JP2022066767A - 顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】顕微鏡システムは、試料に照射される励起光を出力する光源部と、光源部から出力される励起光を変調する第１空間光変調器と、第１空間光変調器で変調された励起光が試料に照射されることにより得られる蛍光を、第１空間光変調器に同期して変調する第２空間光変調器と、第２空間光変調器で変調された蛍光を、試料に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させる第１フィルタと、第１フィルタを透過した蛍光を撮影する撮影装置と、を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、顕微鏡システムに関する。

近年、生体の組織、器官、細胞等の試料を観察するために、共焦点顕微鏡を備える顕微鏡システムが用いられることが多くなっている。共焦点顕微鏡は、対物レンズの焦点面と光学的に共役となる位置にピンホールが配置された共焦点光学系を備えており、共焦点光学系のピンホールを介した光を検出することによって試料の観察を行う顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡では、焦点面における情報のみが得られるため、解像度及びコントラストが優れた画像を観察することができる。

以下の特許文献１～３には、従来の共焦点顕微鏡及びその関連装置が開示されている。具体的に、以下の特許文献１には、光源からの励起光の振幅又は位相を変調するとともに励起光を試料に対して選択的に透過させる空間光変調装置を共焦点光学系に設けることで、小型化を図った共焦点顕微鏡が開示されている。以下の特許文献２には、スピニングディスクを回転させて試料に対する励起光の照射位置を変更する（励起光によって試料を走査する）ことで、試料の共焦点像を得るディスク走査型共焦点顕微鏡が開示されている。以下の特許文献３には、共焦点顕微鏡で用いられる照明光ビームを生成する生成装置が開示されている。

特開２０１２－７８６５２号公報 特許第４９２３９６６号公報 特許第４７９９４２０号公報

ところで、従来の共焦点顕微鏡において、波長が近い複数の励起光が含まれる光を試料に照射した場合に得られる蛍光のスペクトルは、各々の励起光を個別に試料に照射したときに得られる蛍光のスペクトルが重なり合ったものとなることがある。スペクトルが重なった蛍光は、観察波長帯域毎に弁別することが困難であることから、互いにノイズになりあう現象（以下、「蛍光クロストーク」という）が生ずる。このような蛍光クロストークが生ずると、共焦点像の解像度及びコントラストの低下が引き起こされるという問題がある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる顕微鏡システムを提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の一態様による顕微鏡システム（１、２）は、試料（ＳＰ）に照射される励起光を出力する光源部（１１、１４、３１ａ、３１ｂ）と、前記光源部から出力される励起光を変調する第１空間光変調器（１５、３２ａ、３２ｂ）と、前記第１空間光変調器で変調された励起光が前記試料に照射されることにより得られる蛍光を、前記第１空間光変調器に同期して変調する第２空間光変調器（１８）と、前記第２空間光変調器で変調された蛍光を、前記試料に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させる第１フィルタ（２０）と、前記第１フィルタを透過した蛍光を撮影する撮影装置（２２）と、を備える。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記光源部が、前記試料の観察領域（ＯＡ）内に設定された複数の照射領域（Ｒ１～Ｒ４）に異なる波長の励起光が照射されるようにされており、前記第１フィルタが、前記複数の照射領域に対応する領域（Ｒ２１～Ｒ２４）毎に、異なる波長帯域の蛍光を選択的に透過させる。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記光源部が、複数の波長を含む励起光を出力する光源（１１）と、前記光源から出力される励起光のうち、前記複数の照射領域に対応する領域（Ｒ１１～Ｒ１４）毎に異なる波長の励起光を透過させる第２フィルタ（１４）と、を備える。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記第２フィルタが、前記第１空間光変調器に同期して、前記複数の照射領域に対応する領域の各々を透過させる励起光の波長を変える。

或いは、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記光源部が、波長が異なる励起光を出力する複数の光源（３１ａ、３１ｂ）を備えており、前記第１空間光変調器が、前記複数の光源に対応して複数設けられていて、対応する光源から出力される励起光が前記複数の照射領域の少なくとも１つに照射されるように、対応する光源から出力される励起光を変調する。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記第１空間光変調器が、対応する光源から出力される励起光が照射される前記複数の照射領域の少なくとも１つを変える。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記撮影装置が、前記第１空間光変調器及び前記第２空間光変調器に同期して、前記第１フィルタを透過した蛍光を撮影する。

また、本発明の一態様による顕微鏡システムは、前記第１空間光変調器又は前記第２空間光変調器の少なくとも一方を制御して、前記光源部から前記撮影装置に至るまでの光学特性を調整する制御装置（２３）を更に備える。

本発明によれば、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができるという効果がある。

本発明の第１実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。 本発明の第１実施形態による顕微鏡システムに設けられる液晶波長可変フィルタを模式的に示す図である。 本発明の第１実施形態による顕微鏡システムに設けられる空間光変調器を模式的に示す図である。 本発明の第１実施形態において、試料に照射される励起光の波長と、観察の対象となっている波長帯域との関係の一例を示す図である。 本発明の第１実施形態において励起光が試料ＳＰに照射される様子を説明するための図である。 本発明の第１実施形態による顕微鏡システムの制御シーケンスの一例を示す図である。 本発明の第１実施形態における制御装置で行われる同期制御の例を示すタイミングチャートである。 本発明の第２実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。

以下、図面を参照して本発明の実施形態による顕微鏡システムについて詳細に説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。

〔概要〕
本発明の実施形態は、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる顕微鏡システムを提供するものである。具体的には、試料の同一箇所には特定波長の励起光のみが照射されるようにし、試料から得られる蛍光を、試料に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させることで、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができるようにするものである。

ここで、上述した特許文献３に開示された生成装置を、上述した特許文献１，２に開示された共焦点顕微鏡に適用した場合を考える。この場合においては、波長が異なる複数の励起光が試料の同一箇所に照射されるため、蛍光クロストークが発生する可能性がある。このため、得られる共焦点像の解像度及びコントラストが低下する虞がある。また、上述した特許文献１に開示された共焦点顕微鏡では、空間光変調装置と共焦点像を撮影する撮影装置とが非同期であると考えられるため、バンディングノイズが発生する可能性があり、得られる共焦点像の品質が低下する虞もある。

本発明の実施形態では、光源部から出力される励起光を第１空間光変調器で変調し、第１空間光変調器で変調された励起光が試料に照射されることにより得られる蛍光を第１空間光変調器に同期して第２空間光変調器で変調し、第２空間光変調器で変調された蛍光を、試料に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させ、第１フィルタを透過した蛍光を撮影するようにしている。これにより、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

〔第１実施形態〕
〈顕微鏡システムの要部構成〉
図１は、本発明の第１実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。図１に示す通り、本実施形態の顕微鏡システム１は、光源１１（光源部）、コリメートレンズ１２、ミラー１３、液晶波長可変フィルタ１４（光源部、第２フィルタ）、空間光変調器１５（第１空間光変調器）、ダイクロイックミラー１６、顕微鏡ユニット１７、空間光変調器１８（第２空間光変調器）、リレーレンズ１９、液晶波長可変フィルタ２０（第１フィルタ）、ミラー２１、カメラ２２、及び制御装置２３を備える。

このような顕微鏡システム１は、光源１１から出力される励起光を試料ＳＰに照射し、これにより得られる蛍光をカメラ２２で撮影することにより、試料ＳＰの共焦点像を得るものである。本実施形態の顕微鏡システム１は、波長帯域が異なる複数の共焦点像を一度の観察で得ることが可能である。尚、試料ＳＰは、例えば、蛍光色素が添加された生体の組織、器官、細胞等であり、ステージＳＴ上に載置されている。

光源１１は、制御装置２３の制御の下で、試料ＳＰを励起するための励起光を出力する。光源１１から出力される励起光は、コヒーレント光（レーザ光）であっても良く、インコヒーレント光であっても良い。光源１１から出力される励起光は、複数の波長を含む励起光である。これは、波長帯域が異なる複数の共焦点像を一度の観察で得るためである。

例えば、光源１１から出力される励起光には、４つの波長λ１～λ４のレーザ光が含まれる。例えば、波長λ１は４０５［ｎｍ］であり、波長λ２は４８８［ｎｍ］であり、波長λ３は５６１［ｎｍ］であり、波長λ４は６４０［ｎｍ］である。尚、光源１１から出力される光の波長範囲は、上記の波長範囲（４０５～６４０［ｎｍ］）に制限される訳ではなく、試料ＳＰの光学的な特性に応じた任意の波長範囲にすることができる。

コリメートレンズ１２は、光源１１から出力される励起光を平行光に変換する（コリメートする）。ミラー１３は、コリメートレンズ１２でコリメートされた励起光を、ステージＳＴ上に載置された試料ＳＰに向けて反射する。

液晶波長可変フィルタ１４は、ミラー１３から試料ＳＰに至る励起光の光路上に配置されており、制御装置２３の制御の下で、特定波長の励起光を透過させる。液晶波長可変フィルタ１４が透過させる励起光の波長は、制御装置２３によって制御される。尚、液晶波長可変フィルタは、ＬＣＴＦ（Liquid Crystal Tunable Filter）とも呼ばれる。

図２は、本発明の第１実施形態による顕微鏡システムに設けられる液晶波長可変フィルタを模式的に示す図である。尚、図２（ａ）は、液晶波長可変フィルタ１４を模式的に示す図であり、図２（ｂ）は、液晶波長可変フィルタ２０を模式的に示す図である。図２（ａ）に示す通り、液晶波長可変フィルタ１４は、励起光が入射する面が、４つの領域Ｒ１１～Ｒ１４に分割されている。液晶波長可変フィルタ１４は、制御装置２３の制御によって、領域Ｒ１１～Ｒ１４毎に異なる波長の励起光を透過させること、及び、各領域Ｒ１１～Ｒ１４を透過させる励起光の波長を変えることが可能である。

例えば、液晶波長可変フィルタ１４は、ある時点では、波長λ１の励起光が領域Ｒ１１を透過し、波長λ２の励起光が領域Ｒ１２を透過し、波長λ３の励起光が領域Ｒ１３を透過し、波長λ４の励起光が領域Ｒ１４を透過するようにすることができる。また、他の時点では、波長λ４の励起光が領域Ｒ１１を透過し、波長λ１の励起光が領域Ｒ１２を透過し、波長λ２の励起光が領域Ｒ１３を透過し、波長λ３の励起光が領域Ｒ１４を透過するようにすることができる。尚、液晶波長可変フィルタ１４の励起光が入射する面の分割数は４に限られる訳ではなく、２又は３であっても良く、５以上であっても良い。

空間光変調器１５は、制御装置２３の制御の下で、液晶波長可変フィルタ１４を透過した励起光の振幅、位相、偏光を空間的、時間的に変調する。空間光変調器１５は、ミラー１３から試料ＳＰに至る励起光の光路上における液晶波長可変フィルタ１４の後段であって、試料ＳＰの観察面（後述する対物レンズ１７ａの焦点面）と光学的に共役となる位置に配置される。この空間光変調器１５は、制御装置２３の制御によって、励起光を透過させる領域を変えることができる。このため、空間光変調器１５は、共焦点光学系のピンホールとして用いられる。尚、空間光変調器は、ＳＬＭ（Spatial Light Modulator）とも呼ばれる。

図３は、本発明の第１実施形態による顕微鏡システムに設けられる空間光変調器を模式的に示す図である。尚、図３（ａ）は、空間光変調器１５を模式的に示す図であり、図３（ｂ）は、空間光変調器１８を模式的に示す図である。図３（ａ）に示す通り、空間光変調器１５は、液晶波長可変フィルタ１４を透過した励起光が入射する面が、複数の画素Ｇ１に区画されている。空間光変調器１５は、励起光の振幅、位相、偏光を、画素Ｇ１毎に変調可能である。

また、制御装置２３の制御によって、図３（ａ）に示す通り、空間光変調器１５に設けられた複数の画素Ｇ１のうち、所定の画素Ｇ１を光透過領域Ａ１１とし、その他の画素Ｇ１を遮光領域Ａ１２とすることができる。これにより、光透過領域Ａ１１とされた画素Ｇ１をピンホールと同様に機能させることができる。尚、制御装置２３の制御によって、光透過領域Ａ１１とする画素Ｇ１及び遮光領域Ａ１２とする画素Ｇ１を選択的に切り替えることができる。このため、本実施形態では、ピンホール（光透過領域Ａ１１）の位置を様々に変化させることができる。

ダイクロイックミラー１６は、光源１１から出力される励起光を透過させるとともに、試料ＳＰに励起光を照射して得られる反射光や蛍光等（以下、これらを総称する場合には、「戻り光」という）を空間光変調器１８に向けて反射する。尚、ダイクロイックミラー１６に代えて、ハーフミラーを用いることもできる。顕微鏡ユニット１７は、対物レンズ１７ａを備えており、ダイクロイックミラー１６を透過した励起光を試料ＳＰに照射するとともに、試料ＳＰに励起光を照射して得られる戻り光をダイクロイックミラー１６に導く。尚、顕微鏡システム１では、対物レンズ１７ａの焦点面（像側焦点面）が試料ＳＰの観察面とされている。

空間光変調器１８は、制御装置２３の制御の下で、ダイクロイックミラー１６で反射された戻り光の振幅、位相、偏光を、空間光変調器１５に同期して空間的、時間的に変調する。空間光変調器１８は、ダイクロイックミラー１６で反射された戻り光の光路上であって、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）と光学的に共役となる位置に配置される。この空間光変調器１８は、制御装置２３の制御によって、戻り光を透過させる領域を変えることができる。このため、空間光変調器１８は、空間光変調器１５と同様に、共焦点光学系のピンホールとして用いられる。

図３（ｂ）に示す通り、空間光変調器１８は、ダイクロイックミラー１６で反射された戻り光が入射する面が、複数の画素Ｇ２に区画されている。空間光変調器１８は、励起光の振幅、位相、偏光を、画素Ｇ２毎に変調可能である。また、制御装置２３の制御によって、図３（ｂ）に示す通り、空間光変調器１８に設けられた複数の画素Ｇ２のうち、所定の画素Ｇ２を光透過領域Ａ２１とし、その他の画素Ｇ２を遮光領域Ａ２２とすることができる。これにより、光透過領域Ａ２１とされた画素Ｇ２をピンホールと同様に機能させることができる。尚、制御装置２３の制御によって、光透過領域Ａ２１とする画素Ｇ２及び遮光領域Ａ２２とする画素Ｇ２を選択的に切り替えることができる。このため、本実施形態では、ピンホール（光透過領域Ａ２１）の位置を様々に変化させることができる。

リレーレンズ１９は、ダイクロイックミラー１６で反射された戻り光の光路上であって、空間光変調器１８の後段に配置されている。このリレーレンズ１９は、空間光変調器１８を透過した戻り光をリレーしつつ、その光学像を液晶波長可変フィルタ２０に結像させる。

液晶波長可変フィルタ２０は、制御装置２３の制御の下で、リレーレンズ１９を介して導かれた戻り光を、試料ＳＰに照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させる。液晶波長可変フィルタ２０が透過させる励起光の波長は、制御装置２３によって制御される。図２（ｂ）に示す通り、液晶波長可変フィルタ２０の入射面は、４つの領域Ｒ２１～Ｒ２４に分割されている。液晶波長可変フィルタ２０は、制御装置２３の制御によって、領域Ｒ２１～Ｒ２４毎に異なる波長の戻り光を透過させること、及び、各領域Ｒ２１～Ｒ２４を透過させる戻り光の波長を変えることが可能である。

図４は、本発明の第１実施形態において、試料に照射される励起光の波長と、観察の対象となっている波長帯域との関係の一例を示す図である。図４に示す通り、試料ＳＰに波長λ１の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ１を有する蛍光が得られ、試料ＳＰに波長λ２の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ２を有する蛍光が得られるとする。また、試料ＳＰに波長λ３の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ３を有する蛍光が得られ、試料ＳＰに波長λ４の照明光が照射された場合にはスペクトルＳＰ４を有する蛍光が得られるとする。

観察の対象となっている波長帯域は、試料ＳＰに波長λ１の励起光が照射された場合には波長帯域ＷＢ１であり、試料ＳＰに波長λ２の励起光が照射された場合には波長帯域ＷＢ２であるとする。また、試料ＳＰに波長λ３の励起光が照射された場合には波長帯域ＷＢ３であり、試料ＳＰに波長λ４の励起光が照射された場合には波長帯域ＷＢ４であるとする。

例えば、液晶波長可変フィルタ２０は、ある時点では、波長帯域ＷＢ１の戻り光が領域Ｒ２１を透過し、波長帯域ＷＢ２の戻り光が領域Ｒ２２を透過し、波長帯域ＷＢ３の戻り光が領域Ｒ２３を透過し、波長帯域ＷＢ４の戻り光が領域Ｒ２４を透過するようにすることができる。また、他の時点では、波長帯域ＷＢ４の戻り光が領域Ｒ２１を透過し、波長帯域ＷＢ１の戻り光が領域Ｒ２２を透過し、波長帯域ＷＢ２の戻り光が領域Ｒ２３を透過し、波長帯域ＷＢ３の戻り光が領域Ｒ２４を透過するようにすることができる。尚、液晶波長可変フィルタ２０の入射面の分割数は、液晶波長可変フィルタ１４の入射面の分割数と同じであれば良く、２又は３であっても良く、５以上であっても良い。

尚、上記の波長帯域ＷＢ１は、例えば、４２２．５～４７６．５［ｎｍ］に設定され、上記の波長帯域ＷＢ２は、例えば、５００．５～５５０［ｎｍ］に設定される。また、上記の波長帯域ＷＢ３は、例えば、５８１．５～６１８．５［ｎｍ］に設定され、上記の波長帯域ＷＢ４は、例えば、６６１．５～６９０．５［ｎｍ］である。尚、上述した波長帯域ＷＢ１～ＷＢ４はあくまでも一例であって、試料ＳＰに照射されるレーザ光の波長に応じて任意の波長帯域を設定することができる。

ミラー２１は、液晶波長可変フィルタ２０を透過した戻り光をカメラ２２に向けて反射する。カメラ２２は、ミラー２１によって反射された戻り光の光学像を撮影して画像を得るものである。このカメラ２２は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device：電荷結合素子）やＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor：相補型金属酸化膜半導体）等の固体撮像素子を備えており、２次元の静止画像又は動画を撮影可能なカメラである。カメラ２２は、その撮像面が試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）と光学的に共役となる位置に配置される。尚、本実施形態において、カメラ２２は、ＣＭＯＳを備えたものであるとする。

制御装置２３は、顕微鏡システム１の動作を統括して制御する。具体的に制御装置２３は、光源１１、液晶波長可変フィルタ１４、空間光変調器１５、空間光変調器１８、液晶波長可変フィルタ２０、及びカメラ２２の動作を制御して、試料ＳＰから発せられる蛍光を撮影する。また、制御装置２３は、カメラ２２で得られた画像を合成して、試料ＳＰの共焦点像を得る処理を行う。この制御装置２３としては、例えば、デスクトップ型のパーソナルコンピュータ、或いはワークステーションにより実現される。尚、制御装置２３は、得られた試料ＳＰの共焦点像を液晶表示装置等の表示装置に表示しても良く、得られた試料ＳＰの共焦点像の画像データを外部に出力しても良い。

〈顕微鏡システムの動作〉
顕微鏡システム１の動作が開始されると、制御装置２３によって光源１１が制御され、光源１１からは複数の波長（例えば、波長λ１～λ４）のレーザ光を含む励起光が出力される。光源１１から出力された励起光は、コリメートレンズ１２でコリメートされてミラー１３で反射された後、液晶波長可変フィルタ１４に入射する。

液晶波長可変フィルタ１４に入射した励起光は、液晶波長可変フィルタ１４でフィルタリングされ、図２（ａ）に示す領域Ｒ１１～Ｒ１４毎に異なる波長の励起光が透過する。例えば、波長λ１の励起光が領域Ｒ１１を透過し、波長λ２の励起光が領域Ｒ１２を透過し、波長λ３の励起光が領域Ｒ１３を透過し、波長λ４の励起光が領域Ｒ１４を透過する。

液晶波長可変フィルタ１４を透過した励起光は、空間光変調器１５に入射し、図３（ａ）に示す通り、ピンホールとして機能する画素Ｇ１（光透過領域Ａ１１とされた画素Ｇ１）を透過する。液晶波長可変フィルタ１４を透過した励起光は、ダイクロイックミラー１６を透過し、顕微鏡ユニット１７によりステージＳＴ上の試料ＳＰに照射される。

図５は、本発明の第１実施形態において励起光が試料ＳＰに照射される様子を説明するための図である。図５に示す矩形領域は、試料ＳＰの観察領域ＯＡを示している。この観察領域ＯＡは、励起光が照射されて蛍光が発せられる領域であり、試料ＳＰの共焦点像を得ようとする領域である。

図５に示す通り、試料ＳＰの観察領域ＯＡには、空間光変調器１５のピンホールとして機能する画素Ｇ１を通過した点状の励起光が照射される。但し、試料ＳＰの観察領域ＯＡ内には、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１～Ｒ１４に対応する照射領域Ｒ１～Ｒ４が設定されており、照射領域Ｒ１～Ｒ４毎に異なる波長の励起光が照射される。

例えば、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１に対応する照射領域Ｒ１には波長λ１の励起光が点状に照射され、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１２に対応する照射領域Ｒ２には波長λ２の励起光が点状に照射される。また、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１３に対応する照射領域Ｒ３には波長λ３の励起光が点状に照射され、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１４に対応する照射領域Ｒ４には波長λ４の励起光が点状に照射される。

試料ＳＰに励起光が照射されると、試料ＳＰからは照射された励起光に応じた蛍光が発せられる。例えば、試料ＳＰの観察領域ＯＡのうちの照射領域Ｒ１からは、図４に示すスペクトルＳＰ１を有する蛍光が発せられ、照射領域Ｒ２からは、図４に示すスペクトルＳＰ２を有する蛍光が発せられる。また、照射領域Ｒ３からは、図４に示すスペクトルＳＰ３を有する蛍光が発せられ、照射領域Ｒ４からは、図４に示すスペクトルＳＰ４を有する蛍光が発せられる。

試料ＳＰから発せられた蛍光を含む戻り光は、顕微鏡ユニット１７を介してダイクロイックミラー１６に導かれて反射された後、空間光変調器１８に入射する。空間光変調器１８に入射した戻り光は、空間光変調器１８に入射し、図３（ｂ）に示す通り、ピンホールとして機能する画素Ｇ２（光透過領域Ａ２１とされた画素Ｇ２）を透過する。空間光変調器１８を透過した戻り光は、リレーレンズ１９を介して液晶波長可変フィルタ２０に導かれる。

液晶波長可変フィルタ２０に導かれた戻り光は、液晶波長可変フィルタ２０でフィルタリングされ、図２（ｂ）に示す領域Ｒ２１～Ｒ２４毎に異なる波長の戻り光が透過する。例えば、図４に示す波長帯域ＷＢ１の戻り光が領域Ｒ２１（図５に示す観察領域ＯＡの照射領域Ｒ１に対応する領域）を通過し、図４に示す波長帯域ＷＢ２の戻り光が領域Ｒ２２（図５に示す観察領域ＯＡの照射領域Ｒ２に対応する領域）を通過する。また、図４に示す波長帯域ＷＢ３の戻り光が領域Ｒ２３（図５に示す観察領域ＯＡの照射領域Ｒ３に対応する領域）を通過し、図４に示す波長帯域ＷＢ４の戻り光が領域Ｒ２４（図５に示す観察領域ＯＡの照射領域Ｒ４に対応する領域）を通過する。

液晶波長可変フィルタ２０を透過した戻り光は、ミラー２１で反射された後、カメラ２２に入射する。すると、ミラー２１によって反射された戻り光の光学像がカメラ２２によって撮影され、撮影された画像の画像データが制御装置２３に出力される。カメラ２２から出力された画像データが入力されると、制御装置２３は、空間光変調器１５，１８を制御して、ピンホールとして機能する画素Ｇ１，Ｇ２（図３参照）の位置を変えつつカメラ２２から出力される画像データを順次取得する。

以上の処理が終了すると、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４，２０を制御して、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１～Ｒ１４を透過させる波長、及び液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１～Ｒ２４を通過させる波長帯域を変える。例えば、制御装置２３は、波長λ４，λ１，λ２，λ３の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１２，Ｒ１４をそれぞれ透過するよう制御する。また、制御装置２３は、図４に示す波長帯域ＷＢ４，ＷＢ１，ＷＢ２，ＷＢ３の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１，Ｒ２２，Ｒ２３，Ｒ２４をそれぞれ通過するように制御する。

以上の制御が終了すると、制御装置２３は、空間光変調器１５，１８を制御して、ピンホールとして機能する画素Ｇ１，Ｇ２（図３参照）の位置を変えつつカメラ２２から出力される画像データを順次取得する。このように、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４，２０を制御しつつ、空間光変調器１５，１８を制御して、試料ＳＰの共焦点像を取得する。

図６は、本発明の第１実施形態による顕微鏡システムの制御シーケンスの一例を示す図である。図６（ａ）に示す通り、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４、空間光変調器１５，１８、及びカメラ２２を同期制御する。尚、図６では図示を省略しているが、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ２０も液晶波長可変フィルタ１４等と同期するように制御する。

図６（ａ）に示す例において、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４を透過する励起光が、図６（ｂ）に示すＰ１～Ｐ４となるように制御する。具体的に、制御装置２３は、時刻ｔ１において、波長λ１，λ２，λ３，λ４の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１２，Ｒ１４をそれぞれ透過するよう制御する。このとき、制御装置２３は、図４に示す波長帯域ＷＢ１，ＷＢ２，ＷＢ３，ＷＢ４の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１，Ｒ２２，Ｒ２３，Ｒ２４をそれぞれ通過するように制御する。

次に、制御装置２３は、時刻ｔ２において、波長λ４，λ１，λ２，λ３の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１２，Ｒ１４をそれぞれ透過するよう制御する。このとき、制御装置２３は、図４に示す波長帯域ＷＢ４，ＷＢ１，ＷＢ２，ＷＢ３の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１，Ｒ２２，Ｒ２３，Ｒ２４をそれぞれ通過するように制御する。

次いで、制御装置２３は、時刻ｔ３において、波長λ３，λ４，λ１，λ２の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１２，Ｒ１４をそれぞれ透過するよう制御する。このとき、制御装置２３は、図４に示す波長帯域ＷＢ３，ＷＢ４，ＷＢ１，ＷＢ２の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１，Ｒ２２，Ｒ２３，Ｒ２４をそれぞれ通過するように制御する。

続いて、制御装置２３は、時刻ｔ４において、波長λ２，λ３，λ４，λ１の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１，Ｒ１２，Ｒ１２，Ｒ１４をそれぞれ透過するよう制御する。このとき、制御装置２３は、図４に示す波長帯域ＷＢ２，ＷＢ３，ＷＢ４，ＷＢ１の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１，Ｒ２２，Ｒ２３，Ｒ２４をそれぞれ通過するように制御する。尚、時刻ｔ５以降は、時刻ｔ１～時刻ｔ４における制御が繰り返される。

このように、制御装置２３は、波長λ１～λ４の励起光が、液晶波長可変フィルタ１４の領域Ｒ１１～Ｒ１４を順次通過するように液晶波長可変フィルタ１４を制御する。また、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４に同期させて、図４に示す波長帯域ＷＢ１～ＷＢ４の戻り光が、液晶波長可変フィルタ２０の領域Ｒ２１～Ｒ２４を順次通過するように制御する。これにより、図５に示す観察領域ＯＡの照射領域Ｒ１～Ｒ４を異なる波長λ１～λ４の励起光で順次励起することができる。また、観察領域ＯＡの照射領域Ｒ１～Ｒ４の各々で発せられる蛍光を含む戻り光を、照射領域Ｒ１～Ｒ４の各々に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させることができる。

制御装置２３に入力された画像データは、制御装置２３に設けられた格納装置（図示省略）格納される。そして、制御装置２３では、格納装置に格納された画像データを読み出して合成し、試料ＳＰの波長帯域が異なる複数の共焦点像を得る処理が行われる。これにより、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）における波長帯域が異なる複数の共焦点像を得ることができる。尚、ステージＳＴを移動させて試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）を変えながら上述した動作を行うことで、試料ＳＰの三次元画像を得ることも可能である。

以上の通り、本実施形態では、まず、光源１１から射出された複数の波長が含まれる励起光を、液晶波長可変フィルタ１４でフィルタリングするとともに、空間光変調器１５で変調するようにしている。これにより、試料ＳＰの観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ１～Ｒ４毎に波長が異なる点状の励起光が照射されるようにしている。次に、照射領域Ｒ１～Ｒ４で発せられる蛍光を含む戻り光を空間光変調器１８で変調するとともに、液晶波長可変フィルタ２０でフィルタリングしてカメラ２２で撮影するようにしている。これにより、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

また、本実施形態では、制御装置２３の制御によって、空間光変調器１５，１８と共焦点像を撮影するカメラ２２とが同期するようにしている。これにより、バンディングノイズが発生するのを防止することができるため、得られる共焦点像の品質の低下を防止することができる。

尚、上述した実施形態では、制御装置２３が、液晶波長可変フィルタ１４，２０、空間光変調器１５，１８、及びカメラ２２を同期制御する例ついて説明した。しかしながら、これら全てが必ずしも同期制御される必要はない。図７は、本発明の第１実施形態における制御装置で行われる同期制御の例を示すタイミングチャートである。図７（ａ）に示す通り、制御装置２３は、液晶波長可変フィルタ１４，２０と、空間光変調器１５，１８と、カメラ２２とが同期しないように制御しても良い。

或いは、図７（ｂ）に示す通り、制御装置２３は、空間光変調器１５，１８とカメラ２２とが同期し、液晶波長可変フィルタ１４，２０が同期しないように制御しても良い。もちろん、図７（ｃ）に示す通り、制御装置２３は、上述した実施形態のように、液晶波長可変フィルタ１４，２０と、空間光変調器１５，１８と、カメラ２２とが同期するように制御しても良い。

また、本実施形態では、制御装置２３が、空間光変調器１５，１８の少なくとも一方を制御すれば、光源１１からカメラ２２に至るまでの光学特性を調整することが可能である。これにより、光学的な収差（例えば、球面収差や色収差）の補正、シェーディング補正、光学的再配置方式による超解像の実現、共焦理論解像度の確保等を行うことができる。また、ステージＳＴを移動させることなく、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）の高速移動を実現することもできる。尚、このような制御を行う場合（例えば、設計段階で行う場合）には、励起光の光路又は戻り光の光路に波面センサを設け、波面センサの検出結果に基づいて行っても良い。

〔第２実施形態〕
〈顕微鏡システムの要部構成〉
図８は、本発明の第２実施形態による顕微鏡システムの要部構成を示す図である。尚、図８においては、図１に示す構成と同じ構成については同一の符号を付してある。図８に示す顕微鏡システム２は、図１に示す光源１１、液晶波長可変フィルタ１４、空間光変調器１５、及びミラー２１を省略し、光源３１ａ，３１ｂ（光源部）、空間光変調器３２ａ，３２ｂ（第１空間光変調器）、ミラー３３、ダイクロイックミラー３４、ミラー３５、ビームスプリッタ３６、波面センサ３７、ビームスプリッタ３８、及び波面センサ３９を設けた構成である。

このような顕微鏡システム２は、光源３１ａ，３１ｂから出力される励起光を試料ＳＰに照射し、これにより得られる蛍光をカメラ２２で撮影することにより、試料ＳＰの共焦点像を得るものである。本実施形態の顕微鏡システム２は、図１に示す顕微鏡システム１と同様に、波長帯域が異なる複数の共焦点像を一度の観察で得ることが可能である。また、本実施形態の顕微鏡システム２は、光源３１ａ，３１ｂからカメラ２２に至るまでの光学特性を調整可能である。

光源３１ａ，３１ｂは、制御装置２３の制御の下で、試料ＳＰを励起するための励起光を出力する。光源３１ａ，３１ｂから出力される励起光は、コヒーレント光（レーザ光）であっても良く、インコヒーレント光であっても良い。光源３１ａ，３１ｂから出力される励起光は、互いに波長が異なる励起光である。これは、波長帯域が異なる複数の共焦点像を一度の観察で得るためである。例えば、光源３１ａから出力される励起光は波長λ１のレーザ光であり、光源３１ｂから出力される励起光は波長λ２のレーザ光である。

空間光変調器３２ａ，３２ｂは、制御装置２３の制御の下で、光源３１ａ，３１ｂから出力された励起光の振幅、位相、偏光を空間的、時間的に変調する。空間光変調器３２ａは、光源３１ａに対応して設けられており、光源３１ａから出力される励起光の光路上であって、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）と光学的に共役となる位置に配置される。空間光変調器３２ｂは、光源３１ｂに対応して設けられており、光源３１ｂから出力される励起光の光路上であって、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）と光学的に共役となる位置に配置される。尚、空間光変調器３２ａ，３２ｂは、図３に示すものと同様のものである。

空間光変調器３２ａ，３２ｂは、対応する光源３１ａ，３１ｂから出力される励起光が、図５に示す試料ＳＰの観察領域ＯＡ内に設定された複数の照射領域の少なくとも１つに照射されるように、対応する光源３１ａ，３１ｂから出力される励起光を変調する。これら空間光変調器３２ａ，３２ｂは、制御装置２３の制御によって、励起光が照射される領域を変えることができる。

例えば、図５に示す通り、観察領域ＯＡ内に４つの照射領域Ｒ１～Ｒ４が設定されている場合を考える。この場合には、空間光変調器３２ａは、例えば、対応する光源３１ａから出力される励起光が、図５に示す観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ１に照射されるように、対応する光源３１ａから出力される励起光を変調する。また、空間光変調器３２ｂは、例えば、対応する光源３１ｂから出力される励起光が、図５に示す観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ２に照射されるように、対応する光源３１ｂから出力される励起光を変調する。

尚、上記の場合において、空間光変調器３２ａは、例えば、対応する光源３１ａから出力される励起光が、図５に示す観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ１，Ｒ２に照射されるように、対応する光源３１ａから出力される励起光を変調しても良い。また、空間光変調器３２ｂは、例えば、対応する光源３１ｂから出力される励起光が、図５に示す観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ３，Ｒ４に照射されるように、対応する光源３１ｂから出力される励起光を変調しても良い。

ミラー３３は、空間光変調器３２ａを通過した励起光をダイクロイックミラー３４に向けて反射する。ダイクロイックミラー３４は、ミラー３３で反射された励起光を透過させるとともに、空間光変調器３２ａを通過した励起光を反射する。尚、空間光変調器３２ａ，３２ｂを通過した励起光の光学像は、ダイクロイックミラー３４で合成されることになる。ミラー３５は、ダイクロイックミラー３４で合成された励起光の光学像をコリメートレンズ１２に向けて反射する。

ビームスプリッタ３６は、ミラー１３とダイクロイックミラー１６との間における励起光の光路上に配置されており、ミラー１３で反射された励起光の一部を波面センサ３７に向けて反射する。波面センサ３７は、ビームスプリッタ３６で反射される励起光の光路上に配置されており、ビームスプリッタ３６で反射される励起光（即ち、ミラー１３で試料ＳＰに向けて反射された励起光）の波面を検出し、その検出結果を制御装置２３に出力する。

ビームスプリッタ３８は、図１に示すミラー２１に代えて設けられており、液晶波長可変フィルタ２０を透過した戻り光の一部をカメラ２２に向けて反射し、残りの一部を透過させる。波面センサ３９は、液晶波長可変フィルタ２０を透過した戻り光の光路上に配置されており、液晶波長可変フィルタ２０を透過した戻り光（即ち、カメラ２２の撮像面に結像される戻り光）の波面を検出し、その検出結果を制御装置２３に出力する。

本実施形態において、制御装置２３は、波面センサ３７，３９の検出結果に基づいて、空間光変調器３２ａ，３２ｂ又は空間光変調器１８の少なくとも一方を制御して、光源３１ａ，３１ｂからカメラ２２に至るまでの光学特性を調整する。例えば、制御装置２３は、波面センサ３７の検出結果に基づいて、空間光変調器３２ａ，３２ｂを制御することにより、試料ＳＰの観察を行いながら、試料ＳＰに照射される励起光の波面を調整する。また、制御装置２３は、波面センサ３９の検出結果に基づいて、空間光変調器１８を制御することにより、試料ＳＰの観察を行いながら、カメラ２２に入射する戻り光の波面を調整する。

このような波面の調整を行うことで、光学的な収差（例えば、球面収差や色収差）の補正、シェーディング補正、光学的再配置（ＯＰＲ：Optical Photon Reassignment）方式による超解像の実現、共焦理論解像度の確保等を行うことができる。また、ステージＳＴを移動させることなく、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）の高速移動を実現することもできる。

〈顕微鏡システムの動作〉
本実施形態の顕微鏡システム２は、光源３１ａ，３１ｂ及び空間光変調器３２ａ，３２ｂの組み合わせによって試料ＳＰに照射する励起光を生成しており、基本的な動作は第１実施形態の顕微鏡システム１と同様である。このため、ここでの詳細な説明は省略する。

以上の通り、本実施形態では、まず、光源３１ａ，３１ｂから射出された互いに波長が異なる励起光を、空間光変調器３２ａ，３２ｂで変調するようにしている。これにより、試料ＳＰの観察領域ＯＡ内に設定された照射領域Ｒ１～Ｒ４の少なくとも２つに波長が異なる点状の励起光が照射されるようにしている。次に、照射領域Ｒ１～Ｒ４の少なくとも２つで発せられる蛍光を含む戻り光を空間光変調器１８で変調するとともに、液晶波長可変フィルタ２０でフィルタリングしてカメラ２２で撮影するようにしている。これにより、蛍光クロストークの影響が殆ど無く、解像度及びコントラストが優れた共焦点像を得ることができる。

また、本実施形態では、第１実施形態と同様に、制御装置２３の制御によって、空間光変調器１５，１８と共焦点像を撮影するカメラ２２とを同期させることが可能である。これにより、バンディングノイズが発生するのを防止することができるため、得られる共焦点像の品質の低下を防止することができる。

また、本実施形態では、波面センサ３７，３９の検出結果に基づいて、制御装置２３が、空間光変調器３２ａ，３２ｂ又は空間光変調器１８の少なくとも一方を制御して、光源３１ａ，３１ｂからカメラ２２に至るまでの光学特性を調整するようにしている。これにより、光学的な収差（例えば、球面収差や色収差）の補正、シェーディング補正、光学的再配置方式による超解像の実現、共焦理論解像度の確保等を行うことができる。また、ステージＳＴを移動させることなく、試料ＳＰの観察面（対物レンズ１７ａの焦点面）の高速移動を実現することもできる。

以上、本発明の実施形態による顕微鏡システムについて説明したが、本発明は上記実施形態に制限されることなく本発明の範囲内で自由に変更が可能である。例えば、上述した第１実施形態では、４つの波長λ１～λ４が含まれる励起光を出力する光源１１を備える例について説明した。しかしながら、光源１１は、２又は３の波長が含まれる励起光を出力するものであっても、５以上の波長が含まれる励起光を出力するものであっても良い。また、上述した第２実施形態では、２つの波長λ１，λ２の励起光をそれぞれ出力する光源３１ａ，３１ｂを備える例について説明した。しかしながら、顕微鏡システム２に設けられる光源の数は、３つ以上であっても良い。

１，２ 顕微鏡システム
１１ 光源
１４ 液晶波長可変フィルタ
１５ 空間光変調器
１８ 空間光変調器
２０ 液晶波長可変フィルタ
２２ カメラ
２３ 制御装置
３１ａ，３１ｂ 光源
３２ａ，３２ｂ 空間光変調器
ＯＡ 観察領域
Ｒ１～Ｒ４ 照射領域
Ｒ１１～Ｒ１４ 領域
Ｒ２１～Ｒ２４ 領域
ＳＰ 試料

Claims (8)

1. 試料に照射される励起光を出力する光源部と、
   前記光源部から出力される励起光を変調する第１空間光変調器と、
   前記第１空間光変調器で変調された励起光が前記試料に照射されることにより得られる蛍光を、前記第１空間光変調器に同期して変調する第２空間光変調器と、
   前記第２空間光変調器で変調された蛍光を、前記試料に照射される励起光の波長に応じて選択的に透過させる第１フィルタと、
   前記第１フィルタを透過した蛍光を撮影する撮影装置と、
   を備える顕微鏡システム。
2. 前記光源部は、前記試料の観察領域内に設定された複数の照射領域に異なる波長の励起光が照射されるようにされており、
   前記第１フィルタは、前記複数の照射領域に対応する領域毎に、異なる波長帯域の蛍光を選択的に透過させる、
   請求項１記載の顕微鏡システム。
3. 前記光源部は、複数の波長を含む励起光を出力する光源と、
   前記光源から出力される励起光のうち、前記複数の照射領域に対応する領域毎に異なる波長の励起光を透過させる第２フィルタと、
   を備える請求項２記載の顕微鏡システム。
4. 前記第２フィルタは、前記第１空間光変調器に同期して、前記複数の照射領域に対応する領域の各々を透過させる励起光の波長を変える、請求項３記載の顕微鏡システム。
5. 前記光源部は、波長が異なる励起光を出力する複数の光源を備えており、
   前記第１空間光変調器は、前記複数の光源に対応して複数設けられていて、対応する光源から出力される励起光が前記複数の照射領域の少なくとも１つに照射されるように、対応する光源から出力される励起光を変調する、
   請求項２記載の顕微鏡システム。
6. 前記第１空間光変調器は、対応する光源から出力される励起光が照射される前記複数の照射領域の少なくとも１つを変える、請求項５記載の顕微鏡システム。
7. 前記撮影装置は、前記第１空間光変調器及び前記第２空間光変調器に同期して、前記第１フィルタを透過した蛍光を撮影する、請求項１から請求項６の何れか一項に記載の顕微鏡システム。
8. 前記第１空間光変調器又は前記第２空間光変調器の少なくとも一方を制御して、前記光源部から前記撮影装置に至るまでの光学特性を調整する制御装置を更に備える請求項１から請求項７の何れか一項に記載の顕微鏡システム。

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