CN106770114A - 一种高通量测序碱基荧光识别系统装置与方法 - Google Patents

Abstract

一种高通量测序碱基荧光识别系统装置，包括：位移控制模块，通过步进电机驱动精密导轨移动反应室，以控制基因芯片的扫描进程；反应室恒温模块，控制反应室的温度变化；激光触发模块，利用红绿激光经过直角棱镜形成一道激光，打在基因芯片上，结合有不同dNTP的荧光基团在激光的照射下，发出不同光谱特性的四种荧光；荧光成像模块，利用sCMOS相机实现荧光图像成像，最后将图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别；本发明还提供了相应的识别方法，将基因芯片放置在相对密闭无尘的反应室中，激光通过光路到达基因芯片上表面，实现碱基荧光成像，通过碱基识别算法，识别测序碱基，实现高通量测序碱基识别高精度、稳定性好的要求。

Description

一种高通量测序碱基荧光识别系统装置与方法

技术领域

本发明属于高通量基因测序技术领域，涉及生命科学、计算机科学以及自动控制学科，特别涉及一种高通量测序碱基荧光识别系统装置。

背景技术

第一代基因测序技术是荧光标记的Sanger法。1977年Frederick Sanger发明的双脱氧核糖核酸链末端终止法是基因测序领域的成功先例。Sanger法拥有高精度和简单等特点。人类基因组的测序正是基于该技术完成的。但是DNA模板的组成或者二级结构有时候引起DNA聚合酶不正常终止。第二代基因测序技术的核心技术思想是边合成边测序技术，即是通过一系列技术手段捕获新合成的末端标记来确定DNA序列。2005年以后，高通量基因测序技术就指的是第二代测序，也被称为下一代测序技术(Next generation sequencing)，相对于第一代测序技术，测序速度大大提升。自从高通量基因测序技术问世以来，新兴的基因组测序技术展现出了无限的活力。

而测序碱基荧光识别作为高通量基因测序的核心环节，对测序过程中环境温度、亮度、洁净度以及光路结构都有较高要求。高通量基因测序仪中基因芯片的生存环境、光路结构性能的优劣直接决定了测序碱基荧光识别的精度。

现有高通量基因测序系统多采用激光从反应室下的棱镜穿过到达基因芯片下表面的激发方式，易受到周围环境的干扰，循环成像时位移平台的移动容易导致激光光束的偏差，造成成像后的部分区域不发光或光强微弱，影响后期对测序碱基的荧光识别。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高通量测序碱基荧光识别系统装置，将基因芯片放置在相对密闭无尘的反应室中，激光通过光路到达基因芯片上表面，实现碱基荧光成像，通过碱基识别算法，识别测序碱基，实现高通量测序碱基识别高精度、稳定性好的要求。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高通量测序碱基荧光识别系统装置，基因芯片放置于基因测序仪反应室内，包括：

位移控制模块100，通过步进电机驱动精密导轨移动反应室，以控制基因芯片的扫描进程；

反应室恒温模块200，利用温控系统208控制反应室的温度变化，温控系统208包括制热和制冷装置；

激光触发模块300，包括主要激发碱基A和碱基C上荧光基团的红色激光器302和主要激发碱基G和碱基T上荧光基团的绿色激光器301，红绿激光经过直角棱镜401，形成一道激光，打在基因芯片上，结合有不同dNTP的荧光基团在激光的照射下，发出不同光谱特性的四种荧光；

荧光成像模块400，利用sCMOS相机实现荧光图像成像，最后将图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别。

所述基因测序仪反应室为相对密闭带卡扣的抽屉形式，便于对流动槽206进行清洗或更换，包括反应室主体203，反应室主体203上设置抽壳件204、X向插片201和Y向插片202，X向插片201和Y向插片202堆叠在反应室主体203的上表面，X向插片201和Y向插片202上各开有一条开口，两条开口相互垂直，以便使物镜与开口匹配，使得反应室处于一个相对封闭的状态。反应室主体203的顶部设置物镜固定夹205，反应室主体203内置载物台207、流动槽206以及温控系统208，其中，流动槽206设置在载物台207上，反应室主体203的侧面分别开有小孔，供硅胶软管插入，由注射针将软管里的试剂导入流动槽206，温控单元208放置在载物台207正下方，对温度进行闭环控制。

所述位移控制模块100中，利用X-Y导轨装置带动反应室运动；

所述反应室恒温模块200中，利用温度传感器采集温度，加热装置为位于载物台下方的电热片，制冷装置为带散热风扇的半导体制冷片；反应室与试剂组和试剂泵连接，其中试剂泵连接电机，控制器也与电机连接，控制试剂泵向基因芯片完成注入工作。

所述激光触发模块300中：

绿色激光器301的输出光依次经滤光片一303、准直透镜一305、孔径光阑一307，由反射镜一309反射到达半透半反镜311；

红色激光器302的输出光依次经滤光片二304、准直透镜二306、孔径光阑二308，由反射镜二310反射到达半透半反镜311；

两束光再一同被反射镜三312反射到反射镜四313，由反射镜四313将光束反射到透镜314，再经由直角棱镜401，将光束反射到滤波轮402，经由镜筒403和物镜404，到达基因芯片的上表面，激发携带有荧光基团的碱基发光。

所述滤光片一303、半透半反镜311和滤光片二304均装在转轮上，扫描过程中，不断切换转轮，并通过滤波轮402实现扫描过程中的自动切换，形成四种光路。

所述sCMOS相机作为光电转换器件，通过配备滤光片的镜头捕获基因芯片上某一特定区域(Δx×Δy)受激后发出的荧光，所述位移控制模块带动被扫描芯片运动，以完整对整个基因芯片的扫描过程。

本发明还提供了基于所述系统装置的高通量测序碱基荧光识别方法，包括如下步骤：

步骤1，在基因芯片中注入四种不同类型的荧光染料，放置于基因测序仪反应室中；

步骤2，调节反应室恒温模块200，使环境温度控制在基因生存所需的适宜范围内；

步骤3，控制激光触发模块300产生特定波长的平行线型激光束，激发待测基因芯片中核苷酸携带的荧光染料基团发光；

步骤4，利用位移控制模块100控制反应室移动，使激光束以速度可控的方式对基因芯片进行线扫描；

步骤5，利用sCMOS相机对视野中基因芯片发光碱基进行成像；

步骤6，将成像图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别。

所述步骤6中，采用半极大值全宽度(FWHM)方法，即荧光强度下降到最大值一半时对应的宽度，对荧光区域进行碱基簇的判别。

本发明与传统的测序碱基荧光图像扫描成像方法相比，综合了面成像检测法低成本、设计简单和共聚焦点扫描法灵敏度高的优点，把点激发变成线激发，从而把二维扫描变成了一维扫描，提高了成像的速度；而与面成像方法相比，会聚成线的激发光光强具有更高的功率，探测灵敏度有所提高，对更低荧光强度的图像成像效果更好。

综上，本发明通过对测序碱基光路进行精密化设计，提高了碱基识别过程的稳定性，提高了测序结果的准确性。此外通过控制基因测序仪进行大规模的扫描成像，因此保证了足够的测序通量。

附图说明

图1是本发明高通量测序碱基荧光识别系统装置的立体结构图。

图2是本发明基因测序仪反应室的立体结构图。

图3是本发明基因测序仪反应室的截面示意图。

图4是本发明激光触发模块的逻辑结构图。

图5是本发明高通量测序碱基荧光识别系统装置的结构简图。

图6是本发明高通量碱基荧光识别方法流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

如图1所示，本发明高通量测序碱基荧光识别系统装置，由四大功能模块组成，包括位移控制模块100、反应室恒温模块200、激光触发模块300和荧光成像模块400。本发明所有图示中各模块及仪器之间的连接关系是为了清楚阐释其信息交互及控制过程的需要，应视为逻辑上的控制关系，而不应限于物理连接或无线连接。各模块结构或者功能如下：

位移控制模块100，通过步进电机驱动精密导轨移动反应室，以控制基因芯片的扫描进程，具体可基于X-Y导轨装置来实现。

反应室恒温模块200，利用温度传感器采集温度，利用温控系统208控制反应室的温度变化，温控系统208包括制热和制冷装置。加热装置为位于载物台下方的电热片，制冷装置为带散热风扇的半导体制冷片；反应室与试剂组和试剂泵连接，其中试剂泵连接电机，控制器也与电机连接，控制试剂泵向基因芯片完成注入工作。

激光触发模块300，包括主要激发碱基A和碱基C上荧光基团的红色激光器302和主要激发碱基G和碱基T上荧光基团的绿色激光器301，红绿激光经过直角棱镜401，形成一道激光，打在基因芯片上，结合有不同dNTP的荧光基团在激光的照射下，发出不同光谱特性的四种荧光。

荧光成像模块400，利用sCMOS相机实现荧光图像成像，最后将图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别。sCMOS相机作为光电转换器件，通过配备滤光片的镜头捕获基因芯片上某一特定区域(Δx×Δy)受激后发出的荧光，由位移控制模块带动被扫描芯片运动，完整对整个基因芯片的扫描过程。

本发明中，基因芯片放置于图2和图3中的反应室内。基因测序仪反应室为相对密闭带卡扣的抽屉形式，便于对流动槽206进行清洗或更换，包括反应室主体203，反应室主体203上设置抽壳件204、X向插片201和Y向插片202，X向插片201和Y向插片202堆叠在反应室主体203的上表面，X向插片201和Y向插片202上各开有一条开口，两条开口相互垂直，以便使物镜与开口匹配，使得反应室处于一个相对封闭的状态。反应室主体203的顶部设置物镜固定夹205，反应室主体203内置载物台207、流动槽206以及温控系统208，其中，流动槽206设置在载物台207上，反应室主体203的侧面分别开有小孔，供硅胶软管插入，由注射针将软管里的试剂导入流动槽206，温控单元208放置在载物台207正下方，对温度进行闭环控制。

上述四大功能模块分别控制基因测序仪中对应的各个组件，从而保障基因测序仪中适宜基因生存的环境温度，控制碱基成像，从而实现碱基荧光识别。主要包括：控制测序系统将试剂导入反应室内的流动槽206中，并调节反应室的温度；控制扫描过程中位移平台的横向和纵向速度及距离；控制激发光源的形状大小以及激发时长间隔；激发基因芯片中待测碱基片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光；控制相机捕获荧光信号，控制碱基成像过程。

高通量测序碱基荧光识别系统装置由多个具体组件构成，分别与计算机控制系统中的各个功能模块相对应，接受并执行来自各个功能模块的指令。这些组件包括：用于将试剂注入反应室流动槽206的组件，用于调节反应室温度的组件，用于调节位移平台移动距离的组件，用于激发激光的组件，用于碱基图像成像的组件等。应当说明的是，不同功能的各个组件之间不一定完全独立，实现不同功能的各个组件也可能会涉及一个或多个相同的部件。在本发明中，系统装置的关键在于自动地控制并调节反应室温度、保障洁净度及密闭性，为基因芯片的存放提供一个适宜的环境，提供了一个高效可行且稳定性强的光路结构，以便后期对碱基荧光进行识别。

需要说明的是，本发明不涉及碱基片段样品的制备，对象为已制备好的碱基样品。将已制备好的基因芯片放置于基因测序仪的反应室中固定，反应室中配备有温控系统208及试剂传输模块，用于控制反应室内温度以及为基因芯片提供测序所需的试剂。反应室恒温模块200中设置有与控制器相连的温度传感器，控制器与反应室恒温模块200的驱动器连接，实现对反应室内温度的调节与控制；试剂传输模块通过注射针和硅胶软管将基因试剂传输到反应室内的流动槽206，由控制器控制传输时间及速度。

在传统高通量基因测序技术中，多选择汞灯、氙灯等作光源，汞灯的寿命与启动次数和工作时间有关，启动次数愈多，每次工作时间愈短，寿命愈短；氙灯则需专用的低压直流电源箱，灯的温度极高，价格比汞灯更为昂贵。本发明中，采用激光器作为激发光源，其具有亮度高、方向性好、单色性好、相干性好等优点。最主要的是，激光器为冷光源，可有效避免加装隔热光学器件。对碱基进行成像过程中，传统高通量测序技术采用面阵相机进行面扫描，逐个区域进行图像成像，但该方式具有曝光时间长、成像质量差等缺点。本发明采用的是sCMOS相机，其具有高灵敏度、高分辨率和高读出速度的特性。sCMOS相机作为光电转换器件，通过配备相应滤光片的镜头对基因芯片上某一特定区域(Δx×Δy)受激后发出的荧光进行成像。

本发明中，基因芯片的扫描过程由步进电机驱动精密导轨移动反应室来实现。位移平台带动被扫描基因芯片协同运动以完成整个扫描过程。

本发明中，激光触发模块300中，红绿色激光器主要用于产生特定波长的激光光束，照射反应室流动槽206中的基因芯片，激发基因芯片中待测碱基片段样品中核苷酸携带的荧光基团发光，此外，激光触发模块300光路中安装的光学元件可调节激光的光强分布，使光斑的光强均匀分布，避免产生光强呈高斯分布的光斑，同时孔径光阑可调节光斑的大小形状，使输出平行光强均匀的形状可控的光源。

具体地，激光触发模块300的一种结构如图4所示：

绿色激光器301的输出光依次经滤光片一303、准直透镜一305、孔径光阑一307，由反射镜一309反射到达半透半反镜311；

红色激光器302的输出光依次经滤光片二304、准直透镜二306、孔径光阑二308，由反射镜二310反射到达半透半反镜311；

两束光再一同被反射镜三312反射到反射镜四313，由反射镜四313将光束反射到透镜314，再经由直角棱镜401，将光束反射到滤波轮402，经由镜筒403和物镜404，到达基因芯片的上表面，激发携带有荧光基团的碱基发光。

上述的滤光片用于筛选特定波长的光束，其他波长的光束则被阻断，通过的光束进入准直透镜；准直透镜使得出射光为平行光，且能量在该方向上集中，汇聚到孔径光阑；孔径光阑用于限制入射光光束大小，对光束进行整形优化，通过的光束进入反射镜；反射镜用于将光束进行反射使其对准半透半反射；半透半反射用于控制特定波段的光束被反射，而其他波段的光束则能通过，反射的光进入透镜；透镜用于会聚接收的光束，经会聚的光束进入直角棱镜；直角棱镜用于高效地在内部全反射入射光，使其对准sCMOS相机；sCMOS相机用于对接收的光束进行成像，并将生成的图片传送至计算机。

在碱基荧光成像过程中，控制器通过控制基因测序仪反应室的运动，实现对基因芯片中待测碱基片段进行扫描循环成像。激光触发模块300控制激光光路在待测碱基片段样品上逐次移动，同时确定每次移动后反应室流动槽206中待测碱基片段样品的图像位置信息；激光触发模块300控制激光光源产生特定波长的光束，激发待测碱基样品中核苷酸携带的荧光染料基团发光，并在每次激光扫描过程中确定待测碱基片段样品的成像位置，进行碱基荧光成像。

具体来说，荧光成像模块400主要包括聚焦单元、滤波轮单元、直角棱镜单元以及sCMOS相机单元。聚焦单元中物镜404及镜筒403用于收集基因芯片中碱基荧光基团所发荧光并调节焦距，经收集后的光束进入滤波轮单元；滤波轮402用于筛选通过特定波长的光束，其他波长的光束则被阻断，通过的光束进入直角棱镜单元；直角棱镜401将光束反射使其对准sCMOS相机单元；sCMOS相机用于对接收的光束进行成像，并将生成的图片传送至计算机控制系统，进行后期碱基荧光识别。

本发明对高通量测序碱基荧光识别方法与系统装置的实现方式如图5所示。

本发明中，高通量碱基荧光识别方法流程如图6所示。高通量碱基荧光识别方法中，先进行荧光亮点区域的确定，再确定其相应边界、面积和区域内的最大灰度值。

确定碱基荧光簇的规则如下：若荧光亮点区域的半径大于等于三个像素，则认为该区域包含一个碱基簇；若荧光亮点区域的面积大于2×FWHM×FWHM，而小于16×FWHM×FWHM，且直径小于8×FWHM，则认为该区域包含多个碱基簇，在该荧光亮点区域内，通过查找多个局部灰度极大值，将该区域分割成多个更小的、含有单个碱基簇的区域；若荧光亮点区域面积非常大，大于16×FWHM×FWHM，且该亮点区域内只有一个灰度极大值，则视为干扰源，将该区域标记为污染区域并舍弃。

对确定的碱基簇，直接提取亮点区域内灰度值最大的像素的坐标作为碱基簇的坐标，取亮点区域内最大的灰度值为荧光强度值。

测量到的四种颜色对应的四种碱基A、C、G、T的信号强度分别为I_A、I_C、I_G、I_T，构成原荧光强度值I_measure，由下列四元一次方程获得：

其中m_a，a、m_a，c等为四种荧光基团的互相影响因子，构成交叉影响矩阵M，I_a、I_c、I_g、I_t为构成四种碱基A、C、G、T的信号强度基。

对原荧光强度值矩阵I_measure进行校正，用M做校正得到新的荧光强度值矩阵I′，则I′为：

I′＝I_measure×M^T

对新的荧光强度值矩阵I′进行操作，分别对四种碱基做如下筛选：

首先，对每个碱基簇，只选取荧光强度值最高的碱基，并几下其荧光强度值，这是对每种碱基的第一次筛选；

然后，对每种碱基第一次筛选结果的荧光强度值进行从小到大排序，以位于总数90％处的荧光强度值乘以10％，所得结果作为荧光强度值的下限，低于这个下限的荧光强度值都去掉，这是对每种碱基的第二次筛选；

最后，分别把C、G、T三种碱基荧光强度值的累计分布乘以一个校正因子，然后与碱基A的荧光强度值分布做单样本柯尔莫哥洛夫—斯米诺夫检验。通过最小化单样本柯尔莫哥洛夫—斯米诺夫检验的D统计量，得到相应碱基的校正因子r_CA、r_GA、r_TA，从而得到校正因子矩阵f，f为

用f校正M，并使其归一化。用校正后的交叉影响矩阵计算四种碱基的荧光强度值，即完成对高通量碱基荧光识别的过程。

Claims (10)

1.一种高通量测序碱基荧光识别系统装置，基因芯片放置于基因测序仪反应室内，其特征在于，包括：

位移控制模块(100)，通过步进电机驱动精密导轨移动反应室，以控制基因芯片的扫描进程；

反应室恒温模块(200)，利用温控系统(208)控制反应室的温度变化，温控系统(208)包括制热和制冷装置；

激光触发模块(300)，包括主要激发碱基A和碱基C上荧光基团的红色激光器(302)和主要激发碱基G和碱基T上荧光基团的绿色激光器(301)，红绿激光经过直角棱镜(401)，形成一道激光，打在基因芯片上，结合有不同dNTP的荧光基团在激光的照射下，发出不同光谱特性的四种荧光；

荧光成像模块(400)，利用sCMOS相机实现荧光图像成像，最后将图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别。

2.根据权利要求1所述高通量测序碱基荧光识别系统装置，其特征在于，所述基因测序仪反应室为相对密闭带卡扣的抽屉形式，包括反应室主体(203)，反应室主体(203)上设置抽壳件(204)、X向插片(201)和Y向插片(202)，X向插片(201)和Y向插片(202)堆叠在反应室主体(203)的上表面，X向插片(201)和Y向插片(202)上各开有一条开口，两条开口相互垂直，反应室主体(203)的顶部设置物镜固定夹(205)，反应室主体(203)内置载物台(207)、流动槽(206)以及温控系统(208)，其中，流动槽(206)设置在载物台(207)上，反应室主体(203)的侧面分别开有小孔，供硅胶软管插入，由注射针将软管里的试剂导入流动槽(206)，温控单元(208)放置在载物台(207)正下方，对温度进行闭环控制。

3.根据权利要求2所述高通量测序碱基荧光识别系统装置，其特征在于，

所述位移控制模块(100)中，利用X-Y导轨装置带动反应室运动；

所述反应室恒温模块(200)中，利用温度传感器采集温度，加热装置为位于载物台下方的电热片，制冷装置为带散热风扇的半导体制冷片；反应室与试剂组和试剂泵连接，其中试剂泵连接电机，控制器也与电机连接，控制试剂泵向基因芯片完成注入工作。

4.根据权利要求1所述高通量测序碱基荧光识别系统装置，其特征在于，所述激光触发模块(300)中：

绿色激光器(301)的输出光依次经滤光片一(303)、准直透镜一(305)、孔径光阑一(307)，由反射镜一(309)反射到达半透半反镜(311)；

红色激光器(302)的输出光依次经滤光片二(304)、准直透镜二(306)、孔径光阑二(308)，由反射镜二(310)反射到达半透半反镜(311)；

两束光再一同被反射镜三(312)反射到反射镜四(313)，由反射镜四(313)将光束反射到透镜(314)，再经由直角棱镜(401)，将光束反射到滤波轮(402)，经由镜筒(403)和物镜(404)，到达基因芯片的上表面，激发携带有荧光基团的碱基发光。

5.根据权利要求4所述高通量测序碱基荧光识别系统装置，其特征在于，所述滤光片一(303)、半透半反镜(311)和滤光片二(304)均装在转轮上，扫描过程中，不断切换转轮，并通过滤波轮(402)实现扫描过程中的自动切换，形成四种光路。

6.根据权利要求1所述高通量测序碱基荧光识别系统装置，其特征在于，所述sCMOS相机作为光电转换器件，通过配备滤光片的镜头捕获基因芯片上某一特定区域(Δx×Δy)受激后发出的荧光，所述位移控制模块带动被扫描芯片运动，以完整对整个基因芯片的扫描过程。

7.基于权利要求1所述高通量测序碱基荧光识别系统装置的高通量测序碱基荧光识别方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，在基因芯片中注入四种不同类型的荧光染料，放置于基因测序仪反应室中；

步骤2，调节反应室恒温模块(200)，使环境温度控制在基因生存所需的适宜范围内；

步骤3，控制激光触发模块(300)产生特定波长的平行线型激光束，激发待测基因芯片中核苷酸携带的荧光染料基团发光；

步骤4，利用位移控制模块(100)控制反应室移动，使激光束以速度可控的方式对基因芯片进行线扫描；

步骤5，利用sCMOS相机对视野中基因芯片发光碱基进行成像；

步骤6，将成像图像传输到计算机进行测序碱基荧光识别。

8.根据权利要求7所述高通量测序碱基荧光识别方法，其特征在于，所述步骤6中，先进行荧光亮点区域的确定，再确定其相应边界、面积和区域内的最大灰度值，采用半极大值全宽度(FWHM)方法，即荧光强度下降到最大值一半时对应的宽度，对荧光区域进行碱基簇的判别。

9.根据权利要求8所述高通量测序碱基荧光识别方法，其特征在于，所述半极大值全宽度(FWHM)方法如下：

若荧光亮点区域的半径大于等于三个像素，则认为该区域包含一个碱基簇；若荧光亮点区域的面积大于2×FWHM×FWHM，而小于16×FWHM×FWHM，且直径小于8×FWHM，则认为该区域包含多个碱基簇，在该荧光亮点区域内，通过查找多个局部灰度极大值，将该区域分割成多个更小的、含有单个碱基簇的区域；若荧光亮点区域面积非常大，大于16×FWHM×FWHM，且该亮点区域内只有一个灰度极大值，则视为干扰源，将该区域标记为污染区域并舍弃；

对确定的碱基簇，直接提取亮点区域内灰度值最大的像素的坐标作为碱基簇的坐标，取亮点区域内最大的灰度值为荧光强度值。

10.根据权利要求9所述高通量测序碱基荧光识别方法，其特征在于，测量到的四种颜色对应的四种碱基A、C、G、T的信号强度分别为I_A、I_C、I_G、I_T，构成原荧光强度值I_measure，由下列四元一次方程获得：

$\left(\begin{array}{c}{I}_A\\ I_C\\ I_G\\ I_T\end{array}\right)=\left[\begin{array}{cccc}{m}_{a,a}& m_{a,c}& m_{a,g}& m_{a,t}\\ m_{c,a}& m_{c,c}& m_{c,g}& m_{c,t}\\ m_{g,a}& m_{g,c}& m_{g,g}& m_{g,t}\\ m_{t,a}& m_{t,c}& m_{t,g}& m_{t,t}\end{array}\right]\left(\begin{array}{c}{I}_a\\ I_c\\ I_g\\ I_t\end{array}\right)$

其中m_a，a、m_a，c、m_a，g、m_a，t为四种荧光基团的互相影响因子，构成交叉影响矩阵M，I_a、I_c、I_g、I_t为构成四种碱基A、C、G、T的信号强度基；

对原荧光强度值矩阵I_measure进行校正，用M做校正得到新的荧光强度值矩阵I′，则I′为：

I′＝I_measure×M^T

对新的荧光强度值矩阵I′进行操作，分别对四种碱基做如下筛选：

首先，对每个碱基簇，只选取荧光强度值最高的碱基，并几下其荧光强度值，这是对每种碱基的第一次筛选；

然后，对每种碱基第一次筛选结果的荧光强度值进行从小到大排序，以位于总数90％处的荧光强度值乘以10％，所得结果作为荧光强度值的下限，低于这个下限的荧光强度值都去掉，这是对每种碱基的第二次筛选；

最后，分别把C、G、T三种碱基荧光强度值的累计分布乘以一个校正因子，然后与碱基A的荧光强度值分布做单样本柯尔莫哥洛夫—斯米诺夫检验，通过最小化单样本柯尔莫哥洛夫—斯米诺夫检验的D统计量，得到相应碱基的校正因子r_CA、r_GA、r_TA，从而得到校正因子矩阵f，f为

$f=\left[\begin{array}{ccc}1& 00& 0\\ 0& r_{CA}0& 0\\ 0& 0r_{GA}& 0\\ 0& 00& r_{TA}\end{array}\right]$

用f校正M，并使其归一化。用校正后的交叉影响矩阵计算四种碱基的荧光强度值，即完成对高通量碱基荧光识别的过程。