JP2005275125A

JP2005275125A - 光走査型共焦点観察装置

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Publication number: JP2005275125A
Application number: JP2004090002A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Hirata; 唯史平田; Tatsuo Nakada; 竜男中田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2004-03-25
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2024-03-25
Also published as: JP4593139B2

Abstract

【課題】光ファイバ束の一端面における反射光を低減して取得される画像のノイズを低減する。
【解決手段】光源６からの光を走査して第１の対物レンズ２により結像する装置本体３と、前記第１の対物レンズ２の焦点位置に一端面４ａを配する光ファイバ束４と、該ファイバ束４の他端面４ｂ側に配置され、光ファイバ束４の他端面４ｂから発せられた光を試料Ａに結像する第２の対物レンズ５と、前記光ファイバ束４の一端面４ａと共役な位置に配置され、該第２の対物レンズ５、光ファイバ束４および第１の対物レンズ２を介して戻る試料Ａからの戻り光を通過させる共焦点ピンホール１１と、該共焦点ピンホール１１を通過した光を撮像する撮像手段１２とを備え、前記光ファイバ束４の一端面４ａに、所定の厚さを有するガラス板１７を配置した光走査型共焦点観察装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

この発明は、光走査型共焦点観察装置に関するものである。

従来、この種の光走査型共焦点観察装置としては、特許文献１に示すものが知られている。
この光走査型共焦点観察装置は、蛍光顕微鏡からなる走査型レーザ顕微鏡と、この走査型レーザ顕微鏡が有する第１の対物レンズの焦点面に一端面が配置された光ファイバ束と、この光ファイバ束の他端面を光源とするように配置された第２の対物レンズとを備えている。

この光走査型共焦点観察装置によれば、光ファイバ束の端面を共焦点ピンホールとして機能させ、第２の対物レンズの焦点位置に集光したレーザ光によってその焦点位置において蛍光を生じさせ、患部の内部組織を取得することができる。
特開２００３−３４４７７７号公報（図１等）

上述した従来の光走査型共焦点観察装置においては、光ファイバ束の一端面を共焦点ピンホールとして機能させているため、その光ファイバ束を構成する各光ファイバの一端面から発せられた光のみが走査型レーザ顕微鏡によって検出される。
しかしながら、この光ファイバの一端面においては、第１の対物レンズから発せられ空気中を伝播したレーザ光が光ファイバを構成するガラス面に入射させられる。空気とガラスとは、屈折率の異なる媒質であるため、その界面において光の一部、約４％程度の光が反射することになる。

すなわち、共焦点ピンホールとして機能する光ファイバ束の一端面における反射光は、そのまま走査型レーザ顕微鏡に戻ることになり、蛍光画像においてフレアのようなノイズを発生させてしまう不都合がある。一般に蛍光顕微鏡においては、１０^ー３〜１０^−４程度、蛍光レーザ顕微鏡では、１０^ー4〜１０^−６のバリア特性が必要とされる。レーザ顕微鏡においては、通常、ダイクロイックミラーを用いて試料からの戻り光から蛍光を分離して検出しているが、入射光の４％もの光が反射光として戻る場合には、ダイクロイックミラーにおいて十分に除去することができず、ノイズとして検出されてしまうことになる。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、光ファイバ束の一端面における反射光を低減して取得される画像のノイズを低減することができる光走査型共焦点観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源からの光を走査して第１の対物レンズにより結像する装置本体と、前記第１の対物レンズの焦点位置に一端面を配する光ファイバ束と、該ファイバ束の他端面側に配置され、光ファイバ束の他端面から発せられた光を試料に結像する第２の対物レンズと、前記光ファイバ束の一端面と共役な位置に配置され、該第２の対物レンズ、光ファイバ束および第１の対物レンズを介して戻る試料からの戻り光を通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した光を撮像する撮像手段とを備え、前記光ファイバ束の一端面に、所定の厚さを有するガラス板を配置した光走査型共焦点観察装置を提供する。

この発明によれば、装置本体と第２の対物レンズとが光ファイバ束により接続されているため、光ファイバ束を湾曲させて、第２の対物レンズの位置および角度を自由に設定することができる。また、光ファイバ束の先端に第２の対物レンズを配置したことにより、先端部を小さく構成でき、実験小動物等の小さい試料や、狭隘な観察部位近傍に配置し易くなっている。

光源から発せられ第１の対物レンズによって光ファイバ束の一端面に結像される光は、光ファイバ束の一端面に配置されているガラス板に入射された後に光ファイバ束の一端面に入射される。光ファイバ束に入射された光は光ファイバ束内を伝播して第２の対物レンズにより試料に結像され、試料において発せられた光が第２の対物レンズ、光ファイバ束および第１の対物レンズを介して戻り、共焦点ピンホールを経て撮像手段により撮像される。光ファイバ束の一端面と共焦点ピンホールとは共役な位置に配置されているので、光ファイバ束の一端面を通過した光のみが撮像手段により撮像されることになる。

この場合において、第１の対物レンズから光ファイバ束の一端面に向かう光は、ガラス板に入射される際にその一部が反射されるが、ガラス板が所定の厚さを有しているために、ガラス板の表面において反射された光の大部分は共焦点ピンホールを通過できないことになる。また、ガラス板から光ファイバ束に入射する光は、ガラス板と光ファイバ束の一端面とが密着されている場合には、屈折率が同一の媒質間の通過であり、ほとんど反射光を発生しない。一方、ガラス板と光ファイバ束の一端面とが密着していない場合においては、反射光が発生するが、この場合においても、反射光は、ガラス板の表面から再度空気中に出射される際に散乱され、上記と同様に、そのほとんどが共焦点ピンホールを通過することがない。その結果、ガラス板または光ファイバ束の一端面における反射光のうち撮像手段によって撮像される反射光が低減され、ノイズの少ない画像を取得することができる。

上記発明においては、前記ガラス板が、前記光ファイバ束の一端面に接着されていることとしてもよい。
このようにすることで、ガラス板と光ファイバ束の一端面との間の空気層をなくすことができるので、反射光をより一層低減することができる。

また、本発明は、光源からの光を走査して第１の対物レンズにより結像する装置本体と、前記第１の対物レンズの焦点位置に一端面を配する光ファイバ束と、該光ファイバ束の他端面に配置され、光ファイバ束の他端面から発せられた光を試料に結像する第２の対物レンズと、前記光ファイバ束の一端面と共役な位置に配置され、該第２の対物レンズ、光ファイバ束および第１の対物レンズを介して戻る試料からの戻り光を通過させる共焦点ピンホールと、該共焦点ピンホールを通過した光を撮像する撮像手段とを備え、前記光ファイバの一端面と前記撮像手段との間に、前記光ファイバ束の一端面からの反射光を遮断するバリアフィルタ手段を備える光走査型共焦点観察装置を提供する。

本発明によれば、バリアフィルタ手段の作動により、光ファイバ束の一端面からの反射光が遮断されるので、上記と同様に反射光によるフレア等のノイズの少ない画像を取得することが可能となる。なお、バリアフィルタ手段としては、透過式のバリアフィルタを介在させる場合の他、光ファイバ束の一端面から撮像手段までの光路に配置される光学部品に、バリア特性を持たせることとしてもよい。

本発明によれば、光ファイバ束によって先端の第２の対物レンズの自由な位置決めおよび姿勢変更を可能としながら、光ファイバ束の端面における反射光が撮像手段によってフレア等のノイズとして検出されることを防止し、ノイズの少ない鮮明な画像を得ることができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る光走査型共焦点観察装置について、図１および図２を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る光走査型共焦点観察装置１は、レーザ走査型共焦点顕微鏡であって、図１に示されるように、第１の対物レンズ２を備える装置本体３と、該第１の対物レンズ２の結像位置に一端面４ａを配置した光ファイバ束４と、該光ファイバ束４の他端面４ｂ側に配置され、他端面４ｂから発せられた光を試料Ａ上に結像させる第２の対物レンズ５とを備えている。

装置本体３には、レーザ光を発生するレーザ光源６と、２つの直交する軸線回りに揺動可能な２枚のガルバノミラー７ａ，７ｂにより構成され、レーザ光源６から発せられたレーザ光を、光ファイバ束４を構成する各光ファイバの一端面４ａに２次元的に走査させる光走査部７と、瞳投影レンズ８および結像レンズ９と、前記第１の対物レンズ２を介して戻る戻り光からレーザ光を分離するダイクロイックミラー１０と、前記光ファイバ束４の一端面４ａと共役な位置に配置される共焦点ピンホール１１と、共焦点ピンホール１１を通過した光を検出する光検出器１２とを備えている。図中、符号１３は、共焦点レンズである。

なお、図中、レーザ光源６が複数設けられているが、異なる波長のレーザ光を試料Ａに対して照射可能とするためであり、単一のレーザ光源６であってもよい。また、光検出器１２も複数設けた例を示しているが、単一の光検出器１２であってもよい。また、符号１４，２０はダイクロイックミラー、符号１５はバンドパスフィルタである。また、符号１６は光路を折り曲げるミラーである。

前記第２の対物レンズ５は、光ファイバ束４の他端面４ｂから発せられる光を光源として試料Ａの所望の位置に結像させるようになっている。
前記光ファイバ４の一端面４ａには、図２に示されるように、ガラス板１７が固定されている。このガラス板１７は、所定の厚さ寸法、例えば、２ｍｍ程度の厚さ寸法を有している。ガラス板１７は光ファイバ束４の一端面４ａに突き合わせ状態に接触（フィジカルコンタクト）させられている。ガラス板１７と光ファイバ束４の一端面４ａとの間には、理想的には空気層が設けられることなく、屈折率がほぼ同等のガラス板１７と光ファイバ束４を構成する各光ファイバのコアとが密着配置されていることが好ましい。

このように構成された本実施形態に係る光走査型共焦点観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る光走査型共焦点観察装置１によれば、レーザ光源６からレーザ光が発せられると、レーザ光はダイクロイックミラー１０，１４を透過させられて光走査部７に入射させられて２次元方向に走査される。光走査部７により偏向されて出射されたレーザ光は瞳投影レンズ８、ミラー１６、結像レンズ９、第１の対物レンズ２を経て光ファイバ束４の一端面４ａに入射させられる。

光ファイバ束４の一端面４ａに入射させられて光ファイバ束４の内部を伝播したレーザ光は、光ファイバ束４の他端面４ｂから出射される際に一旦広がり、その後段に配されている第２の対物レンズ５によって試料Ａの観察対象部位に照射される。レーザ光を照射された試料Ａの観察対象部位からは蛍光が発せられ、蛍光は、第２の対物レンズ５、光ファイバ束４、第１の対物レンズ２、結像レンズ９、ミラー１６、瞳投影レンズ８および光走査部７を介して戻り、ダイクロイックミラー１０により反射されて、レーザ光と分離された後に、共焦点レンズ１３により集光させられて共焦点ピンホール１１を通過した光のみが光検出器１２により検出される。光ファイバ束４の一端面４ａは共焦点ピンホールとして機能し、また、共焦点ピンホール１１と共役な位置に配置されているので、光ファイバ束４の一端面４ａから出射された光のみが共焦点ピンホール１１を通過することができ、光検出器１２により検出されることになる。

この場合において、第１の対物レンズ２により光ファイバ束４の一端面４ａに入射させられる光は、該一端面４ａに入射させられる前にガラス板１７の表面から入射される。そして、ガラス板１７と光ファイバ４のコアとは空気層を介することなく密着させられているので、屈折率が同等の媒質間の界面を通過させられることになる。この場合には、界面におけるレーザ光の反射はほとんど生ずることがない。また、ごく一部レーザ光の反射が生ずるが、反射したレーザ光はガラス板１７によって、図２に矢印で示されるように散乱させられるので第１の対物レンズ２に戻る反射光はごく一部となる。したがって、共焦点ピンホールとして機能する光ファイバ束４の一端面４ａにおいて反射されて戻るレーザ光が多く発生せず、また反射したわずかなレーザ光も散乱されるので、光検出器１２により検出される蛍光画像に反射光により発生するフレアを低減して、鮮明な蛍光画像を得ることができる。

また、レーザ光は空気層からガラス板１７の表面に入射する際に、屈折率の異なる媒質間の界面を通過させられることになるため、ガラス板１７の表面においてその一部が反射させられることとなるが、ガラス板１７は所定の厚さ寸法を備えているので、共焦点ピンホールとして機能する光ファイバ束４の一端面４ａから光軸方向に離れている。したがって、ガラス板１７の表面において発生する反射光は、光検出器１２の方向に戻ったとしても、そのほとんどが光検出器１２の前段に配置されている共焦点ピンホール１１を通過することができず、光検出器１２により検出されることが防止されることになる。
すなわち、本実施形態に係るレーザ走査型共焦点顕微鏡によれば、反射光によるフレアの発生を防止して、鮮明な蛍光画像を得ることを可能とし、観察精度を向上することができる。

なお、本実施形態に係る光走査型共焦点観察装置１においては、光ファイバ束４の一端面４ａにガラス板１７を直接密着状態に配置することとしたが、これに代えて、図３に示されるように、透明な接着剤１８により両者を接着することにしてもよい。このようにすることで、ガラス板１７と光ファイバ束４の一端面４ａとの間に空気層が形成されることをより確実に防止できるので、光ファイバ束４の一端面４ａにおける反射光の発生を抑制することができる。
また、光ファイバ束４の一端面４ａに配置したガラス板１７に代えて、またはこれとともに、図４に示されるように、該光ファイバ束４の一端面４ａら光検出器１２までの間にレーザ光の反射光を遮断するためのバリアフィルタ１９を配置することにしてもよい。

また、本実施形態に係る光走査型共焦点観察装置１によれば、ガルバノミラー７ａ，７ｂからなる光走査部７を備えているが、これに代えて、図５に示されるように、集光ディスク２１とピンホールディスク２２とをドラム２３により連結し、モータ２４により回転駆動する共焦点スキャナ２５を採用してもよい。集光ディスク２１はガラス基板の片面に形成された複数のフレネルレンズを有するものであり、フレネルレンズが半径方向に所定距離だけ順次ずれた状態で配列されている。ピンホールディスク２２は基板に複数を有するものであり、このピンホールが半径方向に所定距離だけ順次ずれた状態で配置されている。集光ディスク２１とピンホールディスク２２との間には、ビームスプリッタ２６が配置されており、ピンホールディスク２２のピンホールを通過して戻る蛍光をビームスプリッタ２６によって分離して、バリアフィルタ１９、集光レンズ２７を介してカメラ２８により撮像するようになっている。

共焦点スキャナ２５を用いることにより、レーザ光源６から発せられたレーザ光を複数のピンホールに同時に通過させて、複数点のレーザ光によって試料Ａを走査することができ、試料Ａの蛍光画像を迅速に取得することができる。この場合においても、バリアフィルタ１９により、光ファイバ束４の一端面４ａにおける反射光が遮断されるので、カメラ２８に撮像される蛍光画像に発生するフレアを十分に低減することができる。

本発明の第１の実施形態に係るレーザ走査型共焦点観察装置を示す全体構成図である。図１のレーザ走査型共焦点観察装置の光ファイバ束の一端面に配置したガラス板を説明する図である。図２の変形例を示す図である。図１のガラス板に加えてバリアフィルタを有するレーザ走査型共焦点観察装置を示す全体構成図である。図１のレーザ走査型共焦点観察装置の光走査部の変形例を示す全体構成図である。

符号の説明

Ａ試料
１光走査型共焦点観察装置
２第１の対物レンズ
３装置本体
４光ファイバ束
４ａ一端面
４ｂ他端面
５第２の対物レンズ
６光源
１１共焦点ピンホール
１２撮像手段
１７ガラス板
１９バリアフィルタ（バリアフィルタ手段）

Claims

光源からの光を走査して第１の対物レンズにより結像する装置本体と、
前記第１の対物レンズの焦点位置に一端面を配する光ファイバ束と、
該ファイバ束の他端面側に配置され、光ファイバ束の他端面から発せられた光を試料に結像する第２の対物レンズと、
前記光ファイバ束の一端面と共役な位置に配置され、該第２の対物レンズ、光ファイバ束および第１の対物レンズを介して戻る試料からの戻り光を通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した光を撮像する撮像手段とを備え、
前記光ファイバ束の一端面に、所定の厚さを有するガラス板を配置した光走査型共焦点観察装置。
前記ガラス板が、前記光ファイバ束の一端面に接着されている請求項１に記載の光走査型共焦点観察装置。
光源からの光を走査して第１の対物レンズにより結像する装置本体と、
前記第１の対物レンズの焦点位置に一端面を配する光ファイバ束と、
該光ファイバ束の他端面に配置され、光ファイバ束の他端面から発せられた光を試料に結像する第２の対物レンズと、
前記光ファイバ束の一端面と共役な位置に配置され、該第２の対物レンズ、光ファイバ束および第１の対物レンズを介して戻る試料からの戻り光を通過させる共焦点ピンホールと、
該共焦点ピンホールを通過した光を撮像する撮像手段とを備え、
前記光ファイバの一端面と前記撮像手段との間に、前記光ファイバ束の一端面からの反射光を遮断するバリアフィルタ手段を備える光走査型共焦点観察装置。