CN104893972B - 一种高通量基因测序动态调度控制方法及系统装置 - Google Patents

Abstract

一种高通量基因测序动态调度控制方法及系统装置，系统装置包括温度控制系统、试剂控制系统、激光触发控制系统、振镜扫描系统和光学采集系统，通过温度及试剂控制系统对流动槽内被打断的待测片段进行桥式PCR扩增；通过温度、试剂控制系统保证边合成边测序(Sequencing？by？Synthesis，SBS)反应顺利进行；通过激光触发、振镜扫描、光学采集对荧光信号完成捕获并保存数据，实现了高通量基因测序仪的一体化控制系统。

Description

一种高通量基因测序动态调度控制方法及系统装置

技术领域

本发明属于高通量基因测序技术领域，特别涉及一种高通量基因测序动态调度控制方法及系统装置。

背景技术

高通量基因测序技术涉及机械、电子通信、生物、化学、光学等交叉学科。整个测序过程对精度要求高，任何一点点误差，就可能导致测序结果不理想，并且要求各个组件之间协调配合，包括对试剂量及类型、反应温度、时间、洁净度、纳米级位移、聚焦调节、发光强度、光路调节、曝光时间计算、图像拍摄等多方面的控制要求高，难度大。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高通量基因测序动态调度控制方法及系统装置，可为高通量测序仪的反应小室提供环境一体化控制策略。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种高通量基因测序动态调度系统装置，桥式PCR扩增反应以及边合成边测序(SequencingbySynthesis，SBS)反应均在反应小室的流动槽中进行，流动槽表面内表面以共价键的形式固定带有接头的单链DNA片段，包括：

用于调控反应小室内温度的温度控制系统，桥式PCR扩增反应实现温度循环控制，边合成边测序反应实现对温度的恒温保障；

用于控制所述两种反应过程中各种试剂的加载和流出的试剂控制系统，对桥式PCR扩增反应和边合成边测序反应的试剂、试剂缓冲液、PH值控制液等的加载、流出及试剂时序进行控制；

用于向边合成边测序反应过程中的待测DNA片段提供红绿激光以激发待测DNA片段中携带的荧光染料基团发光的激光触发系统，对边合成边测序反应提供红绿激光触发条件；

用于在边合成边测序反应过程中进行扫描的振镜扫描系统，在边合成边测序反应每一轮反应过程中，对流动槽进行扫描，捕获荧光数据；

以及，

用于采集荧光染料基团发光图像的光学采集系统，在边合成边测序反应进行过程中，CCD采集捕获的荧光数据，进行保存，后续进行图像处理、数据处理，进而得到测序结果。

所述温度控制系统包括设置于反应小室内的温度传感器、电热片、半导体制冷片以及散热风扇，其中电热片位于流动槽上方的翻盖上，流动槽下方为载物台，载物台位于反应台上，半导体制冷片嵌在载物台中间的凹槽中，散热片贴放于半导体制冷片下表面，散热片配有散热风扇；电热片贴在SBS反应室四周，根据桥式PCR扩增反应的变性、退火、延伸三个阶段，进行温度的循环调控，在边合成边测序反应过程中，调控反应小室内的温度恒定为室温。

所述试剂控制系统包括一个多通道试剂泵，根据桥式PCR扩增反应和边合成边测序反应的不同阶段，打开或者关闭相应通道，控制相应试剂的加载和流出，并控制加载和流出的相应时间。

所述激光触发系统包括绿激光器和红激光器以及其各自连接的电源，绿激光器和红激光器平行设置，发出的激光均经振镜反射最终射向边合成边测序反应中的待测DNA片段。

所述振镜扫描系统包括振镜及其驱动器，驱动器带动振镜实现扫描，每轮边合成边测序反应，扫描一次。

所述光学采集系统包括CCD相机，采集荧光染料基团发光图像，并传输至计算机。

本发明还提供了一种基于所述系统装置的高通量基因测序动态调度控制方法，包括如下步骤：

步骤1，将待测DNA片段样品放入流动槽中；

步骤2，对待测样品进行桥式PCR扩增反应，在反应过程中，控制小室温度、试剂流量以及PH值；

步骤3，对扩增后的样品进行边合成边测序反应，反应过程中，控制小室温度和试剂流量，同时控制红绿激光触发照射、振镜扫描、光学采集荧光信号。

所述步骤2中小室温度控制策略为：根据PCR扩增反应温度曲线，控制温度在变性、退火、延伸三个反应阶段进行循环，利用温度传感器读取反应小室温度，执行机构为电热片、半导体制冷片以及散热风扇；其中：

半导体制冷片加热反应对象用如下微分方程描述：

$T\frac{{\mathrm{d\Δ\θ}}_c}{dt}+{\mathrm{\Δ\θ}}_c=K\mathrm{\Δ}W+{\mathrm{\Δ\θ}}_0+{\mathrm{\Δ\θ}}_f$

式中Δθ_c表示小室空气温度变化量；T表示半导体制冷片的时间常数；ΔW表示反应台热流量变化；Δθ₀表示电热片加热温度变化；Δθ_f表示制冷片散热引起的温度变化；K表示半导体制冷片的放大系数；

半导体制冷片传导热量用如下所示公式进行计算：

Q_f＝(S_ncw×T_c×I)-(0.5×I²×R_ncw)-[K_ncw×(Th-Tc)]

式中S_ncw表示半导体制冷片热电系数；R_ncw表示半导体制冷片电阻；K_ncw表示半导体制冷片热传导率；I表示输入半导体制冷片电流；Th-Tc表示制冷片两面开氏温度值差；

在各个反应阶段，对反应小室温度进行保持；当需要进行下个阶段反应时，通断继电器相应温控部件进行温控，达到2.5℃/s；

所述试剂流量控制是：

利用多通道试剂泵，在相应反应阶段在流动槽内加入相应试剂；

所述PH值控制是：

在各试剂出口进行PH值检测，根据需要加入PH调节试剂调节PH值至相应范围。

所述步骤3中小室温度控制策略为：控制温度恒定为反应所需温度；

试剂流量控制是：

利用多通道试剂泵，在相应反应阶段在流动槽内加入相应试剂；

红绿激光触发照射控制是：

在反应过程中，红绿激光检测装置检测激光触发是否正常，如正常则继续反应，否则进行报警；

振镜扫描控制是：

对每轮反应进行流动槽扫描，每扫描一次，图像数据进行保存，则完成一轮反应；

光学采集荧光信号控制是：

通过CCD采集由振镜扫描传来的荧光信息，对图像进行数据保存，进而进行图像处理和数据处理，得到测序结果。

所述光学采集系统采集的荧光染料基团发光图像在计算机中依次进行如下处理：图像配准、基因簇定位、定位信息增强、亮度值获取、背景去除；处理之后获取测序片段进行测序拼接，从而得到测序结果。

与现有技术相比，本发明采用一体化控制策略，有效地将桥式PCR反应装置与测序反应装置结合控制过程。采用半导体制冷片与电热片同时温控，加大温控反应速率。采用振镜扫描控制实现对扫描控制的精确控制。采用阶段反应微流量精确控制试剂反应。给出了一种总体控制调度模型。

附图说明

图1为采用本发明的反应小室系统装置立体结构示意图。

图2为系统调度逻辑结构图。

图3为桥式PCR反应系统流程图。

图4为边合成边测序反应系统流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

本发明使用第二代高通量基因测序仪，其可分为四个模块，流动槽载体模块；桥式PCR模块；边合成边测序模块以及软件合成测序模块。环境一体化控制即对桥式PCR模块和边合成边测序模块反应小室的温度及试剂控制一体化。

流动槽模块是高通量基因测序中存放待测DNA片段和DNA边合成边测序反应的场所，根据型号不同流动槽可以分为2、4、8条通道流动槽，本专利采用2条通道流动槽。每条通道的内表面能以共价键的形式随机固定带接头的单链待测DNA片段。

基因测序仪的反应小室系统装置具体结构如图1所示。包括内嵌温度传感器PT100的载物台2，内嵌半导体制冷片的反应台8位于载物台2上，流动槽1位于反应台8上，流动槽1上方有电热片，载物台2下方有散热片4和散热风扇5，流动槽1的两端分别连接一个多通道试剂泵7，本发明各种控制均集成于最下部的主控板6中。

系统调度逻辑结构如图2所示。系统调度控制是指桥式PCR反应中的温度控制与试剂控制的中的各个传感器和执行器的协调工作；还有SBS反应中的激光触发、光学采集、扫描振镜、温度控制和试剂控制中各个部件之间的协调工作。

具体地：

温度控制：

反应小室PCR反应温度需要实现一个温度循环控制。PCR反应对温度和PH值的要求非常严格，小室的PCR反应温度控制实际上是变性(90℃～96℃)、退火(25℃～65℃)、延伸(70℃～75℃)三个过程的一个循环，进而对被打断的DNA片段进行扩增，在流动槽通道表面形成待测簇；边合成边测序反应温度控制是最终测序反应进行时所需的环境温度的控制。

温度控制系统采用模糊神经网络控制系统。被控对象采用铝制的反应台8，PCR环境只需温度循环控制和试剂控制，采用密闭空间更容易实现。流动槽1上方为翻盖，内嵌电热片3，目的是给一个中间温度(可选70℃)恒定，这样升降温度更快。下方为载物台2，中间有凹槽内嵌半导体制冷片，通过加正反向电流来对反应台8进行控温。半导体制冷片下表面贴放散热片4，散热片4配有散热风扇5。最下方为主控板6。温度传感器PT100读取反应室温度，执行机构为电热片3、半导体制冷片、散热风扇5等。在各个反应阶段，需要对室温进行保持；当需要进行下个阶段反应时，通断继电器相应温控部件进行温控，温度升降速度达到2.5℃/s。SBS反应要实现室温恒定。因为SBS反应激光触发及光学采集空间限定，反应小室比PCR小室更大。在SBS反应室四周贴电热片，控制室温为反应所需温度。

其中：

PCR扩增反应温度控制策略为：根据PCR扩增反应温度曲线，控制温度在变性、退火、延伸三个反应阶段进行循环，利用温度传感器读取反应小室温度，执行机构为电热片、半导体制冷片以及散热风扇。

半导体制冷片加热反应对象用如下微分方程描述：

$T\frac{{\mathrm{d\Δ\θ}}_c}{dt}+{\mathrm{\Δ\θ}}_c=K\mathrm{\Δ}W+{\mathrm{\Δ\θ}}_0+{\mathrm{\Δ\θ}}_f$

式中Δθ_c表示小室空气温度变化量；T表示半导体制冷片的时间常数；ΔW表示反应台热流量变化；Δθ₀表示电热片加热温度变化；Δθ_f表示制冷片散热引起的温度变化；K表示半导体制冷片的放大系数；

半导体制冷片传导热量用如下所示公式进行计算：

Q_f＝(S_ncw×T_c×I)-(0.5×I²×R_ncw)-[K_ncw×(Th-Tc)]

式中S_ncw表示半导体制冷片热电系数；R_ncw表示半导体制冷片电阻；K_ncw表示半导体制冷片热传导率；I表示输入半导体制冷片电流；Th-Tc表示制冷片两面开氏温度值差；

在各个反应阶段，对反应小室温度进行保持；当需要进行下个阶段反应时，通断继电器相应温控部件进行温控，达到2.5℃/s；

SBS反应中小室温度控制策略为：控制温度恒定为反应所需温度；

试剂控制：

小室的试剂控制是指PCR反应和边合成边测序反应的试剂、试剂缓冲液、PH值控制液等的加载、流出及试剂时序控制。反应所需试剂包括：dCTP、dGTP、dTTP、α位硫代的dATP、ATP、荧光素、APS、apyrase、apyrase抑制剂等。试剂控制就是在相应反应阶段把试剂加入到流动槽1内进行反应，执行机构采用多通道试剂泵7，多通道试剂泵7的管道通过针孔与试剂泵连接。在试剂出口进行PH值检测，在需要时加入PH调节试剂。

激光触发控制：SBS反应检测荧光信号需要红绿激光的触发，正在合成的碱基，在激光触发下发出荧光信号。红绿激光检测装置检测激光触发正常，反应继续，光学采集系统顺利进行采集；如果检测不正常，进行报警。

振镜扫描控制：扫描采用振镜扫描控制。SBS反应每轮反应都要进行流动槽扫描。对流动槽扫描完成一次，图像数据进行保存，则完成一轮反应。

光学采集系统：由振镜扫描传来的荧光信息，通过CCD采集，对图像进行数据保存，在计算机中依次进行如下处理：图像配准、基因簇定位、定位信息增强、亮度值获取、背景去除；处理之后获取测序片段进行测序拼接，从而得到测序结果。

如图3所示，为桥式PCR反应流程，开始阶段设定扩增温度及循环次数，每个循环包括变性、退火、延伸三个阶段，反应过程需要对小室温度及试剂进行控制。温度控制采用半导体制冷片配合电热片的方式进行控制，电热片提供基础温度，制冷片通过加正反向电压来进行升降温度。试剂控制包括对反应试剂的流量微控制和对反应环境PH值调节。

如图4所示，为边合成边测序反应流程，主要包括五个控制模块：激光触发、温度控制、流量控制、振镜扫描和光学采集。激光触发目的在于产生波长为635nm和532nm的红绿激光，用于激发荧光碱基发光。温度控制不同于桥式PCR，是保持反应温度恒定不变。试剂流量控制保证反应的顺利进行，判断反应状态后加入反应试剂以及缓冲液进行下阶段反应。振镜扫描通过控制扫描振镜的旋转角来改变光学回路，把该反应阶段流动槽内所有荧光信息扫描一遍。光学采集系统采集荧光图像后，保存图像数据到PC端进行后续拼接。

Claims (8)

1.一种高通量基因测序动态调度系统装置，桥式PCR扩增反应以及边合成边测序反应均在反应小室的流动槽中进行，流动槽表面内表面以共价键的形式固定带有接头的单链DNA片段，其特征在于，包括：

用于调控反应小室内温度的温度控制系统；

用于控制所述两种反应过程中各种试剂的加载和流出的试剂控制系统；

用于向边合成边测序反应过程中的待测DNA片段提供红绿激光以激发待测DNA片段中携带的荧光染料基团发光的激光触发系统；

用于在边合成边测序反应过程中进行扫描的振镜扫描系统，所述振镜扫描系统包括振镜及其驱动器，驱动器带动振镜实现扫描，每轮边合成边测序反应，扫描一次；

以及，

用于采集荧光染料基团发光图像的光学采集系统。

2.根据权利要求1所述高通量基因测序动态调度系统装置，其特征在于，所述温度控制系统包括设置于反应小室内的温度传感器、电热片、半导体制冷片以及散热风扇，其中电热片位于流动槽上方的翻盖上，流动槽下方为载物台，载物台位于反应台上，半导体制冷片嵌在载物台中间的凹槽中，散热片贴放于半导体制冷片下表面，散热片配有散热风扇；电热片贴在SBS反应室四周，根据桥式PCR扩增反应的变性、退火、延伸三个阶段，进行温度的循环调控，在边合成边测序反应过程中，调控反应小室内的温度恒定为室温。

3.根据权利要求1所述高通量基因测序动态调度系统装置，其特征在于，所述试剂控制系统包括一个多通道试剂泵，根据桥式PCR扩增反应和边合成边测序反应的不同阶段，打开或者关闭相应通道，控制相应试剂的加载和流出，并控制加载和流出的相应时间。

4.根据权利要求1所述高通量基因测序动态调度系统装置，其特征在于，所述激光触发系统包括绿激光器和红激光器以及其各自连接的电源，绿激光器和红激光器平行设置，发出的激光均经振镜反射最终射向边合成边测序反应中的待测DNA片段。

5.根据权利要求1所述高通量基因测序动态调度系统装置，其特征在于，所述光学采集系统包括CCD相机，采集荧光染料基团发光图像，并传输至计算机。

6.一种基于权利要求1所述系统装置的高通量基因测序动态调度控制方法，包括如下步骤：

步骤1，将待测DNA片段样品放入流动槽中；

步骤2，对待测样品进行桥式PCR扩增反应，在反应过程中，控制小室温度、试剂流量以及PH值；

步骤3，对扩增后的样品进行边合成边测序反应，反应过程中，控制小室温度和试剂流量，同时控制红绿激光触发照射、振镜扫描、光学采集荧光信号，其中：

小室温度控制策略为：控制温度恒定为反应所需温度；

试剂流量控制是：

利用多通道试剂泵，在相应反应阶段在流动槽内加入相应试剂；

红绿激光触发照射控制是：

在反应过程中，红绿激光检测装置检测激光触发是否正常，如正常则继续反应，否则进行报警；

振镜扫描控制是：

对每轮反应进行流动槽扫描，每扫描一次，图像数据进行保存，则完成一轮反应；

光学采集荧光信号控制是：

通过CCD采集由振镜扫描传来的荧光信息，对图像进行数据保存，进而进行图像处理和数据处理，得到测序结果。

7.根据权利要求6所述高通量基因测序动态调度控制方法，其特征在于，所述步骤2中小室温度控制策略为：根据PCR扩增反应温度曲线，控制温度在变性、退火、延伸三个反应阶段进行循环，利用温度传感器读取反应小室温度，执行机构为电热片、半导体制冷片以及散热风扇；其中：

半导体制冷片加热反应对象用如下微分方程描述：

$T\frac{{\mathrm{d\Δ\θ}}_c}{dt}+{\mathrm{\Δ\θ}}_c=K\mathrm{\Δ}W+{\mathrm{\Δ\θ}}_0+{\mathrm{\Δ\θ}}_F$

式中Δθ_c表示小室空气温度变化量；T表示半导体制冷片的时间常数；ΔW表示反应台热流量变化；Δθ₀表示电热片加热温度变化；Δθ_f表示制冷片散热引起的温度变化；K表示半导体制冷片的放大系数；

半导体制冷片传导热量用如下所示公式进行计算：

Q_f＝(S_ncw×T_c×I)-(0.5×I²×R_ncw)-[K_ncw×(Th-Tc)]

式中S_ncw表示半导体制冷片热电系数；R_ncw表示半导体制冷片电阻；K_ncw表示半导体制冷片热传导率；I表示输入半导体制冷片电流；Th-Tc表示制冷片两面开氏温度值差；

在各个反应阶段，对反应小室温度进行保持；当需要进行下个阶段反应时，通断继电器相应温控部件进行温控，达到2.5℃/s；

所述试剂流量控制是：

利用多通道试剂泵，在相应反应阶段在流动槽内加入相应试剂；

所述PH值控制是：

在各试剂出口进行PH值检测，根据需要加入PH调节试剂调节PH值至相应范围。

8.根据权利要求6所述高通量基因测序动态调度控制方法，其特征在于，所述光学采集系统采集的荧光染料基团发光图像在计算机中依次进行如下处理：图像配准、基因簇定位、定位信息增强、亮度值获取、背景去除；处理之后获取测序片段进行测序拼接，从而得到测序结果。