JP5876569B2 - 物質の温度を変えるためのシステム及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、特定の物質の温度を急速に変えるために使用することができるシステムに関する。その適用の１つは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）等の核酸増幅技術の分野においてである。

分子生物学において、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）等の核酸増幅技術は、（１０００ヌクレオチドまでだが、時折、１０，０００ヌクレオチドまで、又はそれより長い）ＲＮＡ又はＤＮＡの短いポリヌクレオチド配列の増幅のために使用される。ＰＣＲプロセスは、Ｋａｒｙ Ｍｕｌｌｉｓによって１９８９年に最初に行われた。

一般的に、このプロセスにおいては、二本鎖ＤＮＡの鋳型が第１の変性温度まで加熱され、該温度にてＤＮＡは変性し、すなわち、ＤＮＡの二重らせん構造は巻き戻され、そのポリヌクレオチド鎖は分けられる。通常、この第１の温度は３６７から３６９ケルビンである。ＤＮＡ鋳型の配列に応じて、より低い温度又はより高い温度を使用することができる。

次のステップにおいて、温度は第２のアニーリング温度まで下げられ、該温度にて、プライマー（合成又は非合成ＤＮＡの短く特異的な配列であり、通常２０塩基長であるが、必要であると思われている場合より長く又は短くもあり得る）は、変性した一本鎖鋳型とアニールすることができる。使用されるプライマーに応じてより高い並びにより低い温度も使用することができるけれども、通常、この第２の温度は３２１から３４３ケルビンであり、より好ましくは、３３１から３３５ケルビンである。

第３のステップにおいて、温度は第３の最適なエクステンション温度に変えられ、それは、より高い並びにより低い温度も使用することができるけれども、通常３４５から３４７ケルビンであり、該温度にて、ポリメラーゼ酵素、より好ましくは熱安定性の酵素が、一本鎖鋳型のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドでプライマーを伸長させる。

次に、このプロセスは繰り返され、すなわち、混合物は変性温度まで戻される。このプロセスは、サーマルサイクリングとも呼ばれる。より多く並びにより少ないサイクル数を用いることができるけれども、通常、ＰＣＲ反応を行うために３０サイクルが用いられる。

既知の実施形態（本発明において等しく適用することができる）においては、所定数のサイクルの後のステップにおいてアニーリング温度がわずかに下げられるステップダウンＰＣＲプロセスを適用することができる。

高い融解温度（エクステンション温度に近い）でプライマーを利用する反応に対して、第２のアニーリング温度の作用を省略した２ステップサイクリングを使用することができ、アニーリング及びエクステンションは、単一のステップにおいて組み合わされる。この反応は、通常、「エッペンドルフチューブ」と呼ばれる反応容器内、又は、９６若しくは３８４ウェルを有した反応プレート内で起こる。プレート及びチューブは、通常、ポリプロピレンから作製される。他のプラスチックも適しているとわかり得る。ガラスチューブ等の他の型式も可能である。

ＰＣＲプロセスの持続時間は、反応の速度、及び、温度変化（サーマルサイクル）の速度及び正確さ次第である。ここ何年か、サーマルサイクルを行うための多くの方法が提案されてきており、それらのうち多くが実行されてきた。
‐最初のＰＣＲ反応は、全てのステップのタイミングをはかりながら、１つの恒温水槽から次の恒温水槽まで反応チューブを手動で変えることによって行われた。このプロセスは、最初の実験に対して有用であったが、扱いにくく、時間のかかるものであった。
‐最初の自動サーマルサイクルは、加熱要素を使用して、反応チューブが固定されたアルミニウムブロックを加熱した。ブロックの冷却のために水が使用された。これらの最初の機械は、約４時間でＰＣＲを行った。
‐次の世代は、ペルティエ素子を使用して、ブロックを加熱及び冷却した。これらの機械は、５Ｋ／ｓまでの温度過度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）を生じる。冷却はよりゆっくりであり、最大で−４．５Ｋ／ｓである。ＰＣＲは、２から４時間で行うことができる。より速い機械が存在する（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ ＰｉｋｏＣｙｃｌｅｒ）。ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒは、ロボットアームを使用して、プレートを１つの温度ブロックから次のブロックまで動かす。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＰｉｋｏＣｙｃｌｅｒは、速い温度勾配（５Ｋ／ｓ及び−４．５Ｋ／ｓ）を使用し、ＰｉｋｏＣｙｃｌｅｒは、薄い壁（平均１５０μｍ）を有した反応容器を使用する。これらの機械のうち全てが、チューブ内の液体の温度におけるずれによって速度の障害が多い又は少ない。
‐より速い機械（Ｒｏｃｈｅ ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）は、恒温空気を使用してガラスチューブ内のＰＣＲ混合物の温度を制御する。加熱中、１７Ｋ／ｓの温度過度に到達することができるが、冷却は、周囲温度次第である。ＰＣＲは、３０分で、場合によっては２０分で行うことができる。通常、反応は、依然として約１時間かかる。
‐テストチューブ内の混合物の内部において温度勾配を生じることによって温度を変える試みが行われてきた。続いて、対流が混合物を捕え、その成分は自動的に連続する温度ステップを経験する。このシステムは最近、より優れた対流を生成するために、傾斜の下、温度勾配を生じることによって改善されてきた。
‐ポンプシステムは、例えばＰＴＦＥから作製されたチューブの内側で間隔をおいて分けられた異なる温度ゾーンを通して混合物をポンプで汲み出すように設計されてきた。
‐オンチップＰＣＲは、引き起こされる、温度ゾーンを通る非常に少量の混合物、すなわち、数ナノリットル以下の液滴の動き次第である。動きは、ポンプで汲み出すことによって、又は、ＤＮＡが磁気ビーズでラベルされている場合には磁場によって発生させることができる。
‐さらに別のシステムは、わざわざ組み立てたキュベット内の温度を、高圧力下で正しい温度のガスをキュベット中に吹き込むことによって変える。

本発明の目的は、従来技術から知られた方法よりも速い方法で物質の温度を変えるために使用することができる装置を提供することである。

その趣意で、本発明は、請求項１に記載の温度制御装置を提供する。この装置の実施形態は、従属項２乃至１２において請求されている。

そのような装置を含むシステムが、請求項１３において請求されている。当該システムの実施形態は、従属項１４乃至１８において請求されている。

本発明による方法が、請求項１９乃至２０において請求されている。

本発明は、いくつかの図面を参考にして詳細に説明され、それらの図面は、本発明の実施形態を示すよう意図されるだけであり、発明の範囲を限定しないよう意図される。本発明の範囲は、付属の請求項の範囲において、及び、その技術的に同等の物によって定められている。

１つの温度から別の温度に変えられることになる物質で満たされたバッグ１７（ｉ）を作製する方法を示す図である。 １つの温度から別の温度に変えられることになる物質で満たされたバッグ１７（ｉ）を作製する方法を示す図である。 １つの温度から別の温度に変えられることになる物質で満たされたバッグ１７（ｉ）を作製する方法を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。 本発明による温度制御装置の実施形態を示す図である。

ここで、物質、好ましくは反応混合物、より好ましくは核酸増幅反応混合物、さらにより好ましくはＰＣＲ反応混合物、最も好ましくは液体ＰＣＲ反応混合物における温度を、優れた速度及び正確さで変えるためのシステムが提案される。

ＰＣＲ反応に適用可能である本発明の実施形態によると、囲いが、ＰＣＲ反応混合物で満たされて生成される。そのようなＰＣＲ反応混合物は、水、ＤＮＡ鋳型、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、緩衝液、ＭｇＣｌ２及びＰＣＲエンハンサー、並びに、ＰＣＲ反応に寄与し得る他の物質を含んでもよい。

囲いの形状は材料の強剛性に依存しないため、囲いは非常に薄い材料から作製することができる。その形状は、必ずしも固定されているというわけでもない。囲いは、囲いが作製される材料の強度及び他の特性に応じて、０．０１ｍｍまで薄い又はそれよりも薄い壁を有してもよい。これらの薄い壁は、以後さらに詳細に説明されるように、超高温の勾配の生成に寄与する。そのような高温の勾配を得るために、１つの囲いの体積は、有利に、５から１００μｌの範囲、好ましくは１０から５０μｌの範囲、最も好ましくは１０から２０μｌの範囲内にあってもよい。

囲いは、適切に温度耐性なプラスチックから成り、混合物が添加され、従って封着の部位にて湿気が存在し得る後でさえも、ＰＣＲ反応に干渉せず、全側面において閉じることができる。

そのような囲いの例はバッグであり、図１Ａ乃至１Ｃを参考にして説明される方法で生成することができる。図１Ａは、そのような囲いをバッグの形で生成するための装置１を示している。

図１Ａは、第１のプレート３及び第２のプレート５を有した装置１を示しており、どれも断面図で示されている。第１のプレート３は、１つ又は複数の拡張部分７（ｉ）を有している。これらの拡張部分は、示されているように空洞であってもよいが、中空でなくてもよい。これらの拡張部分は、第１のプレート３の上面と平行の第１の面において円形断面を有してもよく、第１の面とは垂直の第２の面において楕円形の断面を有してもよい。しかし、本発明は、これらの形状に限定されない。例えば、第１のプレートの表面と平行の断面図は、長方形であってもよいか、又は、いかなる他の適した断面形状を有してもよい。

第２のプレート５は１つ又は複数の開口部９（ｉ）を有しており、それぞれが第１のプレートの対応する拡張部分７（ｉ）を受けることができるように開口部９（ｉ）は配置及び形作られている。好ましくは、拡張部分７（ｉ）の外側の形状は、開口部９（ｉ）の内側の形状に実質的に相当する。

１つ又は複数のバッグを形成するために、プラスチックホイル１１が、第１のプレート３と第２のプレート５との間に配置される。第１のプレート３も第２のプレート５も、所定の温度まで加熱される。これらの温度は、等しくあってもよく、プレートがプラスチック１１に接触した場合にプラスチックホイル１１を柔らかくするように選ばれてもよい。矢印Ａ（１）によって示されているように、第１及び第２のプレートは、各拡張部分７（ｉ）が対応する開口部９（ｉ）によって受けられるように、互いに向かって動かされる。柔らかくされたプラスチックホイルは、バッグ１７（ｉ）を形成するように、拡張部分７（ｉ）によって開口部９（ｉ）内に押し込まれる（図１Ｂ）。拡張部分７（ｉ）及び開口部９（ｉ）が存在するのと同じ数のバッグ１７（ｉ）が形成される。これらのバッグ１７（ｉ）は、プラスチックホイル１１のうち開口部９（ｉ）の内部に押し込まれていない部分によって互いに接続している。

プレート３、５のうち１つが固定された位置にとどまってもよく、もう一方のプレートのみを動かして矢印Ａ（１）によって示された動きを生成する必要があることが観察される。プレート３、５は、アルミニウム、鋼、又は、十分に高い融解温度及び十分に高い熱伝達係数を有したいかなる他の材料から作製してもよい。使用中のそれらの温度は、プラスチックホイルがプロピレンである場合、３２３Ｋから５７３Ｋ、より好ましくは３２３Ｋから４７３Ｋ、最も好ましくは３７３Ｋから４４３Ｋまでの範囲にあってもよい。プラスチックは、ポリプロピレンであってもよい。しかし、例えばポリエチレン、ポリエテン、ＰＭＭＡ（＝ポリメチルメタクリレート）、ポリカーボネート、ＰＯＭ（＝ポリオキシメチレン）等、いかなる他の適した材料も代わりに使用することができる。

プレート３、５は互いから取り外され、さらに、バッグ１７（ｉ）を有したプラスチックホイル１１は装置１から取り外される。次に、バッグ１７（ｉ）を有したプラスチックホイル１１は、バッグ１７（ｉ）が第３のプレート１３における対応する開口部１５（ｉ）内に挿入されるように配置される。第３のプレート１３は加熱されず（そのため、室温であり）、さらに、ガラス、適した金属、又は適したポリマーから作製することができる。

矢印Ａ（２）を用いて図１Ｂに示されているように、開口部１５（ｉ）内に挿入されると、バッグは、所定のＰＣＲ反応混合物で満たされる。

さらなるプラスチックホイル１９が、プラスチックホイル１１の上面に提供される。矢印Ａ３を用いて示されているように、このさらなるプラスチックホイル１９は、プラスチックホイル１１の上に置かれる。位置２３にて（図１Ｃを参照）、さらなるプラスチックホイルはプラスチックホイル１１に封着される。位置２３は、バッグ１７（ｉ）間に位置し、さらなるプラスチックホイル１９がプラスチック１１に接触する位置である。封着のために、接着、加熱、超音波の適用等、いかなる適した手段及び方法も使用することができる。

拡張部分７（ｉ）及び開口部９（ｉ）は、マトリックス配列に配置することができる。従って、バッグ１７（ｉ）もマトリックス配列に配置される。いかなる数（例えば９６）のバッグも、別々のラインに平行に置くか、又は接続させることができる。バッグも、連続してつなげてバッグのマトリックスを生じることができる。或いは、ポリプロピレンホイルのシートを、（例えば８若しくは１２の列に１つの行、又は、８の列に１２の行等）バッグ１７（ｉ）の行及び列を含むように生成することができる。バッグ１７（ｉ）は、円形、長方形であってもよく、又は、いかなる他の適した断面形状を有してもよい。数は、例として役立つよう意味している。

図２Ａ、２Ｂ、３、４、及び５は、所定の温度までバッグ１７（ｉ）を加熱及び冷却するために使用される温度制御装置の実施形態（の一部分）を示している。

図２Ａは、温度制御装置２５を示している。温度制御装置２５には、三組の加熱ブロック、第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）、及び、第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）が提供されている。これらの加熱ブロックの組は、アルミニウムから作製することができる。第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）は、例えばＰＯＭ（＝ポリオキシメチレン）から作製される熱分離ブロック４３（１）／４３（２）の組等の第１の温度隔離材料によって、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）とは分けられている。第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）は、例えばＰＯＭから作製される熱分離ブロック４５（１）／４５（２）の組等の第２の温度隔離材料によって、第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）とは分けられている。

加熱ブロックのそれぞれは、所定の温度にあるように、適した、単に概略的に示された加熱装置４７によって加熱される。ＰＣＲサイクルの場合、第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）は、３６７から３６９ケルビンの第１の温度まで、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）は、３２１から３４３ケルビン、より好ましくは３３１から３３５ケルビンの第２の温度まで、さらに、第３の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）は、３４５から３４７ケルビンの第３の温度まで加熱される。当然ながら、他の適用に対して、他の温度を適用することができる。加熱装置４７は、各加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）に対して１つという３つの別々の加熱ユニットとして配置することができる。しかし、加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）のそれぞれの温度を制御するように配置された単一の加熱ユニットから成ることもできる。他の配置も可能である。例えば、１０個のそのような加熱ブロックがあってもよく、その場合、３６７Ｋの温度で２個、３４５Ｋで２個、３３３Ｋで２個、３３１Ｋで２個、及び、３２９Ｋで２個である。

アルミニウムの代わりに、いかなる他の金属、合金、若しくはプラスチック、又は、十分に高い熱容量及び熱通過率を有した他の材料を使用することができる。ＰＯＭの代わりに、十分に低い熱通過率を有したいかなる他の材料又は物質も使用することができる。例として、加熱ブロックは、水等の液体で満たされた加熱バッグとして製造することができ、より高い熱容量を有することになり、熱伝達は、内部の対流によって支持される。加熱されたガスを有した加熱バッグも使用することができる。アルミニウム及びＰＯＭは、単に例として役立つよう意味している。ガスも、隔離材料として使用することができる。

当該システムは、例えばバッグ１７（ｉ）内の反応混合物等の物質の温度が所望の温度まで加熱／冷却される場合に加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）が実質的に同じ温度でとどまる方法でセットアップするべきである。これは、加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）のそれぞれに、温度が制御されるべきである物質の熱容量の少なくとも１０倍の熱容量を提供することによって得ることができる。しかし、加熱ブロックの熱容量と加熱されることになる物質の比は、５０を超える等、より大きいほうが好ましい。加熱ブロックのうちそれぞれ個々の加熱ブロックは、８０から１０００Ｊ／Ｋの熱容量を有することが好ましい。

従って、そのような加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）がＰＣＲプロセスにおいて使用される、及び、例えば３０サイクルで５から１００μｌの容量を有した多量のＰＣＲ混合物の温度変化を制御することになる場合、そのような加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）のそれぞれは、アルミニウムから作製し、４０から５００グラムの重量を有してもよい。

この構造によって、加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）は、ＰＯＭブロック４３（１）／４３（２）、４５（１）／４５（２）によって継続的に分けられ、加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）を異なる温度にて互いから隔離する。さらなる温度ゾーンが必要とされた場合に、さらなる加熱ブロック／ＰＯＭブロックを追加することができ、より少ない温度ゾーンが必要とされた場合に、より少ない加熱ブロック／ＰＯＭブロックを使用することができる。

各加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）は、それらの間に空間を生じるようにつなげられ、そこに、物質又は混合物、好ましくは反応混合物、より好ましくは核酸増幅反応混合物、さらにより好ましくはＰＣＲ反応混合物、最も好ましくは液体のＰＣＲ反応混合物を含有するバッグ１７（ｉ）が置かれる。

加熱装置４７は、限定されることはないがポケット加熱要素、ペルティエ素子、液体流、ガス流、液体の蒸気、加圧された蒸発‐濃縮サイクリング等を加熱／冷却するのに適した当業者には既知のいかなる装置であってもよい。

好ましくは、加熱制御装置２５は、単一の加熱ブロックの組から互いに向かう及び互いから離れるように行ったり来たりさせるように加熱ブロックをシフトするために、モータ３９のような駆動装置を含む。モータ３９は、各加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）の加熱ブロック２７（２）、２９（２）、３１（２）の１つに接続されて、それらに他の組に関連したそのような動きを提供しているように示されている。当然ながら、他の配置を使用して、加熱ブロックの組の加熱ブロック間のそのような関連した動きを提供することもできる。

第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）間に第１の温度ゾーン２７（３）があり、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）間に第２の加熱ゾーン２９（３）があり、さらに、第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）間に第３の加熱ゾーン３１（３）がある。加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）の個々の加熱ブロック間の空間は、第１の温度ゾーン２７（３）が、第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）と同じ第１の温度Ｔ１に実質的に等しく、第２の温度ゾーン２９（３）が、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）と同じ第２の温度Ｔ２に実質的に等しく、さらに、第３の温度ゾーン３１（３）が、第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）と実質的に同じ第３の温度Ｔ３を有するように設けられる。連続する矢印４１（１）から４１（４）で示されているように、１つの温度ゾーンから次のゾーンまでバッグ１７（ｉ）を動かすことによって、バッグ１７（ｉ）及びその内容物の温度を迅速に変えることができる。バッグは、手動又は適したモータによって動かしてもよい。加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）の熱容量がバッグ１７（ｉ）及びその内容物の熱容量よりも実質的に大きければ、バッグ１７（ｉ）内部の物質／混合物の５００Ｋ／ｓ以上の温度過度は可能である。さらなる温度ゾーンが必要である場合に、さらなるブロックの組を追加することができる。温度ゾーンは、複数のバッグ１７（ｉ）を収容するのに十分な程大きくあってもよい。例えば、バッグ１７（ｉ）のマトリックスを有したカセットを、温度ゾーン１７（ｉ）のそれぞれに置いてもよい。

バッグ１７（ｉ）の一側面における全混合物の集合を改善するために、当該構造を垂直に置くことができ、すなわち、使用中、第１の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）は第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）の上にあり、さらに、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）は第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）の上にある。そうすることによって、混合物は、重力の影響の下、バッグ１７（ｉ）の下部に集められる。

モータ３９は、一組の加熱ブロックの個々の加熱ブロックを互いに対して動かして、バッグ１７（ｉ）に対して押しつけるように配置され、そのような力は、内容物を有したバッグ１７（ｉ）を破壊しないようなものである。例えば、そのような力は、１から１０Ｎ、好ましくは３から８Ｎ、より好ましくは、５Ｎ等、４から６Ｎの範囲にあってもよい。温度ゾーン２７（３）、２９（３）、３１（３）における一組の加熱ブロックの加熱ブロックを共に押すことによって、バッグ１７（ｉ）の内容物は新たな形状をとるように強いられる。従って、内容物が、例えば、液体における特定の化学／生物学的反応の試薬である場合、液体内のこれらの試薬は、そのようなプレスによって混ぜ合わされ、流体へのより速い熱通過を引き起こす。或いは、当該システムの一部又はシステム全体であるバッグ１７（ｉ）は、流体を混ぜ合わせるために振って、流体への迅速な熱伝達を引き起こすことができる。この方法は、ここで説明されたもの以外のヒートサイクラ―の設計に適用することもできる。プレスは、バッグ１７（ｉ）と加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）との物理的接触面を増やす手段としても役立ち得る。従って、液体への熱の伝達、又は、液体からの熱の伝達を高める。

本発明の発明者によって行われたテストは、３０サイクルのＰＣＲプロセスが手動で行われた（すなわち、バッグ１７（ｉ）が１つの温度ゾーン２７（３）、２９（３）、３１（３）から次のゾーンまで手動で移された）場合であっても、７分ほどの速さで行うことができることを示した。

図３は、加熱ブロック２７（１）／２７（２）のそれぞれが熱伝達を改善するためにスロット２８（１）／２８（２）でその輪郭が描かれた実施形態を示している。そのようなスロット２８（１）／２８（２）は、バッグ１７（ｉ）の形状に正確に合うトンネルを生じるように互いに面している。一実施形態において、使用中、２つ以上のバッグ１７（ｉ）が、加熱ブロック２７（１）／２７（２）間の空間に平行に置かれることが予想される。そのような場合、複数のスロットを加熱ブロック２７（１）／２７（２）の相反する側面に機械加工して、複数のバッグ１７（ｉ）に対していくつか平行のトンネルを生じてもよい。図３は、加熱ブロック２７（１）／２７（２）に対するスロットを示しているけれども、そのようなスロットは加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）のいずれにも提供されることが明白である。加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）が共に押された場合に内容物が混ぜ合わされるように、スロット２８（１）、２８（２）は、バッグ１７（ｉ）の形状に正確には一致しないように形作ってもよい。スロットは、半円、多角形の一部、長円の一部等のようないかなる適した断面形状を有してもよい。

複数のバッグ１７（ｉ）は、ポリプロピレン等の適した材料のシート上でつなげることができる。他の適した材料も使用することができる。ポリプロピレンは、単に例として役立つ。或いは、複数のバッグ１７（ｉ）は、カセットにおいてつなげることができ、バッグ１７（ｉ）がブロックを通過するに従いブロックを分けるように設計される。ソレノイド又はモータ又はバルーン等、バッグ１７（ｉ）がブロック間を移動する場合に加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）を分ける他の手段も当業者には既知になる。ここで述べた方法は例として役立つ。

バッグ１７（ｉ）は、適したモータ（図示せず）により操作されるスライドによって、１つのゾーン２７（３）、２９（３）、３１（３）から次のゾーンまで動かしてもよい。１又は多次元の空間において対象を動かすように設計されたいかなる他の装置も使用することができる。方法及び装置は、当業者には既知になる。

さらに別の配置が、図４及び５に示されている。図４は、加熱制御装置の円形の配置を示しており、すなわち、加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）が、円の上に配置されている。図４の配置において、全加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）は、１つの円の中心から等しい間隔に置かれている。図５の配置において、加熱ブロックの組のうち第１の加熱ブロック２７（１）、２９（１）、３１（１）は、円の中心から第１の距離に置かれている一方、加熱ブロックの組のうち第２の加熱ブロックは、円の中心から第２の距離に置かれ、バッグ１７（ｉ）の円形の軌道が、各加熱ブロックの組のうち第１の加熱ブロックと第２の加熱ブロックの間に位置するようになっている。同じく図５において示されているように、二組以上の加熱ブロックの組２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）を、単一の円の上に配置してもよい。各組は、ＰＣＲプロセスの３０サイクルのうち１つのサイクルを提供するように配置される。この方法で、単一の円形の軌道に沿ってバッグ１７（ｉ）を動かすことによって、全３０サイクルのプロセスをさらに加速させることができる。

さらなる選択肢として、各加熱ブロックの対２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）の２つの加熱ブロックを、円の中心から等しい間隔に置かれるように互いに上に置くことができ、円の面は、各対の２つの相反するブロック間に位置する。バッグ１７（ｉ）は、従って、加熱ブロック２７（１）／２７（２）、２９（１）／２９（２）、３１（１）／３１（２）間の円の面において動かすことができる。

或いは、図６において示されているように、円形の構造を、２つ（又はそれ以上）の同心の円柱状の加熱ブロックから作製することができる。図６は、第１の円の外側に置かれた第１の加熱ブロック２７（１）、第１の円内及び第１の円よりも小さい半径を有する第２の円の外側に置かれた第２の加熱ブロック２９（１）、並びに、第１の円内及び第２の円よりも小さい半径を有する第３の円の外側に置かれた第３の加熱ブロック３１（１）を示している。第１の加熱ブロック２７（１）及び第２の加熱ブロック２９（１）は、第１の円の内側に置かれた第１のアイソレータ４３（１）によって分けられている。第２の加熱ブロック２９（１）及び第３の加熱ブロック３１（１）は、第２の円の内側に置かれた第２のアイソレータ４５（１）によって分けられている。さらに、第３のアイソレータ４７（１）が、第３の円の内側に置かれている。この方法で、適した温度まで第１の加熱ブロック２７（１）を加熱することによって、第１の温度Ｔ１の第１の温度ゾーン２７（３）を第１の加熱ブロック２７（１）と第１のアイソレータ４３（１）の間に生成することができる。適した温度まで第２の加熱ブロック２９（１）を加熱することによって、第２の温度Ｔ２の第２の温度ゾーン２９（３）を第２の加熱ブロック２９（１）と第２のアイソレータ４５（１）の間に生成することができる。適した温度まで第３の加熱ブロック３１（１）を加熱することによって、第３の温度Ｔ３の第３の温度ゾーン２９（３）を第３の加熱ブロック３１（１）と第３のアイソレータ４７（１）の間に生成することができる。バッグ１７（ｉ）を同心円に沿って動かし、温度Ｔ１、Ｔ２及びＴ３まで連続して加熱することができる。この実施形態の全ての材料は、他の実施形態における材料と同じであり得る。

さらなる実施形態において、内部温度勾配を有した少なくとも１つの加熱ブロックが使用される。一実施形態が、図７において示されている。図７の実施形態は、２つの同心状に置かれた加熱ブロック３４（１）、３４（２）を含む。同心の加熱ブロック３４（１）、３４（２）両方の第１の末端が、第１の温度Ｔ１まで加熱され、第２の末端が第３の温度Ｔ３まで加熱される。従って、バッグ１７（ｉ）は、第１の末端から第２の末端まで同心の加熱ブロック間で軌道に沿って動かされながら、温度Ｔ１の第１の温度ゾーン２７（３）から温度３１（３）の第３の温度ゾーン２７（３）まで動かされる。その内容物の温度は、従って、Ｔ１からＴ３まで変化する。第１の温度ゾーンと第２の温度ゾーンとの間に、Ｔ１からＴ３の間の温度Ｔ２の第２の温度２９（３）が存在する位置がある。バッグ１７（ｉ）の移動は、ＰＣＲプロセスのような必要とされたプロセスをそこで生じさせるのに十分長く温度ゾーン２７（３）、２９（３）、３１（３）に留まるように制御される。移動は、手動で、又は、上記の実施形態を参考にして説明したいかなる適した駆動装置によって行ってもよい。

第２の加熱ブロック３４（２）を配置する代わりに、いかなる適した形状及び材料の温度アイソレータを、３つの温度ゾーン２７（３）、２９（３）、及び３１（３）が生じるように配置することができる。

図７において示された配置は、同心のユニットを用いて実行する必要はなく、長方形のブロックの形状のユニット又はいかなる他の適した形状を用いても同様に申し分なく作製することができる。

サーマルサイクルの間にＰＣＲ反応において生成されたＤＮＡ断片は、当業者には既知であり且つそれらを密封するのに先立ちバッグ１７（ｉ）の内容物に添加されるラベリングユニットによってラベルすることができる。そのようなラベリングユニットの例は、所定の光の波長を用いた励起後に光子を放出するが、二本鎖ＤＮＡに結合された場合だけ放出するＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎである。ラベリングユニットの別の例は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＴａｑＭａｎプローブである。ＴａｑＭａｎプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に共有結合的に付着するフルオロフォア及び３’末端の消光剤から成る。フルオロフォア及び消光剤が近接している限り、消光によっていかなる蛍光信号も抑制される。ＴａｑＭａｎプローブは、特定のプライマーの組によって増幅されるＤＮＡ領域内でアニールするように設計される。Ｔａｑポリメラーゼがプライマーを伸長する及び新生の鎖を合成するに従い、ポリメラーゼの５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性によって、鋳型にアニールしたプローブが分解される。プローブの分解によって、そこからフルオロフォアが放出され、消光剤との近接関係が壊され、従って、消光作用を軽減し且つフルオロフォアの蛍光を可能にする。従って、リアルタイムＰＣＲサーマルサイクラ―において検出される蛍光は、放出されたフルオロフォア及びＰＣＲに存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例している。

光学信号を生成する他の適したラベリング方法も使用することができる。光学信号を使用することは、１つの例として役立つ。二本鎖ＤＮＡに結合した場合に、例えば磁気共鳴等の強磁場における変化した挙動等、他の信号を生成するラベルも使用することができる。当業者は、他の方法のうちどの方法を使用することができるか理解することになる。

ＰＣＲプロセスの終わりにて生成された量のＤＮＡを検出するために、原則として、２つの異なるアプローチを採用することができる。

第１のアプローチは、ＰＣＲプロセスの終わりにて、すなわち、第３の伸長温度の適用後に生成物を検出することである。このセットアップは、上記のＰＣＲプロセスからは完全に独立して使用することができる。この検出によって、反応の間に生成された生成物の量が与えられる。このために、小さなスキャナーを構築することができる。スキャナーは、例えばガラスから作製されたプレートから成り、そこに、サーマルサイクルが行われた後にバッグ１７（ｉ）を置くことになる。他の適した材料を、ガラスの代わりに使用することができる。これらの材料は、当業者には既知となる。バッグ１７（ｉ）は、バッグ１７（ｉ）の２つの相反する実質的に平らな表面が所定の距離にて生じるように、プレート上で押すことができる。これは、明確な操作プロセスを支持する。

ガラスのもう一方の側面上では、適したランプを励起のために使用することができる。励起光の波長は、利用されるラベル次第である。適したランプは、キセノンランプであり得る。他の適した光源が、当業者には既知となる。フィルタリングを使用して、ラベルを励起するように選択された所定の励起波長をラベルまで伝達することもできる。適したフィルタの例は、色ガラス又はプラスチックシート又はグリッドである。多数のフィルタの組み合わせを使用することもできる。バッグ１７（ｉ）のもう一方の側面上では、例えばＣＣＤチップ等の固定された又は可動式の検出器を使用して、信号を生じることができる。ＣＣＤチップは、レンズと組み合わせてカメラを形成することができる。フィルタは、ラベルからの放出信号を他の波長から隔離するために、バッグ１７（ｉ）とＣＣＤチップの間で利用することができる。適したフィルタの例は、色ガラス又はプラスチックシート又はグリッドである。多数のフィルタの組み合わせも使用することができる。スキャナーは、例えばＵＳＢを介して等、当業者には既知の手段によってコンピュータに接続してもよい。バッグ１７（ｉ）内で生成された生成物あたりの融解曲線を生成することが可能であるために、スキャナーは、バッグ１７（ｉ）内の液体の温度を制御することが可能であるように構成することができる。Ｔ２がＴ１よりも高く且つＴ１が形成された全生成物を二本鎖のＤＮＡであるように可能にするのに十分なほど低く、さらに、Ｔ２が形成された全生成物が（融解した）一本鎖ＤＮＡとして存在するのを可能にするのに十分なほど高い場合に、１つの温度Ｔ１から次の温度Ｔ２まで液体の温度を傾斜させることによって、このプロセスの間に、全生成物は、その独自の温度にて且つこの生成物に特異的な速度論でその二本鎖形状からその一本鎖形状まで推移する。その二本鎖形状からその一本鎖形状まで移る場合に、（例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等の）ラベルは、生成物から離され、さらに、信号を放出するのを止める。この方法で、バッグ１７（ｉ）内の生成物のそれぞれの融解温度を決定することができ、１つの囲い内部の異なる融解温度及び速度論を有する生成物の数を数えることも可能にする。

或いは、スキャナーを、上記のようにサーマルサイクルに利用されるブロックの構造の内部に合うように構成することができる。これは、図２Ｂにおいて示されている。そうするために、スキャナーは、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）内に統合される。そのために、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）のそれぞれが、２つの加熱サブブロック２９（１，１）／２９（１，２）及び２９（２，１）／２９（２，２）に分割される。加熱サブブロック２９（１，１）／２９（１，２）は、レンズとして使用することができる材料の第１の層３０（１）によって分けられる。加熱サブブロック２９（２，１）／２９（２，２）は、レンズ及びフィルタのうち少なくとも１つとして使用することができる材料の第２の層３０（２）によって分けられる。第１の層３０（１）も第２の層３０（２）も、ガラス又は適したポリマーのシートとして作製することができる。光源３２は、反応混合物を保持するバッグ１７（ｉ）に所定の波長λ１の光を提供するように配置され、反応混合物内のラベルが励起され、その励起によって引き起こされるλ２の波長を有した光を放出するように配置される。ＣＣＤチップ等の検出器３４は、λ２の波長を有した光を受けるように配置される。検出ユニット３４は、検出器３４からの出力信号を受け、それを分析して、出力信号に基づいたバッグ１７（ｉ）内の混合物の内容に関するデータを提供するよう配置された適したプロセッサ３６に接続される。

第３の加熱ブロックの組３１（１）／３１（２）は、同じ方法で分割して、例えば、第３の温度ゾーン３１（３）において類似のスキャナー測定を提供することができる。

第１及び第２の層３０（１）、３０（２）は、加熱ブロックの組の加熱ブロックと同じ方法でモータ３９によって互いに対して動かすことができるように配置される。この方法で、波長λ１を有した光を用いた走査の間に、バッグ１７（ｉ）は、例えば、第２の加熱ブロックの組２９（１）／２９（２）の加熱ブロック間の距離によって定められる所定の距離にて２つの相反する実質的に平らな側面を有するように、共に押される。このように、各バッグ１７（ｉ）内のＤＮＡの量は、同じ方法で常に測定され、より信頼できる測定データを生じる。バッグ１７（ｉ）は、入射光及び出射光を実質的に吸収しないか又は非常に少量の入射光及び出射光のみを吸収する非常に薄い透明な材料から作製することができるということに留意されたい。

図２ｂに示された構造を使用する代わりに、波長λ１を有した光を、或いは、図の表面とは垂直の方向から加熱ブロック間の空間に伝えることができる。しかし、従って、いくつかのバッグ１７（ｉ）が同じ方向で互いに隣接してある場合に、全てのバッグ１７（ｉ）は、他の量の光を受けることになる。従って、この作用を補正するべきである。

特別なバージョンにおいて、伸長温度までバッグ１７（ｉ）内の混合物を加熱するための加熱ブロック３１（２）は、同じ温度のレンズと取り替えることができる。

本発明は添付の特許請求の範囲及びその技術的同等物によってのみ限定されるということが理解されることになる。本明細書及びその特許請求の範囲において、「含む」という動詞及びその変化形が、その用語に続くアイテムが、明確に述べられていないアイテムを除外することなく含まれることを意味するようその非限定的なセンスにおいて使用される。加えて、不定冠詞による要素に対する言及は、１つの要素のみが存在するとその文脈が明確に命じない限り、２つ以上のその要素が存在するという可能性を除外しない。不定冠詞は、従って、通常「少なくとも１つ」を意味する。

例えば、本明細書において、「加熱ブロックの組」という用語が、物質を受けるための空間を画定する及びその物質を所定の温度、すなわち加熱ブロックの温度まで加熱するように使用される加熱ブロックを定義するように使用される。図面は、そのような２つの加熱ブロックを有する組を示している。しかし、そのような組は３つ以上の加熱ブロックを含んでもよいということが理解されるべきである。

Claims (23)

1. 温度制御装置、及び、反応混合物を含有する少なくとも１つのバッグを含むシステムであって、前記温度制御装置は、前記少なくとも１つのバッグの温度を制御して第１の温度を得る及び第２の温度まで変えるように配置され、前記温度制御装置は、少なくとも第１の加熱ブロック及び第２の加熱ブロック、並びに、加熱装置を含み、該加熱装置は、前記第１の温度まで前記第１の加熱ブロックを加熱する、及び、前記第２の温度まで前記第２の加熱ブロックを加熱するように配置され、前記温度制御装置は、前記第１の加熱ブロックに相反するように配置される第１のさらなる加熱ブロック又は第１のアイソレータを含む第１の物体を、それらの間に、前記少なくとも１つのバッグを受け且つ前記第１の温度を有する第１の温度ゾーンを定めるように配置された第１の空間を定めるように有し、さらに、前記温度制御装置は、前記第２の加熱ブロックに相反するように配置される第２のさらなる加熱ブロック又は第２のアイソレータを含む第２の物体を、それらの間に、前記少なくとも１つのバッグを受け且つ前記第２の温度を有する第２の温度ゾーンを定めるように配置された第２の空間を定めるように有し、前記第１及び第２の空間は、前記少なくとも１つのバッグを前記第１の温度ゾーンから前記第２の温度ゾーンまで動かすことができるように配置され、
   前記少なくとも１つのバッグは、０．０１ｍｍ以下の壁厚、及び、５から１００μｌの範囲の容量を有し、さらに、
   前記加熱ブロックは、反応混合物を含有する前記少なくとも１つのバッグの熱容量の少なくとも１０倍の熱容量を有する、システム。
2. 前記温度制御装置が、少なくとも第１の加熱ブロックの組及び第２の加熱ブロックの組を含み、前記加熱装置が、前記第１の温度まで前記第１の加熱ブロックの組を加熱する、及び、前記第２の温度まで前記第２の加熱ブロックの組を加熱するように配置され、前記第１の加熱ブロックの組は、温度隔離材料によって前記第２の加熱ブロックの組とは分けられる、請求項１に記載のシステム。
3. 前記温度隔離材料がポリオキシメチレン（ＰＯＭ）から作製される、請求項２に記載のシステム。
4. 前記加熱ブロックが、金属、液体で満たされたバッグ、及び、ガスで満たされたバッグのうちの１つから作製される、請求項１、２、又は３に記載のシステム。
5. 前記温度制御装置が駆動装置を含み、前記駆動装置が、前記少なくとも１つのバッグに対して押すように、前記第１の加熱ブロック及び前記第１の物体を互いに対して関連して動かす、並びに、前記第２の加熱ブロック及び前記第２の物体を互いに対して関連して動かすように配置される、請求項２、３、又は４に記載のシステム。
6. 前記駆動装置が、１から１０Ｎの範囲の力で前記少なくとも１つのバッグに対して押すように配置される、請求項５に記載のシステム。
7. 前記力が３から８Ｎである、請求項６に記載のシステム。
8. 前記力が４から６Ｎである、請求項６に記載のシステム。
9. スキャナーを含む請求項１から８のいずれか一項に記載のシステムであって、前記スキャナーは、第１の波長を有する光を生成するための光源、前記光を前記少なくとも１つのバッグに方向づけるための第１のレンズ、第２の波長の前記少なくとも１つのバッグから放出された光を受けるための検出器、及び、前記検出器からの出力信号を受け、さらに、受けた前記出力信号に基づいて前記少なくとも１つのバッグ内の前記反応混合物を分析するように前記検出器に接続されるプロセッサを含む、システム。
10. 前記第２の加熱ブロックが、２つの個々の加熱ブロックを含み、前記第１のレンズが、前記２つの個々の加熱ブロック間に配置される、請求項９に記載のシステム。
11. 前記第２のさらなる加熱ブロックが、２つのさらなる個々の加熱ブロックを含み、前記スキャナーが、前記第２の波長の前記少なくとも１つのバッグから放出された前記光を受け且つそれを前記検出器まで伝えるために前記２つのさらなる個々の加熱ブロック間に配置された第２のレンズを含む、請求項１０に記載のシステム。
12. 少なくとも前記第１の加熱ブロックが第１の表面において第１のスロットを含み、さらに、前記第１のさらなる加熱ブロックが、前記第１の表面に相反する第２の表面において第２のスロットを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のシステム。
13. 全ての加熱ブロックの組が円上に配置され、前記温度ゾーンの全てが前記円上に置かれるように配置される、請求項１から１２のいずれか一項に記載のシステム。
14. 前記第１の加熱ブロック及び前記第２の加熱ブロックが、第１及び第２の末端部分を有する第３の加熱ブロックの不可欠な部分であり、前記第１の加熱ブロックは、前記第１の末端部分によって形成され、さらに、前記第２の加熱ブロックは、前記第１及び第２の末端部分間の一部分によって形成される、請求項１に記載のシステム。
15. 前記反応混合物が、ＰＣＲ反応混合物を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のシステム。
16. 前記加熱装置が、ＰＣＲプロセスが前記バッグ内で行われるのを可能にするように、前記第１の温度にあるように前記第１の加熱ブロックを制御する、及び、前記第２の温度にあるように前記第２の加熱ブロックを制御するように配置される、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記温度制御装置が、第３の加熱ブロックの組を含み、前記加熱装置が、第３の温度まで前記第３の加熱ブロックの組を加熱するように配置され、前記第１の温度は３６７から３６９Ｋの範囲内にあり、前記第２の温度は３２１から３４３Ｋの範囲内にあり、さらに、前記第３の温度は３４５から３４７Ｋの範囲内にある、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記バッグは、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエテン、ＰＭＭＡ、ポリカーボネート、又は、他の適した透明な材料のうちの１つから作製される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のシステム。
19. 前記バッグが、１０から５０μｌの容量を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のシステム。
20. 前記加熱ブロックのうちそれぞれ個々の加熱ブロックが８０から１０００Ｊ／Ｋの熱容量を有する、請求項１から１９のいずれか一項に記載のシステム。
21. 請求項１から２０のいずれか一項に記載のシステムを使用する方法であって、
    前記少なくとも１つのバッグにプライマー及びある量の二本鎖ＤＮＡを提供するステップ、
    前記ＤＮＡに対して変性行為を行い、変性ＤＮＡを有する前記少なくとも１つのバッグを与えるように前記第１の温度ゾーン内に前記少なくとも１つのバッグを動かすステップ、
    前記プライマーを用いてアニーリング行為を行い、アニーリングした物質を有する前記少なくとも１つのバッグを与えるように前記第２の温度ゾーンまで前記変性ＤＮＡを有する少なくとも１つのバッグを動かすステップ、
    エクステンション行為を行うように前記第３の温度ゾーンまで前記アニーリングした物質を有する前記少なくとも１つのバッグを動かすステップ、
    によって特徴づけられる、方法。
22. 前記アニーリング及びエクステンション行為が、単一の温度ゾーン内で単一の行為において行われる、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第２の温度は、３３１から３３５Ｋの範囲内にある、請求項１７に記載のシステム。
    

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