JP4990771B2 - 微生物のゲノムｄｎａをモニターする方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物のゲノム情報に基づいて、微生物を迅速に検出し分類するための改良法を対象とする。

本出願は、２００４年７月２８日出願の米国仮出願第６０／５９１，５９６号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に合体される。

バイオテクノロジーの分野では、さまざまな（例えば、環境系および医学系）サンプル中の細菌およびウイルスなどの微生物を迅速に検出および／または分類する必要性がある。例えば、細菌の迅速な検出、およびその後の種および／または菌株の分類は、例えば、地域の水供給、病院、食物処理プラントに品質保証を与えるために必要な可能性がある；すなわち、空気、埃、水、血液、組織、植物、食品などのサンプルだけには限られないが、これらを含めたさまざまなサンプルを汚染する微生物の存在に対してスクリーニングして、公衆による消費、露出、および／または使用の前、公衆による使用中に汚染する微生物を分類することが必要な可能性がある。本発明は、サンプル中の微生物（例えば、細菌またはウイルス）を検出および分類するための方法を改良することによって、これらの目標を達成する。

微生物を検出および／または分類するための標準的な微生物学的方法、例えば、培養およびグラム染色または他の生化学的性質の試験は不正確であり、異なる微生物、すなわち異なる菌株の微生物を区別できないことが多い。微生物を検出および／または分類するためのさらに正確な方法は、微生物のゲノムＤＮＡに基づく。このような方法は、ノーザン・ブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲなどの時間のかかる従来的な方法から最先端のＤＮＡマイクロアレイ分析にまで進展している。このようなよく知られている、検出および／または分類の方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。

ＰＣＲは２つの別個の異なる（第１および第２の）プライマーによって成し遂げられ、各プライマーは、二本鎖ゲノムＤＮＡの２つの鋳型（テンプレート）（すなわち鎖）のいずれかにおいて見られるヌクレオチド配列にそれぞれ相補的である。２つのプライマーの配列は２つのゲノムＤＮＡ鋳型の配列に基づくので、２つのプライマーは、二本鎖ゲノムＤＮＡの１つの孤立した遺伝子座（locus）と結合し囲む（一括するbracket）。このようなプライマーの対を使用するＰＣＲは、二本鎖ゲノムＤＮＡの指数関数的増幅をもたらし、この二本鎖ゲノムＤＮＡは、２つのプライマーと相補的なヌクレオチド配列によって囲まれるゲノムの１つの孤立した遺伝子座、すなわち１つのゲノムＤＮＡ鋳型の３’端上の第１のプライマー結合部位および他のゲノムＤＮＡ鋳型の３’端上の第２のプライマー結合部位の側面に位置するＤＮＡの遺伝子座と同一である。

ＰＣＲはＤＮＡを指数関数的に増幅させるので、ＰＣＲを使用して少量のゲノム物質を検出することができる。しかしながらＰＣＲは、知られており当該遺伝子座を囲むゲノム物質の配列と特異的相補性があるプライマーを必要とするので、知られている微生物の検出および分類のみに使用することができる点でＰＣＲは制限される。言い換えると研究者は、微生物を検出する如何なる試みの前にも、微生物の分類（すなわち、使用するための適切なプライマーの対）を知る、あるいは推測することを必要とされる。ＰＣＲの他の制約は、分析中に使用する２つのプライマーと相補的な配列に関する情報以外、増幅ＤＮＡ配列に関する情報を研究者が得ることができないことである。

ＰＣＲの幾つかの制約を克服するために、幾つかの波形プロファイリング法（waveform profiling）が開発された（例えば、特開第２００３−３３４０８２号および特開第２００３−１８０３５１号中に記載された波形プロファイリング法を参照）。波形プロファイリング法は、研究者が検出前に微生物の分類を知る、あるいは推測することを必要とせずに、ゲノム物質（例えば、細菌などの微生物から単離したＤＮＡ）を分析し概略付けするための方法を与える。簡潔には、波形プロファイリングは、一般に、高次構造、例えば三重鎖、四重鎖などを形成する幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーを直線的に増幅させるための鋳型として、独特なプライマーおよびゲノムＤＮＡの２本の変性鎖の多数のコピーを使用して、微生物のゲノムＤＮＡを分析する。微生物のゲノムＤＮＡは鋳型として使用されるので、生成する一本鎖核酸ポリマーは異なり、微生物に独特な配列を含み得る。したがって、一本鎖核酸ポリマーは、微生物に独特な配列に基づいて高次構造を形成し得る。したがって、検出剤、例えば蛍光挿入剤を使用して実施することができる、このような独特な高次構造の検出は、微生物を分類することができる。

幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーは一般に、その構造および長さによって特徴付けられる単一型生成波形プライマーを使用して生成される。波形プライマーは一般に２つの部分、非特異的安定部分および特異的部分からなる。以下で論じるように、非特異的安定部分は高次構造の形成を誘導する手助けをすることができる。対照的に、特異的部分は波形プライマーを誘導して、その独自の配列と相補的な配列と特異的に結合させる。波形プライマーの長さ（例えば、８〜３０塩基長）は通常重要である、何故ならその長さが、プライマーの特異的部分と、幾つかの異なるプライマー結合部位、すなわちゲノムＤＮＡ鋳型の長さ部分に沿って波形プライマーと相補的な配列が特異的に結合するのを可能にするからである。波形プライマーと、それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った幾つかのプライマー結合部位の結合は、幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーの生成を可能にし、その生成はこの方法にとって重要である。

波形プライマーを利用すること以外に、これらの波形プロファイリング法は数サイクルの直線的増幅も利用して、幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーのそれぞれの多数のコピーを与え；したがって、波形プライマーの多くのコピーを、直線的増幅の最初のサイクルの前に当該ゲノムＤＮＡを含む溶液に加える。直線的増幅の１サイクルは以下の工程を含み得る、すなわち、１）変性工程、すなわち別々または個々の一本鎖（例えば、２つの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に変性した二本鎖ゲノムＤＮＡのそれぞれのコピー）への二本鎖ＤＮＡの変性を可能にする条件を与える工程と、２）アニーリング工程、すなわち相補的一本鎖ＤＮＡとそれぞれ他のＤＮＡ（すなわち、それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の幾つかの異なるプライマー結合部位とアニーリングした波形プライマー）の結合を可能にする条件を与える工程と、３）伸長工程、すなわち鋳型ＤＮＡの領域（例えば、それぞれのゲノムＤＮＡ鋳型に沿ってプライマー結合部位と結合した幾つかの波形プライマーのそれぞれから伸長した、幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマー）上のプライマー配列のＤＮＡポリメラーゼ誘導型伸長を可能にする条件を与える工程と、を含み得る。

直線的増幅の１サイクル中に、ゲノムＤＮＡの温度を（例えば９５〜９８℃に）上昇させて、ゲノムＤＮＡのそれぞれのコピーを２つの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に変性させる。その後温度を（例えば２５℃に）低下させて、それぞれの変性ゲノムＤＮＡ鋳型の長さ部分に沿った幾つかの異なるプライマー結合部位と波形プライマーが結合するのを可能にする。サイクル中の最終工程、それぞれの結合した波形プライマーからの幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーの伸長は、ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼを使用して〜７２℃で実施する。この最終工程後、サイクルを繰り返す。次の変性工程中、幾つかの異なる核酸ポリマーがゲノムＤＮＡ鋳型から変性し、一本鎖核酸ポリマーになり、それぞれの一本鎖核酸ポリマーは、そこから一本鎖核酸ポリマーが伸長した波形プライマーのヌクレオチド配列を含む５’→３’ヌクレオチド配列、および次に、波形プライマーと結合したゲノムＤＮＡ配列の下流に存在したゲノムＤＮＡ鋳型の領域の配列と相補的な異なるヌクレオチド配列を有する。それぞれの一本鎖核酸ポリマーはその５’端に波形プライマーの配列を含むので、それぞれの一本鎖核酸ポリマーは波形プライマーの非特異的安定部分も含む。波形プライマーの非特異的安定部分は一般に、それぞれの一本鎖核酸ポリマーが高次構造を形成するのを誘導し、先に伸長した一本鎖核酸ポリマーが後の増幅サイクル中に任意の波形プライマーと結合するのを妨げる。

波形プライマーの非特異的安定部分の結果として、一本鎖核酸ポリマーは後の増幅サイクル中に鋳型として使用されず、それぞれの増幅サイクルは直線的である。言い換えると、それぞれの増幅サイクルは、微生物に独特な配列、すなわちプライマー結合部位と結合した波形プライマーの下流に存在するゲノムＤＮＡ鋳型の配列と相補的な配列を含む、幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーのそれぞれの単コピーのみを生成する。したがって、ＰＣＲとは対照的に、波形プロファイリング法は一般に、微生物に独特な配列を含む幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーの指数関数的増幅をもたらすことはない。

それぞれの一本鎖核酸ポリマーは、プライマー結合部位と結合した波形プライマーの下流に存在するゲノムＤＮＡ鋳型の配列と相補的な塩基配列を含み、したがって、異なるゲノムＤＮＡの多数の部位に存在する塩基配列の違いを比較し、区別することができる。前に記載したように、幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーのそれぞれの多数のコピーは、互いに相互作用して高次構造、すなわち１つまたは複数の一本鎖の異なる核酸ポリマーを含む複合体（例えば、三重鎖および四重鎖）を形成し得る。高次の核酸構造は、一本鎖核酸ポリマーの塩基配列に応じて、すなわち微生物の独特なゲノム情報に基づいて、異なる安定性を有し異なる融解温度（Ｔｍ）で解離し得る。

波形プロファイリングは一般に、鋳型として個々の微生物のゲノムＤＮＡを使用して生成される、さまざまな異なる高次構造の融解温度（Ｔｍ）を測定および記録することを必要とし、高次ＤＮＡ構造中に挿入される蛍光剤、すなわち挿入剤を使用することによって、これを実施することができる。波形プロファイリングによって生成される高次ＤＮＡ構造は、サンプルの温度を上昇させることによって解離させることができる。高次ＤＮＡ構造が解離すると、これらの高次構造中に挿入される蛍光剤も解離し得る。融解温度分析は、温度上昇の関数としてこれらの高次構造の解離によって得られた蛍光強度の変化率をプロットし、微生物のゲノムＤＮＡおよび利用する波形プライマーに独特な波形を生成する、すなわち、異なるＴｍにおける高次ＤＮＡ構造の解離を観察および記録して、微生物、例えば細菌のそれぞれの種（または菌株）に特徴的な「波形プロファイル」を生成する。したがって、波形プロファイリングを使用して、それぞれの微生物に関する独特な波形プロファイルを得ることができ、後の融解温度分析を使用して、独特な波形プロファイルを検出して、第１の微生物から単離したゲノムＤＮＡと第２の微生物から単離したゲノムＤＮＡを区別することができる。

当業者は、波形プロファイルを生成する波形プロファイリング法を実施する前に、微生物を含むサンプルを得なければならず、ゲノムＤＮＡをその微生物を含むサンプルから抽出および単離しなければならないことを理解し得る。サンプル回収ならびにゲノムＤＮＡの抽出および単離の方法は、当技術分野でよく知られている。

（波形プロファイリングに関する）前に記載した方法は直線的増幅に頼るので、この方法を使用する難点の１つは、検出および／または分類する個々の微生物（例えば細菌）由来の多大な初期量のゲノムＤＮＡが必要であることである。したがって、微生物が所与のサンプル中に多数（例えば１０^６以上の微生物）存在する場合のみ、波形プロファイリング法を使用して微生物を検出および分類することができるが、非常に少数の微生物を検出および／または分類するのに有効ではない。
特開第２００３−３３４０８２号 特開第２００３−１８０３５１号 Ｇｏｏｄｂｙｅ ＤＮＡ Ｃｈｉｐ、Ｈｅｌｌｏ Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ

したがって、波形プロファイリング法は、一般に、例えば汚染の開始時に水供給または供給源から採取したサンプル中に、少数で存在する微生物を検出および／または分類する際に有用ではない。ＰＣＲは、多量の初期サンプルを必要とする波形プロファイリング法の制約を解決することができるが（何故なら、ＰＣＲはゲノムＤＮＡの指数関数的増幅をもたらし、少数で存在する微生物の検出を可能にするからである）、ＰＣＲ増幅から生じるＤＮＡの相補的二本鎖種を使用して生成される波形プロファイルは、個々のゲノム配列を分類するのに不充分であることは、当技術分野で知られている（例えば、Ａｄｇｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により印刷および配給された「Ｇｏｏｄｂｙｅ ＤＮＡ Ｃｈｉｐ、Ｈｅｌｌｏ Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒ ２１ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ」を参照）。言い換えると、従来技術は、標準的ＰＣＲ産物の融解温度（Ｔｍ）分析を使用して、（微生物のさまざまな種または菌株由来の）ゲノム物質を比較、区別および分類することは不可能であることを明らかに教示している。

本発明は、検出および分類のために微生物がサンプル中に多数存在しなければならないという要件を克服するために、上記に記載した波形プロファイリング法に対して必要とされる改良を提供する。特に、本発明は、改変型ＰＣＲを組み込むことができるように波形プロファイリング法を適合させてかつ向上させる新規な改良を提供する。当業者は、波形プロファイリング法に対する本発明の改良は、微生物が少数存在する場合でさえ、例えば、水供給または供給源の汚染開始時においてさえもサンプル中に存在する微生物の数で、微生物の検出および分類を可能にすることを理解し得る。

本発明の目的の１つは、例えば水の供給に関する初期の安全性および品質保証をより正確に与えることができるように、少数で存在し得る微生物を検出および分類するための方法を提供することである。このように本発明は、本明細書で集合的に単一ゲノム・プロファイリング（Single Genome Profiling:ＳＧＰ）と呼ぶ改良法を提供する。

ＳＧＰは、幾つかの異なる「ＳＧＰ核酸ポリマー」を増幅させるためにプライマー（「ＳＧＰプライマー」）の使用を必要とする。ＳＧＰプライマーは、その長さ、およびゲノムＤＮＡの長さ部分に沿った幾つかの異なる部位と特異的に結合する能力によって特徴付けられる。ＳＧＰプライマーは非特異的安定部分を含まないので、（例えば一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の、幾つかの異なるＳＧＰプライマー結合部位と結合した本発明のＳＧＰプライマーから伸長した）ＳＧＰ核酸ポリマーは、後の増幅反応においてＳＧＰプライマーと自由に結合する。ＳＧＰプライマーは、一本鎖ＳＧＰ核酸ポリマーの長さ部分に沿った相補的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができるので、ＳＧＰプライマーは（改変型ＰＣＲ、すなわち「ｍＰＣＲ」において）正方向および逆方向プライマーとしても機能して、幾つかの異なる「ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー」を増幅させることができ、そのそれぞれが、ＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれる（一括される）ゲノムＤＮＡの数箇所の領域の１配列と同一のヌクレオチド配列を含む、すなわち、それぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー配列は、その５’端にＳＧＰプライマーの配列を有し、その３’端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有する。したがって、ＳＧＰプライマーのヌクレオチド配列およびＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む、幾つかの異なるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの増幅は指数関数（非直線）式に起こり、微生物が少数で存在する場合でも、本発明を使用して微生物のゲノムＤＮＡを検出および分類するのを可能にする。当業者は、ＲＮＡ系ゲノム（例えば、レトロウイルスのゲノム）に本発明を実施する際には、ＳＧＰおよび関連ｍＰＣＲサイクルを始める前に、逆転写反応を実施しなければならないことを理解し得る。

本発明はさらに、最終増幅サイクルに付随する「半分の時間での伸長工程」を提供する。本発明では、最終増幅サイクルに付随する伸長工程の時間の長さは、時間の減少を含み（好ましくは時間の長さの減少は約４０〜６０％であり、より好ましくは時間の長さの減少は約５０％である）、最終増幅サイクル中の「半分の時間」での伸長工程という結果をもたらす。このような半分の時間での伸長工程は、通常、多くのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的増幅を排除し得る、何故なら、ＳＧＰプライマーからＳＧＰプライマーの逆相補配列に核酸ポリマーを伸長させるのには、不充分な時間だからである。したがって、縮小型のＳＧＰ核酸ポリマー（「縮小ＳＧＰ核酸ポリマー（shortened SGP nucleic acid）」）が半分の時間での伸長工程中でＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーから生成され得る。当業者は、改変型ＰＣＲ、すなわちｍＰＣＲを用いた数サイクルの指数関数的増幅の後に、半分の時間での伸長工程を実施することによって、各縮小ＳＧＰ核酸ポリマーから多くのコピーが生成されることを理解し得る。さらに、後の変性工程中に、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは一本鎖になり得る。最終的に、縮小一本鎖ＳＧＰ核酸ポリマーは、ｍＰＣＲを用いて本発明を実施する際に検出される高次構造を形成する。

本発明はさらに、改良法において使用するプライマー、およびこれらのプライマーを作製するための方法、ならびに指数関数的増幅を利用し波形プロファイリング法の変わりやすさを低下させる方法を提供する。一実施形態では、本発明のＳＧＰプライマーは配列番号５１として示されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、本発明のＳＧＰプライマーは配列番号５２として示されるヌクレオチド配列を有する。

一実施形態では本発明は、波形プロファイリングの改良方法を提供し、その改良方法はＳＧＰプライマーの使用を含んでいる。当業者は、ＳＧＰプライマーの使用がｍＰＣＲを引き起こすことを理解し得る。このように、本発明は、ＤＮＡを指数関数的に増幅させる方法を対象とし、この方法は、ＳＧＰプライマーの多数のコピーおよび他の増幅試薬を適切な濃度で含む第１の混合物とＤＮＡとを混合させて増幅混合物を形成する工程と、増幅混合物を第１時間の間、変性させる工程と、増幅混合物を第２の時間の間、アニーリングさせる工程と、増幅混合物を第３時間の間、伸長させる工程と、変性、アニーリングおよび伸長の工程を少なくとも１回繰り返す工程とを含む。幾つかの実施形態では、この改良は半分の時間での伸長の工程をさらに含む。他の実施形態では、ＳＧＰプライマーは、配列番号５１として示されるヌクレオチド配列および配列番号５２として示されるヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。他の実施形態では、この方法は、任意の工程において、検出剤を加える工程をさらに含む。

本発明の改良型の波形プロファイリング法を使用することにより、例えばサンプル中の微生物が存在しないことまたは存在することを検出して決定することができる。したがって、本発明は、サンプル中の微生物を測定する方法を提供し、この方法は、サンプルを取得する工程、サンプルを抽出にかける工程と、ＳＧＰプライマーの多数のコピーおよび他の増幅試薬を適切な濃度で含む第１の混合物を、サンプル中に導入して増幅混合物を形成する工程と、第１温度で第１時間の間、増幅混合物を変性させる工程と、第２温度で第２時間の間、増幅混合物をアニーリングさせる工程と、第３温度で第３時間の間、増幅混合物を伸長させる工程と、変性、アニーリングおよび伸長の工程を少なくとも１回繰り返す工程と、変性とアニーリングさせる工程を繰り返す工程と、第３時間の長さの約４０％〜６０％に等しい第４時間の間、増幅混合物を第４温度で伸長させる工程（半分の時間での伸長）と、増幅混合物を冷却することによって高次構造を形成させる工程と、高次構造の存在しないことまたは存在することを検出し、高次構造が存在することによって微生物の存在を決定する工程とを含む。本発明の一実施形態では、第４温度を第３時間の約５０％である第４時間の間、維持する。他の実施形態では、完全長の伸長を含む工程を繰り返す回数は、２０〜５０回、例えば、２０〜２５回、２６〜２９回、３０〜４０回、４１〜５０回である。本発明の一実施形態では、半分の時間での伸長工程を、高次構造を形成させる前に１回または複数回繰り返す。さらに、微生物の存在を決定することによって、微生物の分類を決定することができる。幾つかの実施形態では、第３温度と第４の温度が同じ温度である。さらに本発明は、任意の工程において、検出剤を加える工程をさらに含む、サンプル中の微生物を測定するための方法を提供する。本発明の方法での検出工程は、融解温度分析の実施を含むことができる。

本発明は、微生物を測定および／または分類する従来技術の方法に対して改良を提供するものである。本発明では、多数の微生物を含むサンプルを提供することは必要ではない。特に、本発明は、波形プロファイリング法に対する改良を提供する。波形プロファイリング法に対する改良は、改変型ＰＣＲ、すなわちＤＮＡの指数関数的増幅を実施する改良型プライマーを含む。波形プロファイリング法に対する改良は、増幅手順中に半分の時間での伸長工程も含み、改変型ＰＣＲ（すなわちｍＰＣＲ）によって形成される核酸ポリマーの部分集合由来の一組の縮小一本鎖核酸ポリマー（shortened single-stranded nucleic acid polymer）の生成を可能にする。波形プロファイリング法に対する改良は、微生物が少数、例えば、水供給物の汚染の開始時にサンプル中に存在する微生物の数で存在する場合でも、微生物の検出および／または分類を可能にする。したがって、本発明は、空気、埃、水、血液、組織、植物、食品だけには限られないが、これらを含めた、微生物によって汚染状態になり得る多くの供給源（例えば、環境系および医学系）に関する品質保証の提供を助長する、改良型波形プロファイリング法を提供する。当業者は、本発明が単一ゲノムの検出とは反対に、単一ゲノムの一部分、または少数のゲノムの増幅に関するものであり；単一ゲノムの一部分、または少数のゲノムの増幅に検出が続くことを、理解し得る。

単一ゲノム・プロファイリングは、微生物が少数で存在する場合でも、波形プロファイリング法に対する改良を提供することによって、微生物由来のゲノムＤＮＡの分析およびプロファイリングを可能にする。これらの改良は、新規のプライマー（「ＳＧＰプライマー」）および改変型のポリメラーゼ連鎖反応（ｍＰＣＲ）を含む。ＳＧＰは、さらに、最後の「半分の時間での伸長工程」を提供する。これらの改良は、ＳＧＰ（すなわち、ＳＧＰプライマー、ｍＰＣＲ、および半分の時間での伸長工程を使用する方法）が、それぞれがＳＧＰプライマーの配列、次にゲノムＤＮＡ鋳型の幾つかの異なる領域の１つと相補的な配列を含む５’→３’ヌクレオチド配列を有する、異なる核酸ポリマー（「ＳＧＰ核酸ポリマー」）の生成をもたらすのを可能にする。特に、ＳＧＰは作製したＳＧＰ核酸ポリマー、ＳＧＰプライマー、およびｍＰＣＲを利用して、それぞれがＳＧＰプライマーの配列、ゲノムＤＮＡ鋳型の幾つかの異なる領域の１配列と同一である配列、次にＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む５’→３’ヌクレオチド配列を有する、「ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー」を指数関数的に増幅させる。ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的な増幅後、ＳＧＰは新規の半分の時間での伸長工程を導入して、高次構造を形成し得る縮小型のＳＧＰ核酸ポリマー、すなわち「縮小ＳＧＰ核酸ポリマー」を作製することができる。微生物のゲノムＤＮＡは最初の鋳型として使用されるので、ＳＧＰ核酸ポリマーおよびＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、微生物に独特な配列を含み得る。同じ理由で、生成するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは半分の時間での伸長工程中の縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの作製に使用されるので、一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは微生物に独特な配列を含み得る。このように、一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、微生物に独特な配列に基づいて高次構造を形成する。したがって、一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーによって形成される組の高次構造は、微生物に独特である。結果として、形成される異なる高次構造を検出することによって、微生物を検出および／または分類することができるが、この検出は例えば蛍光挿入剤を使用して実施することができる。

Ａ．単一ゲノム・プロファイリングの改変型ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）
多くのＳＧＰ核酸ポリマー、および、したがって、多くのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーおよび縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、本発明の改変型ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）を使用して作製することができる。これらのポリマーはそれぞれ、５’端のＳＧＰプライマーに由来する当該ＳＧＰプライマーを含むので、ＳＧＰプライマーの多くのコピーは、ＳＧＰ中のｍＰＣＲの最初のサイクル前に当該ゲノムＤＮＡを含む溶液に加えなければならない。当業者は、物質（例えば、増幅試薬）およびｍＰＣＲの条件は、よく知られているＰＣＲの増幅試薬および条件と類似していることを理解し得る。例えば、プライマー対およびＤＮＡ鋳型の多くのコピー以外に、ＰＣＲに加えるための増幅試薬、例えば、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ反応バッファーなどの適切な濃度は当業者によく知られており、挿入剤の適切な濃度も同様である。ｍＰＣＲの最初のサイクルの前に加えなければならない、増幅試薬、例えば、ＳＧＰプライマー、ヌクレオチド（すなわちｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼ、反応バッファー、および／またはマグネシウムの濃度および量は、当業者により容易に決定することができる。

ＳＧＰは非常に少量で存在する微生物のゲノムＤＮＡを分析することができる、何故ならＳＧＰは、ｍＰＣＲの工程を含むからである。本発明の一実施形態では、１種の微生物のゲノムＤＮＡは、検出用の充分な量の縮小一本鎖核酸ポリマーおよび関連高次構造の原型鋳型を与えることができる。これはＳＧＰのｍＰＣＲ工程が、従来のＰＣＲとある程度類似した方法で幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーと結合し増幅させるＳＧＰプライマーの能力によって、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的増幅をもたらすためである。しかしながら、従来のＰＣＲと比較して２つの顕著な違いが存在する。第１にｍＰＣＲの工程は、正方向プライマーと逆方向プライマーの両方として作用することができる、１つのプライマー、すなわち、ＳＧＰプライマーのみを利用する。対照的に従来のＰＣＲは、２つの異なるプライマー（１）正方向プライマー、および（２）正方向プライマーの配列と異なる配列を有する逆方向プライマーを使用する。

第２に、従来のＰＣＲでは、２つのプライマーを利用してゲノムＤＮＡの１つの領域を増幅させるのに対して、ｍＰＣＲでは１つのプライマーを使用してゲノムＤＮＡの幾つかの異なる領域を増幅させる、ここで、各１つのプライマーはＳＧＰプライマーと同一の配列およびＳＧＰプライマーと相補的な配列、すなわち「ＳＧＰプライマー結合部位」によって囲まれる。ゲノムＤＮＡの幾つかの異なる領域を増幅させるＳＧＰ中のｍＰＣＲの能力は、正方向プライマーおよび逆方向プライマーとして作用することができる、１つのＳＧＰプライマーを使用することによるものである。ＳＧＰプライマーのこの特徴は、その長さの関数であり、以下の２つの重要な事象を引き起こすことを可能にする、すなわち、（１）それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の幾つかの異なるＳＧＰプライマー結合部位とＳＧＰプライマーとを結合すること、および、（２）ＳＧＰプライマー配列およびその異なるヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む５’→３’ヌクレオチド配列を有する（ｍＰＣＲの少なくとも１つのサイクルによって作製される）ＳＧＰ核酸ポリマーと、ＳＧＰプライマーとを結合することを引き起こすことを可能にする。ＳＧＰ核酸ポリマー内の逆相補配列の存在およびＳＧＰプライマーの後の結合は、幾つかの異なる二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーのＰＣＲ様（すなわちｍＰＣＲ）の指数関数的増幅、すなわちＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれる二本鎖ゲノムＤＮＡの幾つかの異なる領域の指数関数的増幅を可能にする。

以下で詳細に記載するＳＧＰプライマーは、波形プライマーと幾つかの類似した特徴を共有しており、波形プライマーは例えば、特開２００３−３３４０８２号公報および特開２００３−１８０３５１号公報中に詳細に記載された。ＳＧＰプライマーはＳＧＰに必要不可欠であり、それらの長さによって特徴付けられる。ＳＧＰプライマーの長さは重要である。何故ならプライマーの短い長さは、プライマーがそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型の長さ部分に沿った幾つかの異なる部位と特異的に結合するのを可能にし、かつ短い長さは、その異なるヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマー配列の逆相補配列を含む５’→３’配列をＳＧＰ核酸ポリマーが有する確率を高く与えるからである。

ＳＧＰプライマーの特別な特徴は、最初のサイクル後のｍＰＣＲの各サイクル中であるＳＧＰ核酸ポリマーからのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的、すなわち非直線的な増幅をもたらすＳＧＰ法において、ＳＧＰプライマーを使用することを可能にする。ＳＧＰ中のｍＰＣＲの最初のサイクルは、以下の工程からなる、すなわち、１）ゲノムＤＮＡの各コピーを２つの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に変性させる工程と、２）ＳＧＰプライマーと、各一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の幾つかの異なるＳＧＰプライマー結合部位をアニーリングさせる工程と、３）各一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の異なるＳＧＰプライマー結合部位と結合した幾つかのＳＧＰプライマーのそれぞれからＳＧＰ核酸ポリマーを伸長させる工程であって、各ＳＧＰ核酸ポリマーが、そこからＳＧＰ核酸ポリマーが伸長している結合ＳＧＰプライマーを含む５’→３’ヌクレオチド配列、次に結合ＳＧＰプライマーの下流のゲノムＤＮＡ鋳型の配列と相補的な異なるヌクレオチド配列を有する工程と、からなる。

当業者は、伸長工程の「全時間」の間がＳＧＰ核酸ポリマーの長さを決定し、したがって、１サイクル中に形成されるＳＧＰ核酸ポリマーは、異なるヌクレオチド配列を持ち得るが、ほぼ同じ長さであり得ることを理解し得る。例えば、それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った１０^３個の部位にアニーリングするようにＳＧＰプライマーが設計されていると仮定し、かつ伸長工程の時間を調節して約１ｋｂ長のＳＧＰ核酸ポリマーが生成すると仮定すると、ＳＧＰ増幅の１サイクルは、鋳型当たり１０^３個の異なるＳＧＰ核酸ポリマーをもたらすと思われ、そのそれぞれは約１ｋｂ長であると思われる。当然ながら、プライマーがアニーリングするＳＧＰプライマー結合部位の１つが、ゲノムＤＮＡ鋳型の３’端から１ｋｂ未満に存在する場合、その部位と結合したＳＧＰプライマーからの伸長は、１ｋｂ未満のＳＧＰ核酸ポリマーを生み出すと思われる。さらに、ＳＧＰプライマー結合部位（例えば、部位「Ｂ」）が他のＳＧＰプライマー結合部位（例えば、部位「Ａ」）の１ｋｂ下流以内に存在する場合、１ｋｂ未満のＳＧＰ核酸ポリマーが部位Ａと結合したＳＧＰプライマーから生成すると思われる。

ＳＧＰでは、ｍＰＣＲのサイクルは２回以上、例えば１０〜１００回繰り返すことができる。それぞれのサイクルの変性工程中、ＳＧＰ核酸ポリマーは一本鎖になる、すなわちＳＧＰ核酸ポリマーはゲノムＤＮＡ鋳型とはもはや結合しないと思われる。ＳＧＰにおいて、ｍＰＣＲの後のサイクルのアニーリング工程中、その異なるヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む５’→３’ヌクレオチド配列を有する幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーは、ＳＧＰプライマーによって結合可能な状態である、すなわちこれらの幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーは、高次構造を形成しないことは重要である。高次構造の一部分としてあるいはＳＧＰプライマーとのＳＧＰ核酸ポリマーの結合は、幾つかの要因、例えばアニーリング温度、ＳＧＰ核酸ポリマーおよびＳＧＰプライマーの長さ、ならびに反応混合物中のＳＧＰ核酸ポリマーおよびＳＧＰプライマーの濃度に依存する。したがって、例えばＳＧＰプライマーの濃度を増大させることによって、ｍＰＣＲのアニーリング工程を操作することは、ＳＧＰ核酸ポリマーを含む高次構造の形成の防止を助長し得る。しかしながら、これらのよく知られている要因の調節は本発明の実施を助長し得るが、このような調節が絶対に必要とされるわけではない、何故なら、ＳＧＰ核酸ポリマーの安定性の要因はＳＧＰプライマーの設計に示されるからである。以下に示すように、非特異的安定部分を含まないＳＧＰプライマーを設計し、したがって、それぞれがその５’端にＳＧＰプライマーの配列を有するＳＧＰ核酸ポリマーは安定性がない、すなわち容易にプライマーと結合する傾向があると思われる。したがって、ＳＧＰプライマー配列、次にその異なるヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む５’→３’配列を有する幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーは、任意の高次構造の形成前にＳＧＰプライマーと優先的に結合し得る。

ＳＧＰプライマー配列、次にその異なるヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマーの逆相補配列を含む５’→３’配列を有する幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーとのＳＧＰプライマーの結合は、最初のサイクル後にＳＧＰのｍＰＣＲ増幅サイクルを引き起こす。ＳＧＰ核酸ポリマー上のその相補配列と結合するＳＧＰプライマーは、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーをもたらすＰＣＲ様反応を助長し、ポリマーのそれぞれは、ＳＧＰプライマーと同一の５’→３’配列の５’端側面およびＳＧＰプライマーの逆相補配列である５’→３’配列の３’端側面に位置するゲノムＤＮＡ鋳型の幾つかの異なる領域の、１つの配列と同一の配列を含むヌクレオチド配列を有する。したがって、それぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーはその３’端にＳＧＰプライマーと相補的な５’→３’配列を有するので、それぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、後のｍＰＣＲサイクルのアニーリング工程中の高次構造の形成前に、ＳＧＰプライマーによっても結合すると思われる。したがって、ｍＰＣＲの後のサイクルは、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的増幅を含むと思われる。

当業者は、全てのＳＧＰ核酸ポリマーは５’端にＳＧＰプライマー配列を含み得るが、わずか数パーセントのＳＧＰ核酸ポリマーが、その異なる５’→３’ヌクレオチド配列内のＳＧＰプライマー配列の逆相補配列をさらに含むことを理解し得る。ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸の増幅と関係がある幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーの割合は、ｍＰＣＲの「全時間の伸長工程」に使用される「全時間」の長さ、およびＳＧＰプライマーの設計などの、幾つかの容易に測定される要因に依存する。例えば、考えられるＳＧＰ核酸ポリマーは、５’端から約７５０塩基（０．７５ｋｂ）下流にＳＧＰプライマー配列の逆相補配列を有する可能性がある。この例では、ｍＰＣＲの全時間の伸長工程が１ｋｂのＳＧＰ核酸ポリマーを生成するように設定されていると、前と同様に仮定すると、後のｍＰＣＲサイクルは、その７５０塩基（０．７５ｋｂ）領域、すなわち元の１ｋｂのＳＧＰ核酸ポリマーが由来した二本鎖ゲノムＤＮＡの領域の一部分の同じ配列を有する二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの、ｍＰＣＲによる指数関数的増幅を開始し得る。この指数関数的増幅は、その５’端の１ｋｂ下流以内のＳＧＰプライマー配列の逆相補配列を含む５’→３’配列を有する任意の他の一本鎖ＳＧＰ核酸ポリマーのゲノム中の、他の位置でも起こり得る。したがって、完全長の伸長時間を増大させることによって、ＳＧＰ核酸ポリマーがそのヌクレオチド配列内に１つまたは複数のＳＧＰプライマー結合部位を含む確率が増大し得る。逆もまた真実である、完全長の伸長時間を減らすことによって、ＳＧＰ核酸ポリマーがその下流配列内に１つまたは複数のＳＧＰプライマー結合部位を含む確率が低下し得る。

それらの配列内にＳＧＰプライマー結合部位を含むＳＧＰ核酸ポリマーの割合は、例えば１００個のＳＧＰ核酸ポリマー中１個（すなわち１０^−２）が配列内にＳＧＰプライマー結合部位を含むように、プライマーを設計することによって操作することもでき、その完全な開示は以下に与える。このような例において、ＳＧＰプライマーがそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った１０^３個の部位にアニーリングする可能性があると、前と同様に仮定すると、それぞれの微生物に関して２×１０^３個の異なるＳＧＰ核酸ポリマーが生成すると思われ（すなわち、鋳型当たり１×１０^３個のＳＧＰ核酸ポリマー×微生物当たり２鋳型）、約２０の異なるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーが増幅され得る。当然ながら、プライマーが最初に結合する部位に対する逆相補配列の位置は、指数関数的に増幅されるそれぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの長さを決定し得る。さらに、任意のＰＣＲ様手順と同様に、本発明のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸の指数関数的増幅は、変性（ＳＧＰプライマーとのアニーリングに利用可能な一本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーをもたらす）、ＳＧＰプライマーのアニーリング（次サイクルの伸長を設定）、および伸長（次の増幅サイクルで増幅させる二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを生成する）を含むｍＰＣＲサイクルによって起こる。

Ｂ．半分の時間での伸長工程
前に示したように、ＳＧＰの波形プロファイリング法の最終目的として働く波形分析は、ゲノムの独自性を表す幾つかの異なる一本鎖核酸ポリマーの存在を必要とし、これらの核酸ポリマーは挿入剤と組み合わせて、後に検出することができる高次構造を形成する。

ＳＧＰでは、検出可能な高次構造は、１）ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的増幅が全時間の伸長工程を使用する数サイクルのｍＰＣＲによって実施され、かつ、２）半分の時間の伸長工程の導入によるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーからの一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの生成の後まで形成されない。一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの生成前に、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは二本鎖になると思われ、従来手段、例えば臭化エチジウムで染色したゲルの電気泳動、融解温度分析などによって検出することができる。しかしながら、高次構造を生成させるために、本発明は、（充分なｍＰＣＲサイクルが指数関数的に増幅したポリマーの充分なコピー、例えば１０^６〜１０^７個のコピーを生成した後に）「半分の時間の」増幅サイクルをｍＰＣＲ手順に導入して、それぞれの縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの幾つかのコピーを生成することができる。言い換えると、このｍＰＣＲサイクルの伸長工程の時間の量を例えば４０〜６０％減らすことによって、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー由来の核酸ポリマー、すなわち縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの部分集合は長さが減少する。縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、ポリマーの３’端にプライマー配列の逆相補配列をもはや含まないと思われるので、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは指数関数的に増幅しない可能性がある、すなわちそれらは一本鎖状態であり、検出することができる高次構造を後に形成すると思われる。

ＳＧＰプライマーの逆相補配列と同一の５’→３’配列を含まないＳＧＰ核酸ポリマー（すなわち、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーではない）は、ｍＰＣＲ増幅のいずれのサイクル中にもプライマーとは結合しないと思われ、したがって、高次構造を形成する可能性もあることを記さなければならない。しかしながら、以下に説明するように、１つの半分の時間での伸長工程は、それぞれ異なる縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの数個のコピーを生成する（何故ならこれらは、指数関数的に増幅したＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーに由来するからである）。対照的に、ＳＧＰプライマー結合部位を含む配列を有さないＳＧＰ核酸ポリマーは、比較的少ない初期量のゲノムＤＮＡから単に直線的に増幅される。したがって、高次構造の形成に対するこのようなＳＧＰ核酸ポリマーの貢献は、高次構造に対する縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの貢献と比較して無視できる程度のものである。

ＳＧＰにおいて生成される高次構造は、半分の時間での伸長工程の導入によって作製される縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを大部分が含み得る。例えばＳＧＰプライマーが、例えばそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の約１０^３個の部位にアニーリングすることができると、前と同様に仮定すると、最初のサイクル由来のＳＧＰ核酸ポリマーの合計数は、例えばゲノムＤＮＡのコピー当たり（すなわち、微生物当たり）約２×１０^３個のＳＧＰ核酸ポリマーである可能性がある。さらに、１００個のＳＧＰ核酸ポリマー中の１個がその配列中にＳＧＰプライマー結合部位を含む配列を有するようにプライマーが設計されたと、前と同様に再度仮定すると、そのそれぞれがＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれるゲノムＤＮＡ鋳型の幾つかの異なる領域の１個と同一である、約２０個のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、ｍＰＣＲによって指数関数的に増幅し、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの比較的多数のコピー（１個のゲノムＤＮＡで始めると２２〜２４ｍＰＣＲサイクル後に約１０^６〜１０^７個のコピー）をもたらすと思われる。指数関数的に増幅したＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの数、およびしたがってそれに由来する縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの数は、増幅サイクルが進行すると直線的増幅によって生成し続けるＳＧＰ核酸ポリマーの数より多いと思われる。

当業者は、ＳＧＰによって生成されるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの考えられる合計数は、ゲノムの大きさおよびプライマーの長さと関係があることを理解し得る。したがって、最初の増幅サイクル中に生成されるＳＧＰ核酸ポリマーの好ましい数は、半分の時間の伸長工程中に縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを生成することができるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの望ましい数（すなわち、高次構造の形成に利用可能な縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの望ましい数）の関数として測定することができる。以下でさらに詳細に記載するように、本発明のＳＧＰプライマーを設計する際に、このような測定は有用であると思われる。

高次構造の形成に利用可能な縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの望ましい数の測定において、当業者は、ｍＰＣＲによって指数関数的に増幅したＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの部分集合のみが、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの生成において使用され、このような部分集合は半分の時間の伸長工程中に完全に伸長し得ない長いＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを含むことを、理解し得る。ｍＰＣＲによって指数関数的に増幅するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの配列は、３’端にプライマーの逆相補配列のヌクレオチド配列を含むので、全時間の伸長工程はＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーのこの部分集合の伸長を完了するために必要であり、半分の時間の伸長工程は縮小ＳＧＰ核酸ポリマー、すなわち３’端にプライマーの逆相補配列を含まない核酸ポリマーを生成すると思われる。他方で、ｍＰＣＲによって指数関数的に増幅するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの幾つかは、これらの長いＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーより相当短い。半分の時間での伸長工程中に分配された時間内に完全に伸長するこのようなＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、任意の後のｍＰＣＲサイクルにおいて指数関数的に増幅し続けると思われる；何故なら以下に記載するように、これらのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは一般に、高次構造の一部になるとは思われないからである。ｍＰＣＲによる指数関数的増幅を経るＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの長さ部分内のＳＧＰプライマーの逆相補配列のランダムな位置を考慮すると、半分の時間での伸長工程の導入は、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを作製するために使用される約半分のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーをもたらすと思われる。

指数関数的に増幅するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの約５０％は、半分の時間の伸長工程によって伸長した部分内にＳＧＰプライマー結合部位を含まないと思われ、したがって縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの生成と関係があると思われる。縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは他のｍＰＣＲサイクル用のＳＧＰプライマーと結合することができる配列を含まないと思われるので、それらは高次構造を形成し得る。ｍＰＣＲによって指数関数的に増幅するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの他の約５０％は、ＳＧＰプライマー結合部位を依然として含み得る。さらに、二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰポリマーを作製するためのＳＧＰ−ＳＧＰポリマーと逆相補配列のアニーリングは、安定性があり早急に起こる傾向があるので、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは一般に、高次構造の形成に利用されないと思われる。

例えば、９塩基長のＳＧＰプライマーは７，０００の部位にアニーリングすることができ、生成するＳＧＰ核酸ポリマーは２，０００塩基長に伸長する可能性があると仮定すると、ゲノムＤＮＡの１．４×１０^７個の塩基、すなわち、例えば２×１０^９塩基長の一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型の１／１４２が、ＳＧＰ核酸ポリマーとしてコピーされ得る。ＳＧＰでは、これらの７，０００個のＳＧＰ核酸ポリマーの約５０〜７０個が、ＳＧＰプライマー結合部位を含み得る（１００個のＳＧＰ核酸ポリマー中の約１個が１個のＳＧＰプライマー結合部位を含むようにＳＧＰプライマーが設計されたと、前と同様に仮定する）。これらの約５０〜７０個のＳＧＰ核酸ポリマーは、ＳＧＰのｍＰＣＲ工程中に指数関数的に増幅するであろうＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを有効に生成し得る。ｍＰＣＲの２２〜２４サイクル後、および半分の時間の伸長工程後、（高次構造を形成し得る）約２５〜３５の異なる縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの数個（例えば１０^６〜１０^７個）のコピーが、指数関数的に増幅したＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーから生じると予想される。したがって半分の時間の伸長工程は、高次構造の形成用の縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを生成するだけでなく、さらに異なる長さのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーも識別する。

他の例として、ＳＧＰ中の全時間ｍＰＣＲサイクル中に指数関数的に増幅するＳＧＰ−ＳＧＰポリマー中の数個が１ｋｂ、０．８ｋｂ、０．６ｋｂ、０．４ｋｂ、および０．２ｋｂのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーであると仮定し、これらの反復ｍＰＣＲサイクル中の伸長工程の時間が、１ｋｂのポリマーを伸長させるのにちょうど充分であるとさらに仮定する。後の「半分の時間の」伸長工程中、生じる生成ポリマーはそれぞれ約０．５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．５ｋｂ、０．４ｋｂおよび０．２ｋｂであり得る。このｍＰＣＲサイクルが進行し、ＤＮＡの新たに伸長したポリマーがその個々の相補的鋳型鎖から変性すると、最初の３つの列挙したポリマー（すなわち、０．５ｋｂ長のポリマー、元来より長い長さ（１ｋｂ、０．８ｋｂ；および０．６ｋｂ）であった個々の鋳型鎖からコピーされたポリマー）は、それらの３’端にプライマー配列の逆相補配列を有していないと思われ、それらは全てほぼ同じ長さ（すなわち０．５ｋｂ）であり得る。これらの一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、波形プロファイルの作製に必要な高次構造を形成するために利用可能であり得る。しかしながら、０．４ｋｂおよび０．２ｋｂ長の個々の鋳型鎖から伸長したポリマーは完全長であり得る、すなわちプライマー配列の逆相補配列はこれらのコピーの３’端に存在すると思われ、ＰＣＲ増幅の後のサイクルは、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを、それらが高次構造の形成と関係可能でないように生成し続けると思われる。

Ｃ．単一ゲノム・プロファイルの検出
指数関数的増幅、すなわちｍＰＣＲがＳＧＰ法において使用されるので、当該ゲノムＤＮＡの多数のコピーで開始する必要はない。例えば、（非ＳＧＰ）波形プライマーがそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った１０^３個の部位と結合することができると仮定すると、（他の波形プロファイリング法は一般に、前に記載したように少なくとも１０^６の微生物で手順を開始することを必要とするので）、直線的増幅のサイクル当たりに生成される核酸ポリマーの合計数は、約２×１０^９である（ゲノムＤＮＡ鋳型当たり１０^３個の核酸ポリマー×微生物当たり２ゲノムＤＮＡ鋳型×１０^６の微生物）。他の波形プロファイリング法では、直線的増幅のサイクルは例えば２２〜２４回反復され得る（すなわち、２２〜２４組の２×１０^３個の異なる一本鎖を生成する）。対照的に、本発明の一実施形態は、ゲノム配列の１つのコピーが増幅プロセスの開始時にサンプル中に存在する（有効な抽出を仮定する）場合のみ、ＳＧＰ法による波形プロファイリングはおそらく実施することができるという事実と関係がある。数サイクル（例えば２２〜２４サイクル）のｍＰＣＲ増幅の後、ゲノムの１つのコピーで開始すると、ＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれるゲノムＤＮＡのそれぞれの異なる領域、すなわちそれぞれの異なるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸が、約１０^６〜１０^７倍コピーされると思われる（すなわち、約１０^６〜１０^７のコピーが存在すると思われる）。他の波形プロファイリング法を上回るこの改良は、例えばＳＧＰ法を使用するサンプル中の細菌の存在の検出および分類において、一層高い感受性を与える。

縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、ＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれるゲノムＤＮＡの領域と同一であるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーに由来するので、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーは、検出する微生物の独特な配列差異を含み得る。ＳＧＰでは、半分の時間の伸長工程中に生成される幾つかの一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーのそれぞれのコピーは、互いに相互作用して高次構造、すなわち幾つかの縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを含む複合体を形成し得る。高次構造は、縮小一本鎖の塩基配列に応じて、すなわち微生物の独特なゲノム情報に基づいて、異なる安定性を有し異なる融解温度（Ｔｍ）で解離し得る。微生物由来の高次構造のＴｍを測定および記録することができ、これは高次ＤＮＡ構造に挿入される蛍光剤、すなわち挿入剤を使用することによって実施される。したがってＳＧＰを使用して、波形プロファイリング分析、すなわち高次構造の解離の検出および記録により、異なる微生物のゲノムＤＮＡを検出、比較および区別することができる。

個々のサンプルの高次構造は、サンプルの温度を上昇させることによって解離させる。高次ＤＮＡ構造が解離すると、これらの高次構造中に挿入された蛍光剤も解離する。上昇する温度の関数として、これらの高次構造の解離によって得られる蛍光強度の変化率をプロットすることによって、微生物のゲノムＤＮＡに独特な波形が生成する、すなわち異なる融解温度（Ｔｍ）において高次ＤＮＡ構造が観察および記録されて、特徴的な波形プロファイルが生成する。サンプル中の微生物の存在を示す波形プロファイルを正の波形プロファイルと呼び、またサンプル中に微生物が存在しない場合は、負の波形プロファイルが生成する。

本発明の幾つかの実施形態では、適切な（正の）波形プロファイルの存在は、サンプル中の微生物の存在を示す。他の実施形態では、特徴的な波形プロファイルは特定の種（または菌株）の微生物、例えば細菌の種または菌株を示す。したがってＳＧＰ法は、挿入剤を使用して第１の微生物由来のゲノムＤＮＡと第２の微生物由来のゲノムＤＮＡを区別して、波形プロファイリング法を使用してそれぞれの微生物の独特な波形プロファイルを得ることができる。

前に記載したように、ＳＧＰのｍＰＣＲ工程は多サイクルの増幅、すなわち多サイクルの以下の工程：１）それぞれのゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ鋳型に変性させる工程、２）それぞれのゲノムＤＮＡ鋳型および任意の前に生成したＳＧＰ核酸ポリマーおよびＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーに沿った幾つかの異なるＳＧＰプライマー結合部位に、ＳＧＰプライマーをアニーリングさせる工程、および３）ＳＧＰプライマー結合部位にアニーリングしたそれぞれのプライマーからＳＧＰおよびＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを伸長させる工程を含む。詳細には増幅の１サイクル中に、サンプルの温度を（例えば９５〜９８℃に）上昇させて、任意の二本鎖核酸ポリマー（ゲノムＤＮＡ含む）を変性させる。その後温度を（例えば２５℃に）低下させて、ＳＧＰプライマーをいずれかの利用可能なＳＧＰプライマー結合部位にアニーリングさせる。サイクル中の最終工程、プライマーからのＳＧＰおよびＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの伸長は、例えばＴａｑポリメラーゼを使用して〜７２℃で実施する。最後に、増幅の最終サイクルの１つでは、伸長工程の時間の長さを例えば４０〜６０％（例えば５０％）減らして、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを生成させる。追加的な半分の時間の伸長工程を組み込んだ他のサイクルを本発明に含めて、より正確および／または確固たる波形プロファイルを生成することができ、これらのサイクルは生成物（例えば、本発明のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー）を増幅させるために含めた追加的な全時間の伸長工程を組み込んだ追加的サイクルを伴う可能性がある。

当業者は、増幅手順に固有の変性、アニーリング、および伸長工程に必要な温度の変更を含む反復サイクル工程が可能である装置または機器を利用することを熟知していると思われ；このような機器には、非制限的に、当技術分野で知られているＰＣＲ機器、および「Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＧＰ１０００」機器（Ａｄｇｅｎｅ）がある。本発明において必要なｍＰＣＲサイクル工程が可能であるデバイスを製造している他の会社には、非制限的に、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、またはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）がある。このような機器は、温度が変更およびリセットされるさまざまな工程のタイミングおよび時間を変えることができ、したがってこのような機器は、本発明の全時間の伸長工程および実質的に半分の時間の伸長工程を生み出す際に有用であり得る。さらに当業者は、抽出用試薬キット（その中で幾つかが当技術分野で知られている、例えばＸｔｒａｎａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、などＸｔｒａ Ａｍｐ（登録商標）抽出システム（Ｘｔｒａｎａ Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ、ＣＯ））、波形プロファイリングによって生じた結果を解釈するための分析用ソフトウェア（例えば、ＡｄｇｅｎｅによるＧｅｎｏＭａｓｔｅｒ）、およびプライマー設計支援ツール（例えば、いずれもＡｄｇｅｎｅによる、他の波形プロファイリング法において使用される「Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ Ｐｒｉｍｅｒ」、およびＧｅｎｏＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアなど）だけには限られないが、これらを含めた他の物質を利用して、微生物のゲノムＤＮＡを検出するためにＳＧＰを使用する、さまざまな態様を手助けすることができると思われる。当業者はＳＧＰに有用であるように、このようなソフトウェアおよび／またはツールのパラメータおよび／またはプロトコルを調節し得る。

Ｄ．単一ゲノム・プロファイリング用プライマー
ＳＧＰプライマーは、それがそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った幾つかの異なる部位と結合するように、当技術分野でよく知られている方法を使用して設計する。本発明の一実施形態では、ＳＧＰプライマーを使用して、微生物、例えば細菌およびウイルス由来の任意のゲノムＤＮＡの存在を検出する。本発明の他の実施形態では、特定の微生物、例えば特定の種または菌株の細菌の検出において使用するためにＳＧＰプライマーを調整する。当業者は、ゲノムＤＮＡの長さおよび配列を考慮することによって細菌、一般に特定の種または菌株の細菌のゲノムＤＮＡを検出するために使用する、ＳＧＰプライマーの長さおよび配列を決定することができる。当業者は、数種の細菌をそれらのゲノムＤＮＡの配列に関して調査して、大部分または全てのこれらの種を検出することができるプライマーの配列を推定すると思われ、この型のプライマーは時々「共通」プライマーと呼ばれる。共通ＳＧＰプライマー、および特定の種または菌株に特異的なＳＧＰプライマーは、当業者によって実施される簡単な実験的試験後に決定される。

当業者は、ＳＧＰプライマーの長さと、ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った幾つかのＳＧＰプライマー結合部位、すなわち相補配列と結合するその能力は逆関係にある、すなわちプライマーが短くなると、プライマーが結合するゲノムＤＮＡ鋳型沿いの異なるＳＧＰ結合部位の数が多くなることを理解し得る。逆にプライマーが長くなると、プライマーが結合するゲノムＤＮＡ鋳型沿いの異なるＳＧＰ結合部位の数は少なくなる。さらに、プライマー長に関する同じ分析は、ＳＧＰプライマーの相補配列およびＳＧＰプライマーの逆相補配列が、ゲノムＤＮＡ鋳型の長さ部分に沿って予め設定した距離（すなわち、予め設定したＳＧＰ核酸ポリマーの最大長）内に存在する確率に当てはまる。したがって、プライマーが短くなるほど、ＳＧＰプライマー結合部位の逆相補配列が、ＳＧＰプライマー結合部位から下流の予め設定した距離内に存在する可能性は高くなる。予め設定する距離は全時間の伸長工程を含む時間の長さによって決定し、プライマー結合部位の逆相補配列が予め設定した距離内に存在するとき、指数関数的増幅が起こり得る。ＳＧＰプライマーの短い長さに加えて、プライマーの配列内容によって影響を受けるおよび／またはそれと関係があるパラメータ、例えばプライマーの融解温度、プライマーのＧ／Ｃ含量、ＧＣ塊、プライマーの自己相補性などが、プライマーの設計において役割を果たす。これらのパラメータを有するプライマーを考慮して設計することは、当技術分野の一般的な方法となっている（例えば、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」課程の教材、スタンフォード大学において入手可能なＢｕｒｐｏ（２００１）「Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｄｅｓｉｇｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」（ｅｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ％２０２００１／Ｂｕｒｐｏ．ｐｄｆ）を概略的に参照のこと）。

したがって当業者は、ゲノムＤＮＡの長さおよび配列、ならびにプライマーの望ましい長さおよび特異性を考慮することによって、適切なＳＧＰプライマーを設計し得る。本発明の一実施形態では、ＳＧＰプライマーを、それが所定の頻度でそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型と結合するように設計する。本発明の他の実施形態では、所定の頻度でＳＧＰ核酸ポリマーの指数関数的増幅において、プライマーが正方向および逆方向プライマーとしても働くことができるように、ＳＧＰプライマーを設計する。

当業者は、ＳＧＰ用のプライマー（「共通」プライマー、ならびに特定の種および菌株の、例えば細菌の検出用プライマーを含む）を設計する際の手助けとして、他の波形プロファイリング法および（例えばＡｄｇｅｎｅから入手可能な）波形プライマーの作製と関係がある、物質およびソフトウェア・プログラムにも目を通し得る。しかしながら当業者は、プライマーを設計するため、ＳＧＰにおいて正しく機能するプライマーを生成するために、他の波形プロファイリング法と関係がある技法およびパラメータを精製することが必要であることを理解し得る。例えば、他の波形プロファイリング法は、特異的部分と非特異的安定部分の両方を含むプライマーを利用し、本発明のＳＧＰプライマーは非特異的安定部分を含まない。さらに当業者は、（他の波形プロファイリング法中のプライマーと比較して）それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型に沿った多数の結合部位と結合することがＳＧＰプライマーにとって必要であり、それは少なくとも部分的には、わずかな割合のＳＧＰ核酸ポリマーがプライマー結合部位から下流の予め設定した距離内にプライマーの逆相補配列を含む配列を有する、すなわち、わずかな割合のＳＧＰ核酸ポリマーが指数関数的増幅を経て、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーをもたらすためであることを、理解し得る。さらに、指数関数的増幅を経るわずかな割合（例えば約５０％）のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーが、半分の時間での伸長工程中に縮小ＳＧＰ核酸ポリマーをもたらし得る。

ＳＧＰ用プライマーは、他の波形プロファイリング法（または標準的なＰＣＲにおいて使用される方法）において使用されるプライマーより短い（塩基が少ない）ように設計する、何故ならＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーが生成する確率は、プライマー長が短くなると増大するからである。この理由のため当業者は、他の波形プロファイリング法に関して提案／推奨されるプライマーより、短い長さのプライマーを設計し得る。例えばＡｄｇｅｎｅは、「Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡｓ ａｎｄ ＲＮＡｓ ｂｙ Ｐａｔｔｅｒｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄ」（Ａｄｇｅｎｅから入手可能）の図４中に波形プライマーの一例を示す。この波形プライマーは、１１塩基の非特異的安定部分および８塩基の特異的部分を含む。当業者は非特異的部分を除外することによってＳＧＰ用プライマーを設計すると思われ、さらにＡｄｇｅｎｅの波形プライマーの特異的部分中の塩基数より少ない数に、全ＳＧＰプライマー中の塩基数を減らすことができる。例えば、ＳＧＰ中で使用するための６または７塩基長のプライマーを設計することができると思われる。個々の波形プライマーの特異的部分がより多くの塩基を含む他の実施形態では、対応するＳＧＰプライマーに関する設計も、したがってより多くの塩基を含み得る。

ＳＧＰ法によって検出することができる細菌は、それ用の共通波形プライマーが既に設計されている細菌であり、このようなプライマーは当技術分野で知られており、腸炎ビブリオ、緑膿菌、サルモネラ・チフィムリウム、肺炎かん菌、カンピロバクター・ジェジュニ、シゲラ・ソンネイ、エンテロコッカス・フェカーリス、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、化膿連鎖球菌、ウシ型結核菌、大腸菌、バシラス・セレウス、黄色ブドウ球菌、およびバシラス・サチリスを検出する際に有用である。個々の種および菌株の細菌を区別するためにそのうちの幾つかを使用することができる他のプライマーも、他の波形プロファイリング法において使用するためにＡｄｇｅｎｅから入手可能である。前述のように、当業者はプライマーの設計を変えて、またはプライマーを設計する方法を変更して、知られている波形プライマーに基づくＳＧＰにおいて有用なプライマーを生成し得る。さらに当業者は、当該微生物のゲノム物質を分析することによって、および一連の簡単な実験的試験を実施することによって、それ用の波形プライマーが設計されていない微生物用（例えば、他の細菌およびウイルス用）の適切なＳＧＰプライマーを設計し得る。

当業者は、サンプル、例えば水サンプルを試験する際のＳＧＰの適用性を理解し得る。微生物、およびしたがって微生物のゲノムを単離するための方法はサンプルに依存すると思われ、それらは当技術分野でよく知られている。ひとたび可能性のあるゲノムＤＮＡを単離した後、ＳＧＰ法を使用してゲノムＤＮＡの存在、したがって微生物の存在を検出することができる。幾つかの状況では、例えばサンプル、例えば水サンプルが滅菌または比較的汚染がない状態でなければならないとき、このような検出は微生物による汚染を検出するのに充分である。微生物の分類が必要とされる場合、他のより特異的なＳＧＰプライマーを使用することができる。

本発明の幾つかの実施形態を本明細書で論じる。本発明の一実施形態の基盤、すなわちサンプル中に汚染生物が存在しないたは存在することを検出するための系の基盤は、実施例１中で見られる。本発明の適用例は実施例２中で見られる。当業者は、さまざまなサンプルに関する品質保証を与える際の、例えば、供給水中に細菌が存在しないことまたは存在することを検出するための、これらの系の有用性を理解し得る。さらに、本発明を使用して異なるサンプル中の遺伝子が存在しないことまたは存在することおよび他のヌクレオチドの長さを分析することができることは、当業者によって理解され得る。例えば、当業者は本発明を使用して、供給空気から濾過したサンプル中または血液のサンプル中の炭そ菌を検出し分類することができ、あるいはさまざまな食品にコーティングされたウイルスを検出し分類することができる。本発明は、以下に記載する特定の実施例の範囲に限られると解釈すべきでない。

［実施例１］
改変型ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）および半分の時間での伸長工程を含む単一ゲノム・プロファイル（ＳＧＰ）法
以下に与えた実施例および図は、当業者が本発明を理解するのを手助けし、ならびに本明細書に記載した改良を示すために与える理論構成である。図１は、ＳＧＰ法を含めた波形プロファイリング法の最初のサイクルを示し（図１Ａ）、ＳＧＰ法（図１Ｂ）および他の波形プロファイリング法（図１Ｃ）の後のサイクルの結果を比較する流れ図である。この流れ図は検出するゲノムＤＮＡの１コピーの使用を表すことを、記さなければならない。しかしながら、前に論じたように、ＳＧＰ法に関してのみ、この量のゲノムＤＮＡが検出可能な高次構造を形成するのに充分であり得る。

本発明をさらに実証するために、理論上のプライマー配列と理論上のゲノム配列の両方を、それぞれ実施例１．１および実施例１．２に与えて、どのようにして充分短い長さのプライマーが、それぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型の長さに沿った幾つかの異なるプライマー結合部位と結合することができるかを実証する。次いで実施例１．３は、本明細書に記載したＳＧＰ法によって当業者を手引きし、ＳＧＰ法の各工程後に予想されるそれぞれの核酸ポリマーの配列を与え、本発明の改良を示すのを手助けする。本明細書に示した実施例は、本発明の範囲を制限するものとして解釈または理解すべきではない。

実施例１．１
理論上のプライマー配列
本明細書で与えたモデルでは、プライマーは５’−ＡＧＣ−３’である。

実施例１．２
理論上のゲノム配列
４つのＤＮＡヌクレオチド塩基（アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」、およびシトシン「Ｃ」）をランダムな順序および頻度で含む、１００１ｂｐのゲノム配列（その中で２つの鎖を、それぞれ配列番号１および配列番号２として述べる）を、コンピュータ・プログラムを使用することによって作製した。この理論上のランダムに作製した配列の数個の塩基を変えて、ＳＧＰ法をさらに明確に実証する配列を得た。二本鎖ゲノムＤＮＡの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型のそれぞれの配列を、図２中に示す。一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型の１つの配列は５’→３’で示し、ヌクレオチド塩基に対応する大文字によって表し、配列番号１として述べる；相補的な一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型は３’〜５’で示し、ヌクレオチド塩基に対応する小文字によって表し、配列番号２として述べる。それぞれのゲノムＤＮＡ鋳型上の太字は、実施例１．１の理論上のプライマーがアニーリングすると予想される部位、すなわちプライマー結合部位を示す。図２中の括弧付けした領域は、プライマー結合部位によって囲まれる理論上のゲノムＤＮＡの幾つかの異なる領域を示し、そのそれぞれはＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの形で指数関数的に増幅し得る（例えば、図５参照）。

実施例１．３
改変型ＰＣＲおよび半分の時間の伸長工程を含むＳＧＰ法
実施例１．１のプライマーは、実施例１．２のゲノムＤＮＡに沿ったそれぞれのプライマー結合部位にアニーリングすると予想される。ｍＰＣＲの最初のサイクルはゲノムＤＮＡを２つのゲノムＤＮＡ鋳型に変性させることで始め、これは〜９５〜９８℃で約２分間実施する。プライマーとそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の幾つかの異なる相補部位、すなわちプライマー結合部位のアニーリング後、変性を続ける。アニーリングは〜２５℃で約２分間起こる。プライマーがそれぞれの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上の幾つかの異なる相補部位にアニーリングした後、ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼは、プライマーの３’端で始まり５’→３’方向に延長し、異なる核酸ポリマー、すなわちＳＧＰ核酸ポリマーを伸長させる。伸長は〜７２℃で約２分間起こり、このように、このｍＰＣＲの理論上の最初のサイクルでは、２１塩基以下のＳＧＰ核酸ポリマーが生成する。

実施例１．１および１．２の理論上のプライマーおよびゲノムＤＮＡ配列を用いるｍＰＣＲの最初のサイクルの説明は、図３Ａ、Ｂおよび４中に表す。図３Ａ、Ｂは、２つの変性した一本鎖ＤＮＡ鋳型として（図２中にも示した）理論上のゲノムＤＮＡ配列を示す。一本鎖ＤＮＡ鋳型の１つの配列は図３Ａ中に５’→３’および大文字によって示し（配列番号１）、相補的一本鎖ＤＮＡ鋳型の配列は図３Ｂ中に３’〜５’および小文字によって示す（配列番号２）。さらに太字は、予想されるプライマーのアニーリング部位を示す。ＳＧＰ核酸ポリマーが増幅の最初のサイクル中に由来すると予想されるゲノムＤＮＡの領域は、１）プライマーとプライマー結合部位の結合を示すための、それぞれのプライマー結合部位の下の理論上のプライマー配列に対応する文字、２）ＳＧＰ核酸ポリマーの伸長の方向を示す矢印、および３）伸長したＳＧＰ核酸ポリマーの予想される長さを示す陰影によってそれぞれのゲノムＤＮＡ鋳型の下に表す。増幅の最初のサイクル後にそれぞれのゲノムＤＮＡ鋳型から生じると予想されるＳＧＰ核酸ポリマーの配列は、図４に挙げる。示したように、幾つかのＳＧＰ核酸ポリマーの配列は、（太字配列によって表される）ＳＧＰプライマー結合部位を含む。

増幅の第２およびその後のサイクルの変性工程中、（図４中に示すような）ＳＧＰプライマー結合部位を含む配列を有するＳＧＰ核酸ポリマーは、それぞれのゲノムＤＮＡ鋳型から分離すると思われ、後のアニーリングおよび伸長工程に関与する、すなわちそれらは高次構造を形成しないと思われる。したがって、第２およびその後の増幅サイクルでは、図４中に述べるＳＧＰ核酸ポリマー以外に、図５中に述べる一組のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーが合成および増幅されると思われる。

当業者は、図５中に述べるそれぞれの配列、すなわちそれぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー配列は、（図２中の括弧で示すように）プライマー結合部位によって囲まれる、すなわちＳＧＰプライマー配列およびＳＧＰプライマー配列の逆相補配列によって囲まれる、ゲノムＤＮＡ鋳型の幾つかの領域の１つと同一であることを容易に理解し得る。当業者は、増幅の後のサイクルが図５中に挙げた配列の指数関数的倍増をもたらすことも理解し得る。２２〜２４サイクル後に、図５中に挙げたそれぞれの異なるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの、約１０^６〜１０^７のコピーがゲノムの１コピーから生じると見積もられる。

図５中に挙げたＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの幾つかの３’端が、伸長時間が減少するためにコピーされないように、全時間の伸長工程を含む数回、例えば２２〜２４回のｍＰＣＲサイクル後に「半分の時間」での伸長工程を含める。「半分の時間」での伸長工程は、前の全時間の伸長工程で使用した時間の長さの約４０〜６０％、例えば前に使用した伸長工程の時間の長さの５０％であり得る。

この実施例では、半分の時間の工程中の伸長は〜７２℃で約１分間起こる。このような伸長時間は、１０塩基対までの重合を可能にする。このように、（図５中に挙げた）以下の配列の１つを有するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー由来の核酸ポリマーのみが、それがプライマー結合部位：３’−ｔｃｇａ−５’（配列番号３６として述べる）、３’−ｔｃｇｃｃｃｃｃｇａ−５’（配列番号３７として述べる）、５’−ＡＧＣＴ−３’（配列番号４０として述べる）、または５’−ＡＧＣＧＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号４１として述べる）を含むように完全に伸長すると思われる。このようなＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、高次構造の形成に関与しないと思われる。

対照的に、（図５中に挙げた）以下の配列の１つを有するＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーから半分の時間の伸長工程中にコピーされる核酸ポリマーは、縮小ＳＧＰ核酸ポリマーであると思われる、すなわちそれはプライマー結合部位：３’−ｔｃｇｇｇｔｔｔｃｃｃｇｇａａｇｃｃｇａ−５’（配列番号３５として述べる）、３’−ｔｃｇｇｃｔａｃｔａｃｇｇａａｃｇａ−５’（配列番号３８として述べる）、５’−ＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴ−３’（配列番号３９として述べる）、または５’−ＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号４２として述べる）を含む配列を有さないと思われる。半分の時間の伸長工程後の図５中に挙げたＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーに由来すると予想される、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーおよび縮小ＳＧＰ核酸ポリマーの配列は、図６中に挙げる。縮小ＳＧＰ核酸ポリマー、すなわちＳＧＰプライマー結合部位を有さず高次構造の形成に関与すると思われるポリマーは図６中で下線を引き、以下のような配列：５’−ＡＧＣＣＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号４３として述べる）、５’−ＡＧＣＣＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号４６として述べる）、３’−ｃｇｇａａｇｃｃｇａ−５’（配列番号４７として述べる）および３’−ｔａｃｇｇａａｃｇａ−５’（配列番号５０として述べる）を有する。

全時間の伸長工程の代わりに半分の時間での伸長工程を含む後のｍＰＣＲサイクルは、相補鎖を有しておらず、したがって高次構造を形成すると思われる、一本鎖縮小ＳＧＰ核酸ポリマーを生成する。これらの高次構造は、Ｔｍ分析（波形プロファイリング）を実施することによって検出することができる。対照的に、縮小ＳＧＰ核酸ポリマー、例えば５’−ＡＧＣＴ−３’は、半分の時間の伸長工程を含むｍＰＣＲ中に完全に伸長すると思われる。したがって、完全な相補的ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは半分の時間の伸長工程中に常に形成すると思われるので、これらの縮小ＳＧＰ核酸ポリマーはそれらの相補的核酸ポリマーと結合し、高次構造の形成に関与しないと思われる。

［実施例２］
ＳＧＰプライマーの設計および実施
ＳＧＰプライマーを設計して、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得たゲノムＤＮＡに関する異なる波形プロファイルを作製した；試験したゲノムＤＮＡは、４つの密接に関連がある細菌、大腸菌（ＡＴＣＣ＃１０７９８Ｄ）、エンテロバクター・クロアカ（ＡＴＣＣ＃１３０４７Ｄ）、サルモネラ・エンテリティディス（ＡＴＣＣ＃７００７２０Ｄ）、およびプロビデンシア・スチュアルティ（ＡＴＣＣ＃３３６７２Ｄ）由来のものであった。ＳＧＰ核酸ポリマーを生成すると思われる大腸菌ゲノム内のＳＧＰプライマー結合部位の数を計算することによって、特異的なＳＧＰプライマー配列を選択した。

実施例２．１
ＳＧＰプライマーの設計
８ヌクレオチド長のＳＧＰプライマーを２つの理由で選択した。第１に、４つ全てのヌクレオチド（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）をランダムに使用して８塩基長のＳＧＰプライマーを作製する場合、６５，５３６の考えられる配列の組合せが存在する。したがって、８ｂｐである任意のＳＧＰプライマーは、６５，５３６塩基毎の１箇所のそのちょうど相補的な配列と結合し得ると理由付けした。第２に、大腸菌ゲノムは約５百万塩基を含み、したがって８塩基対長のＳＧＰプライマーは、ゲノム上の７６箇所に理論上結合し得る。

他の制約を定義して、ＳＧＰ核酸ポリマーの伸長および１つのＳＧＰプライマーによるＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの増幅を最大にした。例えばＳＧＰプライマーは、ＳＧＰプライマー結合部位によって囲まれる大腸菌ゲノム上の異なる領域が５，０００塩基以内に存在し、正しい方向に存在してＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを生成するように留意して設計した。考えられるＳＧＰプライマーに関して、（受託番号Ｕ０００９６でＧｅｎＢａｎｋにおいて述べられる）大腸菌ゲノム上の実際のＳＧＰプライマー結合部位の数を、ＮＩＨによって与えられたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）プログラムを使用して測定した。このプログラムは、プライマー結合部位であった大腸菌ゲノム内の位置を報告した。よく知られているパラメータ、例えばそれ自体がハイブリダイズする可能性がある任意のプライマーの除外によるプライマー二量体の形成の防止によって、プライマー設計はさらに制約を受けた。

実施例２．２
ＳＧＰプライマーの実施
８個の候補ＳＧＰプライマーのうち、２個が４つ全ての試験細菌を含む増幅ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを生成した。この２個のプライマー配列は５’−ＧＣＧＡＧＧＡＴ−３’（ＤＪＢ７；配列番号５１として述べる）および５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣ−３’（ＤＪＢ８；配列番号５２として述べる）である。Ｂｌａｓｔの結果は、ＤＪＢ７は５，０００塩基内のプライマー結合部位および逆プライマー相補結合部位を有する５つの遺伝子座において大腸菌ゲノムとハイブリダイズし、ＤＪＢ８は１０個のこのような遺伝子座において大腸菌ゲノムとハイブリダイズすると予想した。ＤＪＢ７またはＤＪＢ８プライマーを使用する実験によって、臭化エチジウムで染色した１％アガロース・ゲルを使用するゲル電気泳動によって異なる反応条件下で、増幅したＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの大きさおよび数を比較した。最初に、増幅（すなわち、１または複数サイクルの変性、アニーリング、および伸長）を、１×Ｔａｋａｒａ ＰＣＲバッファー、３００ｎＭのそれぞれのｄＮＴＰ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、２．５単位のＴａｋａｒａポリメラーゼ（いずれもＴａｋａｒａ Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）、ならびに１００ｎｇまたは２５０ｎｇのＤＮＡと共に、５μＭのＤＪＢ８プライマー（５’−ＧＧＣＡＣＴＧＣ−３’）を用いて実施した。３０サイクルの３０秒間９４℃での変性、３０秒間２５℃でのアニーリング、および３０秒間７２℃での伸長を実施して、４個の細菌ＤＮＡのそれぞれおよびヒトＤＮＡ（対照として；Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ３０４１）から二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを生成させた。

前に記載した条件、ＤＪＢ７またはＤＪＢ８のいずれか、および異なる細菌ゲノムを使用する波形プロファイリングは、異なる大きさの増幅二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー、すなわちそれぞれの細菌種に特異的な１つの型をもたらした（データ示さず）。さらに、ヒトのゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から増幅させたＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー生成物は、いずれかのプライマーを使用したとき検出不能であった（データ示さず）。これらの結果は、ＳＧＰプライマーを施用して異なる細菌ＤＮＡ、ならびにさらに細菌ＤＮＡとヒトＤＮＡを検出および区別することができることを示す。

２つのＳＧＰプライマーの１つおよび細菌ＤＮＡ鋳型（対照としてヒトのゲノムＤＮＡを含む）を使用する、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの増幅を最適化した。８塩基のＳＧＰプライマーを用いる首尾よい増幅に関する幾つかの重要なパラメータは、１）低いアニーリング温度、２）高濃度のプライマー、および３）多数の増幅サイクルであった。最終的な最適条件は、１×Ｔａｋａｒａ ＰＣＲバッファー、３００ｎＭのそれぞれのｄＮＴＰ、５．０ｍＭのＭｇＣｌ_２、５。０μＭのＳＧＰプライマー、２．５単位のＴａｋａｒａポリメラーゼ、および１ｎｇの鋳型ＤＮＡとして定義した。最適なサイクル条件は、４０サイクルの１分間９４℃での変性、１分間２５℃でのアニーリング、および１分間７２℃での伸長として定義した。

ＤＪＢ７またはＤＪＢ８のいずれかを用いた増幅（それぞれ図７Ａおよび図７Ｂ）は、異なる細菌ＤＮＡを互いに、かつ／あるいは細菌ＤＮＡとヒトＤＮＡを区別するために使用することができる、異なる型の二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーを生成した。本発明のＳＧＰプライマーを本発明の波形プロファイリング法において使用して異なる型の増幅ＤＮＡを生成することができ、微生物が少数で存在する場合でも、これらの異なる型の検出を使用してその微生物を検出および／または分類ことができることをデータは示す。

異なる型の二本鎖ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーは、上昇する温度に応じた挿入剤色素（例えばＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ）の放出による蛍光の変化をモニターすることによって検出することもできる、すなわち、本発明のＳＧＰプライマーおよび本発明のＳＧＰ法を使用して作製した波形プロファイルは、融解温度分析によって検出することができる。さらに当業者は、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーから生じる縮小ＳＧＰ核酸ポリマーが、融解温度分析によっても検出することができる高次構造を形成することができるように、半分の時間の伸長工程を組み込むことができることを理解し得る。

波形プロファイリング法および単一ゲノム・プロファイリング法の工程、およびそこから生じる核酸ポリマーを示す流れ図である。 図１Ａの続きの図であり、波形プロファイリング法および単一ゲノム・プロファイリング法の工程、およびそこから生じる核酸ポリマーを示す流れ図である。 図１Ａの別の続きの図であり、波形プロファイリング法および単一ゲノム・プロファイリング法の工程、およびそこから生じる核酸ポリマーを示す流れ図である。 理論上のゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列の図である。 ２つの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型への変性を示す図２のゲノムＤＮＡ、およびそれぞれの変性一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上のプライマー結合部位にアニーリングした理論上のプライマーを示す図（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）であり、矢印はＳＧＰ核酸ポリマーが由来するそれぞれのゲノムＤＮＡの領域中のＳＧＰプライマー配列の伸長を示す図である。 ２つの一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型への変性を示す図２のゲノムＤＮＡ、およびそれぞれの変性一本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型上のプライマー結合部位にアニーリングした理論上のプライマーを示す図（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）であり、矢印はＳＧＰ核酸ポリマーが由来するそれぞれのゲノムＤＮＡの領域中のＳＧＰプライマー配列の伸長を示す図である。 図３Ａ、３ＢのゲノムＤＮＡおよびプライマーを使用して作製した、それぞれのＳＧＰ核酸ポリマーの配列の図である。 図４のＳＧＰ核酸ポリマーのｍＰＣＲ増幅後に作製した、それぞれのＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの配列の図である。 図５のＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーに半分の時間の伸長工程を施した後に作製した、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマー（下線なし）および縮小ＳＧＰ核酸ポリマー（下線あり）の配列の図である。 ＳＧＰプライマーＤＪＢ７を使用して、４つの異なる細菌ゲノムＤＮＡ標的（レーン１〜８）およびヒトのゲノムＤＮＡ標的（レーン９および１０）の、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの異なるパターン（レーン１〜１０）が生じることを示す図であり、分子量ラダー（レーンＭ）は、１％アガロース・ゲル上での大きさによる選択したＤＮＡ分子の分離を示す図である。 ＳＧＰプライマーＤＪＢ８（図７Ｂ）を使用して、４つの異なる細菌ゲノムＤＮＡ標的（レーン１〜８）およびヒトのゲノムＤＮＡ標的（レーン９および１０）の、ＳＧＰ−ＳＧＰ核酸ポリマーの異なるパターン（レーン１〜１０）が生じることを示す図であり、分子量ラダー（レーンＭ）は、１％アガロース・ゲル上での大きさによる選択したＤＮＡ分子の分離を示す図である。

Claims (19)

1. ＤＮＡを指数関数的に増幅させる方法であって、
   （ａ）ＤＮＡ、ＤＮＡの複数の箇所に結合し、正方向プライマー及び逆方向プライマーとして機能するＳＧＰ（Single Genome Profiling:単一ゲノム・プロファイリング）プライマーの多数のコピー並びに他の増幅試薬を適切な濃度で含むポリメラーゼ連鎖反応用の増幅混合物を形成する工程と、
   （ｂ）ＤＮＡを１０〜１００回の変性、アニーリング及び伸張を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅して第１の増幅産物を生産する工程、ここで、伸張は第１の長さの時間行われ、第１の増幅産物は（ｉ）５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有しない、一本鎖の、第１の直線的な増幅産物、及び（ｉｉ）５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有する、二本鎖の、第１の指数関数的な増幅産物を含む、工程と、
   （ｃ）前記第１の指数関数的な増幅産物を、１回またはそれ以上の変性、アニーリング及び伸張を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、第２の増幅産物を生産する工程、ここで、伸張は前記第１の長さの時間の４０〜６０％の長さである第２の長さの時間行われ、第２の増幅産物は、前記第１の指数関数的な増幅産物から得られる第２の直線的な増幅産物を含み、第２の直線的な増幅産物は５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有せず、第１の指数関数的な増幅産物よりも短く、かつ一本鎖であることを特徴とする方法。
2. （ｄ）前記増幅混合物を冷却して前記第２の直線的な増幅産物の重複体を形成する工程、
   をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 工程（ｂ）の増幅は２０〜５０回行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｂ）の増幅は３０〜４０回行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記第２の長さの時間は前記第１の長さの時間の５０％の長さであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 工程（ｃ）の増幅は１回または複数回行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 前記ＳＧＰプライマーが、配列番号５１として示されるヌクレオチド配列と、配列番号５２として示されるヌクレオチド配列とからなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の方法。
8. 少なくとも１つの増幅された産物を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 検出剤を加える工程をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. 前記検出する工程が融解温度分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. サンプル中の微生物の存在を測定する方法であって、
    （ａ）前記サンプルを取得する工程と、
    （ｂ）前記サンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
    （ｃ）前記ＤＮＡ、ＤＮＡの複数の箇所に結合し、正方向プライマー及び逆方向プライマーとして機能するＳＧＰプライマーの多数のコピー、並びに他の増幅試薬を適切な濃度で含むポリメラーゼ連鎖反応用の増幅混合物を形成する工程と、
    （ｄ）ＤＮＡを１０〜１００回の変性、アニーリング及び伸張を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅して第１の増幅産物を生産する工程、ここで、伸張は第１の長さの時間行われ、第１の増幅産物は（ｉ）５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有しない、一本鎖の、第１の直線的な増幅産物、及び（ｉｉ）５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有する、二本鎖の、第１の指数関数的な増幅産物を含む、工程と、
    （ｅ）前記第１の指数関数的な増幅産物を、１回またはそれ以上の変性、アニーリング及び伸張を含むポリメラーゼ連鎖反応により増幅して、第２の増幅産物を生産する工程、ここで、伸張は前記第１の長さの時間の４０〜６０％の長さである第２の長さの時間行われ、第２の増幅産物は、前記第１の指数関数的な増幅産物から得られる第２の直線的な増幅産物を含み、第２の直線的な増幅産物は５’末端に前記ＳＧＰプライマーの配列を有し、３’末端にＳＧＰプライマーの逆相補配列を有せず、第１の指数関数的な増幅産物よりも短く、かつ一本鎖である、工程と、
    （ｆ）前記工程（ｅ）後の増幅混合物を冷却して前記第２の直線的な増幅産物の重複体を形成する工程、
    （ｇ）前記第２の直線的な増幅産物の重複体の存在または存在しないことを検出し、前記重複体が存在することによって微生物の存在を決定する工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
12. 前記第２の長さの時間は前記第１の長さの時間の５０％であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 工程（ｄ）の増幅は２０〜５０回行われることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
14. 工程（ｄ）の増幅は３０〜４０回行われることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 工程（ｅ）の増幅は１回または複数回行われることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
16. 工程（ｄ）と工程（ｅ）とで、伸張が行われる温度は同じ温度であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
17. 検出剤を加える工程をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
18. 前記検出する工程が融解温度分析を実施する工程を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記ＳＧＰプライマーは、配列番号５１のヌクレオチド配列と配列番号５２のヌクレオチド配列とからなる群から選択されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。