JP5095935B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents
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Description
本発明は、標本面上を照明光で走査したときの標本からの透過光や反射光又は標本に発生する蛍光を検出する顕微鏡装置に関するものである。
従来、標本に光刺激を与えるための光刺激用光学系を備えた走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、蛍光観察を行うために標本に照射する観察用レーザ光を光軸に垂直な面内で走査させる第１のレーザ走査装置と、刺激用レーザ光を標本平面の任意の位置に照射するために刺激用レーザ光を移動させる第２のレーザ走査装置とを備えている。
特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡は、蛍光観察を行うために標本に照射する観察用レーザ光を光軸に垂直な面内で走査させる第１のレーザ走査装置と、刺激用レーザ光を標本平面の任意の位置に照射するために刺激用レーザ光を移動させる第２のレーザ走査装置とを備えている。
また、従来、水銀ランプを備える観察用の光学系と、水銀ランプを備える第１の光刺激用の光学系と、レーザ光源を備える第２の光刺激用の光学系とを備え、標本等に応じて光刺激に用いる光学系を使い分ける顕微鏡装置が知られている（例えば、特許文献２参照。）。特許文献２に開示されている顕微鏡装置は、標本において発生した蛍光を観察光学系を介してＴＶモニタなどに表示することにより、標本の様子を観察可能としている。
しかしながら、上記特許文献１に開示されている走査型レーザ顕微鏡では、刺激を与える領域が広範囲にわたる場合、走査に時間がかかり、早い反応を捕らえることができないという問題があった。
また、上記特許文献２に開示されている顕微鏡装置では、標本の深さ方向に対して観察面を移動させることができないため、標本の内部状態を観察することができないという問題があった。
また、上記特許文献２に開示されている顕微鏡装置では、標本の深さ方向に対して観察面を移動させることができないため、標本の内部状態を観察することができないという問題があった。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、標本の内部まで観察できるとともに、広範囲に渡る光刺激を短時間で行うことのできる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、観察用レーザ光を出射するレーザ光源と、該観察用レーザ光を、対物レンズを介して標本の所定の観察面内で２次元的に走査する走査光学系とを有する少なくとも１つの観察用走査光学系と、光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、前記標本と前記対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置と、前記観察用レーザ光が前記標本に照射されることにより生じた蛍光を検出する検出光学系とを備え、前記検出光学系が、前記光刺激に用いられた光の波長帯域を除去するためのフィルタを備える顕微鏡装置を提供する。
本発明は、観察用の光を発するランプ光源を備えた照明部と、回転することにより前記ランプ光源からの光を標本上で走査する共焦点ディスクと、標本からの観察光を検出する検出部とを有するディスク走査光学系と、光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、前記標本と対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、前記ディスク走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置とを具備する顕微鏡装置を提供する。
本発明は、観察用レーザ光を出射するレーザ光源と、該観察用レーザ光を、対物レンズを介して標本の所定の観察面内で２次元的に走査する走査光学系とを有する少なくとも１つの観察用走査光学系と、光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、前記標本と前記対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置と、前記観察用レーザ光が前記標本に照射されることにより生じた蛍光を検出する検出光学系とを備え、前記検出光学系が、前記光刺激に用いられた光の波長帯域を除去するためのフィルタを備える顕微鏡装置を提供する。
本発明は、観察用の光を発するランプ光源を備えた照明部と、回転することにより前記ランプ光源からの光を標本上で走査する共焦点ディスクと、標本からの観察光を検出する検出部とを有するディスク走査光学系と、光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、前記標本と対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、前記ディスク走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置とを具備する顕微鏡装置を提供する。
上記構成によれば、レーザ光源から出射された観察用レーザ光は、走査光学系の作用により標本の所定の観察面内で２次元的に走査されることとなる。これにより、標本における所望の断面内の細胞状態等を観察することが可能となる。また、広範囲に渡り光を照射できるランプ光源を備えた刺激用光学系を光刺激に用いるので、光刺激の領域が広範囲に渡る場合でも、該領域全体に渡って一括して光刺激を実行することが可能となる。これにより、光刺激を効率的に短時間で行うことが可能となる。また、シャッタの開閉を切り替えることにより、ランプ光源からの光を効率的に遮断、透過させることができる。これにより、標本への光刺激の開始、終了を極めて容易に行うことができる。
以上のことから本発明によれば、ランプ光源からの光照射により広範囲な光刺激を行いながら、観察用走査光学系にて標本の３次元的な観察を行うことができる。
更に、上記構成によれば、観察用走査光学系が備える走査光学系の走査と、刺激用光学系が備えるシャッタの開閉と、焦準機構による観察面の移動とが同期して行われるので、観察と光刺激のタイミングを所望のタイミングに調節することが可能となる。これにより、標本の所望の断面を観察しながら、所望の断面に対して光刺激を行うことができる。この結果、光刺激直後の反応の観察が可能となり、標本の動的特性を解析することができる。
更に、上記構成によれば、検出光学系が光刺激に用いられた光の波長帯域を除去するためのフィルタを備えるため、刺激用光学系からの漏れ光を効率的にカットすることが可能となる。これにより、標本にて生じた蛍光成分のみを検出することができるので、検出精度を向上させることが可能となる。上記フィルタとしては、例えば、ＵＶカットフィルタ、ＩＲカットフィルタ、蛍光を透過するバンドパスフィルタ等を採用することが可能である。
なお、上記観察用走査光学系は、共焦点効果を用いた共焦点走査型の観察光学系を採用しても良く、極短パルスレーザ光を標本に照射させて多光子励起を生じさせ、このときの蛍光の様子を取得する多光子励起型の観察光学系を採用しても良い。特に、多光子励起型の観察光学系を採用した場合には、検出光学系にピンホール等を不要とすることができるので、高感度検出が可能となる。また、本発明の顕微鏡装置は、上記共焦点走査型の観察光学系と多光子励起型の観察光学系との双方を備えていても良い。
また、共焦点ディスクは、共焦点画像を高速に取得することができるので、光刺激による反応時間が非常に短い場合でも、標本断面全体の反応状態を捉えることが可能となる。
以上のことから本発明によれば、ランプ光源からの光照射により広範囲な光刺激を行いながら、観察用走査光学系にて標本の３次元的な観察を行うことができる。
更に、上記構成によれば、観察用走査光学系が備える走査光学系の走査と、刺激用光学系が備えるシャッタの開閉と、焦準機構による観察面の移動とが同期して行われるので、観察と光刺激のタイミングを所望のタイミングに調節することが可能となる。これにより、標本の所望の断面を観察しながら、所望の断面に対して光刺激を行うことができる。この結果、光刺激直後の反応の観察が可能となり、標本の動的特性を解析することができる。
更に、上記構成によれば、検出光学系が光刺激に用いられた光の波長帯域を除去するためのフィルタを備えるため、刺激用光学系からの漏れ光を効率的にカットすることが可能となる。これにより、標本にて生じた蛍光成分のみを検出することができるので、検出精度を向上させることが可能となる。上記フィルタとしては、例えば、ＵＶカットフィルタ、ＩＲカットフィルタ、蛍光を透過するバンドパスフィルタ等を採用することが可能である。
なお、上記観察用走査光学系は、共焦点効果を用いた共焦点走査型の観察光学系を採用しても良く、極短パルスレーザ光を標本に照射させて多光子励起を生じさせ、このときの蛍光の様子を取得する多光子励起型の観察光学系を採用しても良い。特に、多光子励起型の観察光学系を採用した場合には、検出光学系にピンホール等を不要とすることができるので、高感度検出が可能となる。また、本発明の顕微鏡装置は、上記共焦点走査型の観察光学系と多光子励起型の観察光学系との双方を備えていても良い。
また、共焦点ディスクは、共焦点画像を高速に取得することができるので、光刺激による反応時間が非常に短い場合でも、標本断面全体の反応状態を捉えることが可能となる。
上記の発明において、光刺激に用いられるレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光を、前記標本の所定の断面内で２次元的に走査する走査光学系とを備える少なくとも１つの刺激用走査光学系を具備することとしても良い。
このような構成によれば、広範囲（例えば、直径数十から数百μｍ）に渡って効率的に光刺激を行うのに適している刺激用光学系と、短時間でスポット的（例えば、直径数μｍ）に光刺激を与えるのに適している刺激用走査光学系とを備えるので、標本の特性等に応じて、光刺激に用いる光学系を切り替えることが可能となる。これにより、目的等によって最適な光学系を用いての効果的な光刺激を実施することができる。
更に、レーザ光とランプ光源からの光は、照明範囲の違いだけでなく、エネルギー密度も異なる。したがって、両機能を備えることにより、刺激時間や反応時間等を異ならせることが可能となり、光刺激の自由度を高めることができる。
このような構成によれば、広範囲（例えば、直径数十から数百μｍ）に渡って効率的に光刺激を行うのに適している刺激用光学系と、短時間でスポット的（例えば、直径数μｍ）に光刺激を与えるのに適している刺激用走査光学系とを備えるので、標本の特性等に応じて、光刺激に用いる光学系を切り替えることが可能となる。これにより、目的等によって最適な光学系を用いての効果的な光刺激を実施することができる。
更に、レーザ光とランプ光源からの光は、照明範囲の違いだけでなく、エネルギー密度も異なる。したがって、両機能を備えることにより、刺激時間や反応時間等を異ならせることが可能となり、光刺激の自由度を高めることができる。
上記の発明において、前記刺激用走査光学系が、前記レーザ光源と前記標本との間の光路にシャッタを備えることとしても良い。
このような構成によれば、シャッタの開閉を切り替えることにより、レーザ光源からの光を効率的に遮断、透過させることができる。これにより、標本への光刺激の開始、終了を極めて容易に行うことができる。
このような構成によれば、シャッタの開閉を切り替えることにより、レーザ光源からの光を効率的に遮断、透過させることができる。これにより、標本への光刺激の開始、終了を極めて容易に行うことができる。
上記の発明において、前記制御装置が、前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記刺激用走査光学系が有するシャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することとしても良い。
このような構成によれば、観察用走査光学系が備える走査光学系の操作と、刺激用光学系が備えるシャッタの開閉と、刺激用走査光学系が備えるシャッタの開閉と、焦準機構による観察面の移動とが同期して行われるので、観察と光刺激のタイミングを所望のタイミングに調節することが可能となる。これにより、標本の所望の断面を観察しながら、所望の断面に対して光刺激を行うことができる。
このような構成によれば、観察用走査光学系が備える走査光学系の操作と、刺激用光学系が備えるシャッタの開閉と、刺激用走査光学系が備えるシャッタの開閉と、焦準機構による観察面の移動とが同期して行われるので、観察と光刺激のタイミングを所望のタイミングに調節することが可能となる。これにより、標本の所望の断面を観察しながら、所望の断面に対して光刺激を行うことができる。
本発明によれば、標本の内部まで観察できるとともに、広範囲に渡る光刺激を短時間で行うことができるという効果を奏する。
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
〔第１の実施形態〕
図１は、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。
本実施形態に係る顕微鏡装置は、標本観察用の励起光を標本Ａの焦点面上に２次元的に走査させて照射する共焦点型の観察用走査光学系１と、刺激を与えるための光を標本Ａに照射する刺激用光学系２とを備えている。
〔第１の実施形態〕
図１は、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。
本実施形態に係る顕微鏡装置は、標本観察用の励起光を標本Ａの焦点面上に２次元的に走査させて照射する共焦点型の観察用走査光学系１と、刺激を与えるための光を標本Ａに照射する刺激用光学系２とを備えている。
観察用光学系１は、レーザ光源１１、ダイクロイックミラー１２、走査光学ユニット１３、リレーレンズ１４及びミラー１５を備えて構成される。走査光学ユニット１３は、例えば、互いに直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー１３ａ，１３ｂを対向配置してなるガルバノスキャナである。
ミラー１５により反射されたレーザ光路上には、結像レンズ１６、対物レンズ１７が設けられている。標本Ａは、ステージ１８上に載せられている。ステージ１８は、焦準機構１００により駆動されることにより昇降可能に構成されている。また、上記リレーレンズ１４の焦点位置は、結像レンズ１６の焦点位置と一致するように配置されている。
ミラー１５により反射されたレーザ光路上には、結像レンズ１６、対物レンズ１７が設けられている。標本Ａは、ステージ１８上に載せられている。ステージ１８は、焦準機構１００により駆動されることにより昇降可能に構成されている。また、上記リレーレンズ１４の焦点位置は、結像レンズ１６の焦点位置と一致するように配置されている。
上記観察用走査光学系１のダイクロイックミラー１２の分岐光路上には、検出光学系３が配置されている。この検出光学系３は、測光フィルタ３１、集光レンズ３２、共焦点ピンホール３３及び光電変換素子３４を備えて構成される。光電変換素子３４から出力されるアナログ信号は、例えば、Ａ／Ｄ変換器（図示略）に転送されてデジタルデータに変換された後に、コンピュータ（図示略）に入力される。コンピュータは、Ａ／Ｄ変換器から出力される輝度データに基づいて画像データを作成し、この画像データをモニタに表示することで、標本Ａにおける任意の観察面の状態をユーザに提供する。
刺激用光学系２は、ランプ光源２１、コレクタレンズ２２、励起フィルタ２３、標本Ａへ向かう光の遮断／透過を切り替えるためのシャッタ２４、照射範囲を限定するための可変絞り２５、集光レンズ２６、コンデンサレンズ２７を備えて構成されている。
ランプ光源２１は、例えば、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、フラッシュランプ、ＬＥＤ光源等である。励起フィルタ２３は、観察に用いる試薬に応じた特性を持つものが採用されるが、例えば、ケイジド試薬を用いる場合には、３００乃至４００ｎｍの波長域の光を透過させる特性を有している。
ランプ光源２１は、例えば、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、フラッシュランプ、ＬＥＤ光源等である。励起フィルタ２３は、観察に用いる試薬に応じた特性を持つものが採用されるが、例えば、ケイジド試薬を用いる場合には、３００乃至４００ｎｍの波長域の光を透過させる特性を有している。
また、図１において符号１０は、観察用走査光学系１の走査光学ユニット１３、刺激用光学系２のシャッタ２４、および、焦準機構１００を同期して制御する制御装置である。
このような構成を備える顕微鏡装置において、標本Ａの観察を行う際には、レーザ光源１１からレーザ光（以下「観察用レーザ光」という。）が出射される。この観察用レーザ光は、ダイクロイックミラー１２を介して走査光学ユニット１３へ導かれ、任意の方向に偏向走査される。更に、観察用レーザ光は、リレーレンズ１４、ミラー１５、結像レンズ１６、対物レンズ１７を介して、ステージ１８上に固定された標本Ａの断面上に集光され、断面内で２次元に走査される。
標本Ａには、観察用レーザ光の波長によって励起される蛍光指示薬が導入されており、断面内で観察用レーザ光が２次元的に走査されることにより、蛍光指示薬が励起されて蛍光を生じる。対物レンズ１７により捕らえられた蛍光は、上記観察用レーザ光と同じ光路を逆向きに進み、対物レンズ１７、結像レンズ１６、ミラー１５、リレーレンズ１４、走査光学ユニット１３を介してダイクロイックミラー１２へ導かれる。ダイクロイックミラー１２は、観察用レーザ光の波長より長い波長の光を反射する特性となっており、これにより上記蛍光はダイクロイックミラー１２により反射され、検出光学系３へ導入される。
検出光学系３において、蛍光は、測光フィルタ３１により特定の波長の光が選択透過され、さらに集光レンズ３２、共焦点ピンホール３３により断面からの光のみが選択されて、光電変換素子３４へ入射され、電気信号に変換される。光電変換素子３４の出力信号は、Ａ／Ｄ変換器（図示略）によりディジタル信号に変換された後、コンピュータ（図示略）に供給される。コンピュータは検出光学系３からのディジタル信号に基づいて画像データを作成し、この画像データをモニタに出力する。これにより、標本Ａの断面の蛍光画像（蛍光輝度の２次元分布）がユーザに提供されることとなる。
また、このとき、制御装置１０は、走査光学ユニット１３の走査に同期して、ステージ１８を昇降させることにより、標本Ａにおける観察面を所望の深さ方向に移動させることが可能となる。これにより、標本Ａの所望の深さ断面の細胞状態を観察することができる。
また、このとき、制御装置１０は、走査光学ユニット１３の走査に同期して、ステージ１８を昇降させることにより、標本Ａにおける観察面を所望の深さ方向に移動させることが可能となる。これにより、標本Ａの所望の深さ断面の細胞状態を観察することができる。
一方、光刺激を開始する際には、閉状態であったシャッタ２４が、制御装置１０により開状態とされる。これにより、ランプ光源２１からの光は、コレクタレンズ２２を介して励起フィルタ２３に導かれ、所定の波長帯域の光が透過される。所定の波長帯域の光は、シャッタ２４を介して可変絞り２５に導かれ、光刺激を施す部位に応じた位置及び照射範囲に調節されて、集光レンズ２６、コンデンサレンズ２７を介して標本Ａに照射される。これにより、標本Ａの特定部位の全体にわたって、光刺激を同時に行うことができる。
この場合において、制御装置１０は、上述の観察用走査光学系１の走査光学ユニット１３の制御と同期してシャッタ２４の開閉を制御する。これにより、光刺激を行うタイミングを、観察を行うタイミングに応じて調節することが可能となり、所望の観察タイミングで光刺激を行うことができる。また、光刺激直後の反応を観察することも可能となるので、刺激用光学系２による光照射によって引き起こされる標本Ａの動的特性（化学反応）などを観察することができる。
〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図２は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図２に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、図１に示した顕微鏡装置の構成に、更に、レーザ光源４１を備える刺激用走査光学系４を追加した構成をとる。
この刺激用走査光学系４は、レーザ光を出射するレーザ光源４１と、シャッタ４２、走査光学ユニット４３、リレーレンズ４４、およびミラー４５を備えて構成される。走査光学ユニット４３は、例えば、互いに直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー４３ａ，４３ｂを対向配置してなるガルバノスキャナである。
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図２は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図２に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、図１に示した顕微鏡装置の構成に、更に、レーザ光源４１を備える刺激用走査光学系４を追加した構成をとる。
この刺激用走査光学系４は、レーザ光を出射するレーザ光源４１と、シャッタ４２、走査光学ユニット４３、リレーレンズ４４、およびミラー４５を備えて構成される。走査光学ユニット４３は、例えば、互いに直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー４３ａ，４３ｂを対向配置してなるガルバノスキャナである。
ミラー４５により反射されたレーザ光路上には、結像レンズ４６、ダイクロイックミラー４７、及びコンデンサレンズ２７が設けられている。ダイクロイックミラー４７は、ミラー４５により反射されたレーザ光の光路Ｌ１と刺激用光学系２が備えるランプ光源２１から出射された光の光路Ｌ２とが交差する位置に配置されている。更に、このダイクロイックミラー４７は、上記光路Ｌ１に対して出し入れ可能な構成となっている。更に、このダイクロイックミラー４７は、レーザ光源４１からの光を透過し、ランプ光源２１からの光を反射する特性を有している。リレーレンズ４４の焦点位置は、結像レンズ４６の焦点位置と一致するように配置されている。
また、図２において符号２０は、観察用走査光学系１の走査光学ユニット１３、刺激用光学系２のシャッタ２４、刺激用走査光学系４のシャッタ４２並びに走査光学ユニット４３、ダイクロイックミラー４７の光軸Ｌ１に対する出し入れ、および、ステージ１８の昇降操作を行う焦準機構１００を同期して制御する制御装置である。
このような構成を備える顕微鏡装置において、刺激用走査光学系４により光刺激を行う場合には、制御装置２０によりシャッタ４２が開状態とされる。これにより、レーザ光源４１から出射された刺激用レーザ光は、シャッタ４２を介して走査光学ユニット４３に導かれ、任意の方向に偏向走査される。その後、刺激用レーザ光は、リレーレンズ４４、ミラー４５、結像レンズ４６、ダイクロイックミラー４７、コンデンサレンズ２７を介して、ステージ１８上に固定された標本Ａの所定の断面上に集光される。
ここで、制御装置２０は、上記走査光学ユニット４３が備えるガルバノミラー４３ａ，４３ｂを所定の範囲にわたって連続的に揺動させることにより、標本Ａの所定断面内に設定された光刺激の対象部位全体に渡ってレーザ光を走査させながら照射させても良い。また、制御装置２０は、ガルバノミラー４３ａ，４３ｂを所定の角度で静止させることにより、標本の所定断面内に設定された所定の光刺激位置に、スポット的にレーザ光を照射させても良い。更に、制御装置２０は、ガルバノミラー４３ａ，４３ｂを瞬間的にスキップ作動させることで、標本Ａの所定断面内に設定された複数の任意の位置に、スポット的にレーザ光を瞬間的に照射させても良い。
そして、刺激用走査光学系４による光刺激の終了時には、制御装置２０により、シャッタ４２が閉状態とされることにより、標本Ａへのレーザ光の投入が遮断される。
そして、刺激用走査光学系４による光刺激の終了時には、制御装置２０により、シャッタ４２が閉状態とされることにより、標本Ａへのレーザ光の投入が遮断される。
また、刺激用光学系２による光刺激を行う際には、制御装置２０によりシャッタ２４が開状態とされることにより、ランプ光源２１から発せられた光がコレクタレンズ２２を介して励起フィルタ２３に導かれる。励起フィルタ２３により透過された所定の波長帯域の光は、開状態にあるシャッタ２４を介して可動絞り２５に導かれ、光刺激を施す部位に応じた位置及び照射範囲に調節されて、集光レンズ２６、ダイクロイックミラー４７、コンデンサレンズ２７を介して標本Ａに照射される。これにより、標本Ａの広範囲にわたって、光刺激を行うことができる。
以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡装置によれば、広範囲（例えば、）に渡って効率的に光刺激を行うのに適している刺激用光学系２と、短時間でスポット的（例えば、直径数μｍ）に光刺激を与えるのに適している刺激用走査光学系４とを備えるので、目的に応じて、光刺激に用いる光学系を切り替えることが可能となる。これにより、最適な光学系を用いての効果的な光刺激を実施することができる。更に、レーザ光とランプ光源から発せられた光とは、照明範囲の違いだけでなく、エネルギー密度も異なる。従って、標本Ａ上における刺激時間や反応時間を異ならせることも可能となる。これにより、光刺激の自由度を高めることができる。
また、シャッタ１４と２３とを同期して開状態とすることにより、ランプ光源２１からの光とレーザ光源２２からのレーザ光を標本Ａに同時に照射することも可能となる。これにより、光刺激のバリエーションを増やすことができる。
なお、本実施形態に係るシャッタ４２に代えて、音響光学素子を設けることとしてもよい。
また、シャッタ１４と２３とを同期して開状態とすることにより、ランプ光源２１からの光とレーザ光源２２からのレーザ光を標本Ａに同時に照射することも可能となる。これにより、光刺激のバリエーションを増やすことができる。
なお、本実施形態に係るシャッタ４２に代えて、音響光学素子を設けることとしてもよい。
〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図３は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図３に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、多光子励起型の観察用走査光学系５と、検出光学系６と、刺激用光学系２とを備えている。また、本実施形態に係る顕微鏡装置は、観察用光学系５の光路と刺激用光学系２の光路とを途中で一致させ、これら観察用及び刺激用の光学系を１つの対物レンズ１７で共有する構成としている。
次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図３は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図３に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、多光子励起型の観察用走査光学系５と、検出光学系６と、刺激用光学系２とを備えている。また、本実施形態に係る顕微鏡装置は、観察用光学系５の光路と刺激用光学系２の光路とを途中で一致させ、これら観察用及び刺激用の光学系を１つの対物レンズ１７で共有する構成としている。
観察用走査光学系５は、極短パルスレーザ光を出射するレーザ光源５１、シャッタ５２、走査光学ユニット５３、リレーレンズ５４及びミラー５５を備えて構成される。走査光学ユニット５３は、例えば、互いに直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー５３ａ，５３ｂを対向配置してなるガルバノスキャナである。
ミラー５５により反射されたレーザ光の光路上には、図１と同様に、結像レンズ１６、対物レンズ１７が配置されている他、結像レンズ１６と対物レンズ１７との間に、ダイクロックミラー５７，５８が配置されている。
ダイクロイックミラー５７は、レーザ光源５１からのレーザ光が標本Ａに照射されることにより、励起された蛍光を検出光学系６へ導くためのものであり、レーザ光源５１から出射された励起光（近赤外光）を透過し、標本からの蛍光（可視光）を反射する特性を有している。
ダイクロイックミラー５８は、ランプ光源２１からの刺激用の光（紫光、紫外光）を反射し、レーザ光源５１からの励起光（近赤外光）を透過するとともに、標本Ａからの蛍光（可視光）を透過する特性を有している。
ミラー５５により反射されたレーザ光の光路上には、図１と同様に、結像レンズ１６、対物レンズ１７が配置されている他、結像レンズ１６と対物レンズ１７との間に、ダイクロックミラー５７，５８が配置されている。
ダイクロイックミラー５７は、レーザ光源５１からのレーザ光が標本Ａに照射されることにより、励起された蛍光を検出光学系６へ導くためのものであり、レーザ光源５１から出射された励起光（近赤外光）を透過し、標本からの蛍光（可視光）を反射する特性を有している。
ダイクロイックミラー５８は、ランプ光源２１からの刺激用の光（紫光、紫外光）を反射し、レーザ光源５１からの励起光（近赤外光）を透過するとともに、標本Ａからの蛍光（可視光）を透過する特性を有している。
検出光学系６は、ＵＶカットフィルタ６１、ＩＲカットフィルタ６２、蛍光の波長成分を透過させるバンドパスフィルタ６３、集光レンズ６４，６５及び光電変換素子６６を備えている。ここで、ＵＶカットフィルタ６１、ＩＲカットフィルタ６２、バンドパスフィルタ６３は、検出光学系６に入射された光から標本Ａにて生じた蛍光のみを取り出し、それ以外の波長の光を除去するためのものであり、光刺激に用いられる光の波長、観察用レーザ波長、および蛍光波長に応じて適宜その特性が選択されるものである。
また、図３において符号３０は、シャッタ５２，２４、走査光学ユニット５３及びステージ１８の昇降操作を行う焦準機構１００を同期して制御する制御装置である。
また、図３において符号３０は、シャッタ５２，２４、走査光学ユニット５３及びステージ１８の昇降操作を行う焦準機構１００を同期して制御する制御装置である。
このような構成を備える顕微鏡装置において、観察を行う際には、シャッタ５２が制御装置３０により開状態にされる。レーザ光源５１から出射された極短パルスレーザ光は、開状態にあるシャッタ５２を介して走査光学ユニット５３に導かれ、任意の方向に偏光走査される。その後、極短パルスレーザ光は、リレーレンズ５４、ミラー５５、結像レンズ１６、ダイクロイックミラー５７，５８、および対物レンズ１７を介して、ステージ１８上に固定された標本Ａの所定の断面上に集光され、断面内で２次元に走査される。
このように光が照射されると、この光により蛍光指示薬が励起され、蛍光が発せられる。この標本からの蛍光は、先ほどと同じ光路を途中まで逆向きに進み、つまり、対物レンズ１７、ダイクロイックミラー５８を介してダイクロイックミラー５７へ導かれる。ダイクロイックミラー５７は、レーザ光源からの励起光（近赤外光）を透過し、標本からの蛍光（可視光）を反射する特性となっているため、蛍光はダイクロイックミラー５７により反射され、検出光学系６へ導かれる。
検出光学系６において、蛍光は、ＵＶフィルタ６１、ＩＲフィルタ６２、バンドパスフィルタ６３に導かれることにより、それぞれ特有の波長の光が除去されることにより、標本Ａの断面にて生じた蛍光のみが選択されて、さらに集光レンズ６４，６５を介して光電変換素子６６へ入射される。光電変換素子６６により計測された輝度情報は、アナログ電気信号として、図示しないＡ／Ｄ変換器へ出力され、更に、コンピュータに送られることにより、標本Ａの断面状態が画像としてユーザへ提供される。
次に、光刺激用光学系２を用いた光刺激を実行する際には、制御装置３０によってシャッタ２４が開状態とされる。これにより、ランプ光源２１から発せられた刺激用の光は、コレクタレンズ２２を介して励起フィルタ２３に導かれ、所定の波長帯域の光が選択されたのち、開状態にあるシャッタ２４を介して可変絞り２５へ導かれる。可変絞り２５により、所定範囲及び所定位置に調節された刺激用の光は、集光レンズ２６を介してダイクロイックミラー５８へ導かれる。ダイクロイックミラー５８に導かれた刺激用の光は、観察用光学系５からの観察用レーザ光と合成されて、ダイクロイックミラー５８、対物レンズ１７を介して標本Ａの所定範囲に照射される。
標本Ａにおいて励起された蛍光は、対物レンズ１７によって集光され、ダイクロイックミラー５８を透過し、ダイクロイックミラー５７により反射されて、検出光学系６へ導かれる。検出光学系６において、標本Ａからの光は、ＵＶフィルタ６１、ＩＲフィルタ６２、バンドパスフィルタ６３を通過することで、蛍光像劣化の原因である標本表面で反射された励起光や刺激用の光の漏れ光がほぼ完全に除去され、任意の蛍光のみが光電子変換素子６６へ導かれて測定されることとなる。
これにより、光刺激と観察とを同時期に行った場合でも、標本Ａの所定の断面上における蛍光成分のみを抽出することができ、高い精度で標本Ａの観察を行うことが可能となる。
これにより、光刺激と観察とを同時期に行った場合でも、標本Ａの所定の断面上における蛍光成分のみを抽出することができ、高い精度で標本Ａの観察を行うことが可能となる。
以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡装置によれば、観察用レーザ光を出射する光源として極短パルスレーザ光を出射するレーザ光源５１を用いるので、検出光学系にピンホールが不要となるとともに、検出光学系６を走査光学ユニット５３の前段に設置することが可能となる。これにより、図１に示した検出光学系３と比べて、検出光学系６と標本Ａとの間に介在するレンズや反射面数を少なくすることができるので、光電変換素子６６に入射させる蛍光の強度を高めることが可能となる。これにより、検出精度を向上させることができる。
更に、検出光学系６は、ＵＶカットフィルタ６１、ＩＲカットフィルタ６２、バンドパスフィルタ６３を備えるので、光刺激に用いられた光を除去することが可能となる。これにより、検出精度を更に高めることができる。
また、観察用と刺激用とで光路を途中から共有することで、レンズ等を共有することができるので、装置全体として小型化を図ることができる。
また、本実施形態に係るシャッタ４２に代えて、音響光学素子を設けることとしてもよい。
また、観察用と刺激用とで光路を途中から共有することで、レンズ等を共有することができるので、装置全体として小型化を図ることができる。
また、本実施形態に係るシャッタ４２に代えて、音響光学素子を設けることとしてもよい。
なお、本実施形態に係る顕微鏡装置は、図４に示すように、更に、共焦点型の観察用走査光学系１並びに検出光学系３を備えていても良い。このような構成とした場合、ミラー５５およびダイクロイックミラー５７は、光路に対して出し入れ可能な構成とされる。そして、観察用光学系として、共焦点型の観察用走査光学系１を用いる場合には、ミラー５５およびダイクロイックミラー５７を光路Ｌからはずすことにより、レーザ光源１１からの励起光を標本Ａに導き、また、標本Ａからの蛍光を上記励起光と同じ経路を辿って検出光学系３へ導く。また、このとき、観察用走査光学系５のシャッタ５２は閉状態とされていることにより、レーザ光源５１からの極短パルスレーザ光は遮断される。
一方、観察光光学系として、観察用走査光学系５を用いる場合、つまり、極短パルスレーザを用いた多光子励起による観察を行う場合には、ミラー５５及びダイクロイックミラー５７を光路Ｌに挿入することにより、レーザ光源５１から出射された極短パルスレーザ光を標本Ａに導く。この場合、標本Ａ上にて生じた蛍光は、ダイクロイックミラー５８を透過し、更に、ダイクロイックミラー５７により反射されて検出光学系６に導かれることとなる。なお、この場合には、観察用走査光学系１のレーザ光源１１はオフ状態とされている。また、ミラー５５およびダイクロイックミラー５７の光路への出し入れ制御については、例えば、制御装置３０により行われるものとする。
〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図５は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図５に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、ディスク走査光学系７と、刺激用光学系２とを備えている。
次に、本発明の第４の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
図５は、本実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示すブロック図である。この図において、図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図５に示すように、本実施形態に係る顕微鏡装置は、ディスク走査光学系７と、刺激用光学系２とを備えている。
ディスク走査光学系７の照明部は、ランプ光源７１、コレクタレンズ７２、励起フィルタ７３、シャッタ７４、可変絞り７５、ダイクロイックミラー７６を備えている。
ランプ光源７１は、例えば、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、フラッシュランプ等である。励起フィルタ７３は、例えば、ＧＦＰの蛍光タンパクを用いる場合には、約４６０ｎｍから４８０ｎｍの波長域の光を透過させる特性を有している。
ランプ光源７１は、例えば、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ、フラッシュランプ等である。励起フィルタ７３は、例えば、ＧＦＰの蛍光タンパクを用いる場合には、約４６０ｎｍから４８０ｎｍの波長域の光を透過させる特性を有している。
ダイクロイックミラー７６は、ランプ光源７１から発せられた励起光を反射し、標本Ａからの蛍光を透過する特性を備えている。ダイクロイックミラー７６により反射される光の光路上には、リレーレンズ７７、共焦点ディスク７８、結像レンズ７９、および対物レンズ８０が配置されている。共焦点ディスク７８は、基板面が光軸に対して略直交するように配置され、光軸に平行な軸を中心として回転可能に構成されている。共焦点ディスク７８はリレーレンズ７７，結像レンズ７９の焦点位置に配置されており、対物レンズ８０の焦点位置と共焦点ディスク７８の位置とは互いに共役となっている。
共焦点ディスク７８には、多数のピンホールまたはピンホールと同程度の幅を有するスリットが形成されている。これを回転させることにより、ピンホールまたはスリットを透過した励起光が標本Ａ上で走査される。
ディスク走査光学系７の検出部８は、ダイクロイックミラー７６の透過光路上に設けられ、吸収フィルタ８１、結像レンズ８２、撮像装置８３を備えている。
図５において、符号４０は、刺激用光学系２が備えるシャッタ２４、ステージ１８の昇降を行う焦準機構１００、およびディスク走査光学系７が備えるシャッタをそれぞれ同期して制御する制御装置である。
ディスク走査光学系７の検出部８は、ダイクロイックミラー７６の透過光路上に設けられ、吸収フィルタ８１、結像レンズ８２、撮像装置８３を備えている。
図５において、符号４０は、刺激用光学系２が備えるシャッタ２４、ステージ１８の昇降を行う焦準機構１００、およびディスク走査光学系７が備えるシャッタをそれぞれ同期して制御する制御装置である。
このような構成を備える顕微鏡装置において、ディスク走査光学系７により観察を行う際には、制御装置４０によりシャッタ７４が開状態とされる。これにより、ランプ光源７１から発せられた観察用の光（励起光）は、コレクタレンズ７２を介して励起フィルタ７３に導かれ、所定の波長帯域の光が選択された後、開状態にあるシャッタ７４を介して可変絞り７５へ導かれる。可変絞り７５により調節された観察用の光は、ダイクロイックミラー７６により反射され、リレーレンズ７７を介して共焦点ディスク７８へ導かれる。共焦点ディスク７８に設けられたピンホールまたはスリットを通過した観察用の光は、結像レンズ７９、対物レンズ８０を介して標本上を走査されて蛍光を励起させる。
標本からの蛍光は、対物レンズ８０、結像レンズ７９、共焦点ディスク７８、リレーレンズ７７、およびダイクロイックミラー７６を介して検出部８へ入射される。検出部８に入射した光は、吸収フィルタ８１により蛍光以外の光成分が除去され、蛍光の波長成分が結像レンズ８２を介して撮像装置８３へ導かれる。
以上説明してきたように、本実施形態に係る顕微鏡装置によれば、ディスク走査光学系を備える観察用光学系を用いて観察を行うので、標本Ａの断面の情報を高速で、かつ、広範囲に渡って取得することが可能となり、光刺激直後の反応を広範囲に渡って観察することができる。
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
例えば、上述の各実施形態において、それぞれの光学系を任意に組み合わせて用いることが可能である。例えば、図１に示した観察用走査光学系１に代えて、図３に示した観察用走査光学系５を用いるようにしてもよい。この場合、検出光学系は、各観察用光学系に応じて変更される。また、図３に示した観察用走査光学系５に代えて、観察用走査光学系１、または観察用光学系７を採用しても良い。更に、図３、図４に示した各顕微鏡装置が刺激用走査光学系４を更に備える構成としても良い。
また、観察用光学系２と刺激用走査光学系４の配置においては、図３に示すように、観察用走査光学系と光路の一部を一致させて共通の対物レンズ１７を用いるような配置としてもよいし、図１、図４に示すように、観察光学系の光路とは光路を別にし、それぞれ標本Ａを挟んで対向する側に配置されていても良い。また、刺激用光学系２と刺激用走査光学系４との双方を備える場合には、いずれか一方の刺激用の光学系については、観察用の光学系と同一の方向から光刺激を行い、他方の刺激用の光学系については、観察用の光学系と異なる方向から光刺激を行うような構成としても良い。
また、上述の顕微鏡装置が２台以上の観察用の光学系を備えるようにしても良い。この場合、目的に応じて、観察に用いる光学系を切り替えるようにしても良い。
また、上述の顕微鏡装置が２台以上の観察用の光学系を備えるようにしても良い。この場合、目的に応じて、観察に用いる光学系を切り替えるようにしても良い。
１，５ 観察用走査光学系
２ 刺激用光学系
３，６，８ 検出光学系
４ 刺激用走査光学系
７ 観察用光学系
１０，２０，３０，４０ 制御装置
１１，４１，５１ レーザ光源
１３，４３，５３ 走査光学ユニット
１７ 対物レンズ
１８ ステージ
２１，７１ ランプ光源
６１ ＵＶカットフィルタ
６２ ＩＲカットフィルタ
６３ バンドパスフィルタ
２ 刺激用光学系
３，６，８ 検出光学系
４ 刺激用走査光学系
７ 観察用光学系
１０，２０，３０，４０ 制御装置
１１，４１，５１ レーザ光源
１３，４３，５３ 走査光学ユニット
１７ 対物レンズ
１８ ステージ
２１，７１ ランプ光源
６１ ＵＶカットフィルタ
６２ ＩＲカットフィルタ
６３ バンドパスフィルタ
Claims (7)
- 観察用レーザ光を出射するレーザ光源と、該観察用レーザ光を、対物レンズを介して標本の所定の観察面内で２次元的に走査する走査光学系とを有する少なくとも１つの観察用走査光学系と、
光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、
前記標本と前記対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、
前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置と、
前記観察用レーザ光が前記標本に照射されることにより生じた蛍光を検出する検出光学系とを備え、
前記検出光学系が、前記光刺激に用いられた光の波長帯域を除去するためのフィルタを備える顕微鏡装置。 - 観察用の光を発するランプ光源を備えた照明部と、回転することにより前記ランプ光源からの光を標本上で走査する共焦点ディスクと、標本からの観察光を検出する検出部とを有するディスク走査光学系と、
光刺激に用いられる波長を有する光を出射するランプ光源と、該ランプ光源と前記標本との間の光路に配置されたシャッタ及び前記標本の照射部位を調節する可変絞りとを有し、該光を前記可変絞りで設定された前記標本の特定部位全体に同時に照射する少なくとも１つの刺激用光学系と、
前記標本と対物レンズとの距離を調節する焦準機構と、
前記ディスク走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記焦準機構とを同期して制御することにより、前記標本の異なる断面の観察を可能とするとともに、所望の断面の観察において所望のタイミングで光刺激を行わせる制御装置と
を具備する顕微鏡装置。 - 光刺激に用いられるレーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光を、前記標本の所定の断面内で２次元的に走査する走査光学系とを備える少なくとも１つの刺激用走査光学系を具備する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡装置。
- 前記刺激用走査光学系が、前記レーザ光源と前記標本との間の光路にシャッタを備える請求項３に記載の顕微鏡装置。
- 前記制御装置が、前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタと、前記刺激用走査光学系が有するシャッタと、前記焦準機構とを同期して制御する請求項４に記載の顕微鏡装置。
- 前記制御装置が、前記観察用走査光学系が有する前記走査光学系と、前記刺激用光学系が備える前記シャッタとを同期して制御することにより、前記刺激用光学系のランプ光源による光刺激の直後の標本を前記観察用走査光学系により観察する請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
- 前記制御装置は、前記観察用走査光学系により所望の標本断面の観察を行いながら前記刺激用光学系及び前記刺激用走査光学系の少なくとも一方により前記標本へ光刺激を与える請求項５に記載の顕微鏡装置。
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