JP2006195390A - レーザ走査型蛍光顕微鏡および検出光学系ユニット - Google Patents

Abstract

【課題】 特に、マウス等の実験動物を生きたまま(in vivo)観察する場合においても、観察したい深さ位置の明るい蛍光画像を取得し続けることを可能とする。
【解決手段】 光源ユニット３と、コリメート光学系１２と、スキャナ１３と、瞳投影光学系１４と、結像光学系１５と、対物光学系１６と、第１のリレー光学系２０と、第２のリレー光学系２１と、光検出器２３とを備え、
Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡１を提供する。
ここで、Ｄは受光部２３ａの寸法、Ｅ_Ｘは第２のリレー光学系２１の射出瞳から受光部２３ａまでの距離、θは第１のリレー光学系２０の前段の蛍光像の最外縁からの主光線の射出瞳位置における光軸に対する角度、Φは第１のリレー光学系２０に入射する蛍光の入射瞳径、Ｆ_１、Ｆ_２は第１、第２のリレー光学系２０，２１の焦点距離である。
【選択図】 図１

Description

この発明は、レーザ走査型蛍光顕微鏡および検出光学系ユニットに関するものである。

従来、レーザ走査型蛍光顕微鏡としては、対物レンズの前方に形成されるレーザ光の結像位置と共役な位置関係に配される中間像位置に、共焦点ピンホールを配置して、該共焦点ピンホールを通過した蛍光のみを検出するレーザ走査型共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このレーザ走査型共焦点顕微鏡によれば、対物レンズ前方のレーザ光の結像位置から発せられた蛍光のみを共焦点ピンホールに通過させ、他の位置から発せられた蛍光を共焦点ピンホールによって排除する。したがって、試料の所定の深さに２次元的に広がる極めて薄い領域の蛍光画像を得ることができ、しかも、他の位置からの蛍光がノイズとして含まれない鮮明な蛍光画像を得ることができるという利点がある。
特開２０００−２７５５２９号公報

しかしながら、特許文献１に示されるレーザ走査型共焦点顕微鏡においては、以下のような不都合がある。
すなわち、第１に、検出器に入射される蛍光が、共焦点ピンホールによって極端に制限されるため、光量が少なく、得られる蛍光画像が非常に暗い画像となってしまうという問題がある。
第２に、試料が静止している場合はよいが、マウス等の実験動物を生きたまま観察する場合のように、試料が脈動等によって変動する場合には、試料に対するレーザ光の結像位置がずれてしまい、観察したい深さ位置の蛍光画像を取得し続けることが困難になるという問題がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、特に、マウス等の実験動物を生きたまま(in vivo)観察する場合においても、観察したい深さ位置の明るい蛍光画像を取得し続けることが可能なレーザ走査型蛍光顕微鏡および検出光学系ユニットを提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を出射するレーザ光源と、該レーザ光源からのレーザ光を略平行光にするコリメート光学系と、該コリメート光学系により略平行光にされたレーザ光を走査させるスキャナと、該スキャナにより走査させられたレーザ光を集光して第１中間像を結像させる瞳投影光学系と、該瞳投影光学系により第１中間像を結像したレーザ光を集光する結像光学系と、該結像光学系により集光されたレーザ光を集光して試料に再結像させる対物光学系と、試料から発せられ、対物光学系、結像光学系、瞳投影光学系およびスキャナを介して戻る蛍光を集光して第２中間像を結像する第１のリレー光学系と、該第１のリレー光学系により第２中間像を結像した蛍光を集光して略平行光に変換する第２のリレー光学系と、該第２のリレー光学系により略平行光にされた蛍光を検出する光検出器とを備え、以下の条件式（１）を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供する。
Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
ｔａｎθ≦０．２ （２）
ここで、Ｄは、光検出器の受光部の寸法、Ｅ_Ｘは、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離、θは、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像の最外縁からの主光線の前記射出瞳位置における光軸に対する角度、Φは、第１のリレー光学系に入射する蛍光の入射瞳径、Ｆ_１は、第１のリレー光学系の焦点距離、Ｆ_２は、第２のリレー光学系の焦点距離である。

本発明によれば、レーザ光源から発せられたレーザ光がコリメート光学系を通過させられることにより略平行光とされた状態でスキャナにより走査される。走査されたレーザ光は瞳投影光学系を通過させられることにより集光されて第１中間像を結像し、結像光学系および対物光学系によりさらに集光されて試料に再結像される。これにより、試料内に含有されている蛍光物質が励起されて蛍光が発せられる。試料において発生した蛍光は、対物光学系、結像光学系、瞳投影光学系およびスキャナを介して同一光路を戻り、第１のリレー光学系を通過させられることにより集光されて第２中間像を形成させられる。そして、第２中間像を結像した蛍光は第２のリレー光学系を通過させられることにより略平行光とされた状態で光検出器により検出される。

この場合において、試料における照明範囲が非常に小さいスポットに限定される場合、あるいは、試料における照明範囲に広がりがあっても、共焦点光学系のように、共焦点ピンホールを通過した蛍光のみを光検出器によって検出する場合には、光検出器においては軸上の蛍光を検出するので、原則として光検出器の受光部の大きさが問題になることはない。これに対して、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像が所定の大きさを有する場合には、蛍光像の最外縁からの蛍光が、光検出器の受光部に対して所定の角度および光線高を有して入射されることになる。

本発明によれば、条件式（１）の関係を満たすことにより、第２のリレー光学系により平行光にされた蛍光を、光検出器の受光部の範囲内に全て入射させることができる。光検出器が複数設けられている場合に、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離が異なる場合があるが、この場合においても、全ての光検出器において条件式（１）の関係が満たされていれば、全ての光検出器において同じ強度の蛍光を検出することが可能となる。

検出光学系としては、光検出器の受光部に蛍光を結像させる集光光学系を備えているものもある。この場合には、受光部の大きさが問題になることは少ないが、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離が異なる複数の光検出器を備える場合に、蛍光像の最外縁からの軸外の蛍光が受光部に入射する入射角度が光検出器毎に異なってしまう。光検出器は入射角度によって、検出感度が相違するため、同じ蛍光を検出しても光検出器毎に検出結果が相違してしまう不都合がある。

これに対して、本発明のように略平行光の状態で全ての光検出器に入射させるよう構成することで、入射角度は同一となり、また、ケラレによる損失もないので、全ての光検出器において同一の検出結果を得ることができる。また、他の光検出器を増設する場合においても、条件式（１）の関係を満足している限り、他の光検出器と同一の検出結果を得ることができる。したがって、チャンネル拡張性を向上することができる。

上記発明においては、以下の条件式（２）の関係を満足することが好ましい。
ｔａｎθ≦０．２ （２）
この条件式（２）の関係を満たすことにより、光検出器の受光部への蛍光の入射角度を小さく抑えることができる。これにより、光検出器に入射される蛍光を効率的に検出することができる。

上記発明においては、前記スキャナから前記光検出器までの間の中間像位置近傍に配置される可変絞りを備えることが好ましい。
このように構成することで、試料において発せられスキャナを介して光検出器に向かう蛍光を可変絞りによって制限することができる。これにより、光検出器によって検出される蛍光の試料における発光深さ範囲を限定でき、また、可変絞りの開口径を変更することで、発光深さ範囲を調節することができる。

可変絞りの開口径を絞ることにより、試料の深さ方向の狭い範囲に２次元的に広がる領域の深度の浅い蛍光画像を得ることができる。一方、可変絞りの開口径を大きくすることにより、深度の深い蛍光画像を得ることができる。したがって、実験動物を生きたまま観察する場合のように、試料が脈動等により変動する場合や、分解能を抑えても明るい蛍光画像を得たい場合に、開口絞りを開くことで、深度が深く、明るい蛍光画像を得ることができる。逆に、静止した試料の場合に、明るさを犠牲にしても、高い分解能の蛍光画像を得たい場合には、開口絞りを絞ることにより対応することができる。

また、上記発明においては、スキャナを介して戻る蛍光を集光する集光レンズと、該集光レンズの焦点位置近傍に一端を配置する光ファイバと、該光ファイバの他端から出射された蛍光を略平行光にして第１のリレーレンズに入射させる他のコリメート光学系とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、集光レンズにより蛍光が集光させられる光ファイバの一端をピンホールとして機能させ、光検出器により検出される蛍光の発光深さ範囲を制限することができる。光ファイバとしてコア径の小さいシングルモードファイバを採用することとすれば、その一端を共焦点ピンホールとして機能させ、分解能の高い共焦点画像を得ることができる。

また、コア径の大きな光ファイバ、例えば、マルチモードファイバを採用することとすれば、分解能を抑える代わりに明るくかつ深度の深い蛍光画像を得ることができる。この場合、蛍光を出射する光ファイバの他端が、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像位置となるが、条件式（１）の関係を満たすことにより、その蛍光像の最外縁からの軸外の蛍光を光検出器により、ケラレなく検出することが可能となる。

また、上記発明においては、前記第２リレー光学系が、第２中間像側から、負のパワーを有する第１レンズと、正のパワーを有する第２レンズとを備えることが好ましい。第１レンズにより光束径を一旦広げた後に第２レンズによって集光することで、略平行光を簡易に生成することができる。
この場合に、前記第１レンズが、メニスカスレンズからなることとしてもよく、また、前記第２リレー光学系が、第１レンズと第２レンズとの接合レンズからなることとしてもよい。

また、本発明は、試料から発せられた蛍光を集光して中間像を結像する第１のリレー光学系と、該第１のリレー光学系により中間像を結像した蛍光を集光して略平行光に変換する第２のリレー光学系と、該第２のリレー光学系により略平行光にされた蛍光を検出する光検出器とを備え、以下の条件式（１）を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡の検出光学系ユニットを提供する。
Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
ここで、Ｄは、光検出器の受光部の寸法、Ｅ_Ｘは、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離、θは、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像の最外縁からの主光線の前記射出瞳位置における光軸に対する角度、Φは、第１のリレー光学系に入射する蛍光の入射瞳径、Ｆ_１は、第１のリレー光学系の焦点距離、Ｆ_２は、第２のリレー光学系の焦点距離である。

本発明によれば、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像が比較的大きな広がりを持っていたとしても、蛍光像の最外縁から発せられる蛍光も漏れなく光検出器の受光部に受光させることができる。特に、光検出器を複数備える場合には、全ての光検出器により、同一の条件で蛍光を検出でき、同一の検出結果を得ることができる。

上記発明においては、以下の条件式（２）の関係を満足することが好ましい。
ｔａｎθ≦０．２ （２）
この条件式（２）の関係を満たすことにより、光検出器の受光部への蛍光の入射角度を小さく抑えることができる。これにより、光検出器に入射される蛍光を効率的に検出することができる。

本発明に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡によれば、試料における照明範囲にある程度の広がりを持たせる場合のように、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像が広がりを有する場合に、蛍光像の最外縁から発せられる蛍光をも漏れなく検出することができる。したがって、コンフォーカリティを抑えて、明るくかつ分解能の高い蛍光画像を得ることができる。その結果、例えば、実験動物を生きたまま観察する場合のように、脈動や拍動等により変動する試料を観察する場合に、深度が深く明るい蛍光画像を得ることで、観察対象を見失うことなく、より確実に観察し続けることができるという効果を奏する。

また、本発明に係る検出光学系ユニットによれば、第１のリレー光学系の前段に与えられる蛍光像が所定の広がりを有していたとしても、ケラレを防止して漏れなく光検出器により検出することができるという効果を奏する。特に、検出器を複数設けることとしても、全ての光検出器により、同一の条件で蛍光を検出でき、同一の検出結果を得ることができる。

以下、本発明の一実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および検出光学系ユニット２について、図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１は、図１に示されるように、光源ユニット３と、装置本体４と、検出光学系ユニット２と、これらを接続する光ファイバ５，６とを備えている。

前記光源ユニット３は、異なる波長のレーザ光を発生する複数のレーザ光源７と、該レーザ光源７からのレーザ光を略平行光に変換するコリメートレンズ８と、複数のレーザ光を同一光路に接続するミラー９およびダイクロイックミラー１０と、レーザ光源７からのレーザ光を第１の光ファイバ５の端面５ａに集光させるカップリングレンズ１１とを備えている。

前記装置本体４は、第１の光ファイバ５により伝播されてきたレーザ光を平行光に変換するコリメート光学系１２と、平行光にされたレーザ光を２次元的に走査するスキャナ１３と、該スキャナ１３により走査されたレーザ光を集光して第１中間像を結像させる瞳投影レンズ１４と、第１中間像を結像したレーザ光を集光して平行光に変換する結像レンズ１５と、結像レンズ１５により集光されたレーザ光をさらに集光して試料Ａに再結像させる対物レンズ１６と、試料Ａにおいて発生し対物レンズ１６、結像レンズ１５、瞳投影レンズ１４およびスキャナ１３を介して戻る蛍光をレーザ光から分離するダイクロイックミラー１７と、分離された蛍光を第２の光ファイバ６の端面６ａに集光させるカップリングレンズ１８とを備えている。スキャナ１３は、例えば、相互に直交する軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー１３ａ，１３ｂを対向配置してなる近接ガルバノミラーにより構成されている。

前記検出光学系ユニット２は、第２の光ファイバ６により伝播されてきた蛍光を略平行光に変換する第１コリメート光学系１９と、略平行光にされた蛍光を集光して第２中間像を結像させる集光光学系（第１のリレー光学系）２０と、第２中間像を結像した蛍光をさらに集光して略平行光に変換する第２コリメート光学系（第２のリレー光学系）２１と、略平行光にされた蛍光を波長毎に分離するダイクロイックミラー２２と、波長毎に分離された蛍光を略平行光の状態で入射させ検出する複数の光検出器２３とを備えている。図中、符号２４はミラー、符号２５は蛍光内に含まれるレーザ光成分を遮断するバリアフィルタである。

検出光学系ユニット２は、以下の条件式を満足するように、各光学要素が構成されている。
Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
ｔａｎθ≦０．２ （２）
ここで、Ｄは、光検出器２３の受光部の直径寸法（受光部が非円形の場合その最小幅寸法）、Ｅ_Ｘは、第２コリメート光学系２１の射出瞳Ｂ（図２参照。）から光検出器２３の受光部２３ａまでの距離、θは、第１コリメート光学系１９の前段に配される蛍光像、すなわち、第２の光ファイバ６の出射端６ｂにおける最外縁からの主光線の第２コリメート光学系２１の射出瞳位置における光軸に対する角度、Φは、第１コリメート光学系１９に入射する蛍光の入射瞳Ｃ（図２参照。）の直径、Ｆ_１は、集光光学系２０の焦点距離、Ｆ_２は、第２コリメート光学系２１の焦点距離である。
第１の光ファイバ５および第２の光ファイバ６は、それぞれ、マルチモードファイバにより構成されている。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および光検出ユニット２の作用について以下に説明する。
光源ユニット３の複数のレーザ光源７から発せられた異なる波長の複数のレーザ光は、ミラー９およびダイクロイックミラー１０を介して合波された状態でカップリングレンズ１１により第１の光ファイバ５の端面５ａに入射される。

第１の光ファイバ５内を伝播されたレーザ光は、第１の光ファイバ５の他端面５ｂから装置本体４内に出射され、コリメート光学系１２によって略平行光にされる。略平行光にされたレーザ光は、ダイクロイックミラー１７を反射されることなく通過してスキャナ１３に入射される。スキャナ１３は２枚のガルバノミラー１３ａ，１３ｂをそれぞれ揺動させることにより、レーザ光の出射方向を変化させる。スキャナ１３から出射されたレーザ光は、瞳投影レンズ１、結像レンズ１５および対物レンズ１６を通過させられることでリレーされ、試料Ａに結像させられることになる。

レーザ光が試料Ａに照射されると、結像位置のみならず、レーザ光の通過する試料Ａ内の各位置において蛍光物質が励起され、蛍光が発生する。発生した蛍光はあらゆる方向に出射されるが、その一部が対物レンズ１６を介して装置本体４内に入射し、結像レンズ１５、瞳投影レンズ１４、スキャナ１３を介してレーザ光の光路を逆方向に辿るようにして戻る。スキャナ１３とコリメート光学系１２との間には、４５°の角度で傾斜配置されたダイクロイックミラー１７が設けられているので、蛍光はダイクロイックミラー１７に入射されると反射され、９０°偏向させられてカップリングレンズ１８により、第２の光ファイバ６の端面６ａに集光される。

第２の光ファイバ６の端面６ａは、試料Ａにおけるレーザ光の結像位置と共役な位置関係に配される。したがって、第２の光ファイバ６の端面６ａには、試料Ａにおける結像位置において発生した蛍光が主として入射される。本実施形態においては、第２の光ファイバ６は、コア径の比較的大きなマルチモードファイバにより構成されているので、第２の光ファイバ６には、結像位置において発生した蛍光のみならず、結像位置近傍の所定範囲内において発生した蛍光も入射されることになる。

第２の光ファイバ６を伝播して光検出ユニット２に入射された蛍光は、第２の光ファイバ６の他端面６ｂから出射されると、第１コリメート光学系１９によって一旦略平行光とされた後に、集光光学系２０によって集光されて第２中間像を結像させられる。そして、再度第２コリメート光学系２１によって略平行光とされ、この状態で、光検出器２３まで導かれる。第２コリメート光学系２１と光検出器２３との間には、複数のダイクロイックミラー２２、ミラー２４およびバリアフィルタ２５が設けられているので、蛍光は波長毎に分離され、含まれているレーザ光を除去された状態で略平行光のまま光検出器２３の受光部２３ａに入射される。

この状態を図２に模式的に示す。図２は、第２の光ファイバ６の出射端６ｂから光検出器２３の受光部２３ａまでを模式的に示した図である。この図において、ダイクロイックミラー２２、ミラー２４およびバリアフィルタ２５は、説明の簡略のために省略している。

この図によれば、第２の光ファイバ６の端面６ｂの中央から出射された蛍光は、図２に実線で示されるように、光軸に沿って進行し、光検出器２３の受光部２３ａの中央に入射される。したがって、第２の光ファイバ６がシングルモードファイバである場合のように、第２の光ファイバ６の中央のみから出射される場合には、第２コリメート光学系２１により形成される略平行光の光束径が受光部２３ａの直径以内となるように設計されていれば足りる。

しかしながら、本実施形態においては、第２の光ファイバ６としてマルチモードファイバを用いているので、第２の光ファイバ６の出射端６ｂは、比較的大きな広がりを有する光源（蛍光像）となり、その出射端６ｂにおける発光範囲の最外縁から発せられる蛍光は、図２中に破線で示されるように、光軸中心からずれた光路を通って光検出器２３の受光部２３ａに入射される。

特に、第２コリメート光学系２１を出射されてからは、光軸に対して一定の傾斜角度θをなして進行する。このため、図２に示されるように、第２コリメート光学系２１の射出瞳Ｂが第２コリメート光学系２１と光検出器２３との間に存在する場合には、射出瞳Ｂから最も離れた光検出器２３において、受光部２３ａに入射する蛍光が、光軸から最も離れることになる。なお、図示しないが、第２コリメート光学系２１の射出瞳Ｂが第２コリメート光学系２１からみて光検出器２３よりも離れた位置に配される場合においても、射出瞳Ｂから最も離れた光検出器２３において、受光部２３ａに入射する蛍光が光軸から最も離れることになる。

本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および光検出ユニット２によれば、全ての光検出器２３において、上記条件式（１）が満たされている。したがって、蛍光が光軸から最も離れて受光部２３ａに入射する光検出器２３においても蛍光がケラレることなく受光部２３ａに入射される。

この場合において、全ての光検出器２３の受光部２３ａにおいて同じ強度の蛍光が検出されるとともに、光ファイバ６の出射端６ｂの同一位置から発せられ各光検出器２３に入射する蛍光の入射角度は同一であるため、入射角度に応じて変化する検出感度についても、全ての光検出器２３において同一の条件で蛍光を検出することができる。さらに、条件式（２）が満たされることによって、検出感度を低下させることなく蛍光を検出することができる。

このように、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１によれば、試料Ａから戻る蛍光を共焦点ピンホールによって制限するのではなく、ある程度の大きさのコア径を有するマルチモードファイバ６によって伝播するので、対物レンズ１６の結像位置近傍のある程度の広がりを有する領域から発せられた蛍光を光検出器２３により検出することができる。その結果、蛍光画像の空間分解能は低下するが、その代わりに、多くの蛍光を受光できるので蛍光画像を明るくすることができ、また、試料Ａの深さ方向に広がる各位置からの蛍光を同時に受光するので、深度の深い蛍光画像を得ることができる。

例えば、脈動や拍動等によって試料Ａが深さ方向に変動する場合に、深度の深い蛍光画像を取得することにより、観察している部位が、試料Ａの変動によって画像内から消えてしまうことを回避することができる。したがって、実験動物等の試料Ａを生きたまま観察する場合などに、試料Ａ内部の病変部等の注目部位を見失うことなく蛍光観察し続けることができるという利点がある。

また、第２の光ファイバ６として、マルチモードファイバに代えてシングルモードファイバを採用することにより、光検出器２３に入射させる蛍光を絞り、一端面を実質的に共焦点ピンホールとして機能させて、分解能の高い傾向画像を取得することが可能となる。また、マルチモードファイバからなる第２の光ファイバ６の出射端６ｂに開口径を変更することができる可変ピンホール（図示略）を配置することにしてもよい。このようにすることで、観察対象に合わせて、可変ピンホールの開口径を変更し、蛍光画像の明るさと深度を調節することができる。

この場合において、可変ピンホールの開口径をどのように変更しても、全ての光検出器２３において、蛍光がケラレることなく検出され、しかも、同一の入射角度で検出される。したがって、全ての光検出器２３において同一の検出結果を得ることができる。

次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０および検出光学系ユニット３１について、図３を参照して説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および検出光学系ユニット２と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０は、図３に示されるように、光源ユニット３２と装置本体３３と検出光学系ユニット３１とが、光ファイバを介することなく直接接続されている。光源ユニット３２は、レーザダイオード３４とコリメート光学系３５とを備えている。レーザダイオード３４から発せられたレーザ光は、コリメート光学系３５によって略平行光とされた状態で光源ユニット３２から装置本体３３に入射されるようになっている。
装置本体３３は、略平行光の形態で入射されたレーザ光を試料Ａに結像させ、試料Ａから発せられた蛍光をダイクロイックミラー１７によって分岐して略平行光の状態で検出光学系ユニット３１に引き渡すようになっている。

本実施形態に係る検出光学系ユニット３１は、装置本体３３のダイクロイックミラー１７によって、略平行光の状態で分岐された蛍光を集光して中間像を結像する集光光学系（第１リレー光学系）３６と、中間像の結像位置近傍に配置されるピンホール３７と、中間像を結像した蛍光を略平行光に変換するコリメート光学系（第２リレー光学系）３８とを備えている。ピンホール３７は、例えば、その開口径を変更可能な可変ピンホール（以下、可変ピンホール３７という。）である。

そして、本実施形態に係る検出光学系ユニット３１は、可変ピンホール３７が最大限に開かれて、対物レンズ１６に戻る蛍光の全てが光検出器２３に検出される状態において、以下の条件式（１）、（２）を満足するように構成されている。
Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
ｔａｎθ≦０．２ （２）
ここで、Ｄは、光検出器２３の受光部２３ａの直径寸法、Ｅ_Ｘは、コリメート光学系３８の射出瞳から光検出器２３の受光部２３ａまでの距離、θは、試料Ａにおけるレーザ光の照明範囲の最外縁からの主光線のコリメート光学系３８の射出瞳位置における光軸に対する角度、Φは、集光光学系３６に入射する蛍光の入射瞳径、Ｆ_１は、集光光学系３６の焦点距離、Ｆ_２は、コリメート光学系３８の焦点距離である。

このように構成された本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０および検出光学系ユニット３１の作用について以下に説明する。
光源ユニット３２のレーザダイオード３４から発せられたレーザ光は、コリメート光学系３５によって略平行光とされた状態で、光源ユニット３２から出射され、装置本体３３内に入射される。装置本体３３においては、入射されたレーザ光がダイクロイックミラー１７を通過させられた後に、スキャナ１３によって２次元的に走査され、瞳投影レンズ１４、結像レンズ１５および対物レンズ１６を経て試料Ａに照射される。試料Ａにおいて発生した蛍光は、対物レンズ１６、結像レンズ１５、瞳投影レンズ１４およびスキャナ１３を介して戻り、ダイクロイックミラー１７によってレーザ光から分岐され、略平行光の状態で検出光学系ユニット３１に入射される。

検出光学系ユニット３１内に略平行光の状態で入射した蛍光は、集光光学系３６によって集光され、その結像位置近傍に設けられた可変ピンホール３７を通過させられた後に、コリメート光学系３８によって略平行光に変換される。そして、ダイクロイックミラー２２、ミラー２４およびバリアフィルタ２５を介して光検出器２３によって検出される。

この場合において、本実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡３０および検出光学系ユニット３１によれば、可変ピンホール３７を最も開いた状態で、試料Ａにおける照明範囲の最外縁から発せられる蛍光も、光検出器２３の受光部２３ａにケラレることなく受光される。また、複数の光検出器２３の全てにおいて、蛍光が同一の入射角度で入射される。したがって、いずれの光検出器２３においても同一の検出結果を得ることができる。
また、可変ピンホール３７を絞ることにより、蛍光画像の明るさと、深度とを調節することができ、いずれの場合においても、蛍光を光検出器２３の受光部２３ａにケラレることなく、かつ、同一の入射角度で入射させることができる。

次に、第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡１および検出光学系ユニット２の第１コリメート光学系１９、集光光学系２０および第２コリメート光学系２１の第１〜第４実施例について図４〜図７を参照して説明する。
第１〜第４実施例において、図４〜図７に示されるように、第１コリメート光学系１９は、両凸レンズＬ_１と、第２光ファイバ６側に平面部を配する平凹レンズＬ_２および両凸レンズＬ_３の接合レンズとから構成されている。また、集光光学系２０は、第２光ファイバ６側からみて両凸レンズＬ_４および両凹レンズＬ_５の接合レンズにより構成されている。

第１実施例において、第２コリメート光学系２１は、図４に示されるように、第２光ファイバ６側に凸面を向けた負のパワーを有するメニスカスレンズＬ_６と両凸レンズＬ_７とから構成されている。
第２実施例において、第２コリメート光学系２１は、図５に示されるように、第２光ファイバ６側に平面を向けた負のパワーを有する平凹レンズＬ_６と両凸レンズＬ_７とから構成されている。
第３実施例において、第２コリメート光学系２１は、図６に示されるように、第２光ファイバ６側に平面を向けた負のパワーを有する平凹レンズＬ_６と両凸レンズＬ_７とから構成されている。
第４実施例において、第２コリメート光学系２１は、図７に示されるように、第２光ファイバ６側に配置された両凹レンズＬ_６と両凸レンズＬ_７との接合レンズにより構成されている。

第１〜第４の実施例に係る第１コリメート光学系１９、集光光学系２０および第２コリメート光学系２１のレンズデータは以下の通りである。

また、第１〜第４の実施例における条件式（１）、（２）の値は表５の通りである。

これらの第１〜第４の実施例によれば、明るく深度の深い蛍光画像を得ることができるとともに、全ての光検出器において同一の検出結果を得ることができる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を模式的に示す全体構成図である。 図１のレーザ走査型蛍光顕微鏡の検出光学系ユニットを模式的に示す図である。 本発明の第２の実施形態に係るレーザ走査型蛍光顕微鏡を模式的に示す全体構成図である。 図２の検出光学系ユニットの第１実施例を構成する第１コリメート光学系、集光光学系および第２コリメート光学系を示す図である。 図２の検出光学系ユニットの第２実施例を構成する第１コリメート光学系、集光光学系および第２コリメート光学系を示す図である。 図２の検出光学系ユニットの第３実施例を構成する第１コリメート光学系、集光光学系および第２コリメート光学系を示す図である。 図２の検出光学系ユニットの第４実施例を構成する第１コリメート光学系、集光光学系および第２コリメート光学系を示す図である。

符号の説明

１ レーザ走査型蛍光顕微鏡
２ 検出光学系ユニット
６ 第２の光ファイバ（光ファイバ）
６ａ 一端
６ｂ 出射端（他端）
７ レーザ光源
１２ コリメート光学系
１３ スキャナ
１４ 瞳投影レンズ（瞳投影光学系）
１５ 結像レンズ（結像光学系）
１６ 対物レンズ（対物光学系）
１８ 集光レンズ
１９ 第１コリメート光学系（他のコリメート光学系）
２０ 集光光学系（第１のリレー光学系）
２１ 第２コリメート光学系（第２のリレー光学系）
２３ 光検出器
２３ａ 受光部
３７ 可変ピンホール（可変絞り）
Ａ 試料
Ｂ 射出瞳
Ｃ 入射瞳
Ｌ_６ メニスカスレンズ、平凹レンズ、両凹レンズ（第１レンズ）
Ｌ_７ 両凸レンズ（第２レンズ）

Claims (9)

1. レーザ光を出射するレーザ光源と、
   該レーザ光源からのレーザ光を略平行光にするコリメート光学系と、
   該コリメート光学系により略平行光にされたレーザ光を走査させるスキャナと、
   該スキャナにより走査させられたレーザ光を集光して第１中間像を結像させる瞳投影光学系と、
   該瞳投影光学系により第１中間像を結像したレーザ光を集光する結像光学系と、
   該結像光学系により集光されたレーザ光を集光して試料に再結像させる対物光学系と、
   試料から発せられ、対物光学系、結像光学系、瞳投影光学系およびスキャナを介して戻る蛍光を集光して第２中間像を結像する第１のリレー光学系と、
   該第１のリレー光学系により第２中間像を結像した蛍光を集光して略平行光に変換する第２のリレー光学系と、
   該第２のリレー光学系により略平行光にされた蛍光を検出する光検出器とを備え、
   以下の条件式（１）を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡。
   Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
   ここで、
   Ｄは、光検出器の受光部の寸法、
   Ｅ_Ｘは、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離、
   θは、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像の最外縁からの主光線の前記射出瞳位置における光軸に対する角度、
   Φは、第１のリレー光学系に入射する蛍光の入射瞳径、
   Ｆ_１は、第１のリレー光学系の焦点距離、
   Ｆ_２は、第２のリレー光学系の焦点距離
   である。
2. 以下の条件式（２）を満足する請求項１に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
   ｔａｎθ≦０．２ （２）
3. 前記スキャナから前記光検出器までの間の中間像位置近傍に配置される可変絞りを備える請求項１または請求項２に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
4. スキャナを介して戻る蛍光を集光する集光レンズと、
   該集光レンズの焦点位置近傍に一端を配置する光ファイバと、
   該光ファイバの他端から出射された蛍光を略平行光にして第１のリレーレンズに入射させる他のコリメート光学系とを備える請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
5. 前記第２リレー光学系が、第２中間像側から、負のパワーを有する第１レンズと、正のパワーを有する第２レンズとを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
6. 前記第１レンズが、メニスカスレンズからなる請求項５に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
7. 前記第２リレー光学系が、第１レンズと第２レンズとの接合レンズからなる請求項５または請求項６に記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
8. 試料から発せられた蛍光を集光して中間像を結像する第１のリレー光学系と、
   該第１のリレー光学系により中間像を結像した蛍光を集光して略平行光に変換する第２のリレー光学系と、
   該第２のリレー光学系により略平行光にされた蛍光を検出する光検出器とを備え、
   以下の条件式（１）を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡の検出光学系ユニット。
   Ｄ≧２×（｜Ｅ_Ｘ×ｔａｎθ｜＋Φ×Ｆ_２／Ｆ_１／２） （１）
   ここで、
   Ｄは、光検出器の受光部の寸法、
   Ｅ_Ｘは、第２のリレー光学系の射出瞳から光検出器の受光部までの距離、
   θは、第１のリレー光学系の前段に配される蛍光像の最外縁からの主光線の前記射出瞳位置における光軸に対する角度、
   Φは、第１のリレー光学系に入射する蛍光の入射瞳径、
   Ｆ_１は、第１のリレー光学系の焦点距離、
   Ｆ_２は、第２のリレー光学系の焦点距離
   である。
9. 以下の条件式（２）を満足する請求項８に記載の検出光学系ユニット。
   ｔａｎθ≦０．２ （２）

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