CN112770841A - 变温反应器及其加热器和控制电路 - Google Patents

变温反应器及其加热器和控制电路 Download PDF

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Abstract

描述了一种用于在其中进行预定反应的变温反应器。该反应器包括反应池、加热器和散热器。反应池具有厚度为HV且宽度为WV的反应体积，其中WV＞4HV，并且由多个表面限定，反应体积的其中一个面积较大的表面由厚度为HW的外壁界定。加热器与所述外壁接触。加热器包括位于更靠近反应体积的表面上的发热的加热器元件和位于相反表面上的加热器支撑件。加热器支撑件与散热器接触，使得加热器支撑件在加热器元件与散热器之间提供热阻RT。当反应器填充有热扩散系数为DV的试剂，并且在厚度方向上具有扩散时间tV时，tV＝HV 2/DV。tV小于反应时间常数tR。外壁具有热扩散系数DW并且具有热扩散时间tW＝HW 2/DW＜tV。

Description

变温反应器及其加热器和控制电路
本发明涉及用于需要快速调节温度的反应的反应器。它还涉及用于该反应器的加热器和驱动和感测电路，以及操作该反应器的对应方法。
需要这种反应器的一个示例方法是通过聚合酶链反应(PCR)进行DNA扩增，其中反应器适合于快速热循环以减少完成PCR的时间。另一示例是通过合成进行DNA测序，其中可以通过调节多步骤反应的每个步骤的温度来优化碱基添加。
本发明的反应器还适合于通过溶液中寡核苷酸的量热检测来监测PCR的进度。该反应器还适合于数字PCR或多重PCR，以提供对连续连接的液体样品中多个位置的子样品的独立分析。
本发明还涉及一种用于快速调节反应体积的温度并且具有高度的温度均匀性和精确的温度控制的加热器。
本发明还涉及一种使用样品和在惠斯通电桥电路中配置参比加热器进行差示扫描量热法(DSC)或差示热分析(DTA)的设备。
PCR需要在大约60℃至95℃的温度之间重复进行温度循环。通常，加热和冷却是使用珀尔帖元件进行的，以在需要提高温度时将热量从散热器驱动到样品中，或者在需要降低温度时将热量从样品驱动到散热器。散热器通常用风扇冷却。
这种方法有许多缺点：所需的设备很大并且功耗很高。在热循环中改变温度的设备部分的热容量明显大于样品的热容量，从而导致增加的能量使用和减缓的热循环。穿过珀尔帖元件和用于与样品热接触并容纳样品的部件以及穿过样品本身的漫长热扩散时间会限制温度上升速率，并且增加热循环时间。这些因素导致PCR缓慢且能效低下。
通常，使用远离珀尔帖和样品的温度传感器来控制热循环仪。与珀尔帖相比，温度传感器的热响应不可避免地会滞后，这会使系统的热控制复杂化。经常使用一种调优PID算法来最大程度地提高温度斜率和最小化过冲，但是开发和实施起来可能很复杂，并且可能无法提供样品中预期的时间-温度曲线。
另一缺点是，由于重复的热循环导致的机械应力，珀尔帖元件的寿命受到限制。
这些缺点适用于需要精确控制温度和快速温度变化的其他反应。
用于热循环的替代现有技术方法是在固定温度的水浴或加热器之间移动样品。图1至图33示出三个示例。在图1中，样品在水浴之间转移，而在图2中，样品在加热器块之间转移。由于具有运动部件，这些解决方案具有很高的机械复杂性和较大的空间要求。在图3中，样品穿过微流体芯片，该芯片中有一条蛇形路径穿过两个加热器块，其缺点是样品暴露于大表面积的微流体通道中。这带来了两个缺点：样品和试剂可能粘附在通道壁上，降低了灵敏度，增加了样品体积要求并增加了试剂成本，并且微流体芯片的尺寸和成本也增加了。
图3中所示的长蛇形通道的尺寸和表面积较大是因为要求通道在空间上分离开的两个不同温度区域(通常距离>1mm)之间通过。此外，样品体积小于蛇形通道的内部体积，从而增加了通道表面积与样品体积的比率。
希望以足够快的速度进行热循环，以使温度变化所需的时间不占热循环总时间的大部分。热循环的总时间是温度变化时间和反应时间的总和，PCR反应最慢的部分是延伸阶段，对于100个碱基对的典型序列长度，大约需要1秒或更长的时间。因此，我们将<1s的时间定为温度上升的时间。PCR的目标温度通常在60℃至95℃之间，因此我们需要70℃/s或更高的温度上升速率才能进行加热和冷却，以将温度变化时间减少至1s。更高的温度上升速率(200℃/s或更高)提供的速度优势有限，因为所需的总时间将由反应时间而不是温度变化所需的时间决定。
在本发明中，我们公开了一种用于以约100℃/s进行快速热循环的反应器，它没有机械运动系统或长蛇形通道的缺点。与蛇形通道相比，可以将样品包含在较宽的通道中，从而减小侧壁的表面积。当使用宽通道时，可能有必要引入内部支撑结构，例如肋或柱，以避免大的无支撑跨度并增加流体通道的机械强度。
另外，在本发明中，我们公开了一种包括蛇形通道的反应器。尽管某些蛇形通道具有上述缺点，但在替代方法中，可以将样品包含在位于可以随时间变温的单个加热器上方的较短蛇形通道中。在这种情况下，样品在扩增过程中不会在不同温度区域之间流动；取而代之的是加热器的温度随时间变化。这样可以减小蛇形通道的长度，并且通道内部体积可以等于样品体积，从而减小通道表面积与样品体积的比率。另一好处是，这种配置对于定量PCR实验更方便，在定量PCR实验中，例如可以使用荧光探针或嵌入染料在一段时间内监测单个位置上的扩增DNA的浓度。
反应器包含三个主要元件：反应池，其包含要进行温控的体积；散热器，其用于吸收热量；以及加热器，其与反应池和散热器热接触。加热器在与反应池接触的面上具有发热的发热元件，在与散热器接触的面上具有加热器支撑件。对于给定的一组目标反应温度、散热器温度和功率要求，选择加热器支撑件的热阻以提供低热循环时间。
在一方面，本发明提供了一种用于在其中进行预定反应的变温反应器，所述反应器包括反应池、加热器和散热器，
其中所述反应池具有厚度为HV且宽度为WV的反应体积，其中WV＞4HV，并且由多个面限定，所述反应体积的其中一个面积较大的面由厚度为HW的外壁界定；
其中所述加热器与所述外壁接触，
其中所述加热器包括位于更靠近所述反应体积的面上的发热的加热器元件和位于相反表面上的加热器支撑件，所述加热器支撑件与散热器接触，使得所述加热器支撑件在所述加热器元件与所述散热器之间提供热阻RT，
其中当填充有热扩散系数为DV的试剂的所述反应器在所述厚度方向上具有扩散时间tV时，
Figure BDA0002994261250000031
并且其中tV小于反应时间常数tR，以及
其中所述外壁具有热扩散系数DW并且具有热扩散时间
Figure BDA0002994261250000032
优选地，所述加热器元件既用作加热器又用作温度传感器。
优选地，所述反应器还包括控制器，其中所述加热器连接至所述控制器并且由所述控制器控制，以使所述反应器的温度在较高温度THigh和较低温度TLow之间变化，这两个温度均高于所述散热器的温度TSink。
优选地，所述反应体积厚度HV小于250微米。
优选地，所述反应池包含由位于宽度为WV且长度为LV的区域内的蛇形通道形成的宽度为WV且长度为LV的反应体积。
优选地，所述反应体积在其两个大面积面上由厚度为HW的外壁限定，其中加热器与全部两个所述外壁接触，并且散热器与全部两个加热器接触。
优选地，所述加热器元件是电阻式加热器元件。
优选地，所述加热器元件由导电材料制成，并且所述加热器支撑件由电绝缘材料制成。
优选地，所述加热器可以与所述散热器分离。
优选地，所述反应器被布置成使得能够选择所述加热器元件与所述散热器之间的热阻RT以满足以下关系：
RT>(THIGH-TSink)/pHeat并且
0.5RT,Opt<RT<2RT,Opt
其中RT,Opt＝(THIGH+TLOW-2TSink)/pHeat
所述反应器被布置成使用功率输出为pHeat的加热器和处于温度TSink的散热器在较低温度TLOW与较高温度THIGH之间重复循环。
优选地，所述反应器被布置成使得所述加热器支撑件的热阻RT以及所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV满足关系RTCV<tR，其中tR是所述反应的时间常数。
优选地，所述反应器被布置成使得所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV以及所述散热器的热容量Cs足关系：CS/CV>100。
优选地，所述散热器材料的热导率是所述加热器支撑件材料的热导率的10倍以上。
优选地，所述薄外壁的一部分以及位于所述反应体积与所述散热器之间的加热器的热容量低于所述反应体积内的液体的热容量。
优选地，所述散热器材料的热逸散率是所述加热器支撑件材料的热逸散率的10倍以上，其中热逸散率是所述材料的热导率k、密度ρ和比热容量cp的函数并且被定义为e＝sqrt(kρcp)。
优选地，所述加热器元件在所述反应体积的整个面积上延伸。
优选地，所述加热器元件是电阻式的并且具有矩形或正方形的形状。
优选地，所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于500ppm/K，优选地大于2,500ppm/K，更优选地大于10,00ppm/K。
优选地，所述加热器包括用于电阻测量的开尔文触点。
优选地，所述加热器元件被布置成使得其周边附近的单位面积的热输出高于其中心附近的单位面积的热输出。
优选地，所述加热器元件包括被一个或多个防护加热器包围的主加热器。
优选地，所述主加热器在电流流动方向上呈细长形，并且在所述主加热器的长边附近放置有防护加热器。
优选地，所述加热器元件的薄层电阻在位于垂直于所述电流流动方向的所述加热器元件边缘上的端部区域中局部增加。
优选地，所述反应体积被布置成在使用中包含用于核酸序列的聚合酶链反应(PCR)扩增的试剂。
优选地，所述反应器被配置为通过聚合酶链反应(PCR)热循环进行DNA扩增。
现在将参考附图描述本发明的示例，其中：
图1至图7示出了现有技术的系统和方法；
图8至图11示出了根据本发明的示例性反应器的视图；
图12示出了根据本发明的替代反应器几何形状的截面图；
图13和图14示出了可用于本发明的示例反应池盖；
图15示出了根据本发明的反应器的分解图；
图16示出了本发明中采用的两种形式的反应池；
图17示出了在本发明的操作过程中，在长达60s的时间内同时模拟DNA扩增和扩散，然后在60s之后仅模拟DNA扩散；
图18示出了在针对用于本发明的两个示例单元开始PCR扩增之后的时间100s处的DNA浓度；
图19示出了采用本发明的方法中的浓度变化，变化的位置在开始PCR扩增之后的时间100s处；
图20至图22示出了可用于本发明的流体池阵列；
图23和24示出了根据本发明的反应体积；
图25至图30示出了根据本发明的示例加热器；
图31示出了可用于本发明的散热器；
图32至35是表示本发明在反应过程中的操作和输出特性的图；
图36至图38是表示本发明的操作特性的其他图；以及
图39至图41示出了根据本发明的电路。
图1(现有技术)示出了通过在保持在不同温度的水浴之间移动样品来进行热循环。该装置以示意图形式(A)示出。(B)绘制了样品温度和位置与时间的关系。参考：Farrar,J.S.和C.T.Wittwer(2015年)发表的“Extreme PCR:Efficient and Specific DNAAmplification in 15–60Seconds(极限聚合酶链反应：15-60秒内高效特异的DNA扩增，Clinical Chemistry，61:1，第145页至153页)”。
图2(现有技术)示出了通过在保持在不同温度的加热器块之间移动样品来进行热循环。参考：WO2012161566。
图3(现有技术)示出了通过使样品穿过在高温区和低温区上交替通过的蛇形路径来进行热循环。参考文献：Trauba,J.M.和Wittwer,C.T.(2017年)发表的“MicrofluidicExtreme PCR:<1Minute DNA Amplification in a Thin Film Disposable(微流体极限聚合酶链反应：一次性薄膜中小于1分钟的DNA扩增，J.Biomedical Science andEngineering，10，第219页至第231页)”。
图4(现有技术)示出了通过产生包含在不混溶的液体(通常是氟化油)中的样品液滴进行的数字PCR。参考：Hindson,B.J.(2011年)发表的“High-Throughput DropletDigital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number(用于DNA拷贝数绝对定量的高通量微滴式数字PCR系统。Anal.Chem.，83，第8604页至第8610页)”。
图5(现有技术)示出了滑动芯片装置的俯视图和侧视图。滑动芯片使用两个部件的相对运动来创建用于数字式或多重PCR的隔离子样品。参考：US 9,415,392B2。
图6(现有技术)示出了数字PCR的数字化，其方法是先填充样品液体，然后再填充穿过透气屏障的气体，这样将样品分成不连续的体积。参考：WO 2018094091。
图7(现有技术)示出了0.0244mM PNA(TG)/DNA双链体溶液、0.0303mm DNA(TG)/DNA双链体溶液和缓冲液的两次重复DSC扫描。温度扫描速率为60K/h，池体积为0.511ml。参考：Chakrabarti,M.C.和Schwarz,F.P.(1999年)发表的“Thermal stability of PNA/DNAand DNA/DNA duplexes by differential scanning calorimetry(通过差示扫描量热法测定PNA/DNA和DNA/DNA双链体的热稳定性。Nucleic Acids Research，24，第4801页至第4806页)”。
对于采用本发明的类型的反应，热循环要求加热器和样品之间的热扩散时间与目标循环时间相比要短。热扩散时间t由下式给出：
t＝R2/DT，
其中R是特征长度尺度，DT是材料的热扩散率。下表1示出了将在下面描述的示例反应器设计，其中反应体积和薄外壁的热扩散时间均小于PCR的反应时间，对于100个碱基对的序列，我们的反应时间约为1秒。
为了有效地加热，需要使反应池材料和加热器的热容量相对于样品的热容量的比率最小。反应体积的热容量应占反应池和加热器热容量之和的很大一部分，优选地>10％，更优选地>50％。
为了加热反应体积，接通加热器元件，并且由加热器元件产生的热量流入反应体积和散热器中。为了冷却反应体积，关闭加热器元件，热量从反应体积流经加热器并进入散热器。选择散热器的热容量，使其比反应池和加热器的组合热容量大得多，以便在完成反应所需的一系列热循环中限制散热器的温度升高。在下面给出的示例中，散热器的热容量是加热器和反应池的组合热容量的100倍以上。为了进一步限制散热器的温度升高，可以通过自然对流或强制对流，液体循环、喷雾冷却或连接至热管或珀尔帖装置的方式对散热器进行连续冷却。
可以优化加热器支撑件RT的热阻，以最小化给定温度曲线和散热器温度TSink和加热器元件功率pHeat的热循环时间。当加热时间等于冷却时间时，在TLOW和THIGH之间进行热循环所需的时间最短，并且在RT＝RT,Opt时满足此条件，如下所示：
RT,Opt＝(THIGH+TLOW-2TSink)/pHeat。
我们将轴向定义为垂直于加热器和反应池之间的接触面，将横向定义为在加热器和反应池之间接触表面的平面内。需要限制横向热流，因为横向热流暗示了反应池内存在温度梯度和温度不均匀性，从而降低了温度控制的精度。
为了限制横向热流，选择反应体积，使其高度HV(沿轴向)与宽度WV(沿横向)的比率使得侧面面积小于最靠近加热器元件的面的面积。对于正方形或圆形反应体积，可以满足此条件，如下所示：
WV>4HV。
为了进一步限制横向热流，可以将加热器元件设计成在其边缘附近具有更高的热输出并且延伸超过反应体积。加热器元件边缘附近的较高的热输出可以补偿横向热流，并在整个反应体积内提供更均匀的温度条件。
电加热器元件可以具有正方形或矩形的发热区域，在发热区域的两个相对侧上具有电端子，并且电流的方向从一个端子流向另一端子。改善这种加热器元件的温度均匀性的一种方法是增加加热器元件在电端子的侧面附近的薄层电阻，从而相对于加热器元件的中心附近的热输出，在这些侧面附近局部增加单位面积的热输出。为了进一步提高温度均匀性，还希望沿着平行于电流流动方向的侧面增加加热器元件的热输出。这可以通过局部减小在这些侧面附近的薄层电阻来实现，从而相对于在加热器元件的中心附近的热输出，在这些侧面附近的电流密度增加并且每单位面积的热输出增加。
加热器元件的电阻可通过减小材料的厚度或通过在材料上打孔或切槽或改变材料的图案来局部增加，这具有增加导电路径的长度并减小导电路径的横截面面积的作用。与反应体积的厚度相比，这些孔或切槽特征必须小，以使它们不会干扰反应体积内的温度均匀性。
可以使用防护加热器进一步限制加热器边缘的横向热流。防护加热器是位于加热器元件边缘附近并被驱动以维持接近主加热器元件目标温度的温度的附加加热器。防护加热器的每单位热输出高于主加热器元件的每单位热输出，以补偿横向热量损失。防护加热器可以在闭环控制下以与主加热器元件相同的温度设定值进行操作，或者防护加热器可以在与主加热器元件相同的控制器或开/关定时下进行操作，但可以使用不同的驱动电压，驱动电压可进行调整以优化特定温度设定值的温度均匀性。
反应器可被配置为单侧池或双侧池。单侧配置的反应池具有与加热器接触的一个薄外壁，该加热器又与散热器接触。双侧配置的反应池具有与加热器接触的两个薄外壁，该加热器又与散热器接触。
反应池、加热器和散热器可以具有平面的或弯曲的形式。为了简化构造和反应的光学监测，优选地使用平面的形式。然而，其他形式也是可能的，例如部分球形或圆柱形，并且这些形状的优点是允许张紧的柔性反应池和加热器层彼此之间以及与通常为刚性金属部件的散热器之间具有良好的热接触。
Figure BDA0002994261250000101
表1：反应器材料、热特性和几何形状的示例。给出了单层和双层加热器的示例。假定反应体积中包含的样品的热特性与水相同。
由于加热器元件处的温度变化与温度传感器处的温度变化之间存在时间滞差，因此给使用空间上分离的温度传感器对加热器元件的热控制带来了困难。该时间滞差可能会引起诸如加热器元件温度过冲或振荡的问题。为了避免这些问题，可以将加热器元件配置为温度传感器，其中使用加热器元件的电阻来确定其温度。加热器元件可以具有正的电阻温度系数(例如金属)或负的电阻温度系数(例如金属氧化物或其他电介质)。在任一种情况下，期望加热器元件的电阻温度系数(TCR)的大小较大，优选地大于500ppm/K，更优选地大于2,500ppm/K，最优选地大于10,000ppm/K。
加热器元件可以设置有四个端子的开尔文触点，以允许对加热器元件的电阻进行更精确的测量以及对温度进行更精确的测量。
如果加热器元件材料具有低于期望的薄层电阻，则可以利用垂直于电流流动方向的狭缝或间隙对其进行图案化以增加薄层电阻。
如果加热器元件具有高于期望的薄层电阻，则其可以设置有相互交叉的触点端子，以减小通过加热器元件的路径长度并增加电流的横截面积。
期望在热循环期间和多个热循环结束时监测反应的状态。特别地，可以使用荧光标记的染料或电化学活性标记来检测DNA的PCR扩增。这些方法分别具有以下缺点：需要昂贵或可能抑制PCR扩增过程的标记，需要复杂的光学仪器和与样品的光学界面，以及需要与样品的电化学界面。
本发明通过检测热循环的加热阶段中的解链热来提供对扩增的DNA的量热检测，这导致在解链温度下的热容量增加。这样可以用最少的附加仪器硬件以无标记的方式连续监测PCR扩增。
本发明的反应器的形式非常适合于扫描量热法检测，因为该设计允许快速的温度上升速率，并且还因为反应体积中所含样品的热容量占加热器、反应池和样品的总热容量的很大一部分。这些因素增加了量热信号的强度并提高了量热检测的灵敏度。
为了通过增加DNA解链温度下的热容量来检测DNA的存在，可以使用差示热分析(DTA)方法，其中根据温度或温度升高到熔点的时间，同时向样品池和参比池输入相等的热量来测量样品池和参比池之间的温度差。可以监测反应过程中温差扫描的变化，以检测反应产物浓度的变化。替代方法是使用差示扫描量热法(DSC)，其中样品池和参比池的热通量输入差根据温度或样品池和参比池的温度上升并保持相等的时间来测量。
AC量热法可以与本发明相结合，使用脉冲或振荡加热器驱动以增加量热法测量的鲁棒性和灵敏度。一种示例方法是在驱动频率下以正弦驱动电压来驱动电阻式加热器，以两倍于驱动频率的频率产生振荡热输出。加热器元件的温度还将以两倍于驱动频率的频率振荡，并且该振荡的幅度将取决于样品的热容量。当加热器也被配置为具有非零电阻温度系数的温度传感器时，可以通过测量加热器元件的电阻的振荡来检测温度振荡的幅度。这种方法的优点是该方法对加热器电阻中缓慢的DC漂移不敏感，并且可以使用温度振荡的同步检测来抑制外部噪声源。
可以通过考虑由振荡热源产生的温度振荡的穿透深度L来估计AC量热法的最佳热输入频率范围(参考：Marin,E.(2010年)发表的“Characteristic dimensions for heattransfer(热传递特征尺寸)Lat.Am.J.Phys.Educ.，第56页至第60页)。
Figure BDA0002994261250000121
DT是热量扩散到其中的材料的热扩散率，ω是热源振荡的角频率。对于仅在一侧具有加热器的反应器的情况，优选地选择条件以使穿透深度L等于或小于反应体积的高度HV。使用较高频率的振荡和较小穿透深度的好处是，量热测量对HV的变化不太敏感，这降低了对样品和参比反应体积几何形状之间差异的敏感性。
对于以频率fDRIVE施加到电阻式加热器元件上以产生频率为2fDRIVE的振荡热输出的正弦电驱动，出现L≤HV的条件，其中fDRIVE满足以下条件：
Figure BDA0002994261250000122
对于仅在一侧上具有加热器的反应器，以及对于根据本发明的典型反应体积而言，高度HV＝100μm，水的热扩散率DV＝1.43x10-7m2/s，fDRIVE≥2.3Hz。
对于在两侧均具有加热器的反应器的情况，优选地穿透深度L等于或小于反应体积的高度的一半，并且对于根据本发明的典型反应体积，高度HV＝100μm，水的热扩散率DV＝1.43x10-7m2/s，且fDRIVE≥9.1Hz。通常，对于两侧均具有加热器的反应器，fDRIVE满足以下条件：
Figure BDA0002994261250000131
还期望穿透深度L大于或等于与反应体积接触的薄外壁的厚度HW。这给出了以下条件：
Figure BDA0002994261250000132
对于根据本发明的典型反应体积，壁厚度HW＝24μm，聚丙烯壁的热扩散率DW＝8.26x10-8m2/s，并且fDRIVE≤23Hz。术语“体积”也指定义体积的“容器”或“池”，反之亦然。
当使用AC量热法时，有利地以两倍于AC电驱动频率的频率测量加热器电阻的变化。将频率为ω的正弦电驱动波形馈送到加热器元件中会在频率2ω处产生温度波动，并因此在2ω处产生电阻波动。这进一步导致3ω处的电压波动。使用“3-ω”方法以三倍于AC电驱动的频率的频率测量电压波动允许使用窄带检测技术，从而提高了信噪比。
当使用差示量热法时，有利地为惠斯通电桥电路中的样品和参比反应配置电阻式加热器元件。这种方法可以直接测量样品和参比温度之间的差异，避免了与独立检测样品温度和参比温度，然后计算两个相对较大的量之间的较小差异相关的误差。
在惠斯通电桥的另一配置中，样品和参比物分别由两个加热器元件加热，并且在全桥布置中配置有四个加热器元件，以便对于给定的温度差，电桥电路的电压输出加倍。
样品加热器元件和参比物加热器元件的电阻之间的差异可能会导致电桥电路输出不为零以及样品和参比物的加热不均等。理想的是平衡电桥电路，以便当样品和参比物温度相同时，电桥电路输出为零；还需要平衡电桥电路，以使样品和参比物在跨电桥电路施加电压时接收相同的功率输入。电压和功率平衡的组合可通过四个串联或并联配置的微调电阻器来实现。
数字PCR是一种技术，其中将包含PCR试剂的样品首先在多个单独的隔室中划分为子样品(例如，液滴或被壁分隔的区域)，然后对所有子样品进行温度循环以使样品进行PCR反应。
目的是与实时PCR相比，可以更精确，更准确地确定原始样品中一种或多种靶寡核苷酸的浓度。实时PCR通过确定CT来定量DNA浓度，CT是PCR反应的测量值超过阈值所需的扩增循环数。DNA的起始浓度与CT有关。浓度越高，CT值越小。
成功进行PCR的子样品数量的统计分析允许更准确和精确地估计样品中的DNA浓度。进行PCR的子样品必须包含一个或多个靶寡核苷酸，而不进行PCR的子样品则假定不含任何寡核苷酸。统计方法需要大量子样品才能精确测定浓度，通常使用1000个以上的子样品，而对于需要更高灵敏度的应用则使用10,000多个子样品。
现有数字PCR技术的主要缺点在于要求首先将样品分成子样品。该要求显着增加了与该过程相关的复杂性和硬件成本。微滴式数字PCR要求使用具有更复杂的反应池产生微流体液滴，精确地控制水样和不混溶油流以及在PCR扩增之前延长产生液滴的时间。微滴式数字PCR的替代方法是使用气体划分反应体积。这需要以受控的方式添加样品，然后以受控的方式添加气体，并结合使用透气屏障以允许气体逸出。
本发明提供了一种无壁、无液滴式数字PCR系统和方法，其中样品没有被分成不连续的子样品。相反，PCR在样品中的多个反应区域中进行(或无法进行)，其中这些反应区域仅由其所经历的温度范围来定义。反应区域之间没有物理屏障，并且仅通过使寡核苷酸相对缓慢地扩散通过溶液来防止寡核苷酸从一个反应区域移动到另一反应区域。样品以连续的液体形式容纳，子样品之间没有固体，不溶混的液体或气体屏障。这可以通过以较短的循环时间执行PCR的可能性来实现，从而可以在不到100-200秒的时间内完成30到50个PCR扩增循环，从而限制了扩散时间和扩散发生的距离。
在该方法的变型中，可以引入部分屏障来限定子样品位置，以便于随后的反应检测和分析，并降低相邻子样品位置之间的扩散速度，从而允许子样品更紧密地间隔，并且增加给定尺寸的反应器的子样品数量以及样品的总体积。
双链DNA分子在水中的扩散系数(长度为[bp大小])DDNA可以使用以下表达式计算(参考：Lukacs,GL等人(2000年)发表的的“Size-dependent DNA mobility in cytoplasmand nucleus(细胞质和细胞核中依赖尺寸的DNA迁移性，J Biol Chem.275(3):1625-9)”：
DDNA＝[bp size]-0.72x4.9x10-6cm2/s。
我们考虑了一个100个碱基对的DNA序列的扩散，代表了PCR扩增的典型靶标。在100s的时间尺度上，扩散长度RD为84μm，因此，一个孤立的扩增DNA簇将在100s内扩散大约这个距离。对应于高度为HV的反应体积的数字PCR样品分区的当量体积Vp可以计算为：
VP＝πRD 2HV。
对于100μm的反应体积高度，这将产生2.2nl的体积，从而允许将典型的5μl样品分为1000多个分区，这是数字PCR通常需要的。当使用数字PCR定量DNA浓度时，需要将样品分成大量的分区，因为更多数量的分区将提高确定的精确度，并能够确定更大范围的浓度。因此，快速扩增(数量级为100s)和小反应体积池高度(约为100μm)相结合，可以通过数字PCR分析典型的PCR样品体积(通常最多20μl)。
除了允许小的分配体积之外，本发明中描述的反应器的平坦的反应体积形状还便于使用阵列检测器(例如数字相机)对用于数字PCR的扩增DNA进行荧光检测。
多重PCR是一种技术，其中分析样品以检测多个不同寡核苷酸序列的存在。一种常规方法是使用具有不同荧光波长的荧光标记对不同物种进行多重检测，但是由于荧光波长的重叠，该方法通常仅限于检测最多约六个物种。替代的常规方法是将样品细分为不同的反应体积，这些体积由可以是固体、不混溶的液体或气体的屏障分隔。该方法具有与上述数字PCR相同的缺点，即增加了复杂性和增加了分析时间。
图8示出了根据本发明的单侧反应器A(左)和双侧反应器B(右)。每个反应器包括具有一个或多个加热器和散热器的反应池。加热器包括位于与散热器接触的加热器支撑件上的发热的加热器元件。加热器支撑件可包括较软且较柔韧的导热垫层，以在较硬且较坚固的加热器支撑层和较硬且较坚固的散热器之间提供良好的热接触。实施例A(具有单侧加热器的反应器)包括单个加热器和散热器，以及包括侧壁、薄外壁和盖的反应器。在实施例A中，反应体积被盖、侧壁和薄外壁包围。实施例B(具有双侧加热器的反应器)包括具有围绕侧壁的两个薄外壁的反应池。在实施例B中，反应体积被侧壁和两个薄外壁包围。
图9示出了根据本发明的单侧反应器A(左)和双侧反应器B(右)的侧视图。
图10示出了根据本发明的不具有导热垫的单侧反应器A(左)和双侧反应器B(右)的侧视图。
图11示出了根据本发明的反应器的尺寸：反应池高度HV、薄壁厚度HW、加热器支撑件高度HH、导热垫高度HP、散热器高度HS和反应池宽度WV。
图12示出了不同反应器几何形状的截面图。所有这些都包括一个与加热器接触的反应池，该加热器与一个散热器接触。(A)中示出了平面几何形状，(B)中示出了弯曲几何形状，并且(C)中示出了圆柱几何形状。在所有情况下，反应体积都由两个较大面积的基本上平行的壁和一个较小面积的侧壁限定。较大面积的壁中的至少一个是与加热器接触的薄外壁。
如上所述，反应池可以具有平面或弯曲的形式。然而，在反应池内，可以以多种方式构造一个或多个被施加热循环的反应体积。
图13示出了在本发明的实施例中使用的用于覆盖反应池的盖，该盖包括基本平坦的部分，该部分具有形成流体端口的通孔、限定反应体积的凹入特征，以及连通反应体积与流体端口的流体通道。(A)中示出了完整的盖，(B)中示出了其横截面。
图14示出了在本发明的实施例中使用的反应池盖的平面图，该盖包括通过流体通道与流体端口连通的反应体积。反应体积可以具有细长或矩形形状(A)，或者基本为正方形形状(B)。
图15示出了根据本发明的反应器的分解图，该反应器包括反应池、加热器和散热器的组件。反应池包含两个反应体积，每个反应体积位于加热器元件上方，该加热器元件横向延伸超过反应体积的边缘。加热器与散热器进行热接触(可选地通过导热垫，此图中未示出)。位于加热器元件区域周边附近的绝热空隙可用于局部降低从加热器到散热器的热流速率，从而减少加热器元件区域的边缘比中心区域更冷的趋势，并提高反应体积内的热均匀性。
图16示出了在本发明的实施例中采用的两种形式的反应池：(A)用于多个样品的反应池(示出了8-样品形式)，以及(B)用于具有多个检测位置的单个样品的反应池。检测位置可用于实现数字PCR，其中检测到扩增的DNA的位置数量用于计算样品中靶序列的浓度。检测位置也可用于实现多重PCR以检测多个不同的靶序列，例如通过在不同的检测位置提供不同的序列特定的PCR引物。图16(A)和16(B)的每一个中的反应池可以具有与单个加热器元件相关的单个反应体积。
在一个实施例中，我们提供了无壁的多重PCR系统和方法，其中样品不被分成不连续的子样品。取而代之的是，在反应器中预装一系列不同的试剂，以扩增或检测不同的寡核苷酸序列，并且不同的试剂位于不同的位置。然后将样品装入反应器，并作为连续的液体进行分析。选择靶向试剂的间隔，使得从一个位置到相邻位置的距离大于检测反应所需时间的扩散长度，在寡核苷酸检测的情况下，通常为30至50个PCR循环。
在不同靶序列的PCR扩增的情况下，在本例中，可以将不同的引物对预先装入反应体积内的不同位置，例如，通过将一系列引物对沉积到反应池的其中一个较大面积壁上的一系列位置处，然后进行干燥。引物特定的扩增可在每个引物对的位置处发生，并且该扩增的结果可独立于相邻位置处的PCR扩增结果来确定，只要PCR扩增的时间少于反应产物或引物扩散到相邻位置所需的时间即可。
典型的引物是具有约20个碱基的寡核苷酸序列，并且比靶DNA序列短，具有相应较大的扩散系数。采用与DNA扩散相同的公式，一个20碱基的引物可以在100s的时间内扩散151μm。独立检测要求进行多重检测的相邻位置被间隔开此距离的至少两倍，优选地为此距离的至少4至6倍。例如，我们可以考虑5μl的反应体积，其高度为100μm，面积为50mm2，相邻位置之间的间距约为1mm。每个检测位置占用1mm2的面积，为多重检测提供50个独立的检测位置。
扩散限制通道可用于在整个反应过程中限制试剂和反应产物在相邻反应区域之间的扩散。图17示出了根据本发明在长达60s的时间内同时模拟DNA扩增和扩散，然后在60s之后仅模拟DNA扩散。在模拟开始时，中心细胞包含一个DNA分子，并通过PCR以2s的循环时间对其进行扩增。具有扩散限制通道的反应池的情况用实线示出，而不具有扩散限制通道的反应池的情况用虚线示出。需要快速扩增以便先在一个反应区域中完全扩增，然后才能在相邻区域中进行明显的扩散和扩增。在该示例中，具有扩散限制通道的相邻细胞中的DNA浓度约为60s处的主细胞中的DNA浓度的5％，而在没有扩散限制通道的情况下，相邻细胞中的DNA浓度约为35％。
图18示出了针对以下两种情况通过采用本发明的方法在时间100s处模拟DNA浓度的结果：A是没有扩散限制通道的反应池，而B是具有被扩散限制通道分开的单独的反应区域(检测位置)的反应池。扩散限制通道减少了DNA向相邻细胞的扩散。在这两种情况下，先模拟60s的PCR扩增(30个PCR扩增循环，每个循环2s)，然后再模拟40s的扩散。图18(A)和18(B)中的每个内的反应池可以具有与单个加热器元件关联的单个反应体积。
图19示出了采用本发明的方法中的浓度变化，变化的位置在开始PCR扩增之后的时间100s处。扩散屏障有助于在DNA扩增的位置附近保持较高的DNA浓度，并在相邻的反应位置处保持较低的浓度。这允许在具有用于试剂和样品流的连续流体路径的反应器中进行数字PCR或多重PCR或其他反应，而无需液滴或其他措施来隔离反应体积。
图20示出了根据本发明的两种不同的流体池设计，其具有通过限制相邻反应区域之间的扩散的较小通道连通的反应区域阵列。反应区域可以包含不同的试剂，例如PCR引物，以便在不同位置进行多重扩增和不同DNA序列的检测。或者，反应区域可以全部包含相同的试剂以便进行数字PCR。扩散限制通道允许填充反应区域阵列，而无需在油中产生水性液滴以提供隔离的反应区域，从而简化并降低了进行反应的成本。图20中的每一个中的流体池20(A)和20(B)可能具有与单个加热器元件相关联的单个反应体积
图21示出了具有由扩散限制340隔开的反应区域330的流体池的细节。来自反应区域的流体路径重组以允许反应产物被收集并转移出反应池。
图22示出了具有重组流体路径的反应池的出口的细节。为了避免形成气泡，在流体路径中设置了一系列的毛细管流动限制，其中毛细管破裂压力沿流动方向增加。在图22(A)中，较大半径的毛细管流动限制351的破裂压力低于较小半径的毛细管流动限制352。当来自两个通道的流汇合时，一个通道可以钉在毛细管流动限制上，直到相邻的通道被充满为止。这时，两个前进的液体前沿的弯液面可以接触，并且流重新汇合而不会产生气泡。在图22(B)中，液体流在较小半径的毛细管流动限制点352处停止，而液体流过较大半径的毛细管流动限制点351。当前进的弯液面到达每个限制点352时，液体流重新汇合。
图23示出反应池的另一实施例，其中反应体积220具有宽度WV、长度LV和高度HV。在该示例中，通过避免使用具有较大无支撑跨度的宽流体通道，使池的构造更加坚固。反应体积220与加热器元件500对准并布置成由加热器元件500加热，并且通过高度为HV的蛇形流体通道270构造，该蛇形流体通道270将样品分布在整个反应体积区域WV×LV上。尺寸例如可以是WV＝2.5mm，LV＝16mm，以及HV＝0.1mm。包含具有这种形式的反应体积的反应池具有多个优点：容易控制流体路径，可以冲洗出气泡，并且可以使用压花和层压工艺制造部件以将薄外壁230附着到流体池上。为了进行PCR扩增，将样品引入反应体积，停止液体运动，施加正压，然后使反应体积进行热循环。可以沿着蛇形通道以线性阵列的形式提供PCR引物。可以根据溶解度来选择引物，从而使引物沿通道保持基本固定。
图24示出了具有蛇形流体通道的另一实施例。在该实施例中，四个反应体积220被布置成通过蛇形流体通道270由单个样品填充，并且通过加热器元件500进行热循环。每个反应体积具有宽度WV和长度LV。在该实施例中，尺寸例如可以是WV＝2.0mm，LV＝3.6mm以及HV＝0.1mm。
图25示出了在本发明的实施例中采用的导电加热器元件，该导电加热器元件具有中等、低和高薄层电阻的区域，以在加热器元件的边缘附近提供增强的加热，从而增加整个元件上温度的均匀性。加热器元件由支撑在电绝缘支撑件上的薄膜导体形成。通过在导电薄膜中形成孔，局部地增加了加热器元件的薄层电阻，其中较大的孔面积部分加大了薄层电阻的增加幅度。电流在电端子之间流动因为上下高电阻区域中的薄层电阻增加而提供了较高的加热功率密度，并还因为左下电阻区域和右下电阻区域中的电流密度增加而提供了较高的加热功率密度。通过在一般不透明的导电层中形成孔，还使加热器局部透明。局部透明的加热器元件可用于对反应进行光学监测，尤其是对扩增的DNA进行荧光检测。
图26示出了在本发明的实施例中采用的加热器元件中的边缘效应补偿的替代方法。在主加热器的一个或多个边缘处设置防护加热器，并且多个防护加热器被电驱动至与一个防护加热器相同的温度设定值。主加热器还具有端部加热器区域，这些端部加热区域具有较高的电阻，以在端部附近提供增强的加热，从而减少边缘效应。主加热器配有四端子开尔文连接，因此可以准确测量其电阻，并将该电阻用于计算加热器元件的温度。所得的温度测量结果用于控制加热器的驱动功率和热循环行为。
图27示出了在本发明的实施例中采用的加热器元件，该加热器元件包括主加热器，在主加热器的两边附近具有防护加热器。在这种情况下，主加热器是细长型的，防护加热器位于长边附近。主加热器具有低电阻中心区域和高电阻端部区域，因此，在加热器的长边方向上流动的电流将导致高电阻端部区域中的热输出增加，并且这种增加的热输出将补偿边缘效应，从而增加加热器的温度均匀性。细长型加热器元件的优点在于，它与细长型反应体积的外形匹配，这种细长型反应体积易于制造并且易于填充而不会滞留气泡。主加热器中的穿孔使加热器部分透明。
图28示出了在本发明的实施例中采用的用于两个反应体积的加热器的设计。加热器包含两个细长型主加热器元件，在主加热器元件的长边附近具有三个防护加热器元件。主加热器的端部区域具有通过增加薄膜导体中的孔面积部分形成的高薄层电阻(B)，而主加热器的中心区域具有通过减小薄膜导体中的孔面积部分而形成的低薄层电阻(A)。主加热器配有开尔文触点，以允许准确地测量加热器的电阻。加热器电阻随温度的变化用于监测和控制加热器温度。为防护加热器提供了单独的电触点，从而允许进行独立的电驱动和控制。外部防护加热器可以设计为具有比内部防护加热器更低的电阻，这样，当所有防护加热器被以相同的电压驱动时，外部防护加热器会产生更多的热量，从而提高温度均匀性，因为更大的热输出会补偿加热器边缘处的更大热损失。
图29示出了在本发明的实施例中采用的具有用于改变电阻的图案化电极的加热器。加热器(A)有两个主加热器，这两个主加热器在其较短的端部附近具有高电阻区域，而在中心部分具有低电阻区域。可通过提供可变导体几何形状的间隙区域的几何形状来调节电阻。(B)示出了高电阻区域和低电阻区域的示例。细长型间隙垂直于电流的方向取向，以便增加加热器元件的薄层电阻。较大的纵横比间隙提供了高电阻端部区域，而较小的纵横比间隙提供了低电阻中心区域。通过提供平行的导电路径，主加热器的设计可以强力抵御单轨中断。防护加热器放置在主加热器的长边附近。外部防护加热器(C)的电阻低于内部防护加热器(D)，以便在以相同的驱动电压驱动时提供更大的热输出。
应当理解，加热器元件基本上是连续的，其所包含的任何孔的直径均小于反应体积的厚度HV，或者对于加热器元件中存在狭长间隙的情况，间隙宽度小于反应体积的厚度HV。
图30示出了在本发明的实施例中采用的加热器元件，其使用低电阻叉指电极和高电阻区域的组合来进行加热和温度感测。高电阻区域可以使用诸如氧化钒之类的金属氧化物材料来制造，该氧化物在所关注的温度范围内具有大电阻温度系数(TCR)，而低电阻叉指电极可以使用诸如金、铝或铜之类的金属薄膜来制造，这些金属薄膜的薄层电阻低于高电阻加热和感应区域。
图31示出了在本发明的实施例中采用的散热器，该散热器上具有穿孔，以便在与部分透明的加热器元件结合使用时，允许对反应进行光学监测。孔的直径和间距选择为足够小，以免影响反应池的温度均匀性。一个典型的示例是在厚度为2mm的铝制散热块中使用直径为1mm，间距为2mm的孔。即使在反应器的两侧具有加热器和散热器的情况下，这种布置也可以对反应进行光学监测。
图32示出了根据本发明的经由热阻(A)连接至散热器的加热器的温度随时间的变化。以10W的固定功率驱动加热器，直至达到上设定值温度(时间＝0.26s)，此时将加热器功率降低为零，直至达到下设定值温度(时间＝0.59s)。对于给定的加热器功率和加热器几何形状，存在一个使热循环时间最短的热阻，如(B)所示。对于10W加热器，最佳热阻约为10K/W。高功率加热器需要较低的热阻以最小化热循环时间，而低功率加热器需要较高的热阻以最小化热循环时间。例如，一个5W的加热器需要20K/W的热阻，而一个20W的加热器则需要5K/W。
图33示出了根据本发明的示例反应器中的0.4s、0.8s和1.6s处的热循环时间的加热器功率和热阻的变化。对于固定的热循环时间，存在一个最小化必要的加热器功率的最佳热阻。
图34示出了在90℃至60℃之间驱动的本发明的实施例中使用的加热器的温度随时间的变化。热循环时间为2s。实线显示温度设定值，虚线显示温度测量值。
图35示出了使用本发明的实施例的反应器获得的DNA解链曲线数据。使用插入染料SYBR-GREEN指示双链DNA的存在，随着温度升高至高于DNA的解链温度(在这种情况下约为83℃)，该染料显示荧光突然减少。荧光随温度的变化在A中示出，梯度-dF/dT在B中示出。
图36示出了使用本发明实施例的反应器的热循环PCR扩增的DNA扩增曲线数据。上图示出了插入染料的荧光随时间的变化，示出了DNA浓度的增长在约120s处高于背景水平。下图示出了温度与时间的关系。最初的热启动用于激活聚合酶，然后在95℃高温和60℃低温下使用5s的热循环时间。
图37示出了本发明的实施例中用于进行DNA解链的量热检测的样品细胞与参比细胞之间的温度差。样品细胞中的DNA浓度为1μM，参比细胞中没有DNA。当样品细胞和参比细胞以相同的功率驱动时，由于DNA解链而导致的热容量增加会导致温度降低。直流驱动在A中示出，而交流驱动在B中示出。当DNA经历解链转变时，交流驱动使温度以两倍于驱动频率的频率振荡。由交流驱动产生的信号的电检测可以比直流驱动更容易检测。选择交流驱动的频率，以使加热时间大约等于通过反应器高度的热扩散的时间。加热时间等于正弦驱动的周期时间的1/4。
图38示出了采用本发明的方法中的PCR扩增方案的温度曲线，首先具有20s的热启动周期，随后是重复30次的5s的热循环。使用差示扫描量热法来检测扩增的DNA，如下所示：在热启动周期的温度上升过程中，测量基线差示温度扫描(记录样品细胞和参比细胞之间的温度差与温度的关系)。在最后一个PCR循环的温度上升过程中执行终点温度扫描。基线扫描和终点扫描之间的差异与DNA的解链热成正比。
图39示出了根据本发明的用于DNA解链的量热检测的电桥电路。样品细胞由电阻器R1和R4加热，而参比池由电阻器R2和R3加热。在DNA解链的情况下，样品池的温度将降低，R1和R4的电阻值也降低，从而在放大器X1的正(同相)输入端产生较高的电压，而在放大器X1的负(反相)输入端产生较低的电压。这会导致X1的输出为正。在这种情况下，示出了直流驱动V1，但是也可以使用交流驱动。在正弦交流驱动的情况下，可以使用频率选择性检测方案来仅以两倍于驱动频率的频率来检测信号。对于方波驱动(脉冲+V或0V)，可以使用频率选择检测来通过与驱动频率相同的频率检测信号。期望加热电阻器具有大电阻温度系数，以便根据小温度差产生可测量的信号电压。在替代方法中，连接在样品池与参比池之间的热电偶会产生与池之间的温度差成正比的信号电压。
图40示出了根据本发明的平衡电路，其使用额外的串联电阻器R5、R6、R7和R8以最小化电桥电路的差分电压输出，并最小化包括R1和R4的样品加热器与包括R2和R3的参比加热器的功率输出差。R5、R6、R7和R8的值可以在制造时设置，也可以在检测之前进行调整。理想的情况是最小化电桥电路电压的不平衡，以在不使X1饱和的情况下实现高扩增增益和灵敏的检测。需要向样品池和参比池输入相等的功率，以确保两个池同时达到DNA解链温度，并给出与两个池之间的DNA浓度差异成正比的信号。
图41示出了可用于本发明的附加并联电阻器R5、R6、R7和R8，用于最小化电桥电路的差分电压输出，并最小化样品加热器和参比加热器的功率输出差。
本领域技术人员将理解，我们描述的根据本发明的多个示例反应器、加热器和电路结构可以与所描述的任何其他示例结合使用以实现本发明。
本申请的主题还包括以下编号的条款。
1.一种用于在其中进行预定反应的变温反应器，所述反应器包括反应池、加热器和散热器，
其中所述反应池具有厚度为HV且宽度为WV的反应体积，其中WV＞4HV，并且由多个面限定，所述反应体积的其中一个面积较大的面由厚度为HW的外壁界定；
其中所述加热器与所述外壁接触，
其中所述加热器包括位于更靠近所述反应体积的面上的发热的加热器元件和位于相反表面上的加热器支撑件，所述加热器支撑件与散热器接触，使得所述加热器支撑件在所述加热器元件与所述散热器之间提供热阻RT，
其中当填充有热扩散系数为DV的试剂的所述反应器在厚度方向上具有扩散时间tV时，
Figure BDA0002994261250000241
并且tV小于反应时间常数tR，以及
其中所述外壁具有热扩散系数DW并且具有热扩散时间
Figure BDA0002994261250000242
2.根据条款1所述的反应器，其中所述加热器元件既用作加热器又用作温度传感器。
3.根据条款1或条款2所述的反应器，还包括控制器，其中所述加热器连接至所述控制器并且由所述控制器控制，以使所述反应器的温度在较高温度THigh和较低温度TLow之间变化，这两个温度均高于所述散热器的温度TSink。
4.根据条款1至3中任一项所述的反应器，其中所述反应体积厚度HV小于250微米。
5.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应池包含由位于宽度为WV且长度为LV的区域内的蛇形通道形成的宽度为WV且长度为LV的反应体积。
6.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应体积在其两个大面积面上由厚度为HW的外壁限定，其中加热器与全部两个所述外壁接触，并且散热器与全部两个加热器接触。
7.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件是电阻式加热器元件。
8.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，并且所述加热器支撑件由电绝缘材料制成。
9.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器支撑件由与较硬且较坚固的散热器层接触的较软且较柔韧的层形成。
10.根据条款9所述的反应器，其中所述加热器支撑件进一步由与所述较软且较柔韧的层接触的较硬且较坚固的层形成，其中所述较软且较柔韧的层与所述散热器层接触。
11.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应池可以与所述加热器分离。
12.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器可以与所述散热器分离。
13.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中通过强制的空气冷却或循环液冷却或喷雾冷却或热管或利用珀尔帖元件或热泵的主动冷却来冷却所述散热器。
14.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应池具有将流体入口和出口连接至所述反应体积的入口通道和出口通道。
15.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应池包含为惰性聚合物的液体接触材料。
16.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置成使得能够选择所述加热器元件与所述散热器之间的热阻RT以满足以下关系：
RT>(THIGH-TSink)/pHeat并且
0.5RT,Opt<RT<2RT,Opt
其中RT,Opt＝(THIGH+TLOW-2TSink)/pHeat
所述反应器被布置成使用功率输出为pHeat的加热器和处于温度TSink的散热器在较低温度TLOW与较高温度THIGH之间重复循环。
17.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置成使得所述加热器支撑件的热阻RT、以及所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV满足关系RTCV<tR，其中tR是所述反应的时间常数。
18.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置成使得所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV以及所述散热器的热容量Cs足关系：CS/CV>100。
19.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述散热器材料的热导率是所述加热器支撑件材料的热导率的10倍以上。
20.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述薄外壁的一部分以及位于所述反应体积与所述散热器之间的加热器的热容量低于所述反应体积内的液体的热容量。
21.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述散热器材料的热逸散率是所述加热器支撑件材料的热逸散率的10倍以上，其中热逸散率e是所述材料的热导率k、密度ρ和比热容量cp的函数并且被定义为e＝sqrt(kρcp)。
22.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件在所述反应体积的整个面积上延伸。
23.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件是电阻式的并且具有矩形或正方形的形状。
24.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于500ppm/K。
25.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于2,500ppm/K。
26.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于10,00ppm/K。
27.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件是通过蒸镀或溅射或印刷或层压或光刻图案化或激光图案化所述导电材料而制造的。
28.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由具有正TCR的导电材料制成，并且可以包括Pt、Ti、Al、Mo、Ni、Cu、Au中的一种。
29.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述电阻加热元件由具有负TCR的材料制成，例如随着温度升高从电绝缘转变为导电的金属氧化物，例如氧化钒。
30.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中在所述加热器元件的相对角上设置有电触点，并且通过宽度逐渐减小的导电轨道沿着所述加热器元件的相对边缘来分配电流，所述宽度从所述电触点角处的较大宽度减小到所述电触点边缘的远端处的较窄宽度。
31.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器包括用于电阻测量的开尔文触点。
32.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件被布置成使得其周边附近的单位面积的热输出高于其中心附近的单位面积的热输出。
33.根据条款32所述的反应器，其中所述加热器元件具有正方形或矩形的形状，其具有沿着两个相对的边的电触点，其中在所述电触点边上具有高薄层电阻区域，而在其他两个边上具有低薄层电阻区域。
34.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件包括被一个或多个防护加热器包围的主加热器。
35.根据条款34所述的反应器，包括将所述防护加热器的温度控制到与所述主加热器相同的温度设定值的装置。
36.根据条款34或35所述的反应器，其中所述防护加热器具有比所述主加热器低的薄层电阻。
37.根据条款34至36中任一项所述的反应器，其中所述主加热器在电流流动方向上呈细长形，并且在所述主加热器的长边附近放置有防护加热器。
38.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件的薄层电阻在位于垂直于所述电流流动方向的所述加热器元件的边缘上的端部区域中局部增加。
39.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件的薄层电阻在位于平行于所述电流流动方向的所述加热器元件边缘上的侧面区域中局部增加。
40.根据条款38所述的反应器，其中通过部分覆盖导电材料，例如通过形成由孔或狭槽的阵列穿孔的导电材料层，来提供所述加热器元件中的增加的薄层电阻。
41.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器支撑件或散热器包括位于所述加热器元件的周边附近以及所述加热器元件与所述散热器之间的热断裂。
42.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应体积被布置成在使用中包含用于核酸序列的聚合酶链反应(PCR)扩增的试剂。
43.根据条款1至41中任一项所述的反应器，其中所述反应器被配置为通过聚合酶链反应(PCR)热循环来进行DNA扩增。
44.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应器包括控制器，所述控制器被配置为针对多步反应中的不同反应步骤以不同的温度设定值控制温度。
45.根据条款44所述的反应器，其中所述反应器配置为进行用于DNA测序的多步反应。
46.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述散热器包括孔，以允许对所述反应体积进行光学检查。
47.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置使得能够使用荧光或比色或UV吸收或电化学或量热或电泳或寡核苷酸感测来检测所述反应体积中的反应结果。
48.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置成使得通过监测多个热循环上的反应测量值的变化来检测反应输出。
49.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中反应传感器位于所述反应体积的外壁内或与所述反应体积的外壁接触。
50.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被配置为通过包括用于测量所述反应器中样品的热容量变化的测量组件来实现所述反应结果的量热检测。
51.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应器通过构造成使用样品反应和参比反应而被配置用于DTA或DSC。
52.根据条款1至50中任一项所述的反应器，其通过包括用于从在不同时间测量的第二温度扫描中减去第一温度扫描的装置而被配置用于具有基线校正的DTA或DSC。
53.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被配置用于所述反应结果的无标记检测。
54.根据条款51所述的反应器，其被配置为使得在加热所述样品反应体积和参比反应体积的同时进行测量。
55.根据前述条款中任一项所述的反应器，其被布置成处理DNA或RNA反应产物，并且被布置成使得通过量热法检测所述反应产物的解链。
56.根据条款51或54所述的反应器，其被布置成使得在用于DNA的PCR扩增的热循环之前，在热启动阶段提升样品和参比物的温度的同时执行第一DTA或DSC测量，以及在用于DNA的PCR扩增的热循环之后执行第二DTA或DSC测量。
57.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中在使用中，至少一个反应体积包含样品材料，并且至少一个反应体积包含参比材料。
58.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件具有驱动器，所述驱动器被布置成向所述加热器提供脉冲或振荡的热输出。
59.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中高度为HV的反应体积、热扩散率为DV的反应物、厚度为HW并且热扩散率为DW的薄反应室壁被布置成在加热器驱动的频率满足以下关系时仅由位于一侧的所述加热器加热：
Figure BDA0002994261250000301
60.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中高度为HV的反应体积、热扩散率为DV的反应物、厚度为HW并且热扩散率为DW的薄反应室壁被布置成在加热器驱动的频率满足以下关系时由位于两侧的所述加热器加热：
Figure BDA0002994261250000302
61.根据前述条款中任一项所述的反应器，还包括电阻式加热器元件，其通过正弦波形以驱动频率被驱动，并且包括用于通过以下方式测量所述加热器元件的温度的装置：即，以两倍于所述驱动频率的频率测量加热器元件电阻的变化，或者以三倍于驱动频率的频率测量所述加热器电压或电流的变化。
62.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中使用布置在电桥电路中的样品电阻式加热器和参比电阻式加热器以及两个固定电阻器来感测样品与参比物之间的温度差。
63.根据条款1至61中任一项所述的反应器，其中样品与参比物之间的温度差是使用布置在电桥电路中的两个样品电阻式加热器和两个参比电阻式加热器来感测的，其中所述电桥电路的每一侧都包含来自样品容器和参比容器中的每一个的一个电阻式加热器。
64.根据条款62或63所述的反应器，其中使用微调电阻器来同时平衡所述电桥电路的输出电压与施加到所述样品容器和参比容器的加热器功率。
65.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件包括孔，以允许对所述反应体积进行光学检查。
66.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件形成有允许光透射以及对所述反应进行光学监测的孔、狭槽或间隙或蛇形路径。
67.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由诸如ITO或石墨烯或纳米线材料之类的透明导电材料形成。
68.根据前述条款中任一项所述的反应器，其中所述反应体积包含多个空间上分离的区域，其中不同的试剂位于所述反应体积的不同区域中，并且所述区域的间隔大于所述反应时间常数tR的时标上的所述反应产物的质量扩散长度和所述试剂的质量扩散长度中的较大一者，而且在每个反应区域内独立地监测不同的反应。
69.根据条款68所述的反应器，还包括根据循环时间tC使所述反应体积热循环N次的装置，并且所述试剂的间隔在等于N乘以tC的扩散时间内大于所述反应产物和试剂的所述质量扩散长度。
70.根据条款68或69中任一项所述的反应器，其中当在使用中，相同的试剂位于所述反应体积的每个区域中时，提供了独立监测每个区域以检测每个区域内是否存在反应产物的装置。
71.根据条款68至70中任一项所述的反应器，还包括处理器，用于处理含反应产物而不含反应产物的区域的数量的统计数据，以计算使用中的分析物的浓度。
72.根据条款68至71中任一项所述的反应器，其中在所述反应体积内至少有100个反应区域，或其中在所述反应体积内至少有1,000个反应区域，或其中在所述反应体积内至少有10,000个反应区域。
73.根据条款68至72中任一项所述的反应器，其中所述反应体积被分成通过扩散限制通道连接的反应区域，所述扩散限制通道的横截面面积小于所述反应区域的横截面面积的0.25，并且其中所述扩散限制通道的长度大于所述反应区域的宽度的0.25。
74.一种用于变温反应器的加热器，所述加热器包括加热元件，其中所述加热元件既用作加热器又用作温度传感器。
75.根据条款74所述的加热器，其中所述加热器元件是电阻式的并且具有矩形或正方形的形状。
76.根据条款74或75所述的加热器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于500ppm/K。
77.根据条款74至76中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于2,500ppm/K。
78.根据条款74至77中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于10,00ppm/K。
79.根据条款74至78中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件是通过蒸镀或溅射或印刷或层压或光刻图案化或激光图案化所述导电材料而制造的。
80.根据条款74至79中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件由具有正TCR的导电材料制成，并且可以包括Pt、Ti、Al、Mo、Ni、Cu、Au中的一种。
81.根据条款74至80中任一项所述的加热器，其中所述电阻加热元件由具有负TCR的材料制成，例如随着温度升高从电绝缘转变为导电的金属氧化物，例如氧化钒。
82.根据条款74至81中任一项所述的加热器，其中在所述加热器元件的相对角上设置有电触点，并且通过宽度逐渐减小的导电轨道沿着所述加热器元件的相对边缘来分配电流，所述宽度从所述电触点角处的较大宽度减小到所述电触点边缘的远端处的较窄宽度。
83.根据条款74至82中任一项所述的加热器，其中所述加热器包括用于电阻测量的开尔文触点。
84.根据条款74至83中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件被布置成使得其周边附近的单位面积的热输出高于其中心附近的单位面积的热输出。
85.根据条款84所述的加热器，其中所述加热器元件具有正方形或矩形的形状，其具有沿着两个相对的边的电触点，其中在所述电触点边上具有高薄层电阻区域，而在其他两个边上具有低薄层电阻区域。
86.根据条款74至85中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件包括被一个或多个防护加热器包围的主加热器。
87.根据条款86所述的加热器，包括将所述防护加热器的温度控制到与所述主加热器相同的温度设定值的装置。
88.根据条款86或87所述的加热器，其中所述防护加热器具有比所述主加热器低的薄层电阻。
89.根据条款86至88中任一项所述的加热器，其中所述主加热器在电流流动方向上呈细长形，并且在所述主加热器的长边附近放置有防护加热器。
90.根据条款74至89中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件的薄层电阻在位于垂直于所述电流流动方向的所述加热器元件边缘上的端部区域中局部增加。
91.根据条款74至90中任一项所述的加热器，其中所述加热器元件的薄层电阻在位于平行于所述电流流动方向的所述加热器元件边缘上的侧面区域中局部增加。
92.根据条款91所述的加热器，其中通过部分覆盖导电材料，例如通过形成由孔或狭槽的阵列穿孔的导电材料层，来提供所述加热器元件中的增加的薄层电阻。
93.一种用于变温反应器的驱动和感测电路，所述电路包括用于向样品电阻式加热器和参比电阻式加热器供电的装置，以及用于通过监测布置在电桥电路中的所述样品电阻式加热器和所述参比电阻式加热器以及两个固定电阻器来感测样品与参比物之间的温度差的装置。
94.一种用于变温反应器的驱动和感测电路，所述电路包括用于向布置在电桥电路中的两个样品电阻式加热器和两个参比电阻式加热器供电的装置，以及用于通过监测所述两个样品电阻式加热器和两个参比电阻式加热器来测量样品与参比物之间的温度差的装置，其中所述电桥电路的每一侧被布置成使得在使用中都包含来自样品容器和参比容器中的每一个的一个电阻式加热器。
95.根据条款93或94所述的电路，还包括微调电阻器来同时平衡所述电桥电路的输出电压与施加到所述样品容器和参比容器的加热器功率。
96.一种操作根据前述条款中任一项所述的反应器、加热器和电路以根据变温反应提供测量值的方法。

Claims (25)

1.一种用于在其中进行预定反应的变温反应器，所述反应器包括反应池、加热器和散热器，
其中所述反应池具有厚度为HV且宽度为WV的反应体积，其中WV＞4HV，并且由多个面限定，所述反应体积的其中一个面积较大的面由厚度为HW的外壁界定；
其中所述加热器与所述外壁接触，
其中所述加热器包括位于更靠近所述反应体积的面上的发热的加热器元件和位于相反表面上的加热器支撑件，所述加热器支撑件与散热器接触，使得所述加热器支撑件在所述加热器元件与所述散热器之间提供热阻RT，
其中当填充有热扩散系数为DV的试剂的所述反应器在厚度方向上具有扩散时间tV时，tV＝HV 2/DV并且其中tV小于反应时间常数tR，以及
其中所述外壁具有热扩散系数DW并且具有热扩散时间tW＝HW 2/DW＜tV。
2.根据权利要求1所述的反应器，其中所述加热器元件既用作加热器又用作温度传感器。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的反应器，还包括控制器，其中所述加热器连接至所述控制器并且由所述控制器控制，以使所述反应器的温度在较高温度THigh和较低温度TLow之间变化，这两个温度均高于所述散热器的温度TSink。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的反应器，其中所述反应体积厚度HV小于250微米。
5.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述反应池包含由位于宽度为WV且长度为LV的区域内的蛇形通道形成的宽度为WV且长度为LV的反应体积。
6.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述反应体积在其两个大面积面上由厚度为HW的外壁限定，其中加热器与全部两个所述外壁接触，并且散热器与全部两个加热器接触。
7.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件是电阻式加热器元件。
8.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，并且所述加热器支撑件由电绝缘材料制成。
9.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器能够与所述散热器分离。
10.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其被布置成使得能够选择所述加热器元件与所述散热器之间的热阻RT以满足以下关系：
RT>(THIGH-TSink)/pHeat并且
0.5RT,Opt<RT<2RT,Opt
其中RT,Opt＝(THIGH+TLOW-2TSink)/pHeat
所述反应器被布置成使用功率输出为pHeat的加热器和处于温度TSink的散热器在较低温度TLOW与较高温度THIGH之间重复循环。
11.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其被布置成使得所述加热器支撑件的热阻RT、以及所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV满足关系RT CV<tR，其中tR是所述反应的时间常数。
12.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其被布置成使得所述填充的反应体积的热容量与位于所述反应体积与所述加热器元件之间的所述薄外壁的一部分的热容量之和CV以及所述散热器的热容量Cs足关系：CS/CV>100。
13.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述散热器材料的热导率是所述加热器支撑件材料的热导率的10倍以上。
14.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述薄外壁的一部分以及位于所述反应体积与所述散热器之间的加热器的热容量低于所述反应体积内的液体的热容量。
15.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述散热器材料的热逸散率是所述加热器支撑件材料的热逸散率的10倍以上，其中热逸散率e是所述材料的热导率k、密度ρ和比热容量cp的函数并且被定义为e＝sqrt(kρcp)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件在所述反应体积的整个面积上延伸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件是电阻式的并且具有矩形或正方形的形状。
18.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件由导电材料制成，所述导电材料的电阻温度系数的绝对值在所述加热器的整个工作温度范围内大于500ppm/K，优选地大于2,500ppm/K，更优选地大于10,00ppm/K。
19.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器包括用于电阻测量的开尔文触点。
20.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件被布置成使得其周边附近的单位面积的热输出高于其中心附近的单位面积的热输出。
21.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件包括被一个或多个防护加热器包围的主加热器。
22.根据权利要求21所述的反应器，其中所述主加热器在电流流动方向上呈细长形，并且在所述主加热器的长边附近放置有防护加热器。
23.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述加热器元件的薄层电阻在位于垂直于所述电流流动方向的所述加热器元件的边缘上的端部区域中局部增加。
24.根据前述权利要求中任一项所述的反应器，其中所述反应体积被布置成在使用中包含用于核酸序列的聚合酶链反应(PCR)扩增的试剂。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的反应器，其中所述反应器被配置为通过聚合酶链反应(PCR)热循环来进行DNA扩增。
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