JP4339553B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高いセクショニング効果を持つ共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、共焦点顕微鏡は、ディスクスキャン型とレーザー走査型の二種類が良く知られており、この内、ディスクスキャン型共焦点顕微鏡は、通常の顕微鏡と比較して試料の横方向分解能が高いだけでなく、試料の高さ方向（Ｚ方向）に非常に高いセクショニング効果を持つという大きな特徴を有している。そのため、ディスクスキャン型共焦点顕微鏡と画像処理技術とを組み合わせることにより、試料の３次元画像構築が可能であるという優れた特徴を有している。
【０００３】
図１１は、ディスクスキャン型共焦点顕微鏡の代表的な構成例を示している。このディスクスキャン型共焦点顕微鏡には、目視観察と撮像装置（ＣＣＤカメラ）による観察との二通りの観察方法があるが、ここではＣＣＤカメラを用いた例を示している。図に示す如く、光源１から出射した照明光は、コリメターレンズ２を通ってハーフミラー３に入射し、ここで反射されてマスクパターン部材としての回転ディスク４を照明する。この回転ディスク４は、例えばニポウディスクと呼ばれる螺旋状に複数のピンホールが形成されたものであるが、他にスリットパターンが形成されたものも知られている。この回転ディスク４は、モーター５の回転軸５ａに取り付けられていて、所定の回転速度で回転される。回転ディスク4に照射された照明光は、回転ディスク４に形成された複数のピンホールを通過し、対物レンズ６により試料７上に結像される。
【０００４】
試料７からの反射光は、再び対物レンズ６及び回転ディスク４のピンホールを介してハーフミラー３を透過し、集光レンズ８を通ってＣＣＤカメラ９に入射する。
コンピュータ１０は、ＣＣＤカメラ９から出力された画像信号を取り込み、画像処理を行って所望の画像データを記憶すると共に、モニタ１１に画像を表示する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、このディスクスキャン型共焦点顕微鏡においては、回転ディスク４のピンホールを通過した照明光が対物レンズ６を介して試料７を照射し、その反射光が再び対物レンズ６に戻って回転ディスク４のピンホールとハーフミラー３を介して集光レンズ８によりＣＣＤカメラ９上に結像するようになっているため、試料７が図１２に示すような三次元構造を有していて、その外面の傾斜角が著しく大きい（急峻である）場合、この傾斜面での反射光は対物レンズ８の開口外へ反射してしまい、対物レンズ８には戻らない。そのため、ＣＣＤカメラ９上に形成される像は反射光の不足で非常に暗い像となり、画像にならない恐れがある。この結果、部分的な三次元画像しか構築できないという問題があった。
【０００６】
この場合、開口数の大きい対物レンズに切り替えることにより、ある程度までは反射光を対物レンズの開口内に取り込むことは可能であるが、開口数の大きい対物レンズは動作距離が小さいため適用できる試料が限られてしまったり、倍率の制約があったりして様々な試料に使用することは難しい。
【０００７】
本発明は、上記の如き従来技術の有する問題点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、試料の急峻な斜面部分をも観察でき、より正確な三次元画像が構築できる共焦点顕微鏡を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するため、本発明による共焦点顕微鏡は、落射照明光源と、所定のパターンで光透過部と光遮光部が形成されたマスクパターン部材と、前記落射照明光源からの光を前記マスクパターン部材に導く第１の照明光学系と、前記マスクパターン部材からの光を試料上に照射する対物レンズとを備えた共焦点顕微鏡であって、複数の発光手段によって前記第１の照明光学系の光路とは異なる光路で試料を斜めに照明する第２の照明光学系を備え、前記複数の発光手段の各々が試料上の実質的に一点に向かうように設置されているとともに、前記マスクパターン部材は、前記所定のパターンが形成されたパターン領域と、前記所定のパターンが形成されていない透過領域とからなり、前記パターン領域が第１の照明光学系の光路を通過している期間のみ前記落射照明光源をオンにし、前記透過領域が第１の照明光学系の光路を通過している期間のみ前記複数の発光手段をオンにすることを特徴とする。
また、本発明によれば、上記共焦点顕微鏡は、前記第１の照明光学系からの照明と前記第２の照明光学系からの照明を切り替える切換機構を備えている。
また、本発明によれば、前記パターン領域と前記透過領域の境界線は、前記マスクパターン部材の中心から周辺に向けて形成されている。
また、本発明によれば、前記パターン領域と前記透過領域の境界線は、前記マスクパターン部材の中心に対して同心円状に形成されている。
また、本発明によれば、前記パターン領域は、直線状の光透過部と光遮光部を交互に配置したスリット状に形成されている。
また、本発明によれば、前記第２の照明光学系の発光手段は、発光素子である。
また、本発明によれば、前記第２の照明光学系は、少なくとも一部の領域の前記発光素子を選択的に発光させる。
また、本発明によれば、前記切換機構は、前記第１の照明光学系と第２の照明光学系の少なくとも一方に設けられたシャッターである。
また、本発明によれば、前記第２の照明光学系は、前記対物レンズの光軸に対して傾斜した方向から照明する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図示した実施例に基づき説明する。図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の第１実施例の構成図である。図中、従来技術で示したのと実質上同一の部材には同一符号が付され、それらについての説明は省略されている。この実施例においては、落射照明光源１から出射した照明光は、コリメーターレンズ２，ハーフミラー３を通して複数のピンホールが形成された回転ディスク４を照射する。回転ディスク４はモータ５により所定の速度で回転せしめられており、回転ディスク４に形成された複数のピンホールを通過した照明光が、対物レンズ６により試料７上に結像される。試料７からの反射光は、再び対物レンズ６，回転ディスク４のピンホールを介してハーフミラー３を透過し、集光レンズ８によりＣＣＤカメラ９に入射せしめられる。コンピュータ１０は、ＣＣＤカメラ９から出力される画像信号を取り込み、必要に応じて画像処理等を施し、画像或いは演算結果をモニタ１１に表示する。
【００１０】
更に、対物レンズ６の周囲には、対物レンズ６の光軸を中心としてドーム照明装置１２が取り付けられている。このドーム照明装置１２は、図2（a）に示すように、例えば多数の光ファイバー素線で構成された光ファイバーバンドルであって、互いに分離された各光ファイバー素線の先端部が半球状をなすよう配置されることにより形成されるか、或いは図２（b）に示すように、半球状の支持体に多数の光源例えばLEDを取り付けて、それらの発光端が試料面上の実質的に共通な一点に向かうように配置されることにより形成されたものである。そして、図２（a）に示された照明装置の場合、斜照明光源１３からの照明光は、光ファイバー１４によってドーム照明装置１２まで導かれることにより、また、図２（b）に示された照明装置の場合には光源を一斉に点灯することにより、試料７の表面を落射照明では得られない照明角度（水平方向に近い角度までの広い角度)範囲で照明することが出来る。
【００１１】
第１実施例は上記のように構成されているから、試料７が平坦或いは緩やかな傾斜面を持つ場合、落射照明光源１で照明された時の試料７からの反射光は対物レンズ６の開口内に戻り、一方、斜照明光源１３で照明された時の試料７からの反射光は対物レンズ６の開口内には戻らない。従って、従来の共焦点顕微鏡と同様に良好なセクショニング画像が得られる。これに対して、図３（a）及び（b）に示すように試料７が球状或いは凹凸構造で急な斜面を持つ場合は、落射照明光源１で照明された時の試料７からの反射光は対物レンズ６の開口内に戻らないため、この部分のセクショニング画像が得られない。しかしながら、本実施例では斜照明光源１３による照明を行っているため、斜照明光源１３で照明された時の試料７からの反射光は対物レンズ６の開口内に戻る。この結果、落射照明光源１のみによる照明では得られなかった部分の像を得ることができる。
【００１２】
なお、この斜照明光源１３で得られる画像は、照明光が回転ディスク４のピンホールを通過していない。そのため、従来の共焦点顕微鏡で得られる画像に比べると、光軸に垂直な面内における分解能は低くなる。しかしながら、試料７からの反射光はピンホールを通過するので、セクショニング効果は失っていない。但し、本実施例におけるこの場合のセクショニング効果は、従来の共焦点顕微鏡のセクショニング効果と同じとは云えない。
【００１３】
このように上記第１実施例によれば、従来の共焦点顕微鏡では観察不能であった部分の観察が簡単な構成で可能となる。しかも、何れの照明による像においても、程度の違いはあるもののセクショニング効果が損なわれることはない。
【００１４】
図４は本発明に係る共焦点顕微鏡の第２実施例の構成図である。図中、従来技術及び上記第１実施例で示したのと実質上同一の部材には同一符号が付され、それらについての説明は省略されている。この実施例においては、回転ディスク１５には例えば図５に示すようなピンホールパターンが形成されている。即ち、回転ディスク１５の一方の半円部分にはマスクパターンとして複数のピンホールが形成されており、他方の半円部分にはマスクパターンが形成されておらず光は素通しとなる。また、回転ディスク１５の周辺部には何れの半円部分が光路を通過しているかを識別するためのパターン１５ａが形成されている。回転ディスク１５の周辺部には、このパターン１５ａと協働するように配置されたフォトセンサ１６が設置されていて、回転ディスク１５の回転動作に同期した信号（図６（a）参照）が生成されるようになっている。
【００１５】
フォトセンサ１６の出力端は落射照明光源１の電源回路と反転器１７を介して斜照明光源１３の電源回路にそれぞれ接続されていて、フォトセンサ１６は、マスクパターンとしての複数のピンホールが形成されている半円部分が光路を通過している期間のみ落射照明光源1に対してON信号（図６（b）参照）を出し、逆に斜照明光源１３に対しては反転器17によりOFF信号（図６（c）参照）を出力するようになっている。また、マスクターンが形成されていない半円部分が光路を通過している期間は、逆に落射照明光源1に対してOFF信号を出し、斜照明光源１３に対しては反転器１７によりON信号を出力する。なお、回転ディスク１５の回転数は、ＣＣＤカメラ９のフレームレートに対して半分の速度で回転するように設定されている。つまり、回転ディスク１５の半回転毎に一枚の画像がえられるような設定になっている。
【００１６】
第２実施例は上記のように構成されているから、第１実施例の場合と同様に、試料７が平坦或いは緩やかな傾斜面を持つ場合は、落射照明光源１で照明された時の試料７からの反射光は、対物レンズ６の開口内に戻る。一方、斜照明光源１３で照明された時の試料７からの反射光は、対物レンズの開口内には戻らない。従って、従来の共焦点顕微鏡と同様に良好なセクショニング画像が得られる。これに対して、試料７が球状又は凹凸構造で急な斜面を持つ場合は、落射照明光源１で照明された時の試料７からの反射光は、対物レンズ６の開口内には戻らない。一方、斜照明光源１３で照明された時の試料７からの反射光は、対物レンズ６の開口内に戻ることになる。
【００１７】
但し、本第２実施例の場合、第１実施例とは以下の点で異なる。即ち、第１点は、照明光に加えて試料７からの反射光も回転ディスク１５のピンホールを通過しないため、従来の共焦点顕微鏡で得られる画像に比べると、光軸に垂直な面内における分解能が低く、セクショニング効果も認められない画像になる。即ち、従来の光学顕微鏡（非共焦点型）の明視野像と同じ像になる。しかしながら、従来の共焦点顕微鏡では反射光が殆ど戻らないために、観察不能であった部分の観察が可能となる。更に、斜照明光源１３で得られる画像は、回転ディスク１５のマスクパターンの形成されていない半円が光路を通過する期間に撮像されたものであるため、第１実施例に比べて光量ロスの少ない明るい画像が得られる。
【００１８】
第２点は、回転ディスク１５に光が素通しになる透明領域を備えていることである。この場合、落射照明光源1からの光は、ピンホールが形成されているパターン領域と透明領域による二つの異なる照明を行う。そこで、例えば試料７が平坦な場合を考えると、パターン領域を通過した光も透明領域を通過した光も、何れも試料７で反射して対物レンズの開口内を通過する。この結果、セクショニング画像の方が明視野像に比べて暗くなる。
【００１９】
ところで、三次元画像はセクショニング画像から得られる。即ち、試料７と対物レンズ６との間の距離を変えながらセクショニング画像を撮像し、各画素で最も明るい値を保持するという信号処理を行う。そこで、明視野像が得られる状態でこの処理を行うと、明視野像がセクショニング画像に比べて明るいため、セクショニング画像の方が常に明視野像に基づいて信号処理が行われる。しかしながら、明視野像は所謂スライス像ではないので、上記信号処理を行っても正確な三次元画像は得られない。そこで、本第２実施例では、光源のON／OFF制御を行って、セクショニング画像が得られる部分では明視野像が得られないようにしている。コンピュタ１０で三次元画像を構築する際は、上記のようにして交互に得られる２種類の画像について各画素毎に輝度値を比較して、輝度の大きい方を採用することにより、正確な三次元画像が得られるようにしている。
【００２０】
以上説明したように、第２実施例によれば、従来の共焦点顕微鏡では観察不可能であった部分の観察が可能となる。また、第１実施例に比べても、光量ロスの少ない明るい画像を得ることが出来る。なお、本第２実施例では、各照明光による悪影響を回避するために、回転ディスク１５の回転に同期させて落射照明光源と斜照明光源とを制御しているが、このような制御を行わなくても同様な効果が得られる場合もある。また、回転ディスク１５とＣＣＤカメラ９のフレームレートの関係を固定値に設定しているが、ＣＣＤカメラ９に対して回転ディスク１５の回転動作により生成される信号を与えて同期を取る方法、或いは回転ディスク１５の回転制御を行って、ＣＣＤカメラ９のフレームレートに対して回転ディスク１５の回転数を制御する方法により、より安定した画像を得る方法もある。
【００２１】
図７は本発明に係る共焦点顕微鏡の第３実施例の構成図である。図中、従来技術及び既述の実施例で示したのと実質上同一の部材には同一符号が付され、それらについての説明は省略されている。この実施例においては、第2実施例と同様に落射照明光源１及び斜照明光源１３に対してのON／OFF制御を行うが、この制御をコンピュータにより例えばI／Oポートを用いて行うようにしたものである。即ち、この実施例では、予め試料７の形状（高さや構造）が分かっている場合、セクショニング画像を得る高さ毎に、何れの光源（或いは両方の光源）によって照明すべきかを決定できるので、予めプログラミングしておき、コンピュータ１０によって落射照明光源１と斜照明光源１３を制御して、三次元画像を構築することが出来る。
【００２２】
更に、一様にマスクパターンが形成された回転ディスク４の代わりに、回転ディスクの径方向に応じて異なるパターンを形成した回転ディスクを用い、モーター５ごと移動させることにより、光路内に異なるマスクパターンを配置できるように構成し、照明する光源に応じてマスクパターンを切り替えるようにしても良い。例えば、図８に示すように第１の領域には従来通りのピンホールを配置し、第２の領域にはマスクパターンのない回転ディスク４を用い、試料７の比較的平坦な部分に対しては落射照明光源１により照明し、回転ディスクの第１の領域を光路内に配置して、セクショニング効果のある画像を得るようにしている。試料７の斜面部分に対しては斜照明光源１３により照明し、回転ディスク４の第２の領域を光路内に配置して、斜面部分の明るい画像を得ることが出来る。
【００２３】
以上、三つの実施例について説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、上記第１、第２および第３の実施例においては、何れもマスクパターン部材として複数のピンホールを形成した回転ディスクを用いているが、これに限らず、図９及び図１０に示すように、直線状の透光部１８aと遮光部１８bを交互に配置したパターンを有する回転ディスク１８を用いても良い。また、例えば液晶表示装置に、回転ディスクが回転しているのと同様にピンホールを回転表示させたり、所定の範囲で揺動表示させたりすることにより実現させても良い。また、斜照明装置としてドーム照明装置を用いているが、例えばリング照明を同心円状に複数配置しても同様の効果が得られる。
【００２４】
なお、図1に示した第１実施例では、ドーム照明装置１２による照明のために光源１３が設けられているが、この光源１３の代わりにハーフミラー３を透過して集光レンズ２´で集光された光を光源として用いても良い（図１鎖線図示）。共焦点顕微鏡用の光源は高輝度のものが用いられることが多いので、ハーフミラー３を透過した光でも十分照明光として利用することが出来る。また、落射照明と斜照明とで同じような明るさの像が得られるように、ハーフミラー３の透過率特性を設定しても良い。また、光源１と１３の光出射側にシャッター１９を夫々設けて、このシャッター１９を切り換えることにより、第２及び第３実施例で述べたのと同様の効果を得るようにすることも出来る。この場合、シャッター１９は光源１及び１３の何れか一方に設けて操作するようにしても良い。
【００２６】
【発明の効果】
上述のように本発明によれば、従来の共焦点顕微鏡では観察できなかった試料の斜面部分をも観察できるようになるため、より正確な三次元画像の構築が可能となると共に、種々のアプリケーションに適用可能な共焦点顕微鏡を提供することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る共焦点顕微鏡の第１実施例の構成図である。
【図２】（a）は第１実施例に用いられるドーム照明装置の一例の一部破断斜視図、（b）は他の例の一部破断斜視図である。
【図３】（a）は試料が球状の場合の（b）は試料が凹凸構造で急な斜面を持つ場合の第１実施例における反射光の様子を夫々示す説明図である。
【図４】本発明に係る共焦点顕微鏡の第２実施例の構成図である。
【図５】第２実施例に用いられる回転ディスクのピンホールパターンを示す平面図である。
【図６】（a）は第２実施例における回転ディスクの回転動作に同期したフォトセンサ出力の変化を示す線図、（b）は落射照明光源に対するON／OFF信号を示す線図、（c）は斜照明光源に対するON／OFF信号を示す線図である。
【図７】本発明に係る共焦点顕微鏡の第３実施例の構成図である。
【図８】第３実施例に用いられる回転ディスクのピンホールパターンを示す平面図である。
【図９】回転ディスクの他の実施例を示す平面図である。
【図１０】回転ディスクの更に他の実施例を示す平面図である。
【図１１】従来の共焦点顕微鏡の構成図である。
【図１２】従来の共焦点顕微鏡における反射光の様子を示す説明図で、（a）は試料が球状の場合、（b）は試料が凹凸構造で急な斜面を持つ場合である。
【符号の説明】
１ 落射照明光源
２ コリメータレンズ
２´，８ 集光レンズ
３ ハーフミラー
４，１５，１８ 回転ディスク（マスクパターン部材）
５ モーター
６ 対物レンズ
７ 試料
９ ＣＣＤカメラ
１０ コンピュータ
１１ モニタ
１２ ドーム照明装置
１３ 斜照明光源
１４ ファイバー
１６ フォトセンサ
１７ 反転器
１９ シャッター

Claims (9)

1. 落射照明光源と、所定のパターンで光透過部と光遮光部が形成されたマスクパターン部材と、前記落射照明光源からの光を前記マスクパターン部材に導く第１の照明光学系と、前記マスクパターン部材からの光を試料上に照射する対物レンズとを備えた共焦点顕微鏡であって、複数の発光手段によって前記第１の照明光学系の光路とは異なる光路で試料を斜めに照明する第２の照明光学系を備え、前記複数の発光手段の各々が試料上の実質的に一点に向かうように設置されているとともに、前記マスクパターン部材は、前記所定のパターンが形成されたパターン領域と、前記所定のパターンが形成されていない透過領域とからなり、前記パターン領域が第１の照明光学系の光路を通過している期間のみ前記落射照明光源をオンにし、前記透過領域が第１の照明光学系の光路を通過している期間のみ前記複数の発光手段をオンにすることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記第１の照明光学系からの照明と前記第２の照明光学系からの照明を切り替える切換機構を備えたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記パターン領域と前記透過領域の境界線は、前記マスクパターン部材の中心から周辺に向けて形成されていることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記パターン領域と前記透過領域の境界線は、前記マスクパターン部材の中心に対して同心円状に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記パターン領域は、直線状の光透過部と光遮光部を交互に配置したスリット状に形成されていることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記第２の照明光学系の前記発光手段は、発光素子であることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
7. 前記第２の照明光学系は、少なくとも一部の領域の前記発光素子を選択的に発光させることを特徴とする請求項６に記載の共焦点顕微鏡。
8. 前記切換機構は、前記第１の照明光学系と第２の照明光学系の少なくとも一方に設けられたシャッターであることを特徴とする請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
9. 前記第２の照明光学系は、前記対物レンズの光軸に対して傾斜した方向から照明することを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。

Images