KR20070052770A - 유기체의 게놈 ｄｎａ의 모니터링 방법 - Google Patents
유기체의 게놈 ｄｎａ의 모니터링 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 DNA 증폭의 파형-프로파일링 방법에서의 개선된 용도를 위한 신규 SGP 프라이머를 제공한다. 한 실시양태에서, DNA 증폭의 방법에서 SGP 프라이머의 사용은 몇몇의 별개 생성물을 기하급수적으로 증폭시킨다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 추가로 신규 절반 시간 연장 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 별개 생성물은 융점 분석을 통해 검출할 수 있다. 본 발명의 프라이머 및 방법은 샘플에서 유기체를 측정하는 것을 겸할 수 있다.
DNA 증폭, 파형-프로파일링 방법, SGP 프라이머, 절반 시간 연장, 융점 분석, 유기체
Description
본 출원은 미국 가출원 번호 제60/591,596호(2004년 7월 28일 출원)를 우선권으로 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 유기체의 게놈 정보를 기초로 한 유기체의 신속한 검출 및 분류를 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
생명공학 분야에서, 각종 샘플 (예컨대, 환경적 및 의학적)에서의 유기체, 예컨대 박테리아 및 바이러스의 신속한 검출 및/또는 분류에 대한 요구가 있다. 예를 들어, 박테리아의 신속한 검출, 및 종 및/또는 균주의 후속 분류가 예컨대 지방 급수, 병원, 또는 식품 가공 공장에 대한 품질 보증을 제공하기 위해 필요할 수 있는데; 즉, 소비, 적발 및/또는 일반 대중의 사용 전에, 또는 일반 대중의 사용 동안에 오염 유기체의 존재 및 오염 유기체의 분류를 위해 공기, 먼지, 물, 혈액, 조직, 식물, 식료품 등의 샘플을 포함하지만 이에 제한되지 않는 각종 샘플의 스크린에 요구될 수 있다. 본 발명은 샘플 중의 유기체 (예컨대, 박테리아 또는 바이러스)의 개선된 검출 및 분류 방법에 의해 이들 목적을 달성한다.
유기체의 기본 미생물학적 검출 및/또는 분류 방법, 예컨대 배양 및 그람 염색 또는 다른 생화학적 특성의 시험은 부정확하고, 유기체의 상이한 균주는 말할 것도 없이 상이한 유기체들 중에도 종종 식별할 수 없다. 유기체의 검출 및/또는 분류를 위한 더 정확한 방법은 유기체의 게놈 DNA를 기초로 한다. 이러한 방법, 예컨대 노던 블롯팅 및 RT-PCR 내지 최첨단 DNA 마이크로어레이 분석은 장황하고 전통적인 과정으로부터 개발되었다. 익히 공지된 이러한 검출 및/또는 분류 방법 중 하나는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이다.
PCR은 2개의 개별적이고 별개인 (제1 및 제2) 프라이머에 의해 실시되며, 이들 프라이머 각각은 이중 가닥 게놈 DNA의 2개의 주형 (즉, 가닥들) 중 하나인 뉴클레오티드 서열에 각각 상보적이다. 2개의 프라이머의 서열이 2개의 게놈 DNA 주형의 서열들에 기초하기 때문에, 2개의 프라이머는 이중 가닥 게놈 DNA의 단리된 특이적 좌위에 결합하고, 브래키팅한다. 이러한 프라이머 쌍을 사용하는 PCR은 2개의 프라이머에 상보적인 뉴클레오티드 서열에 의해 브래키팅된 게놈의 단리된 특이적 좌위, 즉 하나의 게놈 DNA 주형의 3'-말단 상의 제1 프라이머 결합 부위 및 다른 게놈 DNA 주형의 3'-말단 상의 제2 프라이머 결합 부위에 의해 플랭킹된 DNA의 좌위와 동일한 이중 가닥 게놈 DNA을 기하급수적으로 증폭시킨다.
PCR이 DNA를 기하급수적으로 증폭시키기 때문에, 소량의 게놈 물질을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, PCR이 공지되어 있고, 목적하는 좌위를 브래키팅하는 게놈 물질의 서열에 특이적으로 상보적인 프라이머를 요구하기 때문에, 공지된 유기체의 검출 및 분류에만 사용될 수 있는 제한이 있다. 달리 말하면, 조사 자가 유기체 검출시 임의의 시도 전에 유기체의 분류(즉, 사용할 적절한 프라이머 쌍)을 알고 있거나 추측하는 것이 요구된다. PCR의 또다른 제한은 조사자가 분석에 사용된 2개의 프라이머에 상보적인 서열에 대한 정보외에 증폭된 DNA에 대한 서열 정보를 얻을 수 없다라는 것이다.
PCR의 일부 제한을 극복하기 위해, 파형 프로파일링 방법이 개발되었다 (예컨대, 일본 특허 출원 공보 제2003-334082호 및 제2003-180351호에 기재된 파형 프로파일링 방법 참조). 파형-프로파일링 방법은 조사자가 검출 전에 유기체의 분류를 알거나 또는 추측하는 것 없이 게놈 물질 (예컨대, 유기체, 예컨대 박테리아로부터 단리된 DNA)의 분석 및 프로파일링 방식을 제공한다. 간략하게는, 파형 프로파일링은 특이한 프라이머의 다중 카피 및 게놈 DNA의 2개의 변성된 가닥을 주형으로 사용하여 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체를 선형 증폭시켜 고차 구조, 예컨대, 삼중나선, 사중나선 등을 형성시킴으로써 유기체의 게놈 DNA를 일반적으로 분석한다. 유기체의 게놈 DNA가 주형으로 사용되기 때문에, 생성된 단일 가닥 핵산 중합체는 별개일 것이고, 유기체에 특이한 서열을 함유할 것이다. 따라서, 단일 가닥 핵산 중합체는 유기체에 특이한 서열을 기초로 하는 고차 구조를 형성할 것이다. 따라서, 검출가능 제제, 예컨대 형광 인터컬레이터를 사용하여 달성될 수 있는 이러한 특이한 고차 구조의 검출은 유기체를 분류할 수 있다.
몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체는 그의 구조 및 길이에 의해 특성화된 단일 패턴 생성적 파형 프라이머를 사용하여 보통 생산된다. 파형 프라이머는 일반적으로 비특이적 안정화 부분 및 특이적 부분의 2 부분으로 이루어진다. 하기 논의되는 바와 같이, 비특이적 안정화 부분은 고차 구조의 형성 안내를 도울 수 있다. 대조적으로, 특이적 부분은 파형 프라이머가 자신의 서열에 상보적인 서열에 특이적으로 결합하도록 안내한다. 파형 프로이머의 길이 (예컨대, 8 내지 30개 염기 길이)는 프라이머의 특이적 부분이 게놈 DNA 주형의 길이에 따라 몇몇의 개별 프라이머-결합 부위, 즉 파형 프라이머에 상보적인 서열에 특이적으로 결합할 수 있도록 하기 때문에 일반적으로 중요하다. 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 몇몇의 프라이머-결합 부위에 파형 프라이머가 결합하는 것은 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체를 생산할 수 있게 하며, 이러한 생산은 이 방법에서 중요하다.
파형 프라이머를 사용하는 것 외에, 이들 파형 프로파일링 방법은 또한 선형 증폭의 몇몇 주기를 사용하여 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체 각각의 다중 카피를 제공하므로 파형 프라이머의 다수 카피는 선형 증폭의 제1 주기 전에 목적하는 게놈 DNA를 함유하는 용액에 첨가된다. 선형 증폭의 1주기는 하기 단계를 포함한다: 1) 변성, 즉, 이중 가닥 DNA를 개별적이거나 또는 개개의 단일 가닥 (예컨대, 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성된 이중 가닥 게놈 DNA의 각 카피)으로 변성시킬 수 있는 조건을 제공; 2) 어닐링, 즉 상보적 단일 가닥 DNA를 서로 것에 결합시킬 수 있는 (즉, 파형 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇몇의 개별 프라이머-결합 부위에 어닐링함) 조건을 제공함; 및 3) 연장, 즉 주형 DNA의 영역 상에서 프라이머 서열을 DNA 중합효소-유도 연장시킬 수 있는 (예컨대, 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체가 각각의 게놈 DNA 주형에 따라 프라이머-결합 부위에 결합한 각각의 몇몇 파형 프라이머로부터 연장됨) 조건을 제공함.
선형 증폭의 1주기 동안, 게놈 DNA의 온도는 게놈 DNA의 각 카피가 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성되도록 (예컨대, 95 내지 98 ℃로) 증가된다. 온도는 파형 프라이머가 각각의 변성된 게놈 DNA 주형의 길이에 따라 몇몇의 개별 프라이머-결합 부위에 결합하도록 후속적으로 (예컨대, 25 ℃로) 감소된다. 주기 중의 최종 단계인 각각의 결합된 파형 프라이머로부터의 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체의 연장은 ~72 ℃에서 중합효소, 예컨대 Taq 중합효소를 사용하여 수행된다. 이 최종 단계 후에, 주기는 반복된다. 다음 변성 단계 동안, 몇몇의 별개 핵산 중합체는 게놈 DNA 주형으로부터 변성되어, 단일 가닥 핵산 중합체가 되며, 여기서 각각의 단일 가닥 핵산 중합체는 단일 가닥 핵산 중합체가 연장된 파형 프라이머의 뉴클레오티드 서열, 이어서 파형 프라이머에 결합된 게놈 DNA 서열의 하류인 게놈 DNA 주형 영역 서열에 상보적인 별개 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 가진다. 각각의 단일 가닥 핵산 중합체가 파형 프라이머의 서열을 그의 5'-말단에서 포함하기 때문에, 각각의 단일 가닥 핵산 중합체는 또한 파형 프라이머의 비특이적 안정화 부분을 포함한다. 파형 프라이머의 비특이적 안정화 부분은 일반적으로 각각의 단일 가닥 핵산 중합체가 고차 구조를 형성하도록 안내하고, 증폭의 후속 주기에서 임의의 파형 프라이머에 대한 최근 연장된 단일 가닥 핵산 중합체의 결합을 차단한다.
파형 프라이머의 비특이적 안정화 부분의 결과로서, 단일 가닥 핵산 중합체는 증폭의 후속 주기에서 주형으로서 사용되지 않고, 각 주기의 증폭이 선형이다. 달리 말하면, 각 주기의 증폭은 유기체에 특이한 서열, 즉 프라이머-결합 부위에 결합된 파형 프라이머의 하류인 게놈 DNA 주형의 서열에 상보적인 서열을 함유한 각각의 몇몇 별개 단일 가닥 핵산 중합체의 단일 카피만을 생산한다. 따라서, PCR과 대조적으로, 파형-프로파일링 방법은 일반적으로 유기체에 특이한 서열을 함유한 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체를 기하급수적으로 증폭시키지 않는다.
각각의 단일 가닥 핵산 중합체는 프라이머-결합 부위에 결합된 파형 프라이머의 하류인 게놈 DNA 주형의 서열에 상보적인 염기 서열을 함유하기 때문에 상이한 게놈 DNA의 다중 부위 상에 존재하는 염기 서열 상의 차이들이 비교되어 구별될 수 있다. 상술한 바와 같이, 각각의 몇몇 별개 단일 가닥 핵산 중합체의 다중 카피는 서로 상호작용하여 하나 이상의 단일 가닥 별개 핵산 중합체를 함유하는 고차 구조, 즉 복합체 (예컨대, 삼중나선 및 사중나선)를 형성할 것이다. 고차 핵산 구조는 상이한 안정성을 가지고, 단일 가닥 핵산 중합체의 염기 서열에 따라, 즉 유기체의 특이한 게놈 정보를 기초로 한 상이한 융점 (Tm)에서 분리할 것이다.
파형 프로파일링은 일반적으로 특정 유기체의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 생산된 각종 상이한 고차 구조의 융점 (Tm)이 측정되고, 기록되는 것을 요구하는데; 이는 고차 DNA 구조 내로 개재되는 형광 제제, 즉 인터컬레이터의 사용에 의해 달성될 수 있다. 파형 프로파일링에 의해 생성된 고차 DNA 구조는 샘플의 온도 증가에 의해 분리될 수 있다. 고차 DNA 구조가 분리되기 때문에, 이들 고차 구조에 개재된 형광 제제도 분리될 것이다. 융점 분석은 증가 온도를 함수로서 이들 고차 구조의 분리에 의해 얻어진 형광 세기의 변화율을 플롯팅하고, 유기체의 게놈 DNA 및 사용되는 파형 프라이머에 특이한 파형을 생성하는데, 즉 상이한 Tm에서의 고차 DNA 구조의 분리가 유기체의 각각의 종 (또는 균주), 예컨대 박테리아에 대한 특징적 "파형 프로파일"을 생성하기 위해 관찰되고, 기록된다. 따라서, 파형 프로파일링은 각 유기체에 대한 특이한 파형 프로파일을 수득하기 위해 사용될 수 있고, 후속 융점 분석은 특이한 펴형 프로파일을 검출하고, 제1 유기체로부터 단리된 게놈 DNA와 제2 유기체로부터 단리된 게놈 DNA 간의 구별을 위해 사용될 수 있다.
당업자는 파형 프로파일을 생성하는 파형-프로파일링 방법을 수행하기 전에 유기체를 함유한 샘플을 수득하고, 게놈 DNA를 유기체를 함유한 샘플로부터 추출 단리하여야 한다는 것을 인식할 것이다. 샘플 수집, 및 게놈 DNA 추출 및 단리 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
(파형 프로파일링에 관련된) 상술된 방법이 선형 증폭에 의지되기 때문에 이 방법을 사용하는 것에 대한 어려움 중 하나는 검출 및/또는 분류될 특정 유기체 (예컨대, 박테리아)로부터의 게놈 DNA의 많은 개시량을 요구한다는 것이다. 그 결과, 파형-프로파일링 방법은 유기체가 주어진 샘플 내에 다수 (예컨대, 106 이상의 유기체)로 존재하는 경우에만 유기체의 검출 및 분류에 사용될 수 있지만, 매우 소수의 유기체를 검출 및/또는 분류하기에는 효과적이지 않다.
따라서, 파형-프로파일링 방법은 예컨대 오염 개시시에 급수 또는 공급원으로부터 취득한 샘플에서 소수로 존재하는 유기체의 검출 및/또는 분류에 일반적으로 유용하지 않다. PCR이 (PCR이 게놈 DNA를 기하급수적으로 증폭시키고, 소수로 존재하는 유기체를 검출할 수 있게 하기 때문에) 많은 개시 샘플을 요구하는 파형- 프로파일링 방법의 제한을 해결할 수 있지만, PCR 증폭으로부터 생성된 DNA의 상보적 이중 가닥 단편을 사용하여 생성된 파형 프로파일이 특정 게놈 서열의 분류에 충분하지 않다라는 것은 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 ["Goodbye DNA Chip, Hello Genopattern for 21st Century," printed and distributed by Adgene Co., Ltd.] 참조). 달리 말하면, 선행 기술은 기본 PCR 산물의 융점 (Tm) 분석을 사용하여 게놈 물질을 비교, 구별 및 분류할 수 없음을 명백히 교시하고 있다.
본 발명은 유기체가 검출 및 분류를 위한 샘플에 다수로 존재하여야 하는 요구를 극복하는 상술된 파형-프로파일링 방법에 대한 필요한 개선을 제공한다. 특히, 본 발명은 PCR의 변형된 형태가 도입될 수 있도록 파형-프로파일링 방법을 적합하게 업그레이드하는 신규한 개선을 제공한다. 당업자는 유기체가 소수로 존재하더라도, 예컨대 심지어 급수 또는 공급원의 오염 개시시에 샘플에 존재하는 유기체의 수로도 유기체의 검출 및 분류를 가능하게 할 것이라는 것을 인식할 것이다.
<발명의 요약>
본 발명의 목적 중 하나는 소수로 존재할 수 있는 유기체의 검출 및 분류 방법을 제공하여 예컨대 급수와 관련된 초기 안전 및 품질 보증이 더 정확하게 제공될 수 있게 하는 것이다. 이와 같이, 본 발명은 단일 게놈 프로파일링 (SGP)으로 본원에 개괄적으로 나타내는 개선된 방법을 제공한다.
SGP는 몇몇의 별개 "SGP 핵산 중합체"의 증폭을 위해 프라이머 ("SGP 프라이머")의 사용을 요구한다. SGP 프라이머는 그의 길이 및 게놈 DNA의 길이에 따라 몇몇의 개별 부위에 특이적으로 결합하는 능력에 의해 특성화된다. SGP 프라이머가 비특이적 안정화 부분을 포함하지 않기 때문에, (예컨대, 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇몇의 개별 SGP 프라이머-결합 부위에 결합된 본 발명의 SGP 프라이머로부터 연장된) SGP 핵산 중합체는 후속 증폭 반응에서 SGP 프라이머에 대한 결합에 자유롭다. SGP 프라이머가 단일 가닥 SGP 핵산 중합체의 길이에 따라 상보적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, SGP 프라이머는 또한 전방향 및 역방향 프라이머 (PCR의 변형 형태, 즉 "mPCR" 중에서) 모두와 같이 기능하여 몇몇의 별개 "SGP-SGP 핵산 중합체"의 증폭을 가능하게 하며, 여기서 "SGP-SGP 핵산 중합체"는 각각 SGP 프라이머-결합 부위에 의해 프래키팅된 게놈 DNA의 몇몇 영역 중 하나의 서열과 동일한 뉴클레오티드서열을 포함하는데, 즉 각각의 SGP-SGP 핵산 중합체 서열은 그의 5'-말단에서 SGP 프라이머의 서열 및 그의 3'-말단에서 SGP 프라이머의 역 상보적 서열을 가진다. 그 결과, SGP 프라이머의 뉴클레오티드 서열 및 SGP 프라이머의 역 상보적 서열을 포함하는 몇몇의 별개 SGP-SGP 핵산 중합체의 증폭은 기하급수적 (비선형) 방식으로 일어나고, 유기체가 소수로 존재하는 경우에 조차도 본 발명을 사용하여 유기체의 게놈 DNA를 검출 및 분류할 수 있게 한다. 당업자는 RNA-기초 게놈 (예컨대, 레트로바이러스의 게놈)에 대해 본 발명을 실행하는 경우에, 역전사 반응이 SGP 및 관련 mPCR 주기의 개시 전에 수행되어야 한다는 것을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 최종 증폭 주기와 관련된 "절반 시간 연장 단계"를 제공한다. 본 발명에서, 최종 증폭 주기와 관련된 연장 단계에 대한 기간은 최종 증폭 주기 중의 "절반 시간" 연장 단계를 유발하는 시간의 감소 (바람직하게는 기간의 감소는 약 40 내지 60%이거나; 더 바람직하게는 기간의 감소는 약 50%임)를 포함한다. 이러한 절반 시간 연장 단계는 전형적으로 다수의 SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭을 제거할 것이며, 이는 SGP 프라이머로부터 SGP 프라이머의 역 상보체로의 핵산 중합체의 연장이 불충분할 것이기 때문이다. 따라서, SGP 핵산 중합체의 단축된 형태 ("단축된 SGP 핵산 중합체")는 절반 시간 단계에서 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 생성될 것이다. 당업자는 PCR의 변형 형태, 즉 mPCR을 사용하는 몇몇 주기의 기하급수적 증폭에 이어서 절반 시간 연장 단계를 수행함으로써, 단축된 SGP 핵산 중합체 각각의 다수 카피가 생산될 것이라는 것을 인식할 것이다. 또한, 후속 변성 단계 동안, 단축된 SGP 핵산 중합체는 단일 가닥이 될 것이다. 최종적으로, 단축된 단일 가닥 SGP 핵산 중합체는 mPCR을 사용하는 본 발명의 실행에서 검출되는 고차 구조를 형성한다.
본 발명은 또한 개선된 방법에 사용되는 프라이머, 및 이들 프라이머를 제조하는 방법, 뿐만 아니라 기하급수적 증폭을 사용하고 파형-프로파일링 방법의 변동성을 저하시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 SGP 프라이머는 서열 51로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 SGP 프라이머는 서열 52로 나타낸 뉴클레오티드 서열을 가진다.
한 실시양태에서, 본 발명은 파형 프로파일링의 개선된 방법을 제공하며, 여기서 개선은 SGP 프라이머의 사용을 포함한다. 당업자는 SGP 프라이머의 사용이 mPCR을 달성할 것이라는 것을 인식할 것이다. 이와 같이, 본 발명은 DNA를 제1 혼 합물과 혼합하여 증폭 혼합물을 형성시키며, 여기서 제1 혼합물이 다중 카피의 SGP 프라이머 및 다른 증폭제를 적절한 농도로 포함하는 것인 단계; 증폭 혼합물을 제1 기간 동안 변성시키는 단계; 증폭 혼합물을 제2 기간 동안 어닐링시키는 단계; 증폭 혼합물을 제3 기간 동안 연장시키는 단계; 및 변성, 어닐링, 및 연장의 단계를 1회 이상 반복하는 단계를 포함하는, DNA의 기하급수적 증폭 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 개선은 추가로 절반 시간 연장의 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, SGP 프라이머는 서열 51로 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 서열 52로 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 가진다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 임의의 단계에서 검출가능 제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 개선된 파형-프로파일링 방법을 샘플 중의 유기체의 존재 또는 부재의 검출, 예컨대 이를 결정하기 위해 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 샘플 획득 단계; 샘플 추출 단계; 제1 혼합물을 샘플에 도입하여 증폭 혼합물을 형성시키며, 여기서 제1 혼합물이 다중 카피의 SGP 프라이머 및 다른 증폭제를 적절한 농도로 포함하는 것인 단계; 증폭 혼합물을 제1 온도에서 제1 기간 동안 변성시키는 단계; 증폭 혼합물을 제2 온도에서 제2 기간 동안 어닐링시키는 단계; 증폭 혼합물을 제3 온도에서 제3 기간 동안 연장시키는 단계; 변성, 어닐링, 및 연장의 단계를 1회 이상 반복하는 단계; 변성 및 어닐링의 단계를 반복하는 단계; 증폭 혼합물을 제4 온도에서 제3 기간의 약 40 내지 60%인 제4 기간 동안 연장시키는 단계; 증폭 혼합물을 냉각시킴으로써 고차 구조가 형성되게 하는 단계; 및 고차 구조의 부재 또는 존재를 검출하며, 여기서 고차 구조의 존재는 유기체의 존재를 측정하는 것인 단계를 포함하는, 샘플 중의 유기체의 측정 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 제4 온도는 제3 기간의 약 50%인 제4 기간 동안 유지한다. 또다른 실시양태에서, 전장 연장을 포함하는 단계의 회수가 20-50회, 예컨대, 20-25, 26-29, 30-40, 41-50회이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 절반 시간 연장 단계(들)은 고차 구조의 형성을 허용하기 전에 1회 이상 반복된다. 또한, 유기체의 존재를 측정하는 것은 유기체의 분류를 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제3 및 제4 온도는 동일한 온도이다. 또한, 본 발명은 임의의 단계에서 검출가능 제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 샘플 중의 유기체를 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에서 검출 단계는 융점 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
도 1 : 파형-프로파일링 방법 및 단일 게놈 프로파일링 방법의 단계를 나타내는 흐름도 및 그로부터 생성된 핵산 중합체.
도 2: 이론상 게놈 DNA의 뉴클레오티드 서열.
도 3: 각각의 변성된 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 프라이머-결합 부위에 어닐링된 이론상 프라이머를 갖는 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성된 도 2의 게놈 DNA를 나타내고, 화살표는 SGP 핵산 중합체가 유래될 각각의 게놈 DNA의 영역 상에서 SGP 프라이머 서열의 연장을 나타낸다.
도 4: 게놈 DNA 및 도 3의 프라이머를 사용하여 생성될 SGP 핵산 중합체 각각의 서열.
도 5: 도 4의 SGP 핵산 중합체의 mPCR 증폭 후에 생성될 SGP-SGP 핵산 중합체 각각의 서열.
도 6: 도 5의 SGP-SGP 핵산 중합체가 절반 시간 연장 단계로 처리된 후에 생성될 SGP-SGP 핵산 중합체 (밑줄 없음) 및 단축된 SGP 핵산 중합체 (밑줄 있음)의 서열.
도 7: SGP-SGP 핵산 중합체의 별개 패턴 (레인 1-10)이 SGP 프라이머 DJB7 (도 7A) 또는 SGP 프라이머 DJB8 (도 7B)를 사용하는 4종의 상이한 박테리아 게놈 DNA 표적 (레인 1-8) 및 인간 게놈 DNA 표적 (레인 9 및 10)에 대해 나타난다. 분자량 래더(ladder) (레인 M)는 1% 아가로스 겔 상에서 크기에 의해 정선된 DNA 분자의 분리를 나타낸다.
본 발명은 유기체의 측정 및/또는 분류의 선행기술 방법에 대한 개선을 제공한다. 본 발명에서는, 다수의 유기체를 함유하는 샘플을 제공할 필요가 없다. 특히, 본 발명은 파형 프로파일링 방법에 대한 개선을 제공한다. 파형-프로파일링 방법에 대한 개선은 PCR의 변형 형태, 즉 DNA의 기하급수적 증폭을 달성하는 개선된 프라이머를 포함한다. 파형-프로파일링 방법에 대한 개선도 PCR의 변형 형태 (즉, mPCR)에 의해 형성되는 핵산 중합체의 서브세트로부터 유도된 단축된 단일 가닥 핵산 중합체 세트의 생성을 허용하는 증폭 절차 중에 절반 시간 연장 단계를 또한 포함한다. 파형-프로파일링 방법의 개선은 유기체가 소수로, 예컨대 급수의 오염 개시에서 샘플에 존재하는 유기체의 수로 존재하는 경우 조차도 유기체의 검출 및/또는 분류를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 공기, 먼지, 물, 혈액, 조직, 식물, 및 식료품을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유기체로 오염될 수 있는 다수 공급원 (예컨대, 환경적 및 의학적 공급원)과 관련된 품질 보증을 제공하는 것을 조력할 개선된 파형-프로파일링 방법을 제공한다. 당업자는 본 발명이 단일 게놈의 부분의 증폭, 또는 단일 게놈의 검출에 반하는 소수의 게놈의 증폭에 관련된다는 것을 인식할 것이며, 검출은 단일 게놈의 부분, 또는 소수의 게놈의 증폭 후에 수행된다.
단일 게놈 프로파일링 (SGP)은 파형-프로파일링 방법에 대한 개선을 제공함으로써 유기체가 소수로 존재하는 경우 조차도 유기체로부터의 게놈 DNA의 분석 및 프로파일링을 가능하게 한다. 이들 개선은 신규 프라이머, ("SGP 프라이머") 및 중합효소 연쇄 반응의 변형 형태 (mPCR)를 포함한다. SGP는 추가적으로 최종 "절반 시간 연장 단계"를 제공한다. 이들 개선은 SGP (즉, SGP 프라이머, mPCR, 및 절반 시간 연장 단계를 사용하는 방법)가 SGP 프라이머의 서열, 이어서 게놈 DNA 주형의 몇몇 별개 영역 중 하나에 상보체를 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 별개 핵산 중합체 ("SGP 핵산 중합체")를 생산할 수 있게 한다. 특히, SGP는 생산된 SGP 핵산 중합체, SGP 프라이머, 및 mPCR을 사용하여 SGP 프라이머의 서열, 게놈 DNA 주형의 몇몇 개별 영역 중 하나의 서열과 동일한 서열, 이어서 SGP 프라이머의 역 상보체를 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 "SGP-SGP 핵산 중합체"를 기하급수적으로 증폭시킨다. SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭 후에, SGP는 신규 절반 시간 연장 단계를 도입하여 SGP 핵산 중합체의 단축된 형태 즉, 고차 구조를 형성할 "단축된 SGP 핵산 중합체"를 생산할 수 있다. 유기체의 게놈 DNA가 초기 주형으로서 사용되기 때문에, SGP 핵산 중합체 및 SGP-SGP 핵산 중합체는 유기체에 특이한 서열을 포함할 것이다. 동일한 이유로, 생성된 SGP-SGP 핵산 중합체가 절반 시간 연장 단계 동안 단축된 SGP 핵산 중합체의 생산에 사용되기 때문에, 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체는 유기체에 특이한 서열을 함유할 것이다. 이와 같이, 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체는 유기체에 특이한 서열을 기초로 하는 고차 구조를 형성한다. 따라서, 단일 가닥 단축 핵산 중합체에 의해 형성된 고차 구조의 세트는 유기체에 특이하다. 그 결과, 형성된 상이한 고차 구조의 검출은 유기체의 검출 및/또는 분류를 가능하게 하며; 이러한 검출은 예를 들어 형광 인터컬레이터를 사용하여 달성될 수 있다.
A. 단일 게놈 프로파일링의 변형된 PCR (mPCR)
다수의 SGP 핵산 중합체, 및 그 결과, 다수의 SGP-SGP 핵산 중합체 및 단축된 SGP 핵산 중합체는 본 발명의 변형된 PCR (mPCR)을 사용하여 생산될 수 있다. 이들 중합체 각각이 5'-말단에서의 SGP 프라이머로부터 유래되고, 이를 함유하기 때문에, SGP 프라이머의 다수의 카피는 SGP에서 mPCR의 제1 주기 전에 목적하는 게놈 DNA를 함유한 용액에 첨가하여야 한다. 당업자는 물질 (예컨대, 증폭제) 및 mPCR의 조건이 잘 공지된 증폭제 및 PCR의 조건과 유사하다는 것을 인식할 것이다. 다수의 카피의 프라이머 쌍 및 DNA 주형(들) 외에 PCR에 첨가될 예를 들어 증폭제, 예컨대, 중합효소, dNTP 반응 완충액 등의 적절한 농도는 인터컬레이터의 적절한 농도와 같이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 증폭제, 예컨대 SGP 프라이머, 뉴클레오티드 (즉, dNTP), DNA 중합효소, 반응 완충액, 및/또는 마그네슘 (mPCR의 제1 주기 전에 첨가되어야 함)의 농도 및 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
SGP는 mPCR의 단계를 포함하기 때문에 이례적으로 소량으로 존재하는 유기체의 게놈 DNA를 분석할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 단일 유기체의 게놈 DNA는 검출을 위해 고차 구조와 관련된 충분한 양의 단축된 단일 가닥 핵산 중합체를 위한 공급원 주형을 제공할 수 있다. 이는 SGP의 mPCR 단계가 통상적 PCR과 다소 유사한 방식으로 특정 SGP 핵산 중합체에 결합하여 증폭시키는 SGP 프라이머의 능력에 의해 SGP-SGP 핵산 중합체를 기하급수적 증폭시키기 때문이다. 그러나, 통상적 PCR에 비해 2개의 두드러진 차이가 있다. 첫번째, mPCR 단계는 전방향 및 역방향 프라이머 모두로서 작용할 수 있는 단지 하나의 프라이머인 SGP 프라이머만을 사용한다. 대조적으로, 통상적 PCR은 2개의 별개 프라이머인 (1) 전방향 프라이머, 및 (2) 전방향 프라이머의 서열과 상이한 서열을 갖는 역방향 프라이머를 사용한다.
두번째, 통상적 PCR은 게놈 DNA의 단일 영역을 증폭하는 2개의 프라이머를 사용하는 반면, mPCR은 SGP 프라이머와 동일한 서열 및 SGP 프라이머에 상보적인 서열, 즉 "SGP 프라이머-결합 부위"에 의해 각각 브래키팅되는 게놈 DNA의 몇몇 별개 영역을 증폭하는 하나의 프라이머를 사용한다. 게놈 DNA의 몇몇 별개 영역을 증폭하는 SGP에서의 mPCR의 능력은 전방향 및 역방향 프라이머로서 작용할 수 있는 하나의 SGP 프라이머의 사용에 의한 것이다. SGP 프라이머의 이 특성은 발생되는 하기 2개의 중요한 현상을 가능하게 하는 그의 길이의 기능이다: (1) SGP 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 대한 몇몇의 개별 SGP 프라이머-결합 부위에 결합하는 것, 및 (2) SGP 프라이머가 SGP 프라이머 서열 및 SGP 프라이머의 역 상보적 서열을 그의 별개 뉴클레오티드 서열 내에서 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 갖는 SGP 핵산 중합체 (1 주기 이상의 mPCR에 의해 생산됨)에 결합하는 것. SGP 핵산 중합체 내의 역 상보적 서열의 존재 및 SGP 프라이머의 후속 결합은 몇몇의 별개 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체의 PCR-유사 (즉, mPCR) 기하급수적 증폭, 즉, SGP 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅되는 이중 가닥 게놈 DNA의 몇몇의 별개 영역의 기하급수적 증폭을 가능하게 한다.
하기에 상세히 기재되는 SGP 프라이머는 파형 프라이머를 갖는 일부 유사한 특징을 공유하며, 여기서 파형 프라이머는 예컨대 일본 특허 출원 공개 제2003-334082호 및 제2003-180351호에 상세히 기재되어 있다. SGP 프라이머는 SGP에 필수적이고, 그의 길이에 의해 특성화된다. 프라이머의 감소된 길이는 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 길이에 따라 몇몇의 개별 부위에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 감소된 길이는 또한 SGP 핵산 중합체가 SGP 프라이머 서열의 역 상보체를 그의 별개 뉴클레오티드 서열 내에 포함하는 5'- 내지 -3' 서열을 가질 확률을 증가시킬 수 있게 하기 때문에 SGP 프라이머의 길이는 중요하다.
SGP 프라이머의 독특한 특징은 SGP 프라이머가 제1 주기 후에 mPCR의 각각의 주기 동안 특정 SGP 핵산 중합체로부터 SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적, 즉 비선형 증폭을 유발하는 SGP 방법에 사용될 수 있게 한다. SGP 중의 mPCR의 제1 주기는 하기 단계로 이루어진다: 1) 게놈 DNA의 카피 각각을 2개의 단일 가닥 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 단계, 2) SGP 프라이머를 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇몇의 개별 SGP 프라이머-결합 부위에 어닐링시키는 단계, 및 3) 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 개별 SGP 프라이머-결합 부위에 결합된 각각의 몇몇 SGP 프라이머로부터 SGP 핵산 중합체를 연장시키며, 여기서 각각의 SGP 핵산 중합체는 SGP 핵산 중합체가 연장된 결합된 SGP 프라이머, 이어서 결합된 SGP 프라이머의 게놈 DNA 주형 하류의 서열에 상보적인 별개 뉴클레오티드 서열을 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 단계.
당업자는 연장 단계의 "전체 시간" 기간이 SGP 핵산 중합체의 길이를 결정하고, 따라서 1 주기에서 생산된 SGP 핵산 중합체가 별개 뉴클레오티드 서열을 가지지만, 대략적으로 동일한 길이일 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, SGP 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 103개 부위에 어닐링되도록 디자인되고, 연장 단계의 시기가 대략 길이 1 kb의 SGP 핵산 중합체를 생산하도록 조정된다고 가정하면, SGP 증폭의 1 주기는 1 주형 당 103개 별개 SGP 핵산 중합체를 생산할 것이며, 여기서 이들 각각은 대략적으로 1 kb 길이일 것이다. 물론, 프라이머가 어닐링하는 1개의 SGP 프라이머-결합 부위가 게놈 DNA 주형의 3'-말단으로부터 1 kb 미만인 경우에, 그 부위에 결합된 SGP 프라이머로부터의 연장은 1 kb 미만의 SGP 핵산 중합체를 생산할 것이다. 또한, SGP 프라이머-결합 부위 (예컨대, 부위 "B")가 또다른 SGP 프라이머-결합 부위 (예컨대, 부위 "A")의 1 kb 하류 내에 있는 경우에, 1 kb 미만의 SGP 핵산 중합체가 부위 A에 결합된 SGP 프라이머로부터 생산될 것이다.
SGP에서, mPCR의 주기는 1회 이상, 예컨대, 10-100회 반복될 수 있다. 각 주기의 변성 단계 동안, SGP 핵산 중합체는 단일 가닥이 될 것인데, 즉 SGP 핵산 중합체는 게놈 DNA 주형에 더 이상 결합하지 않을 것이다. SGP 프라이머의 역 상보체를 그의 별개 뉴클레오티드 서열 내에 포함하는 5'- 내지 -3' 뉴클레오티드 서열을 갖는 특정 SGP 핵산 중합체가 SGP 프라이머에 의해 결합하기 쉬운 채 있는데, 즉, 이들 특정 SGP 핵산 중합체가 고차 구조를 형성하지 않는 것은 mPCR의 후속 주기 중의 어닐링 단계 동안 SGP에서 중요하다. SGP 핵산 중합체가 고차 구조의 부분으로서 또는 SGP 프라이머에 결합하는 것은 몇몇의 인자, 예컨대 어닐링 온도, SGP 핵산 중합체 및 SGP 프라이머의 길이, 및 반응 혼합물 중의 SGP 핵산 중합체 및 SGP 프라이머의 농도에 따라 변한다. 그 결과, 예컨대 SGP 프라이머의 농도를 증가시키는 것에 의해 mPCR의 어닐링 단계를 조작하는 것은 SGP 핵산 중합체를 포함하는 고차 구조의 형성을 차단하는 것을 조력할 수 있다. 그러나, 이들 잘 공지된 인자를 조정하는 것이 본 발명의 실행을 조력할 수 있는 반면, 이러한 조정은 SGP 핵산 중합체 안정성의 인자가 SGP 프라이머의 디자인에 초점이 맞추어 있기 때문에 전적으로 요구되지 않는다. 하기 기재되는 바와 같이, SGP 프라이머가 비특이적 안정화 부분 없이 디자인되고, 따라서 SGP 프라이머의 서열을 그의 5'-말단에서 각각 갖는 SGP 핵산 중합체는 안정하지 않을 것인데, 즉 프라이머에 쉽게 결합하는 경향이 있을 것이다. 그 결과, SGP 프라이머 서열, 이어서 SGP 프라이머 서열의 역 상보체를 그의 별개 뉴클레오티드 서열 내에 포함하는 5'- 내지 -3' 서열을 갖는 특정 SGP 핵산 중합체는 바람직하게는 SGP 프라이머에 임의의 고차 구조의 형성 전에 결합할 것이다.
SGP 프라이머가 SGP 프라이머 서열, 이어서 SGP 프라이머 서열의 역 상보체를 그의 별개 뉴클레오티드 서열 내에 포함하는 5'- 내지 -3' 서열을 갖는 특정 SGP 핵산 중합체에 결합하는 것은 제1 주기에 이어 SGP mPCR 증폭 주기를 달성한다. SGP 핵산 중합체 상의 그의 상보체에 결합하는 SGP 프라이머는 5'-말단에서 SGP 프라이머와 동일한 5'- 내지 -3' 서열에 의해 3'-말단에서 SGP 프라이머의 역 상보체인 5'- 내지 -3' 서열에 의해 플랭킹되는 게놈 DNA 주형의 몇몇 개별 영역 중 하나의 서열과 동일한 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 각각 갖는 SGP-SGP 핵산 중합체를 생성하는 PCR-유사 반응을 촉진한다. 따라서, 각각의 SGP-SGP 핵산 중합체가 그의 3'-말단에서 SGP 프라이머에 상보적인 5'- 내지 -3' 서열을 가지기 때문에, 각각의 SGP-SGP 핵산 중합체는 또한 후속 mPCR 주기의 어닐링 단계에서 고차 구조의 형성 전에 SGP 프라이머에 의해 결합될 것이다. 그 결과, mPCR의 후속 주기는 SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭을 포함할 것이다.
당업자는 모든 SGP 핵산 중합체가 SGP 프라이머 서열을 5'-말단에서 포함할 것이지만; SGP 핵산 중합체의 단지 특정 백분율만이 또한 SGP 프라이머 서열의 역 상보적 서열을 그의 5'- 내지 -3' 별개 뉴클레오티드 서열 내에 포함할 것이라는 것을 인식할 것이다. SGP-SGP 핵산 증폭에 관여하는 특정 SGP 핵산 중합체의 백분율은 몇몇의 용이하게 결정된 인자, 예컨대 mPCR의 "전체 시간 연장 단계"에 사용되는 "전체 시간" 길이, 및 SGP 프라이머의 디자인에 따라 달라진다. 예를 들어, 잠재적 SGP 핵산 중합체는 5'-말단로부터 하류로 대략적으로 750개 염기 (0.75 kb)인 SGP 프라이머 서열의 역 상보체를 가질 수 있다. 이 예에서, 상기와 같이, mPCR의 전체 시간 연장 단계가 1 kb SGP 핵산 중합체를 생산하게 설정되는 경우에, 후속 mPCR 주기는 그 750-염기 (0.75 kb) 영역, 즉 원본 1 kb SGP 핵산 중합체가 유도된 이중 가닥 게놈 DNA의 영역의 부분과 동일한 서열을 갖는 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체의 mPCR 기하급수적 증폭을 개시할 것이다. 이 기하급수적 증폭은 또한 SGP 프라이머의 역 상보체를 그의 5'-말단의 1 kb 하류 내에 함유하는 5'- 내지 -3' 서열을 갖는 임의의 다른 단일 가닥 SGP 핵산 중합체에 대한 게놈 중의 다른 위치에서 발생될 것이다. 그 결과, 전장 연장 시간을 증가시키는 것은 SGP 핵산 중합체가 하나 이상의 SGP 프라이머-결합 부위를 그의 뉴클레오티드 서열 내에서 포함할 확률을 증가시킬 것이다. 그 반대도 또한 일치하는데; 전장 연장 시간을 감소시키는 것은 SGP 핵산 중합체가 하나 이상의 SGP 프라이머-결합 부위를 그의 하류 서열 내에서 포함할 확률을 감소시킬 것이다.
SGP 프라이머-결합 부위를 그의 서열 내에 포함하는 SGP 핵산 중합체의 백분율은 예컨대 100개 SGP 핵산 중합체 중의 1개 (즉, 10-2)가 SGP 프라이머-결합 부위를 그 서열 내에 함유하도록 프라이머의 디자인(프라이머의 디자인의 자세한 설명은 하기에 제공됨)에 의해 조작될 수도 있다. 이러한 예에서, 상기와 같이 SGP 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 103개 부위에 어닐링될 수 있다고 가정하면, 2 x 103개 상이한 SGP 핵산 중합체가 각각의 유기체에 대해 생산되고 (즉, 1 주형 당 1 x 103개 SGP 핵산 중합체 x 1 유기체 당 2개 주형), 대략적으로 20개 별개 SGP-SGP 핵산 중합체가 증폭될 것이다. 물론, 프라이머가 초기에 결합하는 부위에 상대적인 역 상보체의 위치는 기하급수적으로 증폭될 각각의 SGP-SGP 핵산 중합체의 길이를 결정할 것이다. 또한, 임의의 PCR-유사 절차에서와 같이, 본 발명의 SGP-SGP 핵산의 기하급수적 증폭은 변성 (SGP 프라이머에 대한 어닐링에 이용될 수 있는 단일 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체를 생산함), SGP 프라이머의 어닐링 (연장의 다음 주기를 설정함), 및 연장 (증폭의 다음 주기에서 증폭될 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체를 생산함)을 포함하는 mPCR 주기를 통해 일어난다.
B. 절반 시간 연장 단계
상기 기재한 바와 같이, SGP에서 파형-프로파일링 방법의 최종 목적으로 제공되는 파형 분석은 게놈의 특이성을 나타내는 몇몇의 별개 단일 가닥 핵산 중합체의 존재를 요구하는데; 이들 핵산 중합체는 인터컬레이터와 조합되어 후속적으로 검출될 수 있는 고차 구조를 형성한다.
SGP에서, 검출가능한 고차 구조는 1) SGP-SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭이 전체 시간 연장 단계를 사용하는 mPCR의 몇몇의 주기를 통해 달성되고, 2) SGP-SGP 핵산 중합체로부터의 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체가 절반 시간 연장 단계의 도입을 통해 생산된 후까지 형성되지 않는다. 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체의 생산 전에, SGP-SGP 핵산 중합체가 이중 가닥일 것이고, 통상적 수단, 예컨대 에티듐 브로마이드로 염색되는 전기영동, 융점 분석 등을 통해 검출될 수 있다. 그러나, 고차 구조의 생성의 경우에, 본 발명은 각각의 단축된 SGP 핵산 중합체의 몇몇 카피를 생산하기 위해 증폭의 "절반 시간" 주기를 mPCR 절차 내로 도입될 수 있게 한다 (충분한 mPCR 주기가 기하급수적으로 증폭된 중합체의 충분한 카피를 생산한 후에; 예컨대, 106 내지 107 카피). 달리 말하면, 시간을 예컨대 이 mPCR 주기에 대한 연장 단계의 40 내지 60%까지 감소시킴으로써 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유도된 핵산 중합체의 서브세트는 길이가 감소되는데, 즉 단축된 SGP 핵산 중합체이다. 단축된 SGP 핵산 중합체가 프라이머 서열의 역 상보체를 중합체의 3'-말단 상에 더 이상 함유하지 않을 것이기 때문에, 단축된 SGP 핵산 중합체는 기하급수적으로 증폭될 수 없는데; 즉, 이들은 단일 가닥으로 남을 것이고, 그 결과 검출될 수 있는 고차 구조를 형성할 것이다.
SGP 프라이머의 역 상보체와 동일한 5'- 내지 -3' 서열을 포함하지 않는 SGP 핵산 중합체 (즉, 단축되지 않은 SGP 핵산 중합체)가 프라이머에 mPCR 증폭의 임의의 주기 동안 결합하지 않고, 따라서 고차 구조를 형성할 수도 있다는 것이 주시되어야 한다. 그러나, 하기에 설명하는 바와 같이, 하나의 절반 시간 연장 단계는 각각의 별개 단축 SGP 핵산 중합체의 몇몇 카피를 생산한다 (이는 이들이 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유도되기 때문임). 대조적으로, SGP 프라이머-결합 부위를 포함하는 서열을 갖지 않는 SGP 핵산 중합체는 상대적으로 적은 개시량의 게놈 DNA로부터 단지 선형적으로 증폭된다. 그 결과, 고차 구조의 형성에 대한 이러한 SGP 핵산 중합체의 기여도는 고차 구조에 대한 단축된 SGP 핵산 중합체의 기여도에 비해 미미하다.
SGP로 생성된 고차 구조는 절반 시간 연장 단계의 도입에 의해 생성된 대부분 단축된 SGP 핵산 중합체를 함유할 것이다. 예를 들어, 상기에서와 같이, SGP 프라이머가 예컨대 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 대략 103개 부위에 어닐링할 수 있다고 가정하면, 제1 주기로부터의 SGP 핵산 중합체의 총수가 예를 들어 게놈 DNA의 1카피 당 (즉, 유기체 당) 대략적으로 2 x 103의 SGP 핵산 중합체일 수 있다. 또한, 다시 상기에서와 같이, 프라이머가 100개 SGP 핵산 중합체 중의 1개가 SGP 프라이머-결합 부위를 그의 서열 내에 포함하는 서열을 가지도록 디자인된다고 가정하면, 대략적으로 20개 SGP-SGP 핵산 중합체 (여기서, 이들 각각은 SGP 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅되는 게놈 DNA 주형의 몇몇의 별개 영역 중 하나와 동일함)는 mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되어 상대적으로 다수의 SGP-SGP 핵산 중합체의 카피 (단일 게놈 DNA로 개시하는 경우에 22-24 mPCR 주기 후에 대략적으로 106-107 카피)를 생산할 것이다. 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 수, 및 그 결과 그로부터 유도된 단축된 SGP 핵산 중합체의 수는 증폭의 주기가 진행되기 때문에 선형 증폭에 의해 연속적으로 생산될 SGP 핵산 중합체의 수를 작게 할 것이다.
당업자는 SGP에 의해 생산되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 잠재적 총수가 게놈의 크기 및 프라이머 길이와 관련된다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 증폭의 제1 주기에서 생산되는 SGP 핵산 중합체의 바람직한 수는 절반 시간 연장 단계 동안 단축된 SGP 핵산 중합체를 생산할 수 있는 SGP-SGP 핵산 중합체의 목적하는 수 (즉, 고차 구조의 형성에 사용될 수 있는 단축된 SGP 핵산 중합체의 목적하는 수)의 함수로서 측정될 수 있다. 이러한 측정은 추가로 하기에 상세히 기재하는 바와 같은 본 발명의 SGP 프라이머의 디자인에 도움이 될 것이다.
고차 구조의 형성에 사용될 수 있는 단축된 SGP 핵산 중합체의 목적하는 수를 결정하는 데 있어서, 당업자는 mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 서브세트만이 단축된 SGP 핵산 중합체의 생산에 사용되는데; 이러한 서브세트는 절반 시간 연장 단계에서 완전히 연정될 수 없는 더 긴 SGP-SGP 핵산 중합체를 포함한다는 것을 인식할 것이다. mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 서열이 프라이머의 역 상보체의 뉴클레오티드 서열을 3'-말단에서 포함하기 때문에, 전체 시간 연장 단계는 SGP-SGP 핵산 중합체의 이 서브세트에 대한 연장을 완료하기 위해 필요하고, 절반 시간 연장 단계는 단축된 SGP 핵산 중합체, 즉 프라이머의 역 상보체를 3'-말단에서 포함하지 않는 핵산 중합체를 생산할 것이다. 그 반면, mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 일부는 이들 더 긴 SGP-SGP 핵산 중합체보다 상당히 짧다. 절반 시간 연장 단계에 할당된 시간에 완전히 연장하는 이러한 SGP-SGP 핵산 중합체는 mPCR의 임의의 후속 주기에서 연속적 및 기하급수적으로 증폭될 것인데; 하기 기재하는 바와 같이, 이들 SGP-SGP 핵산 중합체는 일반적으로 고차 구조의 일부가 되지 않을 것이다. mPCR로 기하급적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 길이 내에 SGP 프라이머 역 상보체의 랜덤 위치 때문에, 절반 시간 연장 단계의 도입은 단축된 SGP 핵산 중합체를 생산하기 위해 사용되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 대략 절반을 생산할 것이다.
대략적으로 50%의 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체는 SGP 프라이머-결합 부위를 절반 시간 연장 단계에 의해 연장된 부분 내에 함유하지 않을 것이고, 따라서 단축된 SGP 핵산 중합체의 생산에 관여할 것이다. 단축된 SGP 핵산 중합체가 추가 mPCR 주기 동안 SGP 프라이머에 결합할 수 있는 서열을 포함하지 않을 것이기 때문에, 이들은 고차 구조를 형성할 것이다. mPCR에 의해 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 다른 대략 50%는 SGP 프라이머-결합 부위를 여전히 함유할 것이다. 또한, 이중 가닥 SGP-SGP 중합체를 생산하는 상보적 서열과의 SGP-SGP 중합체의 어닐링이 안정하고, 신속히 일어나는 경향이 있기 때문에, SGP-SGP 핵산 중합체는 일반적으로 고차 구조의 형성에 사용되지 않을 것이다.
예를 들어, 길이 9개 염기의 SGP 프라이머가 7,000 부위에 어닐링할 수 있고, 생성된 SGP 핵산 중합체가 길이 2,000개 염기로 연장될 수 있다고 가정하면, 게놈 DNA의 1.4 x lO7개 염기, 즉 예컨대, 길이 2 x 109개 염기의 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 1/142가 SGP 핵산 중합체로서 카피될 것이다. SGP에서, 이들 7,000개 SGP 핵산 중합체 중 대략적으로 50 내지 70개가 SGP 프라이머-결합 부위를 포함할 것이다 (상기와 같이, SGP 프라이머는 100개 SGP 핵산 중합체 중에 대략적으로 1개가 SGP 프라이머-결합 부위를 함유하도록 디자인된다고 가정함). 이들 대략 50 내지 70개 SGP 핵산 중합체는 SGP의 mPCR 단계(들) 동안 기하급수적으로 증폭될 SGP-SGP 핵산 중합체를 효과적으로 생산할 것이다. mPCR의 22 내지 24 주기 후 및 절반 시간 연장 단계 후에, 대략적으로 25-35개 별개 단축 SGP 핵산 중합체 (이들은 고차 구조를 형성할 것임) 중 몇몇의 카피 (예컨대, 106 내지 107)는 기하급수적으로 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 생성되는 것으로 예상된다. 따라서, 절반 시간 연장 단계는 고차 구조의 형성을 위한 단축된 SGP 핵산 중합체를 생산하고, 또한 상이한 길이의 SGP-SGP 핵산 중합체들을 구별한다.
추가 예로서, SGP에서 전체 시간 mPCR 주기 동안 기하급수적으로 증폭되는 몇몇의 SGP-SGP 중합체 중에 1 kb, 0.8 kb, 0.6 kb, 0.4 kb, 및 0.2 kb의 SGP-SGP 핵산 중합체가 있고; 또한 이들 반복적 mPCR 주기 중에 연장 단계의 시기가 1 kb 중합체 연장에 마침 충분한 것으로 가정한다. 후속 "절반 시간" 연장 단계 동안, 생성된 중합체는 각각 대략적으로 0.5 kb, 0.5 kb, 0.5 kb, 0.4 kb 및 0.2 kb일 것이다. 이 mPCR 주기가 진행하고, DNA의 새롭게 연장된 중합체가 그들의 개개의 상보적 주형 가닥으로부터 변성되기 때문에, 3개의 처음 열거된 중합체 (즉, 원래 더 큰 길이 (1 kb, 0.8 kb, 및 0.6 kb)인 개개의 주형 가닥으로부터 카피되는 길이 0.5 kb의 중합체)가 프라이머 서열 그의 3'-말단의 역 상보적 서열을 갖지 않을 것이고, 이들은 모두 대략적으로 동일한 길이 (즉, 0.5 kb)일 것이다. 이들 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체는 파형 프로파일의 생성에 필요한 고차 구조를 형성하기 위해 사용될 것이다. 그러나, 0.4 kb 및 0.2 kb 길이의 개개의 주형 가닥으로부터 연장된 중합체가 전장일 것인데, 즉 프라이머 서열의 역 상보체는 이들 카피의 3'-말단에 존재할 것이고, PCR 증폭의 후속 주기는 SGP-SGP 핵산 중합체를 연속적으로 생산하여 이들이 고차 구조의 형성에 관여하기에 이용가능하지 않을 것이다
C. 단일 게놈 프로파일의 검출
기하급수적 증폭, 즉 mPCR이 SGP 방법에 사용되기 때문에, 목적하는 게놈 DNA를 다수의 카피로 개시하는 요구가 필요없다. 예를 들어, (비-SGP) 파형 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 103개 부위에 결합할 수 있고, (상기 기재한 바와 같이, 다른 파형-프로파일링 방법이 일반적으로 106개 이상의 유기체로 절차를 개시하는 것을 요구하기 때문에) 선형 증폭의 주기 당 생산된 핵산 중합체의 총수는 대략적으로 2 x 109 (게놈 DNA 주형 당 103개 핵산 중합체 x 유기체 당 2개 게놈 DNA 주형 x 106개 유기체)인 것으로 추정된다. 다른 파형-프로파일링 방법에서, 선형 증폭 주기는 예컨대 22-24회 반복될 것이다 (즉, 2 x 103개 상이한 단일 가닥의 22-24개 세트를 생산함). 대조적으로, 본 발명의 실시양태들 중 하나는 게놈 서열의 단일 카피가 증폭 프로세스의 개시시에 샘플에 존재하는 경우에만 SGP 방법을 사용하는 파형 프로파일링이 잠재적으로 달성될 수 있다는 사실과 관련된다 (유효한 추출을 가정함). mPCR 증폭의 몇몇 주기 (예컨대, 22-24 주기) 후에, 게놈의 1카피 (여기서, SGP 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅된 게놈 DNA의 각각의 별개 영역, 즉 각각의 별개 SGP-SGP 핵산)로 개시하는 것은 약 106 내지 107회 카피될 것이다 (즉, 대략적으로 106-107카피가 존재할 것임). 다른 파형-프로파일링 방법에 비해 이 개선은 예를 들어 SGP 방법을 사용하는 샘플에서 박테리아의 존재를 검출 및 분류하는 데 매우 큰 민감성을 가능하게 한다.
단축된 SGP 핵산 중합체가 SGP 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅된 게놈 DNA의 영역과 동일한 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유도되기 때문에, 단축된 SGP 핵산 중합체는 검출되는 유기체의 특이한 서열 차이를 포함할 것이다. SGP에서, 절반 시간 연장 단계 동안 생산된 몇몇의 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체 각각의 카피는 서로 상호작용하여 고차 구조, 즉 다수의 단축된 SGP 핵산 중합체를 포함하는 복합체를 형성할 것이다. 고차 구조는 상이한 안정성을 가지고, 단축된 단일 가닥의 염기 서열에 따라, 즉 유기체의 특이한 게놈 정보에 기초하여 상이한 융점 (Tm)에서 분리될 것이다. 유기체로부터 유도된 고차 구조의 Tm은 측정 및 기록될 수 있는데; 이는 고차 DNA 구조 내로 사이에 개재되는 형광 제제, 즉 인터컬레이터의 사용으로 달성된다. 따라서, SGP는 상이한 유기체의 게놈 DNA를 파형 프로파일 분석을 통해 검출, 비교 및 구별 즉, 고차 구조의 분리를 검출 및 기록하기 위해 사용될 수 있다.
특정 샘플의 고차 구조는 샘플의 온도를 증가시킴으로써 분리된다. 고차 DNA 구조를 분리시키면, 이들 고차 구조 사이에 개재되는 형광 제제도 또한 분리된다. 이들 고차 구조의 분리에 의해 얻은 형광 세기의 변화율을 증가 온도의 함수로서 플로팅하여 유기체의 게놈 DNA에 대해 특이한 파형을 생성하는데, 즉 상이한 융점 (Tm)에서의 고차 DNA 구조를 얻고, 이를 기록하여 특징적인 파형 프로파일을 생성한다. 샘플 중의 유기체의 존재를 나타내는 파형 프로파일을 양성 파형 프로파일이라 하고; 샘플 중에 유기체가 존재하는 않는 경우에, 음성 파형 프로파일이 생성된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 적절한 (양성) 파형 프로파일의 존재는 샘플 중에 유기체의 존재를 나타낸다. 다른 실시양태에서, 특징적인 파형 프로파일은 유기체의 특정 종 (또는 균주), 예컨대 박테리아의 종 또는 균주를 나타낸다. 따라서, SGP 방법은 인터컬레이터를 사용하여 제1 유기체로부터의 게놈 DNA와 제2 유기체로부터의 게놈 DNA 간에 구별하여 파형 프로파일링 방법을 사용하여 각각의 유기체에 대해 특이한 파형 프로파일을 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이, SGP의 mPCR 단계는 증폭의 다수 주기를 포함하는데; 즉 다수 주기는 하기 단계들이다: 1) 각각의 게놈 DNA를 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 단계, 2) SGP 프라이머를 몇몇의 개별 SGP 프라이머-결합 부위에 각각의 게놈 DNA 주형 및 임의의 이전 생산된 SGP 핵산 중합체 및 SGP-SGP 핵산 중합체에 따라 어닐링시키는 단계, 및 3) SGP 프라이머-결합 부위에 어닐링된 각각의 프라이머로부터 SGP 및 SGP-SGP 핵산 중합체를 연장시키는 단계. 특히, 증폭의 1주기 동안, 샘플의 온도가 (예컨대, 95-98 ℃로) 증가되어 임의의 이중 가닥 핵산 중합체 (게놈 DNA 포함)를 변성시킨다. 온도는 이어서 (예컨대, 25 ℃로) 감소되어 SGP 프라이머가 임의의 이용가능한 SGP 프라이머-결합 부위에 어닐링할 수 있도록 한다. 주기 중의 최종 단계인 프라이머로부터의 SGP 및 SGP-SGP 핵산 중합체의 연장은 예컨대 Taq 중합효소를 사용하여 ~72 ℃에서 수행된다. 최종적으로, 증폭의 마지막 주기 중 하나에서, 연장 단계에 대한 기간이 예컨대 40 내지 60% (예컨대, 50%)까지 감소되어 단축된 SGP 핵산 중합체를 생산한다. 추가 절반 시간 연장 단계를 도입하는 추가 주기는 본 발명에 포함되어 더 정확하고(거나) 강력한 파형 프로파일을 생성할 수 있는데; 이들 주기는 생성물 (예컨대, 본 발명의 SGP-SGP 핵산 중합체)을 증폭하기 위해 포함되는 추가 전체 시간 연장 단계를 도입하는 추가 주기의 후에 수행될 수 있다.
당업자는 증폭 절차에 특유한 변성, 어닐링, 및 연장 단계에 필요한 온도에서 변경을 포함하는 반복적 사이클링 단계가 가능한 기기 또는 기계를 사용하는 것을 알 것인데; 이러한 기계에는 당업계에 공지된 PCR 기계, 및 "게노패턴 애널라이저(Genopattern Analyzer) GP1000" 기계 (Adgene(아드젠))이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 필요한 mPCR 사이클링 단계가 가능한 장치를 제조하는 다른 회사에는 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) (미국 매사츄세츠주 웰레슬레이 소재), 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재), 또는 엠제이 리서치(MJ Research) (미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 기계는 온도가 변화되고, 재설정되는 각종 단계의 시기 및 기간의 변경을 가능하게 하고, 따라서 이러한 기계는 본 발명의 전체 시간 연장 단계 및 필수 절반 시간 연장 단계 모두를 생성하는 데 유용할 것이다. 또한, 당업자는 유기체의 게놈 DNA를 검출하기 위해 SGP를 사용하는 각종 측면에서 조력하는 추가 물질을 사용할 수 있는데, 여기에는 추출용 시약 키트 (당업계에 몇몇이 공지되어 있음; 예컨대, 크스트라나 테크놀로지즈(Xtrana technologies), 예컨대 크스트라 앰프(등록상표) 추출 시스템(Xtra Amp® extraction system) (미국 콜로라도주 브룸필드 소재의 크스트라나 인크(Xtrana Inc.)); 파형 프로파일링에 의해 생성되는 결과를 해석하는 분석 소프트웨어 (예컨대, 아드젠의 게노마스터(GenoMaster)); 및 프라이머-디자인 지지 툴 (예컨대, 다른 파형-프로파일링 방법에 사용되는 "게노패턴 프라이머용 디자인 서포트 툴(Design Support Tool for Genopattern Primer)", 및 게노시퀀스애널라이저(GenoSeqenceAnalyzer) 소프트웨어, 이들 모두 아드젠에 의해 입수가능함)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 SGP에 유용할 이러한 소프트웨어 및/또는 툴의 파라미터 및/또는 프로토콜을 조정할 것이다.
D. 단일 게놈 프로파일링 프라이머
SGP 프라이머는 몇몇의 개별 부위에 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 결합하도록 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 디자인한다. 본 발명의 한 실시양태에서, SGP 프라이머를 사용하여 유기체, 예컨대 박테리아 및 바이러스로부터의 임의의 게놈 DNA의 존재를 검출한다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, SGP 프라이머는 특정 유기체, 예컨대, 박테리아의 특정 종 또는 균주를 검출하는 데 사용하기 위해 맞추어진다. 당업자는 게놈 DNA의 길이 및 서열을 고려함으로써 일반적으로 박테리아, 또는 박테리아의 특정 종 또는 균주의 게놈 DNA를 검출하기 위해 사용되는 SGP 프라이머의 길이 및 서열을 결정할 수 있다. 당업자는 그의 게놈 DNA의 서열과 관련된 박테리아의 몇몇의 종을 조사하고, 이들 종의 대부분 또는 모두를 검출할 수 있는 프라이머의 서열을 추론할 것인데; 이 유형의 프라이머를 종종 "유니버셜(universal)" 프라이머로서 나타낸다. 유니버셜 SGP 프라이머, 및 특정 종 또는 균주에 특이적인 SGP 프라이머는 당업자에 의해 수행되는 간단한 실험 후에 결정된다.
당업자는 SGP 프라이머의 길이 및 몇몇의 SGP 프라이머-결합 부위에 결합하는 그의 능력, 즉 게놈 DNA 주형에 따른 상보적 서열이 반비례하는데, 즉 프라이머가 더 짧을 수록 프라이머가 결합할 게놈 DNA 주형에 따른 개별 SGP 결합 부위의 수가 많다는 것을 인식할 것이다. 반대로, 프라이머가 더 길수록, 프라이머가 결합할 게놈 DNA 주형에 따른 개별 SGP 결합 부위의 수가 작다. 또한, 프라이머 길이와 관련된 동일한 분석은 SGP 프라이머의 상보적 서열 및 SGP 프라이머의 역 상보적 서열이 게놈 DNA 주형의 길이에 따른 미리조절된 거리 (즉, SGP 핵산 중합체의 미리조절된 최대 길이) 내에서 일어난 확률에 적용된다. 따라서, 프라이머가 더 짧을 수록 SGP 프라이머-결합 부위의 역 상보체가 SGP 프라이머-결합 부위로부터 하류의 미리조절된 거리 내에 존재할 가능성은 더 크진다. 미리조절된 거리는 전체 시간 연장 단계를 포함하는 기간에 의해 결정되고, 프라이머-결합 부위의 역 상보체가 그 미리조절된 거리 내에 존재하는 경우에 기하급수적 증폭이 일어날 것이다. SGP 프라이머의 더 짧은 길이 외에, 프라이머의 서열 함유 정보, 예컨대 프라이머의 융점, 프라이머의 G/C 함량, GC 클램프(clamp), 프라이머의 자체-상보성 등에 의해 영향을 받고(거나) 그와 관련된 파라미터는 프라이머의 디자인에서 역할을 수행한다. 이들 파라미터를 염두에 두고 프라이머를 디자인하는 것은 당업계에 일상적 방법이 되었다 (일반적으로, 예컨대, 문헌 [Burpo (2001) "A critical review of PCR primer design algorithms and cross-hybridization case study," available in "Computational Molecular Biology" course materials, Stanford University (cmgm.stanford.edu/biochem218/Projects%202001/Burpo.pdf)] 참조).
그 결과, 당업자는 게놈 DNA의 길이 및 서열, 및 프라이머의 목적하는 길이 및 특이성을 고려함으로써 적절한 SGP 프라이머를 디자인할 수 있을 것이다. 본 발명의 한 실시양태에서, SGP 프라이머는 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형과 미리결정한 빈도로 결합하도록 디자인된다. 본 발명의 또다른 실시양태에서, SGP 프라이머는 프라이머가 또한 미리결정한 빈도로 SGP 핵산 중합체의 기하급수적 증폭에서 전방향 및 역방향 프라이머로서 작용할 수 있도록 디자인된다.
당업자는 SGP를 위한 프라이머 ("유니버셜" 프라이머, 및 예컨대 박테리아의 특정 종 및 균주의 검출을 위한 프라이머 포함) 디자인에서 조력으로서 다른 파형-프로파일링 방법 및 파형 프라이머의 생산 (예컨대, 아드젠로부터 입수가능함)과 관련된 물질 및 소프트웨어 프로그램을 또한 주시할 것이다. 그러나, 당업자는 SGP에서 정확하게 기능하는 프라이머를 생산하기 위해 프라이머 디자인을 위한 다른 파형-프로파일일 방법과 관련된 기술 및 파라미터를 개량할 필요를 인정할 것이다. 예를 들어, 다른 파형-프로파일링 방법은 특이적 부분 및 비특이적 안정화 부분 모두를 함유하는 프라이머를 사용하는데; 본 발명의 SGP 프라이머는 비특이적 안정화 부분을 함유하지 않는다. 또한, 당업자는 SGP 프라이머가 적어도 부분적으로 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형에 따라 (다른 파형-프로파일링 방법에서의 프라이머에 비해) 더 많은 수의 결합 부위에 결합하는 것이 필요하다는 것을 인정할 것이며, 이는 SGP 핵산 중합체의 단지 1%가 프라이머의 역 상보체를 프라이머-결합 부위로부터의 미리조절된 거리 하류 내에 포함하는 서열을 가질 것인데, 즉 단지 1%가 기하급수적으로 증폭하고 SGP-SGP 핵산 중합체를 생산할 것이기 때문이다. 추가로, 기하급수적으로 증폭되는 SGP-SGP 핵산 중합체의 단지 1% (예컨대, 대략적으로 50%)가 단축된 SGP 핵산 중합체를 절반 시간 연장 단계 동안 생산할 것이다.
SGP용 프라이머는 다른 파형-프로파일링 방법 (또는 표준 PCR에 사용되는 것)에서 사용되는 프라이머보다 더 짧도록 (작은 염기들) 디자인되는데, 이는 SGP-SGP 핵산 중합체가 생산되는 확률이 프라이머 길이가 감소하면 증가하기 때문이다. 이러한 이유로, 당업자는 다른 파형-프로파일링 방법에 제안/추천되는 것보다 짧은 길이의 프라이머를 디자인할 것이다. 예를 들어, 아드젠은 문헌 ["A Method for Comparison and Identification of DNAs and RNAs by Pattern Analysis: Genopattern Method"]의 도 4에서 파형 프라이머의 예로서 존재한다 (아드젠으로부터 입수가능함). 이 파형 프라이머는 11-염기 비특이적 안정화 부분 및 8-염기 특이적 부분을 함유한다. 당업자는 비특이적 부분을 제외함으로써 SGP에 대한 프라이머를 디자인할 것이고, 또한 총 SGP 프라이머 중의 염기수를 아드젠 파형 프라이머의 특이적 부분 중의 염기수보다 작은 수로 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 길이 6 또는 7개 염기의 프라이머는 SGP에 사용하기 위해 디자인할 수 있다. 특정 파형 프라이머의 특이적 부분이 더 많은 염기를 함유하는 다른 실시양태에서, 상응하는 SGP 프라이머에 대한 디자인은 또한 더 많은 염기를 함유할 수 있다.
SGP 방법에 의해 검출될 수 있는 박테리아 중에는 유니버셜 파형 프라이머가 이미 디자인된 것에 대한 것이 있는데; 이러한 프라이머는 당업계에 공지되어 있고, 비브리오 파라하에몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus); 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa); 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium); 클레브시엘라 뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae); 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni); 시겔라 소네이(Shigella sonnei); 엔테로코쿠스 파에칼리스(Enterococcus faecalis); 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae); 헬리코박터 필로리(Helicobacter pylori); 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes); 미코박테륨 보비스(Mycobacterium bovis); 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli); 바실루스 세레우스(Bacillus cereus); 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 검출에 유용하다. 다른 프라이머 (여기서, 이들 몇몇은 박테리아의 개개의 종 및 균주 중에 구별하기 위해 사용될 수 있음)는 또한 다른 파형-프로파일링 방법에 사용하기 위해 아드젠으로부터 입수가능하다. 상술한 바와 같이, 당업자는 공지된 파형 프라이머에 기초된 SGP에 유용한 프라이머를 생산하기 위해 프라이머의 디자인을 변경하거나, 또는 프라이머의 디자인 방법을 바꿀 것이다. 또한, 당업자는 파형 프라이머가 (예를 들어, 다른 박테리아 및 바이러스에 대해) 목적하는 유기체(들)의 게놈 물질을 분석하고, 간단한 실험의 시리즈를 수행함으로써 디자인되는 것이 없는 유기체에 대한 적절한 SGP 프라이머를 다자인할 것이다.
당업자는 샘플, 예컨대 물 샘플의 시험에서 SGP의 응용성을 인식할 것이다. 유기체, 및 그 결과 유기체의 게놈의 단리 방법은 샘플에 대해 달라질 것이고, 당업계에 잘 공지되어 있다. 잠재적 게놈 DNA가 단리되면, SGP 방법은 게놈 DNA의 존재, 및 따라서 유기체의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 특정 상황에서, 예컨대 샘플이 무균이거나 오염이 비교적 없는 경우에, 예컨대 물 샘플인 경우에, 이러한 검출은 유기체에 의한 오염을 검출하기에 충분하다. 유기체의 분류가 요구되는 경우에는, 다른 더 특이적 SGP 프라이머를 사용할 수 있다.
본 발명의 실시양태를 본원에서 논의한다. 본 발명의 한 실시양태의 기초, 즉 샘플에 오염 유기체의 부재 또는 존재를 검출하는 시스템의 기초는 실시예 1이다. 본 발명의 응용은 실시예 2이다. 당업자는 각종 샘플에 대한 품질 보증을 제공하는데 있어서 예컨대 급수에 박테리아의 부재 또는 존재를 검출하기 위한 이러한 시스템의 용도를 인식할 것이다. 또한, 당업자에 의해 본 발명이 상이한 샘플 중의 유전자의 부재 또는 존재 및 다른 길이의 뉴클레오티드를 분석하기 위해 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 당업자는 공기 공급원으로부터 여과한 샘플 또는 혈액의 샘플에서 탄저균을 검출 및 분류, 또는 각종 식료품 상에 코팅된 바이러스의 검출 및 분류를 위해 본 발명을 이용할 수 있다. 본 발명은 하기 기재하는 특정 실시예들의 범위에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 l
변형된 PCR (mPCR) 및 절반 시간 연장 단계를 포함하는 단일 게놈 프로파일 (SGP) 방법
하기 제공하는 실시예 및 도면은 당업자에 대한 본 발명의 이해를 돕고, 본원에 기재된 개선을 나타내기 위해 제공하는 이론상의 작제물이다. 도 1은 SGP 방법을 포함하는 파형-프로파일링 방법의 제1 주기 (도 1A)를 나타내고, SGP 방법의 후속 주기 (도 1B) 및 다른 파형-프로파일링 방법 (도 1C)의 결과를 비교하는 흐름도이다. 상기 흐름도가 검출될 게놈 DNA의 1카피의 사용을 나타내는 것이 주목되어야 한다. 그러나, 상술한 바와 같이, 단지 SGP 방법의 사용만으로 게놈 DNA의 상기 양은 검출가능한 고차 구조의 형성에 충분할 것이다.
본 발명을 추가로 입증하기 위해, 이론상 프라이머 서열 및 이론상 게놈 서열 모두는 충분히 짧은 길이의 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 길이에 따라 몇몇의 개별 프라이머-결합 부위에 어떻게 결합할 것인지를 측정하기 위해 실시예 1.1 및 실시예 1.2에 각각 제공된다. 실시예 1.3은 이어서 본원에 기재한 SGP 프로세스를 통해 당업자를 안내하고, SGP 방법의 각 단계 후에 예상되는 각 핵산 중합체의 서열을 제공하고, 본 발명의 개선을 나타내는 것을 조력한다. 본원에 제공되는 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것과 같이 해석 또는 이해되지 않아야 한다.
실시예 1.1: 이론상 프라이머 서열
본원에 제공되는 모델에서, 프라이머는 5'-AGC-3'이다.
실시예 1.2: 이론상 게놈 서열
4개 DNA 뉴클레오티드 염기 (아데닌 "A," 구아닌 "G," 티민 "T," 및 시토신 "C")를 랜덤 순서 및 빈도수로 함유하는 1001 bp 게놈 서열 (이들 2가닥을 각각 서 열 1 및 서열 2로 나타냄)을 컴퓨터 프로그램을 사용하여 생산한다. 이 이론상 랜덤하게 생산된 서열 중 소수의 염기를 SGP 방법을 더 명확하게 입증하는 서열을 얻기 위해 변경하였다. 이중 가닥 게놈 DNA의 단일 가닥 게놈 DNA 주형의 각 서열을 도 2에 나타낸다. 단일 가닥 게놈 DNA 주형 중 하나의 서열은 5'- 내지 -3'로 존재하고, 뉴클레오티드 염기에 상응하는 대문자로 나타내며, 서열 1이라 하고; 상보적 단일 가닥 게놈 DNA 주형은 3'- 내지 -5'로 존재하고, 뉴클레오티드 염기에 상응하는 소문자로 나타내며, 서열 2라 한다. 각각의 게놈 DNA 주형 상의 볼드체는 실시예 1.1의 이론상 프라이머가 어닐링할 것으로 예상되는 부위, 즉 프라이머-결합 부위를 나타낸다. 도 2 중의 브래키팅된 영역은 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅되는 이론상 게놈 DNA의 몇몇의 개별 영역을 나타내며, 여기서 이들 각각은 SGP-SGP 핵산 중합체의 형태로 기하급수적으로 증폭될 것이다 (예컨대, 도 5 참조).
실시예 1.3: 변형된 PCR 및 절반 시간 연장 단계를 포함하는 SGP 방법
실시예 1.1의 프라이머는 각각의 프라이머-결합 부위에 실시예 1.2의 게놈 DNA에 따라 어닐링할 것으로 예상된다. mPCR의 제1 주기를 ~95-98 ℃에서 대략 2 분 동안 처리함으로써, 게놈 DNA를 2개의 게놈 DNA 주형으로 변성시키는 것으로 개시한다. 변성 후, 프라이머를 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇몇의 개별 상보적 부위, 즉 프라이머-결합 부위에 어닐링시키는 것을 수행한다. 어닐링은 ~25 ℃에서 대략 2 분 동안 수행한다. 프라이머가 각각의 단일 가닥 게놈 DNA 주형 상의 몇몇의 개별 상보적 부위에 어닐링 한 후에, 중합효소, 예컨대 Taq 중합효 소로 프라이머의 3'-말단에서 출발하여 5'- 내지 -3' 방향으로 연장하는 별개 핵산 중합체, 즉 SGP 핵산 중합체를 연장시킨다. 연장은 ~72 ℃에서 대략 2 분 동안 수행되고, 이와 같이 mPCR의 이 이론상 제1 주기에서, ~21 염기 이하의 SGP 핵산 중합체가 생산된다.
실시예 1.1 및 1.2의 이론상 프라이머 및 게놈 DNA 서열을 갖는 mPCR의 대표적 제1 주기를 도 3 및 4에 나타낸다. 도 3은 이론상 게놈 DNA 서열 (도 2에도 도시함)을 2개의 변성된 단일 가닥 DNA 주형으로서 나타낸다. 단일 가닥 DNA 주형 중 하나의 서열은 도 3A에서 대문자 (서열 1)로서 5'- 내지 -3'로 나타내고, 상보적 단일 가닥 DNA 주형의 서열은 도 3B에서 소문자 (서열 2)로서 3'- 내지 -5'로 나타낸다. 또한, 볼드체는 예상되는 프라이머 어닐링 부위를 나타낸다. SGP 핵산 중합체가 증폭의 제1 주기 동안 유도될 것으로 예상되는 게놈 DNA의 영역은 1) 프라이머가 프라이머-결합 부위에 결합하는 것을 나타내기 위해 각각의 프라이머-결합 부위 아래의 이론상 프라이머 서열에 대한 문자, 2) SGP 핵산 중합체의 연장 방향을 나타내는 화살표, 및 3) 연장된 SGP 핵산 중합체의 예상된 길이를 나타내는 평행선으로 각각의 게놈 DNA 주형 아래에 나타낸다. 증폭의 제1 주기 후에 각각의 게놈 DNA 주형으로부터 생산될 것으로 예상되는 SGP 핵산 중합체의 서열을 도 4에 열거한다. 나타낸 바와 같이, 일부 SGP 핵삭 중합체의 서열은 SGP 프라이머-결합 부위 (볼드체 서열에 의해 나타냄)를 포함한다.
증폭의 제2 및 후속 주기의 변성 단계 동안, SGP 프라이머-결합 부위 (도 4에 나타냄)를 포함하는 서열을 갖는 SGP 핵산 중합체는 각각의 게놈 DNA 주형으로 부터 분리되고, 후속 어닐링 및 연장 단계에 참여할 것인데, 즉 이들은 고차 구조를 형성하지 않을 것이다. 그 결과, 제2 및 후속 증폭 주기에서, 도 4에 나타낸 SGP 핵산 중합체 외에, 도 5에 나타낸 SGP-SGP 핵산 중합체의 세트를 합성하고, 증폭시킬 것이다.
당업자는 도 5에 나타낸 각각의 서열 세트, 즉 각각의 SGP-SGP 핵산 중합체 서열이 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅된 게놈 DNA 주형의 몇몇 영역 중 하나와 동일한데 (도 2에서 브래키팅으로 도시됨), 즉 SGP 프라이머 서열 및 SGP 프라이머 서열의 역 상보체에 의해 브래키팅된다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 당업자는 증폭의 후속 주기가 도 5에 열거한 서열의 기하급수적으로 배가시킬 것이라는 것을 또한 인식할 것이다. 22-24 주기 후에, 도 5에 열거한 각각의 별개 SGP-SGP 핵산 중합체의 대략 106 내지 107 카피가 게놈의 1 카피로부터 생산될 것이라는 것이 예상된다.
연장 시간이 감소되기 때문에 도 5에 열거된 일부 SGP-SGP 핵산 중합체의 3'-말단이 카피되지 않도록 전체 시간 연장 단계를 포함하는 몇몇의, 예컨대 22-24 mPCR 주기 후에 "절반 시간" 연장 단계가 포함된다. "절반 시간" 연장 단계는 이전 전체 시간 연장 단계에 이용되는 기간의 대략 40 내지 60%, 예를 들어 상기 이용되는 연장 단계 기간의 50%일 것이다.
이 예에서, 절반 시간 단계 동안 연장은 ~72 ℃에서 대략 1 분 동안 수행된다. 연장에 대한 이러한 시간은 ~10 염기쌍의 중합을 가능하게 한다. 이와 같이, 하기 서열 (도 5에 열거함) 중 하나를 갖는 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유도된 핵산 중합체만이 프라이머-결합 부위를 포함하도록 완전히 연장될 것이다: 3'-tcga-5' (서열 36으로 나타냄), 3'-tcgcccccga-5' (서열 37로 나타냄), 5'-AGCT-3' (서열 40으로 나타냄), 또는 5'-AGCGGGGGCT-3' (서열 41로 나타냄). 이러한 SGP-SGP 핵산 중합체는 고차 구조의 형성에 참여하지 않을 것이다.
대조적으로, 하기 서열 (도 5에 열거됨) 중 하나를 갖는 SGP-SGP 핵산 중합체로부터의 절반 시간 연장 단계에서 카피된 핵산 중합체는 단축된 SGP 핵산 중합체일 것인데, 즉 이는 프라이머-결합 부위를 함유하는 서열을 가지지 않을 것이다: 3'-tcgggtttcccggaagccga-5' (서열 35로서 나타냄), 3'-tcggctactacggaacga-5' (서열 38로서 나타냄), 5'-AGCCCAAAGGGCCTTCGGCT-3' (서열 39로서 나타냄), 또는 5'-AGCCGATGATGCCTTGCT-3' (서열 42로서 나타냄). 절반 시간 연장 단계 후에 도 5에 열거된 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 유도될 것으로 예상되는 SGP- SGP 핵산 중합체 및 단축된 SGP 핵산 중합체의 서열은 도 6에 열거된다. 단축된 SGP 핵산 중합체, 즉 SGP 프라이머-결합 부위를 가지지 않고 고차 구조의 형성에 참여할 중합체는 도 6에 밑줄 쳐져 있고, 하기 서열을 가진다: 5'-AGCCCAAAGG-3' (서열 43으로서 나타냄), 5'-AGCCGATGAT-3' (서열 46으로서 나타냄), 3'-cggaagccga-5' (서열 47로서 나타냄) 및 3'-tacggaacga-5' (서열 50으로서 나타냄).
전체 시간 연장 단계 대신에 절반 시간 연장 단계를 포함하는 후속 mPCR에 의해 상보적 가닥을 가지지 않을 단일 가닥 단축 SGP 핵산 중합체가 생산되고, 따라서 이들은 고차 구조를 형성할 것이다. 이들 고차 구조는 Tm 분석 (파형 프로파 일링)을 수행함으로써 검출될 수 있다. 대조적으로, 더 짧은 SGP-SGP 핵산 중합체, 예컨대 5'-AGCT-3'은 절반 시간 연장 단계를 갖는 mPCR 동안 완전히 연장될 것이다. 따라서, 완전 상보적 SGP-SGP 핵산 중합체가 절반 시간 연장 단계 동안 항상 형성될 것이기 때문에, 이들 더 짧은 SGP-SGP 핵산 중합체는 그들의 상보적 핵산 중합체에 결합할 것이고, 고차 구조의 형성에 참여하지 않을 것이다.
실시예 2
SGP 프라이머의 디자인 및 실시
SGP 프라이머를 디자인하여 ATCC (미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 얻은 게놈 DNA에 대한 별개 파형 프로파일을 생성하였는데; 시험한 게놈 DNA는 4개의 밀접하게 관련된 박테리아인 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) (ATCC #10798D), 엔테로박터 클로아카에(Enterobacter cloacae) (ATCC #13047D), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) (ATCC #700720D), 및 프로비덴시아 스투아르티이(Providencia stuartii) (ATCC #33672D)로부터 얻었다. 특이적 SGP 프라이머 서열은 SGP 핵산 중합체를 생산할 이. 콜라이 게놈 내의 SGP 프라이머-결합 부위의 수를 계산함으로써 선별된다.
실시예 2.1: SGP 프라이머 디자인
길이 8개 뉴클레오티드의 SGP 프라이머를 2가지 이유로 선택하였다. 첫번째, 모든 4개 뉴클레오티드 (즉, A, T, G, C)가 랜덤하게 사용되어 길이 8개 염기인 SGP 프라이머를 생성하는 경우에, 65,536개 가능한 서열 조합물이 있다. 따라서, 8 bp인 임의의 SGP 프라이머가 매 65,536개 염기마다 1개 위치에 그의 정확한 상보적 서열에 결합할 것으로 추론된다. 두번째, 이. 콜라이 게놈은 대략 5백만 염기를 함유하기 때문에 길이 8개 염기쌍의 SGP 프라이머가 게놈 상에 76개 위치에 이론적으로 결합할 것이다.
추가 제한은 단일 SGP 프라이머에 의한 SGP 핵산 중합체의 연장 및 SGP-SGP 핵산 중합체의 증폭을 최대화하기 위해 정의되었다. 예를 들어, SGP 프라이머는 SGP 프라이머-결합 부위에 의해 브래키팅된 이. 콜라이 게놈 상의 별개 영역이 5,000개 염기 내에 있어야 하고, SGP-SGP 핵산 중합체를 생산하기에 올바른 방향이어야 한다는 것을 유념하고 디자인하였다. 잠재적 SGP 프라이머의 경우, 이. 콜라이 게놈 (젠뱅크(GenBank)에서 고유번호 U00096으로 나타냄) 상의 실제 SGP 프라이머-결합 부위의 수는 NIH에 의해 제공되는 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 사용하여 측정하였다. 상기 프로그램은 프라이머-결합 부위인 이. 콜라이 게놈 내의 위치를 보고하였다. 프라이머 디자인은 잘 공지된 파라미터에 의해, 예컨대 그 자신과 혼성화될 수 있는 임의의 프라이머를 제외함으로써 프라이머 2량체의 형성을 차단하는 것에 의해 제한되었다.
실시예 2.2: SGP 프라이머 실시
8개 후보 SGP 프라이머 중에, 2개는 모든 4개 시험 박테리아를 갖는 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체를 생산하였다. 2개 프라이머의 서열은 5'-GCGAGGAT-3' (DJB7; 서열 51로서 나타냄) 및 5'-GGCACTGC-3' (DJB8; 서열 52로서 나타냄)이다. 블라스트(Blast) 결과는 DBJ7이 5,000개 염기 내에서 프라이머 결합 부위 및 역방향 프라이머 상보체 결합 부위 모두를 갖는 5개 좌위에서 이. 콜라이 게놈에 혼성 화되고, DBJ8이 이러한 10개 좌위에서 이. 콜라이 게놈에 혼성화될 것을 예측하였다. DJB7 또는 DJB8 프라이머를 사용하는 실험은 1% 아가로스 겔을 사용하고 에티듐 브로마이드로 염색하는 겔 전기영동을 통해 상이한 반응 조건하에 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체의 크기 및 수를 비교하였다. 먼저, 증폭 (즉, 변성, 어닐링, 및 연장의 하나 이상의 주기)은 5 μM DJB8 프라이머 (5'-GGCACTGC-3')를 1 x 다까라(Takara) PCR 완충액, 300 nM 각 dNTP, 2.5 mM MgCl2, 2.5 유닛의 다까라 중합효소 (미국 위스콘신 매디슨 소재의 다까라 미니스 바이오(Takara Minis Bio)로부터 모두 입수가능함) 및 100 ng 또는 250 ng DNA와 함께 사용하여 수행하였다. 94 ℃에서 30초 동안의 변성, 25 ℃에서 30초 동안의 어닐링, 및 72 ℃에서 30초 동안의 연장의 30 주기를 수행하여 각각의 4종의 박테리아 DNA 및 인간 DNA (대조군; 프로메가(Promega) #G3041)로부터 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체를 생산하였다.
상술한 조건을 사용하는 DJB7 또는 DJB8, 및 상이한 박테리아 게놈의 파형 프로파일링은 상이한 크기, 즉 각각의 박테리아 종에 특이적인 단일 패턴 (데이타를 나타내지 않음)의 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체를 증폭하였다. 또한, 인간 게놈 DNA (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가)로부터 증폭된 SGP-SGP 핵산 중합체 생성물은 프라이머 중 하나가 사용되는 경우에 검출가능하지 않았다 (데이타를 나타내지 않음). 상기 결과는 SGP 프라이머가 상이한 박테리아 DNA들, 및 또한 박테리아 DNA와 인간 DNA 간에 검출 및 구별하는데 사용할 수 있다는 것을 입증한다.
2개 SGP 프라이머 및 박테리아 DNA 주형 (인간 게놈 DNA를 대조군으로 포함함) 중 하나를 사용하는 SGP-SGP 핵산 중합체의 증폭을 최적화하였다. 8-염기 SGP 프라이머를 사용하는 성공적 증폭을 위한 몇몇의 중요한 파라미터는 1) 낮은 어닐링 온도, 2) 높은 농도의 프라이머, 및 3) 많은 수의 증폭 주기이었다. 최종 최적 조건은 1 x 다까라 PCR 완충액, 300 nM 각 dNTP, 5.0 mM MgCl2, 5.0 μM SGP 프라이머, 2.5 유닛의 다까라 중합효소, 및 1 ng 주형 DNA로서 정의하였고; 최적 사이클링 조건은 94 ℃에서 1 분 동안의 변성, 25 ℃에서 1 분 동안의 어닐링, 및 72 ℃에서 1 분 동안의 연장의 40 주기로서 정의하였다.
DJB7 또는 DJB8 (각각, 도 7A 및 도 7B)을 사용한 증폭은 상이한 박테리아 DNA를 각각의 또다른 박테리아 DNA로부터 및/또는 박테리아 DNA를 인간 DNA로부터 구별하기 위해 사용할 수 있는 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체의 별개 패턴을 생성하였다. 상기 데이타는 본 발명의 SGP 프라이머가 본 발명의 파형-프로파일링 방법에 사용하여 별개 패턴의 증폭된 DNA를 생산할 수 있고, 유기체가 소량으로 존재할지라도 이들 별개 패턴의 검출이 유기체의 검출 및/또는 분류에 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
별개 패턴의 이중 가닥 SGP-SGP 핵산 중합체는 또한 온도 증가에 반응하는 인터컬레이팅 염료 (예컨대, SYBR(등록상표) 그린(Green))의 유리에 의해 형광에서의 변화를 모니터링함으로써 검출할 수 있는데, 즉 본 발명의 SGP 프라이머 및 본 발명의 SGP 방법을 사용하여 생성한 파형 프로파일을 융점 분석을 통해 검출할 수 있다. 또한, 당업자는 절반 시간 연장 단계가 SGP-SGP 핵산 중합체로부터 생성된 단축된 SGP 핵산 중합체가 고차 구조를 형성할 수 있도록 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이며, 이는 융점 분석을 통해 검출될 수도 있다.
SEQUENCE LISTING
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agcgggggct 10
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agct 4
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<223> SGP primer DJB8
<400> 52
ggcactgc 8
Claims (19)
- (a) DNA를 제1 혼합물과 혼합하여 증폭 혼합물을 형성시키며, 여기서 제1 혼합물이 다중 카피의 SGP 프라이머 및 다른 증폭제를 적절한 농도로 포함하는 것인 단계;(b) 증폭 혼합물을 제1 기간 동안 변성시키는 단계;(c) 증폭 혼합물을 제2 기간 동안 어닐링시키는 단계;(d) 증폭 혼합물을 제3 기간 동안 연장시키는 단계; 및(e) 단계 (b) 내지 (d)를 1회 이상 반복하는 단계를 포함하는, DNA의 기하급수적 증폭 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (e) 후에,(i) 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계;(ii) 증폭 혼합물을 제3 기간의 40% 내지 60%인 제4 기간 동안 연장시키는 단계; 및(iii) 증폭 혼합물을 냉각시킴으로써 고차 구조가 형성되게 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (e)에서 반복되는 단계 (b) 내지 (d)의 회수가 20 내지 50회인 방법.
- 제3항에 있어서, 단계 (e)에서 반복되는 단계 (b) 내지 (d)의 회수가 30 내지 40회인 방법.
- 제2항에 있어서, 제4 기간이 제3 기간의 약 50%인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 (iii) 전에 단계 (i) 내지 (ii)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, SGP 프라이머가 서열 51로 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 서열 52로 나타낸 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 하나 이상의 증폭된 생성물을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 검출가능 제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 검출 단계가 융점 분석을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
- (a) 샘플 획득 단계;(b) 샘플 추출 단계;(c) 제1 혼합물을 샘플에 도입하여 증폭 혼합물을 형성시키며, 여기서 제1 혼합물이 다중 카피의 SGP 프라이머 및 다른 증폭제를 적절한 농도로 포함하는 것인 단계;(d) 증폭 혼합물을 제1 온도에서 제1 기간 동안 변성시키는 단계;(e) 증폭 혼합물을 제2 온도에서 제2 기간 동안 어닐링시키는 단계;(f) 증폭 혼합물을 제3 온도에서 제3 기간 동안 연장시키는 단계;(g) 단계 (d) 내지 (f)를 1회 이상 반복하는 단계;(h) 단계 (d) 내지 (e)를 반복하는 단계;(i) 증폭 혼합물을 제4 온도에서 제3 기간의 약 40 내지 60%인 제4 기간 동안 연장시키는 단계;(j) 증폭 혼합물을 냉각시킴으로써 고차 구조가 형성되게 하는 단계; 및(k) 고차 구조의 부재 또는 존재를 검출하며, 여기서 고차 구조의 존재가 유기체의 존재를 결정하는 것인 단계를 포함하는, 샘플 중의 유기체의 결정 방법.
- 제11항에 있어서, 제4 온도를 제3 기간의 약 50%인 제4 기간 동안 유지하는 방법.
- 제11항에 있어서, 단계 (g)에서 반복되는 단계 (d) 내지 (f)의 회수가 20 내지 50회인 방법.
- 제13항에 있어서, 단계 (g)에서 반복되는 단계 (d) 내지 (f)의 회수가 30 내지 40회인 방법.
- 제11항에 있어서, 단계 (j) 전에 단계 (h) 내지 (i)를 1회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제11항에 있어서, 제3 및 제4 온도가 동일한 온도인 방법.
- 제11항에 있어서, 검출가능 제제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 검출 단계가 융점 분석을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 서열 51의 뉴클레오티드 서열 및 서열 52의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머.
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2005
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