換許多(2R)-甲基支鏈脂肪醯基輔酶A(methyl-branched-chain fatty acyl-CoAs)到其(S)-立體異構體(stereoisomers)(J Lipid Res.2000 Nov；41(11)：1890-6)。
在過去研究中，已經被證實於前列腺癌細胞(prostate cancer cells)中高度表現AMACR，已成為新的前列腺癌檢驗之新生物標記(biomarker)蛋白質(Am J Surg Pathol.2001 Nov；25(11)：1397-404；Cancer Res.2000 Mar 15；60(6)：1677-82)。此外，除了於前列腺癌外，AMACR高度表現亦與乳癌(breast cancer)、大腸直腸癌(colorectal cancer) 及腎藏癌(renal cancer)等其他癌症正相關(Am J Surg Pathol.2002 Jul；26(7)：926-31)。前述文獻習知AMACR是有效的癌症生物標記分子，並改善前列腺癌之早期診斷。AMACR可被以非侵入性方式所檢驗，例如，尿液(J Urol.2004 Oct；172(4 Pt 1)：1501-3)、前列腺分泌物(J Urol.2004 Sep；172(3)：1130-3)或血液(J Natl Cancer Inst.2004 Jun 2；96(11)：834-43)。因此，AMACR之免疫檢測或是生物感測器之發展可應用於臨床檢測。而目前檢測是以抗體免疫檢測方式，其缺點是昂貴且產品生命週期有限。
適體為一種能與蛋白質(protein)和核酸(nucleic acid)相結合之寡核酸(oligonucleic acid)，也就是具有抗體特性的單股核苷酸(single strand DNA，簡稱ssDNA)。適體除具有一般蛋白質抗體(antibody)的專一性特性，更具有能以化學合成(oligonucleotide synthesis)或聚合酶連鎖反應方式大量生產核酸的特性，同時並擁有較高化學穩定性，而不像蛋白質抗體有合成不易且化學穩定性不佳之問題。與蛋白質抗體比較而言，適體更可克服許多使用上的限制，像是在篩選它的過程中無需動物或細胞培養，如此即可篩選出抗有毒物質或非免疫性的標的物之適體。再者由於適體的分子量較小，在試管內及細胞內的影像分析上是很好的工具。最重要的是，適體可經由化學性的修飾來配合應用，像是為了偵測或固定化而引入官能基(functional groups)。目前適體也已可使用在毛細管電泳(capillary electrophoresis)、親合層析法、流式細胞儀(flow cytometry)和生物感測器。
適體(aptamer)於1990年被以「配體指數增強系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，簡稱SELEX)」篩選出來(Nature.1990 Aug 30；346(6287)：818-22)。而SELEX技術本 質上類似達爾文的演化理論，利用大量序列不同的單股RNA或DNA分子庫與標的物進行雜交過程，經過不同的洗滌(wash)方式將非專一性鍵結之序列洗去後，利用聚合酶連鎖反應(PCR)進行序列放大並單股化的過程後，再次投入下一次的篩選過程，如此經過多次篩選淘汰循環之後，其篩選到之單股分子庫對標的物的解離常數(dissociation constant)可由原先μM降至nM等級，再經過定序、純化等步驟處理後，便得到數組可得到對該標的物專一性高、靈敏性強的適體。
雖然一般之SELEX有效的篩選適體，但需要耗費毫克(mg)等級之標的蛋白質，因此對於新穎或昂貴之標的蛋白質仍不易實施。單微珠SELEX(single microbead SEXEX)有效率且簡單篩選出適體。利用500μm玻璃珠易於使用鑷子操作，矽烷化學(Silane chemistry)應用於玻璃珠表面修飾，使環氧化物官能基(epoxide functionality)對於AMACR的共價固定(covalent immobilization)。該單微珠SELEX減少適體篩選過程對於昂貴標的蛋白質之消耗。
本文中，術語「複數個」係用以描述本發明之元件或單元之數量。此用語除非明確另有所指，否則應理解為兩個以上。
本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
本發明提供一種結合至AMACR的適體(aptamer)。
在一具體實施例中，本發明所提供之結合至AMACR的適體係利用單微珠SELEX技術篩選得到，該結合至AMACR的適體係由選自SEQ ID NOs：4、5、6、7及8的核苷酸序列所組成，對於AMACR之辨識具高專一性與親合性。
在一具體實施例中，本發明之結合至AMACR的適體之GC含量大於50%。
在一具體實施例中，本發明之結合至AMACR的適體，其形成二級結構之delta吉布斯自由能(delta Gibbs free energy，簡稱△G)在-4.3kcal/mol至-8.9kcal/mol之間，使本發明之適體具有穩定二級結構。在另一具體實施例中，本發明之適體，於SEQ ID NOs：4(AMC51)、SEQ ID NOs：5(AMC55)、SEQ ID NOs：6(AMC56)中比較，SEQ ID NO：5最不形成穩定B型結構或髮夾環結合模體(binding motif)之二級結構；SEQ ID NO：4有較穩定B型結構，結構穩定度影響適體辨識AMACR的親和性及專一性。
在一具體實施例中，本發明之結合至AMACR的適體SEQ ID NOs：4、5及6，其依序具有49±26nM、139±157nM及65±31nM的解離常數(dissociation constants，簡稱Kd)。本發明之適體與AMACR具高親和性，且趨勢與二極結構穩定性呈正相關。
在一具體實施例中，本發明之結合至AMACR的適體，其不結合至牛血清白蛋白(bovine serum albumin，簡稱BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin，簡稱HAS)、胎牛血清總蛋白(total protein infetal bovine serum，簡稱FBS)、大腸桿菌重組第一型流感血凝素(recombinant E. coli hemagglutinin 1，簡稱H1)及大腸桿菌重組第五型流感血凝素(recombinant E.coli hemagglutinin 5，簡稱H5)等非本適體專一性蛋白原。本發明之適體具高度專一性。
本發明亦提供一種在樣本中檢測AMACR及癌症的套組，其包含如上述之結合至AMACR的適體。
本文中所述之「癌症」係指控制細胞生長增殖機制的失常產生時，大量AMACR異常增加的有關疾病，在一具體實施例係指惡性腫瘤疾病，包括前列腺癌，但不限於前列腺癌。
本文中所述之套組，在一具體實施例中檢測極限為0.44nM或19.5ng/mL。
本文中所述之套組，在一具體實施例中亦對於前列腺癌細胞株(22Rv1)之全蛋白質檢測具反應，本套組可運用於前列腺癌患者檢測診斷。
本文中所述之「樣本」係收集自生物個體，其中該樣品係選自由以下組成之群：組織樣品、糞便樣品、尿液樣品、細胞均質物、血液樣品、一或多種生物流體或其任何組合。本發明中所提及之個體為動物，包括人類或非人類的動物，如狗、貓、小鼠、大鼠、牛、綿羊、豬、山羊、或非人之靈長類，其中較佳為人類。
在一具體實施例中，該結合至AMACR的適體經標記物質標記。該標記物質係選自由同位素(例如：125I、131I、35S、3H、或32P)、酵素(例如：鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase)、山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase)、冷光素(luciferase)、或β-半乳糖酵素 (β-galactosidase))、螢光物質(例如：螢光素(fluorescein)、羅丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、綠色螢光蛋白(GFP)或藍色螢光蛋白(BFP))、發光物質(例如：QdotTM奈米粒子，由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA所提供)或磁性物質組成之群組。
圖1A顯示單珠SELEX產生抗AMACR適體實施步驟；圖1B顯示ELAA實施原理。
圖2顯示自製重組AMCAR蛋白質之定性分析及EGBs修飾GLYMO之定性結果分析。圖2A顯示自製重組AMACR蛋白質利用變性凝膠電泳(SDS-PAGE)分析；圖2B顯示利用酵素免疫分析法(ELISA)證實成功表現AMCAR蛋白質；圖2C顯示EGBs修飾GLYMO之傅立葉紅外線光譜儀(Fourier transform infrared spectroscopy，簡稱FIRT)之光譜圖；圖2D顯示以布拉福蛋白質定量方法定量比較AMCAR蛋白質包被(coated)溶液與EGBs反應前後濃度差。
圖3顯示SELEX過程中寡核苷序列定量及定性分析。圖3A顯示非專一性與專一性鍵結的DNA於每個循環qPCR定量數據的比較結果；圖3B顯示69條候選寡核苷序列GC含量分析。
圖4顯示篩選到重複性較高之適體的二級結構預測與分析：圖4A顯示AMC51(SEQ ID NO：4)；圖4B顯示AMC55(SEQ ID NO：5)；圖4C顯示AMC56(SEQ ID NO：6)；圖4D顯示AMC68(SEQ ID NO：7)；圖4E顯示AMC69(SEQ ID NO：8)；圖4F顯示AMC51、AMC55及AMC56之圓偏光二色光譜分析。
圖5顯示適體測試親和力與專一性的結果。圖5A顯示以AMC51、AMC55或AMC56使用ELAA方法對AMACR進行全接合分析(total binding assay)之結果；圖5B顯示以ELAA評估適體與其他蛋白質之交互反應關係。
圖6顯示適體AMC51(SEQ ID NO：4)使用ELAA方法對不同濃度AMACR進行分析。
圖7顯示適體AMC51(SEQ ID NO：4)使用ELAA方法對前列腺癌細胞株(22Rv1)之全蛋白質進行分析。
本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1 環氧化功能性玻璃微珠(EGBs)及重組AMACR製備及與AMACR接合反應
市售重組AMACR被用來進行單珠配位指數增強系統進化技術(Single-bead SELEX)，自製重組AMCAR被用來執行一系列篩選適體的親和性及專一性分析，並確認市售重組AMACR所篩選之適體是否辨識自製重組AMCAR。AMACR蛋白表現自gb|EAX10818.1|的亞型CRA_c之序列，依照標準重組DNA技術使用pET-28a為載體(vector)及大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主細胞。該重組AMCAR在序列N端具有6個組胺酸標記(Histidine tag)及其他14個胺基酸(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH)。
自製重組AMACR蛋白質利用變性凝膠電泳(SDS-PAGE) 分析如圖2A於分子量45kDa位置有清楚的訊號，說明自製重組蛋白質與AMACR有相同分子量。進一步利用酵素免疫分析法(ELISA)證實成功表現AMCAR蛋白質，如圖2B所示自製AMACR於ELISA中具劑量依賴性反應，並如同市售AMACR可被AMACR抗體所辨識。
玻璃微珠(500μm)以piranha溶液(30%過氧化氫及濃硫酸以1：4混合)清洗1小時，再以95%酒精漂洗，最後以60℃烘乾1小時。微珠浸於4%(v/v)GLYMO溶液(3-縮水甘油氧基丙基-三甲氧基矽烷稀釋於甲苯得之)中，置於30℃烘箱至隔日，接著以95%酒精漂洗，最後以40℃烘乾。以傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，簡稱FTIR)確認微珠表面上功能環氧基團。修飾過微珠相對於未修飾微珠作為背景值之傅里葉變換紅外光譜在波長4000至650cm-1在256掃瞄器4cm-1解析度下。
500μm大小的玻璃微珠可以鑷型單珠操縱(tweezers-based single-bead manipulation)，矽烷為基礎的化學試劑GLYMO用來修飾玻璃微珠表面並產生環氧化功能性玻璃微珠(EGBs)。圖2C所繪為EGBs之FTIR光譜圖。Si-O-Si、Si-CH3及C-H之伸縮振動帶(stretching vibration bands)分別出現在1110、1270及2950的位置。這些帶(band)的位置證實GLYMO成功被修飾於微珠表面。
EGBs接合AMACR能力分析如下。首先，EGBs(30mg約等於200顆微珠球)以AMACR溶液(約1μg蛋白質溶於30μL選擇緩衝溶液，選擇緩衝溶液為50mM Tris/HC、100mM氯化鈉、4mM氯化鉀、2.5mM氯化鎂、1mM氯化鈣，pH=7.4)覆蓋，置於4℃至隔日。在接合 反應後，未接合的AMACR在懸浮液中以布拉福(Braford)蛋白質定量方法定量。接著已與微珠接合之AMACR含量藉由初始AMACR量對減未接合AMACR量來求得，並且估計平均每個EGBs之AMACR包被量。
如圖2D所示，以布拉福蛋白質定量方法定量比較AMCAR蛋白質包被溶液在與環氧化功能性玻璃微珠EGBs於4℃反應至隔日後濃度。AMCAR包被在EGBs的數量可根據兩者濃度差來估算。每一個EGB的AMACR的接合能力可經由包被於EGBs上的AMACR總量約為600ng，而加入的EGBs數量30mg約200顆微珠計算，每個EGB約3ng AMACR的包被。在SELEX實驗中，每輪僅3顆AMACR包被之EGBs被使用，因此五輪SELEX實驗僅使用45ng AMACR，以完成適體篩選的工作。本SELEX實驗方法對於高價且新穎的蛋白質之適體篩選具有優勢及效率。
在進行SELEX前，相同方法備置AMACR包被之EGBs，但以1%(w/v)BSA溶於200μL選擇緩衝溶液進行阻斷(blocking)反應於4℃至隔日。以相同條件，只使用BSA製備BSA包被之EGBs做為在配體進化(ligand evolution)的不同qPCR分析中做為反向選擇及對照組實驗。
實施例2 單珠配位指數增強系統進化技術
60個單股核苷酸(ssDNA)之寡核苷酸分子庫中的序列被使用，其包含一長度為30個核苷酸的中央隨機區域，兩旁分別為15個核苷酸長的特定序列：5’-CCCTACGGCGCTAAC-(N)30-GCCACCGTGCTACAA-3’(SEQ ID NO：1)。
一輪的SELEX對於AMCAR包被EGBs的流程如圖1A所 示。在首輪的SELEX，3個AMACR包被的EGBs與預溶於20μL選擇緩衝溶液之2nmol寡核苷酸分子庫(多樣性為1.2×1015，使用前加熱至95℃下5分鐘，並逐漸冷卻至25℃)於200μL聚合酶連鎖反應(PCR)微量離心管，溫和攪動於25℃下反應1小時。在反應步驟後，此3個微珠以200μL選擇緩衝溶液洗滌六次，接著以鑷子逐個轉移至一個含有25μL Rotor-Gene SYBR® green PCR(Qiagen)套組組成之預混PCR，其順向引子5’-CCCTACGGCGCTAAC-3’(SEQ ID NO：2)及反向引子5’-biotin-TTGTAGCACGGTGGC-3’(SEQ ID NO：3)。接合於AMACR包被微珠上之DNA序列藉Qiagen q-PCR儀(Rotor-Gene® Q)被放大同時量化，其反應條件為95℃下起始變性反應5分鐘，接著12次循環快速雙溫度PCR反應(95℃下反應10秒及60℃下反應另10秒)。
生物素修飾PCR(biotinylated PCR)放大產物以鏈黴(SA，streptavidin)包被磁珠純化，於10×SSC緩衝溶液中反應並輕微搖擺1小時，接著以相同緩衝J溶解性清洗兩次。未被SA包被磁珠抓住的順向寡核苷酸在50mM氫氧化鈉存在下被分離。利用離心管柱(Centri-SepTM)進行緩衝溶液交換，置換為選擇緩衝溶液，寡核苷酸分子庫為下一輪SELEX使用。隨後幾輪SELEX根據上述步驟重覆進行，除了調整洗滌嚴謹度移除寡核苷酸分子庫與AMCAR包被EGBs之間非專一性接合事件。洗滌緩衝液在第一及二輪SELEX反應是選擇緩衝液含100mM氯化鈉，第三及四輪含300mM氯化鈉，第五輪含500mM氯化鈉。此外，在與AMCAR包被EGBs反應前，寡核苷酸分子庫先以30顆BSA包被EGBs反向選擇於第二至五輪SELEX。同時執行寡核苷酸分子庫對於BSA包被EGBs非專一性接合的 qPCR分析，與專一性接合的qPCR分析進行比較。在五輪SELEX後，成功選出的寡核苷酸分子進行收集、選殖與定序。
在每一輪SELEX中，即時定量聚合酶連鎖反應(real-time qPCR)技術被同時用於製備(放大寡核苷酸配體數量)及分析(寡核苷酸配體之定量)之目的，而所使用的qPCR為SYBR Green I。如圖3A所示，在SELEX實驗中第二至五輪中所篩選出，接合於AMACR包被微珠之專一性寡核苷酸配體相對於BSA包被微珠之非專一性寡核苷酸配體之qPCR定量數據的比較結果。隨著SELEX次數增加，兩組間PCR循環閾值差(threshold PCR cycle difference，△Ct)明顯增加，此說明專一性寡核苷酸配體在SELEX過程中被發展及豐富化。圖3A亦說明qPCR螢光訊號可以在PCR早期階段被偵測(即低循環閾值)，此說明即時定量PCR方法用於單珠SELEX過程中寡核苷酸配體進化之監控具有足夠敏感度(必須注意，在此僅有一顆微珠的產物用於PCR分析)。在SELEX第五輪與稍早的SELEX之專一性接合事件之qPCR數據顯示明顯的Ct延遲，此起因於高嚴謹度洗滌(以500mM氯化鈉)。同時可明顯發現，第五輪SELEX之qPCR分析有最大△Ct，此說明專一接合配體(與AMACR接合)與非專一性接合(與BSA接合)比率大於1000。避免過度篩選造成的偏差及人為因素，寡核苷酸分子庫在第五輪篩選後，視為可選殖、定序及分析的成功分子庫。選殖69個並定序之寡核苷酸配體之GC含量比例以直條圖呈現如圖3B，88.5%的DNA序列GC含量大於50%，且將近一半序列GC含量在57%至62%之間。
實施例3序列比對，二級結構預測和圓偏光二色光譜特性
在成功選出的寡核苷酸分子庫中，選殖69個並定序，並以Clustal W2網站所提供軟體排列69個苷酸序列。從多序列排列分析，三組具有較高排列分數被確定，並從每一組中選一至二個具代表性的候選適體。
69個後選序列以典型多序列分析工具(Clustal W2)分析，序列排列分析分數分辨SELEX產物間的相似度與保守度，以此做為標準篩選出五個代表性適體序列來進行後序AMACR分析。最高分的五條序列(AMC51、AMC55、AMC56、AMC68、AMC69)如表一所列。
N30區域以粗體註明。
候選適體的二級結構以RNAstructure Version 5.6網站提供 軟體在DNA模式下預測。預測圖如圖4A、圖4B、圖4C、圖4D及圖4E所示，其特色是多髮夾環(stem-loop)結構及B型結構的分子內變體(intra-molecular variants of the B-forms tructure)。其△G如表一所列，於37℃環境下約-4.3kcal/mol與-8.9kcal/mol之間，說明適體結構穩定。
5μM適體樣本置備於選擇緩衝溶液圓偏光二色(CD，circular dichroism)光譜被記錄在25℃ 0.1公分光徑的比色皿條件下。參數設定條件如下：敏感度為100mdeg、數據間距1nm、反應為1秒、帶寬是1nm以及掃瞄模式為50nm/min持續性掃瞄。CD光譜報告以波長320至200nm三次掃瞄的平均。如圖4F選擇三組適體(AMC51、AMC55及AMC56)於選擇緩衝溶液中CD光譜比較，可發現適體光譜均於約220與275nm有正向訊號帶，於210及245有負向訊號帶。此數據說明，其適體二級結構屬於B型結構之亞型(subtype of B-form)，與電腦模擬(in silico)之圖4A、圖4B及圖4C所預測的結果相符。圖4F說明適體AMC55(SEQ ID NO：5)之序列與其他兩個序列比較，最不易形成穩定B型結構或髮夾環結合模體(binding motif)。此外適體AMC51(SEQ ID NO：4)與其他兩者比較有較穩定B型結構，結構穩定度影響適體辨識AMACR的親和性及專一性。
實施例4 酶聯適體分析
酶聯適體分析(enzyme-linked aptamer assay，簡稱ELAA)以典型不透明黑色96孔聚苯乙烯微量孔盤，類似ELISA分析進行了，如圖1B所示(1)對選擇性抗AMACR的適體之親和性及專一性評估及(2)使用適體進行螢光AMACR檢測之概念驗證。對於工作(1)不同濃度適體與 固定濃度蛋白質(0.2μM)進行實驗；對於工作(2)不同濃度蛋白質使用相同濃度適體(500nM)進行實驗。兩個均使用ELAA步驟除非另有註明。
為了蛋白質塗層(coating)，AMACR溶於0.05M碳酸納緩衝溶液(pH=9.6)加入微量盤孔中(100μL/well)，並於4℃反應至隔日。在反應後，以200μL/well選擇緩衝液含0.05% tween 20洗滌三次。為了阻斷，每個以AMACR塗層盤孔加入200μL溶於含0.05% tween 20的選擇緩衝溶液之3% BSA於37℃反應2小時。之後，以前述洗滌方式洗滌。在蛋白分析前，生物素標記適體序列懸浮於選擇緩衝溶液並加熱至95℃反應5分鐘，接著逐漸降溫至25℃。接著每個蛋白質塗層盤孔加入100μL適體溶液(溶於選擇緩衝溶液)並於室溫中反應1小時接著與前述相同洗滌程序。於此之後，每個盤孔加入兩滴(約100μL)鹼性磷酸酶偶合鏈黴(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin，簡稱Strep-AP)溶液(0.003mg/mL)(Abcam)並在室溫中反應30分鐘接著洗滌微量孔盤。在螢光訊號發展部分，每個盤孔加入100μL AttoPhos®鹼性磷酸酶螢光受質溶液(Promega)，並黑暗中反應至少15min。最後每個盤孔螢光訊號以螢光微孔盤讀取儀讀取(激發光波長在435nm及放射光波長在555nm)。
一系列螢光ELAA實驗目的在評估AMCAR與適體AMC51、AMC55或AMC56之間親和性及專一性。除了以適體取代一級抗體外，ELAA檢測法原理與標準ELISA檢測法相似。AttoPhos®鹼性磷酸酶螢光受質(2’-[2-benzothiazoyl]-6’hydroxybenzothiazole phosphate，簡稱BBTP)做為報導者(reporter)增加偵測敏感性。圖5A顯示以AMC51、AMC55或AMC56使用螢光ELAA方式對AMACR進行全接合分析(total binding assay)之結果，從此結果明顯求知AMC51、AMC55或AMC56與AMACR之間接合事件之解離常數(KD)估計依序為49±26nM、139±157nM、65±31nM。此可說明單珠SELEX步驟不僅有效率並且產生高親和性適體。此外，KD數值趨勢與如顯而易見之圖4D之CD光譜圖趨勢相一致，此說明AMCAR易與二級結構穩定之適體辨識接合。
利用ELAA進行分析，評估適體與其他蛋白質之交互反應關係。由於非專一性接合事件常發生於高濃度適體條件下，因此使用500nM適體濃度而非低適體濃度進行交互反應分析，結果如圖5B。可發現三條適體測試高度專一性辨識AMACR但不與如牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胎牛血清總蛋白、大腸桿菌重組第一型流感血凝素及大腸桿菌重組第五型流感血凝素等非專一性蛋白質接合。此外，AMC51於ELAA對於非專一性蛋白分析有最佳結果，AMC56次之，AMC55最後。
依據前述結果得知AMC51為其中最佳適體，首次利用螢光ELAA檢測新前列腺癌生物標識分子，AMCAR。結果如圖6所示，與圖5具相同原理，不同於圖5A以不同適體濃度而有相同AMACR濃度(0.2μM)之處，圖6所報導之分析檢測不同蛋白質濃度而有相同適體濃度(500nM)。由圖6所示，以適體為基礎之螢光AMACR分析具有寬動態範圍(10-1至103nM，對應一個高度可微之AMACR劑量-反應性範圍約由0.5nM至500nM)且高度AMCAR專一性(對HAS無交互作用)。估計ELAA之檢測極限(limit of detection，LOD)，需先計算背景極限(limit of blank，LOB)，如式1，此處背景值平均(Meanblank)為平均訊號，而背景值標準偏差(SDblank)為背景樣本訊號(不含AMCAR)之標準偏差(standard deviation，簡稱S D)。LOD計算如式2，此處低濃度樣本值標準偏差(SDlow concentration sample)為稀釋樣本訊號之標準偏差。根據此計算方式，LOD經計算為0.44nM(19.5ng/mL)。根據文獻報導(World J Urol.2010 Dec；28(6)：681-6)，前列腺癌患者血液中AMACR濃度達次μM(sub-μM，μg/mL)範圍。如圖7所示，適體AMC51亦對於前列腺癌細胞株(22Rv1)之全蛋白質檢測具反應，因此本ELAA方法可運用於前列腺癌患者檢測診斷。
LOB=Meanblank+1.645(SDblank) (式1)
LOD=LOB+1.645(SDlow concentration sample) (式2)
<110> 國立台灣大學
<120> 抗α-甲醯基輔酶A消旋酶之適體及其檢測套組
<130> 2383-NTU-TW
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 適體分子庫中的合成序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(45)
<223> n is a,c,g,or t
<400> 1
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的順向引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的反向引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<400> 3
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的AMC51適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 4
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的AMC55適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 5
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的AMC56適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 6
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的AMC68適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 7
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 篩選得到的AMC69適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<400> 8

Claims (7)

  1. 一種結合至α-甲醯基輔酶A消旋酶(AMACR)的適體，其係選自由SEQ ID NOs：4、5、6、7及8所組成之群組的核苷酸序列。
  2. 一種在樣本中檢測癌症的套組，其包含一種結合至α-甲醯基輔酶A消旋酶的適體，該適體係選自由SEQ ID NOs：4、5、6、7及8組成之群組的核苷酸序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之套組，其中該檢測係比較該樣本中α-甲醯基輔酶A消旋酶含量和正常、未受疾病感染樣本中α-甲醯基輔酶A消旋酶含量。
  4. 如申請專利範圍第2項之套組，其中該檢測極限為0.44nM或19.5ng/mL。
  5. 如申請專利範圍第2項之套組，其中該癌症包括直腸癌或前列腺癌。
  6. 如申請專利範圍第2項之套組，其進一步包含一標記物質，其中該標記物質係用於標記該適體，其中該標記物質係選自由同位素、酵素、螢光物質、發光物質及磁性物質所組成之群組。
  7. 如申請專利範圍第2項之套組，其中該結合至α-甲醯基輔酶A消旋酶的適體的SEQ ID NO：4、5及6的解離常數(Kd)依序為49±26nM、139±157nM及65±31nM。
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