CN1800411A - 热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统 - Google Patents
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Abstract
热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，由热循环加热制冷组件(1)、光学系统(2)、光电倍增管(3)、运动台(4)、步进电机(5)、热循环温度控制器(6)、荧光检测控制器(7)、步进电机驱动器(8)和PC机(9)组成，本发明采用荧光实时检测方式来分析PCR模板的扩增，采用热电半导体制冷技术实现PCR过程，通过高灵敏度的光电系统对荧光信号进行检测，实现了在同一管内同时进行扩增和检测的功能，并采用微机作为上位机进行热循环工艺控制，以及采用光强实时检测的PCR生物检测系统，具有安全、清洁、温度变化快速，温度工艺控制灵活性好；荧光检测灵敏度高，动态范围大；数据处理自动化、不用制备专用芯片等特点。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种具有热循环工艺控制和光强实时检测的生物检测系统，特别是热循环控制聚合酶链式反应(PCR)生物检测系统。
技术背景
PCR是“聚合酶链式反应”的英文缩写，是一种用途极为广泛的基因检测新技术。它能灵敏地检测出是否含有某种特定基因及其含量。PCR在医药、工农业、考古、公安、军事等各个领域，都具有广阔的应用前景。PCR反应是一种模拟天然DNA复制的体外快速扩增技术，通过试管反应使极少量的基因组DNA样品中的特定基因片段，可短时间内获得数百万个特定DNA序列拷贝，PCR就是反复进行热变性—退火—引物延伸三个步骤的循环过程。经过上述三个步骤这样一个循环，模板DNA拷贝数增加一倍。在以后进行的循环过程中，新合成的DNA链都起着模板作用，因此，每经过一个循环，DNA拷贝数便增加一倍(×2)，N次循环后，拷贝数增加2N倍。进行25～30个循环，拷贝数即可扩增上百万倍(106)。传统PCR技术最基本的功能，就是反复提供三个不同的温度，通常是94℃、50℃和72℃，让样品在反复的变温中，进行生化反应。但是这种PCR技术有以下缺点：
(1)微细的条件波动都会影响扩增量，且反应到一定程度就易进入平坡区；
(2)用终点法从扩增产生DNA的量来推算起始样品中模板的量很难得出可靠的结果；
(3)因在设定循环次数到达时究竟是否在平坡区不得而知，对扩增条件控制各管颇难一致。
因此，最好的方法是作PCR实时定量，从扩增曲线上升的斜率及起始抬头点来估计原始样品中的拷贝数。
发明内容
本发明的技术解决问题是：克服现有技术的不足，提供一种安全、清洁、温度变化快速，温度工艺控制灵活性好；荧光检测灵敏度高，动态范围大；数据处理自动化的热循环控制PCR生物检测系统。
本发明的技术解决方案是：热循环控制PCR生物检测系统，其特点在于：它由热循环加热制冷组件、光学系统、光电倍增管、运动台、步进电机、热循环温度控制器、荧光检测控制器、步进电机驱动器和PC机组成，PC机经串口发送命令至热循环温度控制器，从而驱动热循环加热制冷组件对试管中样本加热制冷；同时热循环温度控制器将热循环加热制冷组件检测到的温度信号转换为数字信号，经串口送回PC机。样本经热循环发生性状改变，受激发光产生的荧光也随之改变；荧光向下经光学系统投射到光电倍增管变成电信号，送到荧光检测控制器转换成数字信号，再经另一串口发送至PC机。由PC机保存温度和荧光检测信号并作数据处理。另外PC机发送指令到荧光检测控制器，控制步进电机驱动器驱动步进电机，使运动台及其上的光学系统和光电倍增管作直线运动以循环检测各试管样本。
上述热循环加热制冷组件由承载样本试管的导热部件、热电阻传感器、热电致冷模块和散热器组成，其中承载样本试管的导热部件是一个有呈直线均匀排列的漏斗形孔的铝块，孔中可放样本试管，样本受激发光产生的荧光可通过漏斗形孔向下入射到光学系统，导热部件端部紧贴有一热电阻传感器用于检测导热部件温度。紧贴导热部件两侧均匀放置着多片热电制冷模块用于对导热部件进行加热制冷，最外侧紧贴着散热器用来散去多余的热量。
上述热循环温度控制器由温度检测放大器、模数转换器、单片机、数模转换器、PWM控制器、MOSFET全桥功率放大器、开关电源组成，热电阻传感器所检测的信号由温度检测放大器放大变为电压信号，经模数转换器变成数字信号送到单片机作数字处理，单片机经运算后得到数字控制量经数模转换器变成模拟信号，送到PWM控制器，产生双极性电流PWM驱动信号驱动MOSFET全桥功率放大器形成大小和方向均可改变的驱动电流驱动热电致冷模块，开关电源对各部分供电。同时温度检测信号数字量经串口送回PC机。
上述荧光检测控制器由荧光信号放大器、模数转换器、单片机、数模转换器组成，由光电倍增管检测到的荧光信号经荧光信号放大器放大，再经模数转换器变成数字信号送到单片机，同时单片机输出数字信号到数模转换器得到模拟电压信号对荧光信号放大器进行数控零位调节和数控增益补偿调节；另外单片机输出数字信号到步进电机驱动器以驱动步进电机，荧光检测信号的数字量经串口送回PC机作数据处理。
上述光学系统由LED发光二极管、透镜A、滤光片A、滤光片B、透镜B、分光镜、透镜C组成，由LED发光二极管发出的特定波长的光通过透镜A、滤光片A、又经分光镜反射，再经透镜C投射到样本试管中的样品上，经过PCR反应所激发出特定波长(波长与LED发出的光不一样)的荧光再经透镜C、分光镜、滤光片B、透镜B入射到光电倍增管上，经过光电转换得到受激发光荧光检测信号。
本发明的工作原理是：通过热循环工艺控制，使得被检测样本发生性状改变，从而改变被测样本的受激发光的强度，通过计算机统计在一定热循环工艺条件下的检测到的发光强度，并经过一定的数据处理来获取样本所反映的生物信息。
本发明的工作过程如下：通过控制热循环温度控制器的输出电流的大小和方向来驱动热电制冷器(TEC)，利用热电致冷片的温差效应改变承载样本试管的导热部件(为铝件，良好的导热性能及较小的热容量)的温度。用PT1000热电阻传感器(PT1000薄膜铂电阻测温元件具有体积小、响应速度快、测温精度和灵敏度高、长时间稳定性好的特点)作为测温元件检测温度，并与16位模数转换器结合构成测温电路，由PC机控制单片机进行数字模拟闭环温度控制；采用温控软件实现灵活的温控流程，从而实现热循环工艺控制。另外，采用由光电倍增管构成灵敏度高、动态范围大的荧光探测器，用具有数控零位调节和数控增益补偿调节的荧光信号放大器和16位A/D转换电路将荧光检测电压转换为可程控的数字量，并送到PC机中作数据分析处理，来获取样本所反映的生物信息。
本发明与现有技术相比的有益效果如下：
(1)用微机作为上位机进行热循环工艺控制，可灵活设置热循环工艺过程，而不只是局限于三温循环，使用更灵活可满足使用者多样化的要求。
(2)采用热电致冷片作为加热制冷元件具有安全、清洁、加热制冷转换速度快的特点。采用PT1000薄膜铂电阻作为温度测量元件以及采用16位A/D转换器作为温度测量通道的模拟数字转换器件使仪器具有检测精度高，稳定性好的优点。
(3)采用光电倍增管作为光电转换器件，以及采用具有数控零位调节和数控增益补偿调节的荧光信号放大器和16位A/D转换器构成荧光检测控制器能够实现荧光信号实时定量检测，荧光检测灵敏度高，动态范围大。
(4)采用的光学系统采用LED发光二极管发光具有寿命长、免维护、功耗小的优点。采用滤光片、透镜、分光镜组合的光学系统能有效分离LED光源入射光和受激发光产生的荧光，并且由于只对特定波长光源激发产生的特定波长的荧光进行检测，所获检测信号的信噪比高，为荧光大动态范围、高灵敏度检测创造了有利条件。
(5)采用微机作为上位机进行数据分析处理，使用方便。
附图说明
图1为本发明的组成原理框图；
图2为本发明中的热循环加热制冷组件结构示意图；
图3为本发明中的热循环温度控制器的结构组成框图；
图4为本发明中的荧光检测控制器的结构组成框图；
图5为本发明的光学系统结构组成图。
具体实施方式
如图1所示，本发明由热循环加热制冷组件1、光学系统2、光电倍增管3、运动台4、步进电机5、热循环温度控制器6、荧光检测控制器7、步进电机驱动器8、和PC机9组成，PC机9经串口发送命令至热循环温度控制器6，从而驱动热循环加热制冷组件1对样本试管13中样本加热制冷；同时热循环温度控制器6将热循环加热制冷组件1检测到的温度信号转换为数字信号，经串口送回PC机9，样本经热循环发生性状改变，受激发光产生的荧光也随之改变；荧光向下经光学系统2投射到光电倍增管3变成电信号，送到荧光检测控制器7转换成数字信号，再经另一串口发送至PC机9，由PC机保存温度和荧光检测信号并作数据处理；另外PC机9发送指令到荧光检测控制器7，控制步进电机驱动器8驱动步进电机5，使运动台4及其上的光学系统2和光电倍增管3作直线运动以循环检测各样本试管13中的样本。
图1中光电倍增管3采用日本Hamamatsu公司H7712-02型16位光电倍增管，处理电路响应频率200KHz，波长在600nm探测灵敏度最高，其增益为6.0×10V/W，感光面积3.7×13mm2；步进电机驱动器8采用美国IMS公司IM483型混合式步进电机驱动器，可将基本步距角在线进行1～256的8种细分，最大分辨率为51200，最大步进脉冲频率为10MHz，电机步进灵敏度：Δs＝10000×1.8°/360°＝50um。一个样点的直径大约为1mm，Δs是它的1/20，足以保证测试的定位精度；驱动步进电机5采用日本KH42KM2-951型2相步进电机，静力矩0.4N·m，步距角为1.8°。
如图2所示，热循环加热制冷组件1由承载样本试管的导热部件12、热电阻传感器14、热电致冷模块11和散热器10组成，其中承载样本试管的导热部件12是一个有呈直线均匀排列的漏斗形孔的铝块，孔中可放样本试管13，样本受激发光产生的荧光可通过漏斗形孔向下入射到光学系统2，导热部件端部紧贴有一热电阻传感器14，用于检测导热部件温度，紧贴导热部件两侧均匀放置着多片热电制冷模块11用于对导热部件进行加热制冷，最外侧紧贴着散热器10用来散去多余的热量。
图2中的热电阻传感器14为PT100014，其选用日本林电工产薄膜铂电阻Pt1000(三线)，最大电流0.5mA，电阻温度系数约为3.95Ω/℃，即约1.975mV/℃，它具有体积小、响应速度快、测温精度和灵敏度高、长时间稳定性好的特点；热电制冷模块11选用杭州大和产热电致冷片TE9500/031/085BS(20×20mm)二十片，最高使用温度为200℃，在温差为72℃时，单片吸热量为20W，最大电压4.3V，最大电流8.5A；这种利用热电温差效应的加热制冷器件，具有加热制冷转换速度快，可控性好(改变电流大小和方向即可)、安全清洁的特点；导热部件12有着24个呈直线排列的漏斗形孔，每个孔的间距为9mm的铝件，其总长度为280mm，具有良好的导热性能及较小的热容量的温度，形成数字模拟闭环温度控制。
如图3所示，热循环温度控制器6由温度检测放大器15、模数转换器16、单片机17、数模转换器18、PWM控制器19、MOSFET全桥功率放大器20、开关电源21组成，热电阻传感器14采用薄膜铂电阻传感器PT1000，其所检测的信号由温度检测放大器15放大变为电压信号，经模数转换器16变成数字信号送到单片机17作数字处理，单片机经运算后得到数字控制量经数模转换器18变成模拟信号，送到改进的以UC3638为核心的PWM控制器19，产生双极性电流PWM，驱动信号驱动MOSFET全桥功率放大器20形成大小和方向均可改变的电流驱动热电致冷模块11，开关电源21对各部分供电。同时温度检测信号数字量经串口送回PC机9。
图3中的温度检测放大器15采用MA×873ACSA精密基准电压源(2.5V±1.5mV@25℃，7ppm/℃@0～70℃)和美国TI公司高精度低漂移运放OPA2277构成三线制恒流激励和差分放大及多级放大器，转换率为10～40mV/℃、可调节；模数转换器16采用高速、低功耗16位AD976A模数转换器。分辨率5V/65535＝70μV、转换精度为±1/2LSB、转换时间为5～10μs，16位/8位兼容，具有足够高的分辨率和精度，比较快的转换速度；单片机17以AT89C52为核心的下位机主控制器，具有足够快的运算速度和足够大的存储器容量；数模转换器18选用双路12位电压输出AD7237A数模转换器，带有输出放大器和内置参考电压源，分辨率最低有效位(1LSB)相当于2.44mV，相对精度小于1/2LSB，功耗为165mW，(8+4)位数据结构，建立时间30ns；具有足够高的分辨率、精度和转换速度；PWM控制器19采用UC3638，产生双极性电流PWM驱动信号；MOSFET全桥功率放大器20主要由两个P沟道MOSFET，其型号为IRF4905和两个N沟道MOSFET，其型号为IRL3705N构成形成大小和方向均可改变的电流驱动热电致冷模块11、开关电源21主电源为24V/20A商品化开关电源。
如图4所示，荧光检测控制器由荧光信号放大器22、模数转换器23、单片机24、数模转换器25组成。由光电倍增管3检测到的荧光信号经荧光信号放大器22放大，再经模数转换器23变成数字信号送到单片机24，同时单片机输出数字信号到数模转换器25得到模拟电压信号对荧光信号放大器22进行数控零位调节和数控增益补偿调节；另外单片机24输出数字信号到步进电机驱动器8以驱动步进电机5，荧光检测信号的数字量经串口送回PC机9作数据处理。
图4中的荧光信号放大器22采用OPA2277构成；模数转换器23采用AD976，光电倍增管3电流到电压转换为0.1V/μA，A/D转换分辨率远远大于光电倍增管3的转换值，保证了测试数据的准确性；单片机24采用AT89C51单片机；数模转换器25采用AD7237A。
如图5所示，光学系统2由LED发光二极管26、透镜A27、滤光片A28、滤光片B29、透镜B30、分光镜31、透镜C32组成，由LED发光二极管26发出的特定波长的光通过透镜A27、滤光片A28、又经分光镜31反射，再经透镜C32投射到样本试管13中的样品上，经过PCR反应所激发出特定波长(波长与LED发出的光不一样)的荧光再经透镜C32、分光镜31、滤光片B29、透镜B30入射到光电倍增管3上；经过光电转换得到荧光检测信号。
图5中的LED发光二极管26选用长寿命发光LED，发射光峰值480nm，功率50mW；透镜A27的工作距15mm、有效孔径13mm、轴上点成像、480nm波长左右消色差；滤光片A28的半高带宽10nm，直径12.5mm，峰值480nm，透过率＞90％；分光镜31为45°放置，即入射角45°，对发射光480nm±10nm，反射率R＞60％；对激发光峰值530nm、640nm、710nm，透射率TR＞60％；透镜C 32的工作距7mm、数值孔径0.4、有效孔径10mm、轴上点成像、480nm～750nm波长左右消相差；滤光片B29为半高带宽10nm，直径12.5mm，峰值640nm，透过率＞90％；透镜B 30的工作距23mm、有效孔径13mm、轴上点成像、500～750nm波长左右消色差。
本发明的工作过程如下：热循环控制PCR生物检测系统采用热循环加热制冷组件1中的热电阻传感器14作为测温元件测量承载样本试管的导热部件12的温度，经温度检测放大器15形成温度检测输出电压；再经模数转换器16得到温度采样数字信号，送入单片机17进行温度检测转换，数字滤波，数字PID运算得到数字控制量，然后由数模转换器18得到模拟电流控制信号，送到以UC3638为核心的PWM控制器19产生双极性电流PWM驱动信号驱动MOSFET全桥功率放大器20，开关电源21对各部分供电形成大小和方向均可改变的电流驱动热电致冷模块11，而改变承载样本试管的导热部件12，温度循环中多余的热量由散热器10带走。
热循环控制PCR生物检测系统的工作流程由PC机9构成的上位机的软件产生，采用易于使用的人机接口，便于用户自己设定热循环控制PCR生物检测系统的工作方式、温度值、时间等。另一方面在热循环扩增过程中，样本试管13中样本受激发光产生的荧光经光学系统2聚焦在光电倍增管3上，将光信号转换成电信号，经荧光信号放大器22放大，再经模数转换器23变成数字信号送到单片机24，同时单片机输出数字信号到数模转换器25得到模拟电压信号对荧光信号放大器22进行数控零位调节和数控增益补偿调节，经荧光检测控制器7采样放大、A/D转换等数字处理后送入PC机9形成样本检测数据供后续样本分析。同时PC机9控制荧光检测控制器7中的下位单片机24控制步进电机驱动器8驱动步进电机5，带动运动台4和安装在上面的光电倍增管3和光学系统2作直线运动，以循环检测24个样本试管13中样本所发出的荧光。
另外，荧光激发的过程是：由LED发光二极管26发出的光通过透镜A27收集准直、再经窄带滤光片A28滤掉杂波、又经分光镜31反射，由透镜C32汇聚到样本试管13中的样品上，经过PCR反应所激发出特定波长(波长与LED发出的光不一样)的荧光再经透镜C32、分光镜31、再经窄带滤光片B29滤波、透镜B30入射到光电倍增管3上，经过光电转换得到荧光检测信号。
Claims (5)
1、热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，其特征在于：它由热循环加热制冷组件(1)、光学系统(2)、光电倍增管(3)、运动台(4)、步进电机(5)、热循环温度控制器(6)、荧光检测控制器(7)、步进电机驱动器(8)、和PC机(9)组成，PC机(9)经串口发送命令至热循环温度控制器(6)，从而驱动热循环加热制冷组件(1)对试管中样本加热制冷；同时热循环温度控制器(6)将热循环加热制冷组件(1)检测到的温度信号转换为数字信号，经串口送回PC机(9)；样本经热循环发生性状改变，受激发光产生的荧光也随之改变；荧光向下经光学系统(2)投射到光电倍增管(3)变成电信号，送到荧光检测控制器(7)转换成数字信号，再经另一串口发送至PC机(9)，由PC机(9)保存温度和荧光检测信号并作数据处理；另外PC机(9)发送指令到荧光检测控制器(7)，控制步进电机驱动器(8)驱动步进电机(5)，使运动台(4)及其上的光学系统(2)和光电倍增管(3)作直线运动以循环检测各试管样本。
2、根据权利要求1所述的热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，其特征在于：所述的热循环加热制冷组件(1)由承载样本试管的导热部件(12)、热电阻传感器(14)、热电致冷模块(11)和散热器(10)组成，其中承载样本试管的导热部件(12)是一个有呈直线均匀排列的漏斗形孔的铝块，孔中可放样本试管(13)，样本受激发光产生的荧光可通过漏斗形孔向下入射到光学系统(2)，导热部件(12)端部紧贴有一热电阻传感器(14)用于检测导热部件温度；紧贴导热部件(12)两侧均匀放置着多片热电制冷模块(11)，用于对导热部件(12)进行加热制冷，最外侧紧贴着散热器(10)用来散去多余的热量。
3、根据权利要求1所述的热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，其特征在于：所述的热循环温度控制器(6)由温度检测放大器(15)、模数转换器(16)、单片机(17)、数模转换器(18)、双极性PWM电流信号发生器(19)、MOSFET全桥功率放大器(20)、开关电源(21)组成，热电阻传感器(14)所检测的信号由温度检测放大器(15)放大变为电压信号，经模数转换器(16)变成数字信号送到单片机(17)作数字处理，单片机(17)经运算后得到数字控制量经数模转换器(18)变成模拟信号，送到改进的以UC3638为核心的PWM控制器(19)，产生双极性电流PWM驱动信号；最后驱动MOSFET全桥功率放大器(20)形成大小和方向均可改变的驱动电流驱动热电致冷模块(11)，由开关电源(21)对各部分供电，同时温度检测信号数字量经串口送回PC机(9)。
4、根据权利要求1所述的热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，其特征在于：所述的荧光检测控制器(7)由荧光信号放大器(22)、模数转换器(23)、单片机(24)、数模转换器(25)组成，由光电倍增管(3)检测到的荧光信号经荧光信号放大器(22)放大，再经模数转换器(23)变成数字信号送到单片机(24)，同时单片机(24)输出数字信号到数模转换器(25)得到模拟电压信号对荧光信号放大器(22)进行数控零位调节和数控增益补偿调节，另外单片机(24)输出数字信号到步进电机驱动器(8)以驱动步进电机(5)，荧光检测信号的数字量经串口送回PC机(9)作数据处理。
5、根据权利要求1所述的热循环控制聚合酶链式反应生物检测系统，其特征在于：所述的光学系统(2)由LED发光二极管(26)、透镜A(27)、滤光片A(28)、滤光片B(29)、透镜B(30)、分光镜(31)、透镜C(32)组成，由LED发光二极管(26)发出的特定波长的光通过透镜A(27)、滤光片A(28)、又经分光镜(31)反射，再经透镜C(32)投射到样本试管(13)中的样品上，经过PCR反应所激发出特定波长(波长与LED发出的光不一样)的荧光再经透镜C(32)、分光镜(31)、滤光片B(29)、透镜B(30)入射到光电倍增管(3)上；经过光电转换得到受激发光荧光检测信号。
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