JP2005172460A

JP2005172460A - タンパク質とサンプルとの反応を検出する方法

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Publication number: JP2005172460A
Application number: JP2003408946A
Authority: JP
Inventors: Kazufumi Aida; 和史合田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2003-12-08
Filing date: 2003-12-08
Publication date: 2005-06-30

Abstract

【課題】細胞内タンパク質と他の物質との相互作用を容易に早く検出する。
【解決手段】遺伝子ａをベクター内に組み込む。同時に、遺伝子ｆをベクター内に組み込み配向させる。細胞内に組替えたＤＮＡを遺伝子導入する。遺伝子導入された細胞から発現した蛍光タンパク質ＦＡを抽出する。蛍光タンパク質ＦＡを含む細胞抽出液とサンプルを混合し反応させる。反応させた混合液をＦＣＳ測定する。ＦＣＳ測定での測定値に基づいて、反応の有無を検出する。
【選択図】図１

Description

本発明は細胞内タンパク質と他の物質との相互作用を検出する方法に関する。

細胞内で、タンパク質は様々なパートナー分子と相互作用することが知られている。それらの相互作用は遺伝発現、抗原抗体反応、シグナル伝達など多様な生命活動において重要な役割を担っている。パートナー分子には、タンパク質、糖、核酸など様々な生体分子がある。パートナー分子との相互作用は、細胞の種類や時期によって異なる場合があり、試験管内での人工的に均一化された反応を用いて、真に重要な相互作用を解き明かすことは難しい。タンパク質とパートナー分子の相互作用を検出するためには、実際の細胞内での反応を用いることが好ましい。細胞内のタンパク質と他の物質との相互作用を検出する方法として、二重抗体染色を用いて細胞を直接に蛍光染色する方法や、免疫沈降法(非特許文献１)による検出が挙げられる。

二重抗体染色では、異なる蛍光色素が結合した抗体を用いて細胞内の２種類のタンパク質を染色し、それらを直接に観察することで細胞内局在を検出する。細胞が生きているときの空間的配置が保たれたままにタンパク質が抗体染色されるので、異なる蛍光シグナルが同じ位置から検出されるかどうかで、２種類のタンパク質細胞内で相互作用をしているかどうかを検出することができる。

免疫沈降法では、細胞からタンパク質を抽出、濃縮した後に、濃縮サンプル内のタンパク質と結合している可能性がある抗体を加える。加えた抗体が濃縮サンプルと反応しているかどうかでタンパク質の相互作用を検出する。
ベルント・ノウフェルド等（Bernt Neufeld et al.,）、"Serine/Threonine Kinase 3pK and MAPK-activated Protein Kinase 2 Interact with the Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor E47 and Repress Its Transcriptional Activity"、J Biol Chem. 、2000年７月７日、第275巻、第27号、ｐ．20239-42

しかしながら、二重抗体染色では細胞体に傷をつけないように取り扱う必要があり、サンプルの調整が難しく、熟練した技術が必要とされる。

また、免疫沈降法では、タンパク質の濃縮過程があるためにアーティファクト（人工産物）が出ることがあり、検出結果の信頼性に問題がある。また、タンパク質の濃縮に手間がかかり、検出結果がすぐには得られない。

本発明の目的は、細胞内のタンパク質と他の物質との相互作用を容易に早く検出することにある。

上記目的を達成する本発明の特徴は、タンパク質をコードする遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクターを用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成し、蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合して、蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する分子の並進拡散時間を求めることにある。この特徴によれば、細胞の粗抽出液を精製や濃縮することなしに相互作用を検出できるので、容易に早く検出結果を得ることができる。

また、各溶液の混合と、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法(FIDA)、多項目蛍光強度分布解析法(FIMDA)または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)の利用により、浮遊系における反応生成物の大きさの変化、明るさの変化、数の変化をｎＭオーダーという非常に良い感度で検出することができる。

また、蛍光標識されたタンパク質と結合する分子をサンプル中に含み、その分子に抗体結合させておいてもよい。これにより、反応生成物の分子が大きくなり、並進拡散時間の変化が顕著になって、より精度良く相互作用を検出することができる。

また、前記蛍光標識されたタンパク質を合成する際に、細胞内にベクターで得られたＤＮＡを導入し、細胞の粗抽出液とサンプルとを混合してもよい。

本発明によれば、細胞の粗抽出液を精製や濃縮することなしに相互作用を検出できるので、容易に早く検出結果を得ることができる。

（実施例１）
本発明の第一の実施例であるタンパク質Ａとパートナー分子Ｂとの相互作用を検出する方法を説明する。タンパク質Ａとパートナー分子Ｂとは検出したい相互作用を担う物質である。

（１）遺伝子発現のためのベクター構築
タンパク質Ａをコードする遺伝子ａ、蛍光タンパク質Ｆをコードする遺伝子ｆ、遺伝子導入用ベクターを用意する。

遺伝子組み替え技術を用いて遺伝子ａをベクター内に組み込む。同時に、遺伝子ｆをベクター内に組み込み配向させる。これによって得られた組替えＤＮＡは、タンパク質Ａと蛍光タンパク質Ｆとからなる蛍光性タンパク質ＦＡを、細胞内で発現することができる。

タンパク質Ａとして、細胞質基質に存在するタンパク質、葉緑体やミトコンドリアに存在するタンパク質、細胞核の中に存在するタンパク質、細胞膜に存在するタンパク質などを用いることができる。

蛍光タンパク質Ｆとして、ＧＦＰ、ＧＦＰ改変型、ＹＦＰ、ＹＦＰ改変型、ＣＦＰ、ＣＦＰ改変型、ＲＦＰ、またはＲＦＰ改変型を用いることができる。

ベクターは、外来遺伝子が導入された細胞株を選択することができ、細胞内でタンパクを発現することが可能なものとする。

（２）細胞内への組替えＤＮＡの導入
細胞内に（１）で組替えたＤＮＡを遺伝子導入する。遺伝子導入後は、適切に遺伝子導入が行われた細胞のみを薬剤耐性や栄養要求性を元に選択する。

細胞種としては、大腸菌、酵母、カビ、動物由来の培養細胞、植物細胞などを用いることができる。生物個体に対して遺伝子導入を適用する場合にも、生殖系列の細胞もしくは将来生殖細胞を作ると考えられる細胞に適用することが可能である。

（３）蛍光タンパク質の抽出
遺伝子導入された細胞から発現した蛍光タンパク質ＦＡを抽出する。動物由来の培養細胞から抽出する場合は、低張液に浸すなどの方法で緩やかに抽出する。大腸菌や酵母、植物細胞などのように細胞壁を持つ細胞の場合は、細胞壁分解酵素を加える。蛍光タンパク質ＦＡが細胞核内にある場合は、核膜や細胞内小器官を破壊して抽出する。いずれの方法でも、蛍光タンパク質ＦＡのみを精製したり濃縮したりする必要はなく、いわゆる粗抽出液でよい。

（４）パートナー分子Ｂのサンプルの用意
パートナー分子Ｂを含むサンプルを２種類用意する。一つは、抗体が結合していないパートナー分子Ｂを含むサンプルＳ１、もう一つは抗体が結合したパートナー分子Ｂを含むサンプルＳ２である。

パートナー分子Ｂとしてタンパク質、ペプチド、低分子化合物などを用いることができる。

（５）反応実験
蛍光タンパク質ＦＡを含む細胞抽出液とサンプルを混合し反応させる。このとき、混合液内の蛍光タンパク質ＦＡの濃度が１ｎＭから２０ｎＭの範囲内になるよう適宜希釈する。

（６）ＦＣＳ解析
反応させた混合液をＦＣＳ測定用のガラスボトムプレート、例えばマイクロプレートに移し、ＦＣＳ測定を行う。ＦＣＳ測定での測定値に基づいて、反応の有無を検出する。

測定は１５秒計測を５回程度行う。計測時間および回数は、これより長くてもよい。ただし、１０秒以下または１回程度の計測ではデータの再現性、信頼性が低下するので、１０秒以上複数回行うのがよい。

ＦＣＳ測定では、微小領域内の蛍光分子の揺らぎを測定し、求められた値に基づいて並進拡散時間(Diffusion Time)を求める。並進拡散時間の大小は分子量の大小を示すので、反応の前後で並進拡散時間を比較することにより、分子量の増加または減少がわかる。分子量の増加は生体分子間の結合反応を、分子量の減少は生体分子の分解反応を、分子量の維持は生体分子に結合も分解も無かったことを示す。従って、蛍光標識タンパク質とサンプルとの反応の前後で、蛍光標識された物質の並進拡散時間の増加を検出することにより、蛍光標識タンパク質とサンプルとの結合反応を検出することができる。

上述した手順では、（６）で反応生成物の並進拡散時間を求めるために蛍光相関分光法(fluorescence correlation spectroscopy：FCS)を用いたが、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）の代わりに、蛍光相互相関分光法(fluorescence cross correlation spectroscopy)、蛍光強度分布解析法(Fluorescence Intensity Distribution Analysis)、多項目蛍光強度分布解析法(Fluorescence Intensity Multiple Distribution Analysis)または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)を用いてもよい。これらの解析法から、反応後のタンパク質結合分子の大きさ、数、明るさに関達するデータを求める。これらのデータから、反応前後での分子の大きさの変化、数の変化、明るさの変化を得ることができる。例えば、ＦＣＳ測定の結果、反応の前後でタンパク質の大きさに顕著な差はないが、１分子あたりの蛍光の明るさに変化がある場合には、蛍光強度分布解析法(FIDA)を行うことによって、反応の有無を知ることができる。

次に、（４）で用意したサンプルＳ１，Ｓ２による解析結果の違いについて説明する。図１に、蛍光タンパク質ＦＡとパートナー分子Ｂとの結合反応および並進拡散時間の違いを模式的に示す。

サンプルＳ１を混合した場合もサンプルＳ２を混合した場合も、蛍光タンパク質ＦＡのタンパク質Ａの部分にパートナー分子Ｂが結合する。反応生成物の分子量は蛍光タンパク質ＦＡよりも大きいので、反応の前後で測定される並進拡散時間は大きくなる。

パートナー分子Ｂに結合した抗体の有無で並進拡散時間を比較すると、サンプルＳ２を混合した場合は、パートナー分子Ｂに抗体が結合している分、反応生成物の分子が大きいので、サンプルＳ２を混合した場合の並進拡散時間がサンプルＳ１を混合した場合よりも大きくなる。

次に、タンパク質Ａとは結合しない分子Ｃを含むサンプルで、同様の反応実験とＦＣＳ計測をした場合の解析結果の違いについて説明する。サンプルには、抗体が結合していない分子Ｃを含むサンプルＳ３、および抗体が結合した分子Ｃを含むサンプルＳ４を用いる。

図２に蛍光タンパク質ＦＡと分子Ｃとの結合反応および並進拡散時間を模式的に示す。細胞抽出液にサンプルＳ３またはＳ４を加えても、結合反応は起こらず、混合液中の蛍光タンパク質ＦＡ分子の大きさに変化はないので、並進拡散時間は反応前の前後で変わらない。分子Ｃに結合する抗体の有無による違いもない。

従って、細胞中で発現した蛍光タンパク質ＦＡを含む抽出液にサンプルを混合し、ＦＣＳ計測を用いて並進拡散時間を比較することにより、タンパク質Ａとパートナー分子Ｂとの相互作用を検出することができる。このとき、パートナー分子Ｂに抗体を結合させておくと、反応の前後で求められる並進拡散時間について差が大きくなるので、より精度良く相互作用を検出することができる。

また、細胞の粗抽出液を精製や濃縮することなしに相互作用を検出できるので、容易に早く検出結果を得ることができる。

本発明は、精製や濃縮をしていない細胞の粗抽出液を用いて、細胞内タンパク質の他の分子との相互作用を検出することを可能にした。本発明は、創薬スクリーニング、環境、食品などの各種バイオ分野でのバイオアッセイなど、細胞内でのタンパク質の相互作用を検出することに利用可能である。

本実施様態におけるタンパク質解析手順の例を示す図。蛍光タンパク質ＦＡとパートナー分子Ｂとの結合反応および並進拡散時間の違いを模式的に示す図。蛍光タンパク質ＦＡと分子Ｃとの結合反応および並進拡散時間を模式的に示す図。

Claims

タンパク質をコードする遺伝子および蛍光タンパク質をコードする遺伝子を組み込まれたベクターを用いて、蛍光標識されたタンパク質を合成するステップと、
前記蛍光標識されたタンパク質を含む溶液とサンプルとを混合するステップと、
蛍光解析法により混合溶液中の蛍光標識を有する分子の並進拡散時間を求めるステップと、
を有することを特徴とするタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
前記蛍光解析法は、蛍光相関分光法(FCS)、蛍光相互相関分光法(FCCS)、蛍光強度分布解析法(FIDA)、多項目蛍光強度分布解析法(FIMDA)または蛍光偏光解析法(FIDA-polarization)であることを特徴とする請求項１のタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
前記サンプルは、抗体を含むことを特徴とする請求項１のタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。
前記蛍光標識されたタンパク質を合成するステップは、
細胞内に前記ベクターで得られたＤＮＡを導入するステップを含み、
前記溶液は、前記細胞の粗抽出液であることを特徴とする請求項１のタンパク質とサンプルとの反応を検出する方法。