JPWO2005005664A1

JPWO2005005664A1 - 核酸の検出方法および同定方法

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Publication number: JPWO2005005664A1
Application number: JP2005511598A
Authority: JP
Inventors: 根本　健; 健根本; 大島　譲二; 譲二大島
Original assignee: G&G Science Co Ltd
Current assignee: G&G Science Co Ltd
Priority date: 2003-07-15
Filing date: 2004-07-09
Publication date: 2006-08-24
Also published as: WO2005005664A1

Abstract

１プライマーで１本鎖核酸核を合成し、その相互干渉産物の解離曲線波形パターンから核酸の検出および同定を行う方法は有用であるが、１本鎖合成核酸の低合成効率から検出感度に問題があったが、低温アニーリングで検出感度を高めるための特異性の低い１本鎖核酸を特異性の高い目的１本鎖核酸とともに合成し、高温アニーリングで特異性の高い目的１本鎖核酸のみを合成して両者共存下に１本鎖核酸相互干渉産物を形成させ、その解離曲線波形パターンから高感度かつ特異的な核酸を検出および同定を実現した。また、検出感度を高めるための合成１本鎖核酸を添加することにより、高温アニーリングで合成された特異性の高い目的１本鎖核酸との両者共存下に合成１本鎖核酸相互干渉産物を形成させることから、高感度かつ特異的な核酸を検出および同定を実現した。

Description

本発明は、任意の塩基配列を有する核酸を高感度に検出および同定するため、低温度アニーリング条件下で相対的に特異性の低い１本鎖核酸を合成、高温度アニーリング条件下で相対的に特異性の高い１本鎖核酸を合成、前者と後者の合成産物を混在させることにより、あるいは合成１本鎖核酸の添加により１本鎖相互干渉物の物理量を増加させ、特異度および高感度を実現し、なおかつこれらを１種類のプライマーで実施する核酸検出および同定法に関する。

従来、核酸を増幅する方法としては、酵素ＤＮＡポリメラーゼを触媒として２本鎖ＤＮＡの特定の部位の一方の鎖の一端と他方の鎖の他端とを結合する相補的な特異プライマーを使用して目的核酸を増幅させるポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が広く用いられている。ＰＣＲ法の原理は、２本鎖のＤＮＡを鋳型とし、特定領域を挟む２本のプライマー鎖のＤＮＡポリメラーゼによる伸長をくり返すことにより、プライマー間のＤＮＡ断片を増幅するもので、このＰＣＲ法を基盤にさまざまなＤＮＡ、ＲＮＡ解析技術が考案されている（例えば、特公平４−６７９５７および関谷剛男、蛋白質核酸酵素、第４１巻、Ｎｏ．５，４１５（１９９６）参照）。このＰＣＲ法では、プライマーの鋳型ＤＮＡに対する特異性を高め、全ＤＮＡ中の特定の部位のみを認識するために、１つのＰＣＲ産物のみが増幅される。また、遺伝性疾患、癌性疾患或いは伝染性疾患等の遺伝子診断の用途で核酸中の特定配列の存在を検出するために、標的核酸の塩基配列に相補的プライマーを用いて、僅かしか含まれていない核酸配列を増幅して検出する技術が開示されている（例えば、特公平４−６７９６０参照）。

２本鎖核酸又はＰＣＲ法で増幅された２本鎖の増幅産物に温度をかけていくと各々１本鎖に解離するが、この急激に解離する温度点をＴｍ（ＭｅｌｔｉｎｇＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）という。本件発明者らは、先に出願した特許明細書及び図面において、核酸にサイバーグリーン等のインターカレーター色素を添加して核酸増幅を行い、このＴｍ値と該Ｔｍ値を観察した溶解曲線（ＭｅｌｔＣｕｒｖｅ）、或いは該溶解曲線を微分して得られた解離曲線（ＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＣｕｒｖｅ）等の解離曲線波形パターンとから核酸を同定する技術を提案している（特開２００３−１８０３７４）。さらに、１種類のプライマーを用いて１本鎖核酸を同時かつ複数領域で合成し、その相互干渉産物の解離曲線を解離曲線波形パターンとして認識し、核酸の検出および同定を行う方法も提案されている（特開２００３−３３４０８２）。
上述の、１種類のプライマーを用いて１本鎖核酸を合成、その相互干渉産物の解離曲線を解離曲線波形パターンとして認識し核酸の検出および同定を行う方法は、核酸を容易にかつ多様に分析する方法として有用であるが、１本鎖核酸の合成効率が低いこと、およびこれに起因する低検出感度には改善の余地があった。つまり、低合成効率による低検出感度化を改善するためには、低アニーリング温度を適応して核酸合成効率を増加させる方法が考えられるが、これは目的塩基配列の検出および同定に対し、特異度の低下を引き起こす原因となる。しかし、特異度を改善するために高アニーリング温度を適応すると、核酸合成の効率はより一層低下して検出感度は悪化する。このような矛盾点を解決することが１種類のプライマーを用いて１本鎖核酸を合成し、その相互干渉産物の解離曲線を解離曲線波形パターンとして認識し核酸の検出および同定を行う方法の課題であった。
本発明は従来の実情に鑑み、鋭意研究の結果、提案されたものであり、容易かつ効果的な１本鎖核酸合成を利用した核酸検出および同定法に対し、検出感度を改善すると同時にその特異度を維持する方法を提供することを目的とするとするもので、本発明に係る請求項１に記載のアニーリング温度を変化させる方法、つまり低温度アニーリングと高温度アニーリングを組み合わせる方法、また、請求項２に記載の相対的に特異性の低い１本鎖核酸と同等の機能を有する合成核酸または化学物質を添加する方法を課題解決の手段とした。
本発明は、核酸上の任意の特定塩基配列領域に対し特異的な相補性を有する１種類のプライマーを用い、高温度アニーリング条件で特定塩基配列領域に対し相対的特異性の高い１本鎖核酸を合成し、核酸を検出、同定する方法で、１本鎖核酸の低合成効率に起因する感度の低下を改善する方法を本発明で実現した。具体的には、（ｉ）合成サイクルの初期に、低温度アニーリング条件を設定し、十分な５’側の完全相補性がない類似塩基配列領域でも不完全相補鎖を形成し、特定塩基配列領域に対し相対的特異性の低い１本鎖核酸を複数かつ同時に合成する方法、（ｉｉ）別途合成した１本鎖核酸を添加する方法、の２種類の方法を考案した。これらはいずれも、高温度アニーリング条件で合成される相対的特異性の高い、しかし量的に不十分で、検出工程において十分な感度を得られない１本鎖合成核酸に対し、該１本鎖核酸と部分的相補鎖を形成することにより水素結合の物理的量を増加させ、検出工程における感度を改善する効果が得られる。
以下、本発明を適用した具体的な実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。この実施の形態は、対象２本鎖核酸の特異的な塩基配列に反応して１本鎖のみを増幅する１種類のプライマーを用い、その特異度を高めつつ感度を改善する核酸検出および同定法について説明するものである。ここで「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリックの法則に基づく塩基対結合によって２本鎖構造を形成することをいう。本発明では、特異度を高めた合成１本鎖核酸のみでは得られない検出感度を高めるため、（ｉ）アニーリング温度を低温と高温に変化させ、低温アニーリングでは検出感度を高めるための特異性の低い１本鎖核酸を特異性の高い目的１本鎖核酸とともに合成し、高温アニーリングでは特異性の高い目的１本鎖核酸のみを合成し、両者共存下に合成１本鎖核酸相互干渉産物を形成させ、その解離曲線波形パターンから高感度かつ特異的な核酸を検出および同定を実現する方法、（ｉｉ）検出感度を高めるための合成１本鎖核酸を添加することにより、高温アニーリングで合成された特異性の高い目的１本鎖核酸との両者共存下に合成１本鎖核酸相互干渉産物を形成させ、その解離曲線波形パターンから高感度かつ特異的な核酸を検出および同定を実現する方法を用いた。
上記（ｉ）の概念を図１に模式的に示す。図１（Ａ）では、低温アニーリングにおける核酸の合成状況を示しており、１種類のプライマーで、多量の検出感度を高めるための特異性の低い１本鎖核酸、目的塩基配列Ｘ外由来合成核酸と、少量の特異性の高い目的１本鎖核酸、目的塩基配列Ｘ由来合成核酸の両者が合成されている。図１（Ｂ）では、高温アニーリングにおける核酸の合成状況を示しており、１種類のプライマーで、特異性の高い目的１本鎖核酸、目的塩基配列Ｘ由来合成核酸のみが合成されている。低温アニーリングでは、プライマーと鋳型核酸間の完全相補性がなくともアニールが行われ、核酸合成が進行するのに対し、高温アニーリングでは、プライマーと鋳型核酸間の完全相補性がないとアニールがおこなわれないため、特異的な目的核酸のみが合成されることを示す。
低温アニーリングにおけるプライマーと鋳型核酸間の不完全相補的なアニールの状況を模式的に図２で示し、上述の温度変化アニーリングにより合成された各種１本鎖合成核酸が混在した状況における、相互干渉産物の模式図を図３に示す。検出感度を高めるための特異性の低い１本鎖核酸が、特異性の高い目的１本鎖核酸と共存することにより両者間に反応が起こり、水素結合の物理量が増加するため、水素結合に取り込まれるインターカレーター量が増加し、結果的に高感度が実現する。特異性の低い１本鎖核酸が存在しない場合は、水素結合部位は特異性の高い目的１本鎖核酸自身による自己ループ、ヘアピン構造形成時に存在するか、ダイマー形成時にのみ存在するため、その物理量も少なく、結果的に感度も低下する。合成１本鎖核酸を添加する方法の概念は図３と同等であり、同図の目的塩基配列Ｘ外由来合成核酸（蛍光強度増加用合成核酸）を、別途に合成し添加することにより上述の低温アニーリングと高温アニーリングを連続的あるいは不連続的に行う方法と同様の効果を得るものである。
目的核酸の検出感度を高めるために、低温アニーリングと高温アニーリングを連続的あるいは不連続的に行う方法および合成１本鎖核酸を添加する方法において、酵素ＤＮＡポリメラーゼの存在下でプライマーのアニーリングを安定させるためには非イオン型などの界面活性剤や硫酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウムのような硫酸化合物の添加が有用であり、殊に低温アニーリングで効果が大きい。

図１は、本発明の形態における核酸合成を模式的に説明する図であり、（Ａ）は本発明の低温アニーリングにおける核酸合成の様子を、（Ｂ）は高温アニーリングにおける核酸合成の様子を示すものである。
図２は、低温アニーリングにおけるプライマーと鋳型核酸間のアニールを模式的に説明する図である。
図３は、本発明の形態における核酸合成産物の相互干渉物を模式的に説明する図である。
図４は、表２に示した本発明のプロトコールで得た解離曲線波形パターン。
図５は、表２に示した比較プロトコール（Ａ）および（Ｂ）で得た解離曲線波形パターン。
図６は、本発明と比較プロトコールの電気泳動写真。
図７は、合成核酸を添加した場合の解離曲線波形パターンである。
図８は、合成核酸を添加しなかった場合の解離曲線波形パターンである。

以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明が以下の実施例に限定されるものないことは勿論であり、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
（１）アニーリング温度変化の効果
細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列のうち、約３０００菌種で保存されており、かつ細菌以外のＤＮＡでは出現頻度の低い１２塩基を選択しこれをＢＳＳプライマーとして使用、アニーリング温度変化を行った本発明プロトコールとアニーリング変化を行わないプロトコールを比較し、その感度および特異度の改善効果を実施例として行った。具体的には、両プロトコールともに、細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードする配列以外に、２３ＳｒＲＮＡ、８ＳｒＲＮＡ等の１６ＳｒＲＮＡと相同性のある配列が同時に増幅される。低温度アニーリング条件のみのプロトコールでは、合成１本鎖核酸で構成される相互干渉産物は、検出工程における十分な物理量を確保することは可能であっても、多領域で相対的特異性の低い１本鎖核酸の必要以上の存在により特異性が低下する。また、高温度アニーリング条件のみでは、合成１本鎖核酸で構成される相互干渉産物は、目的遺伝子領域に対し相対的特異性の高い１本鎖核酸のみが合成されるため特異性は高いが、検出工程における十分な物理量を確保することが困難である。本発明プロトコールでは、低温度アニーリング条件下においてこれらの目的遺伝子領域以外からも、多領域で相対的特異性の低い１本鎖核酸が複数かつ同時に合成され、さらに高温度アニーリング条件下では、これらの目的遺伝子領域以外からの相対的特異性の低い１本鎖核酸は合成されず、目的遺伝子領域に対し相対的特異性の高い１本鎖核酸のみが合成されるため、両者がバランスよく混在することにより、これら合成１本鎖核酸で構成される相互干渉産物は、検出工程における十分な物理量を確保すると同時に、特異性も得ることが期待される。使用する細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を選択し、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（日本ジーン株式会社製）をマニュアルに従って使用してＤＮＡを抽出した。この各検体ＤＮＡは、３００ｎｇ／５μｌ（Ｈ_２Ｏ）に調整し、以下の表１に示す通り、５０μｌの反応液に添加、総量を５５μｌの組成液として実施した。また、実施例は各々Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ（繰り返し実験）で確認を行った。本発明実施のための組成液処方例を表１に示す。

表１中、１０×ＰＣＲ緩衝液は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ−ＲＥＸ（ＴＡＫＡＲＡ社製）に添付のものを、５×サイバーグリーン希釈液は、原液を滅菌蒸留水で１０００倍希釈したものを、５×Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ緩衝液は、Ａｄｇｅｎｅ社製の製品を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ−ＲＥＸ（ＴＡＫＡＲＡ社製）をそれぞれ使用した。また、ＢＳＳプライマーは、５’−ＡＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＣ−３’（塩基配列１）、
の塩基配列を用いた。表２に本発明プロトコールおよび比較プロトコールを示す。

上記各プロトコールはｉ−ｃｙｃｌｅｒｉＱ（バイオラッド社製）を用いて行い、発明の効果は温度範囲６５〜９５℃、温度ステップ０．１℃の条件で各温度で１秒間観察することにより、合成核酸相互干渉産物の解離曲線波形パターンを観察し判定した。
次に、これら反応終了後のサンプル２０μｌに５μｌのローディングバッファーを添加し、２％アガロースゲルを使って、２０分間、１００Ｖで電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して合成核酸を確認した。なお、分子サイズマーカとして、２００ｂｐｌａｄｄｅｒｍａｒｋｅｒを使用した。本発明と比較プロトコールＡ，Ｂの解離曲線波形パターンをそれぞれ図４および図５（Ａ）、（Ｂ）に示す。図４から分かるように、本発明プロトコールを用いた場合、波形パターンの各ピークは鋭利かつ鮮明で、Ｄｉｐｌｉｃａｔｅの差も少なく、十分な蛍光量も得られている。これに対し、図５（Ａ）の比較プロトコールＡ、つまり低温度アニーリング条件のみのプロトコールを用いた場合、図４と比較し同等の蛍光量は得られるものの、波形パターンの各ピークの鮮明さに劣り、合成核酸が検出工程における十分な蛍光量を確保することは可能であっても、多領域で相対的特異性の低い１本鎖核酸の必要以上の存在により特異性が低下することを示す。図５（Ｂ）の比較プロトコールＢ、つまり高温度アニーリング条件のみのプロトコールを用いた場合、図４と比較し十分な蛍光量が得られておらず、単純な１本鎖合成のみでは波形パターンとしての検出が困難であることを示している。これら本発明プロトコールと比較プロトコールの波形パターンから、本発明プロトコールでは１本鎖核酸を合成する１プライマーのみで、核酸同定に必要な特異性を高めつつ十分な検出蛍光量を得ることを可能としていることが認められた。本プロトコールを利用することにより、核酸の目的塩基配列の存在に着目した高感度の核酸検出、また、多様な波形パターンが安定的に観察されることから、この波形パターンを調べることにより多様な核酸同定が実現される。
本発明プロトコールと比較プロトコールの電気泳動写真を図６に示す。ここで、レーン１は本発明プロトコール、レーン２は比較プロトコールＡ、レーン３は比較プロトコールＢである。図６から分かるように、本発明プロトコールおよび比較プロトコールＡ、つまり低温度アニーリング条件のみのプロトコールでは、十分な核酸合成が行われているが、核酸の詳細な同定に関しては電気泳動では行うことができず、解離曲線波形パターンの検出工程が必要である。また、高温度アニーリング条件のみのプロトコールでは、十分な核酸合成が行われておらず、未反応のプライマーも観察されている。本法では、解離曲線波形パターンの検出工程を行っても安定的な核酸同定は困難である。このことからも、本発形パターンの検出工程を行っても安定的な核酸同定は困難である。このことから本発明の有用性が確認された。
（２）添加合成核酸の効果
細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列のうち、約３０００菌種で保存されており、かつ細菌以外のＤＮＡでは出現頻度の低い１２塩基を選択しこれをＢＳＳプライマーとして使用、高温度アニーリング条件のみでは検出工程における十分な核酸の物理量を確保することが困難である欠点を補う目的で、この条件で合成された１本鎖核酸と反応する合成核酸を添加し、蛍光強度の改善効果を実施例として行った。高温度アニーリング条件下では特異性の高い１本鎖核酸が合成されるが、この１本鎖核酸のみでは、例えばインターカレーターを用いた場合、各々の自己ループあるいはダイマー形成しか水素結合が形成されないため、蛍光強度の基盤となる水素結合部位の不足が蛍光強度低下の原因となる。従って、合成１本鎖核酸に対し、水素結合部位を提供する核酸を合成反応終了後に添加することにより、この欠点の解消が期待される。使用する細菌としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を選択し、ＩＳＯＧＥＮ−ＬＳ（日本ジーン株式会社製）をマニュアルに従って使用してＤＮＡを抽出した。この各検体ＤＮＡは、３００ｎｇ／５μｌ（Ｈ_２Ｏ）に調整し、以下の表１に示す通り、５０μｌの反応液に添加、総量５５μｌの組成液として実施した。また、実施例は各々重複実験で行った。本発明実施のための組成液処方例を表３に示す。

表３中、１０×ＰＣＲ緩衝液は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ・ＲＥＸ（ＴＡＫＡＲＡ社製）に添付のものを、５×サイバーグリーン希釈液は、原液を滅菌蒸留水で１０００倍希釈したものを、５×Ｇｅｎｏｐａｔｔｅｒｎ緩衝液は、Ａｄｇｅｎｅ社製の製品を、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ・ＲＥＸ（ＴＡＫＡＲＡ社製）をそれぞれ使用した。また、ＢＳＳプライマーは、５’−ＡＴＣＧＣＴＡＴＧＴＧＣ−３’（塩基配列１）、
の塩基配列を用いた。表４に本発明実施プロトコールを示す。

上記プロトコールはｉ−ｃｙｃｌｅｒｉＱ（バイオラッド社製）を用いて行い、その後、１００ｐｍｏｌ／μｌの濃度の各種合成核酸を２μｌ添加した。この実施例による発明の効果は、温度範囲６０〜９５℃、温度ステップ０．１℃の条件において各温度で１秒間観察することにより、合成核酸相互干渉産物の解離曲線波形パターンを観察し判定した。表５に実験に使用した添加合成核酸の塩基配列を示す。

各合成核酸Ａ，Ｂ，Ｃを添加した後の解離曲線波形パターンを、それぞれ図７（Ａ）、（Ｂ）（Ｃ）に、また、無添加添加解離曲線波形パターンを図８に示す。図７（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）と図８の比較から分かるように、本発明の合成核酸を添加した場合、高温度アニーリング条件下で不足していた蛍光強度の基盤となる水素結合部位を補うことが可能となり、無添加の場合に不足していた核酸検出感度を改善する効果が認められた。同時に、この実施例は、添加合成核酸の塩基配列を工夫することにより、検出核酸の解離曲線波形パターンを調整できる可能性を示唆しており、目的にあわせた多様な核酸検出および同定が容易に実現可能であることが示された
産業上の利用の可能性
本発明により、目的核酸の任意の塩基配列を特異的に高感度に、かつ容易に検出および同定することが可能となった。１種類のプライマーを用いる利点は、目的核酸の任意の塩基配列をその関連領域も含め幅広く合成することにより、その情報を解離曲線波形パターンに反映させるため極めて有用であり、核酸の性状を広く観察することができる。従って、１種類のプライマーを用いたうえで、その問題点の低合成効率に起因する低感度の改善法として本発明を組み合わせることは、容易な核酸の検出および同定法として利用可能である。
本発明は目的核酸の任意の塩基配列を特異的に高感度に、かつ容易に検出および同定することを可能とするもので、殊に１種類のプライマーを用いる利点は、目的核酸の任意の塩基配列をその関連領域も含め幅広く合成することにより、その塩基配列に起因する情報を解離曲線の波形パターンに反映させるために極めて有用であり、核酸の性状を広く観察することができる。従って、細菌類の同定はもとより遺伝性疾患、癌性疾患或いは伝染性疾患等の遺伝子診断、薬剤代謝、男女の鑑別など、人の遺伝解析への応用が可能となる。

【配列表】

Claims

核酸上の任意の特定塩基配列領域に対し特異的な相補性を有する１種類のプライマーで、該塩基配列３’側に高い安定性が維持されるよう塩基配列を選定し、低温度アニーリング条件下では該プライマーが任意の特定塩基配列領域で完全相補鎖を形成するのみならず、十分な５’側の完全相補性がない類似塩基配列領域でも不完全相補鎖を形成し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に多領域で、特定塩基配列領域に対し相対的特異性の低い１本鎖核酸を複数かつ同時に合成し、高温度アニーリング条件下では該プライマーが任意の特定塩基配列領域のみで完全相補鎖を形成し、ＤＮＡポリメラーゼ存在下に単あるいは少数領域で特定塩基配列領域に対し相対的特異性の高い１本鎖核酸を合成し、両条件を連続的あるいは非連続的に実行することにより相対的特異性の低い１本鎖核酸および相対的特異性の高い１本鎖核酸を混在させ、適当な温度条件下においてこれら１本鎖核酸の相互干渉物を形成後、物理化学的刺激による解離変性状況を経時的に観測し、その変化状況から核酸の検出および同定を行う核酸検出および同定法であって、相対的に特異性の高い１本鎖核酸のみでは十分な感度および特異度を得られない対象に対しても、相対的に特異性の低い１本鎖核酸を混在させ、両者間の相互干渉物の物理量の増加から検出感度を上昇させることを特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、相対的に特異性の高い１本鎖核酸と相互干渉物を形成し、その感度および特異度を上昇させる目的の低温度条件下で合成される相対的に特異性の低い１本鎖核酸と同等の機能を有する合成核酸または化学物質を、別途添加することにより相互干渉物の物理量の増加から検出感度を上昇させることを特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、上記核酸合成効率、検出効率、同定効率などが目的核酸における特定塩基配列の出現頻度をもとに規定されうる塩基配列を骨格とするプライマーで、かつ目的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の双方に同時にアニールし同時に核酸合成を行う場合でも、完全相補的２本鎖核酸生成を伴わない１種類のプライマーを用いることを特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、任意のプライマー塩基鎖長における全ての塩基配列組み合わせについて鋳型核酸での出現頻度を検索し、高出現頻度塩基配列をその存在領域とは無関係に鋳型核酸全体を代表する特異性を持ち得る塩基配列として、あるいは特定遺伝子における高出現頻度塩基配列に遺伝子特異性を持ち得る塩基配列として設計概念上組み込まれたプライマーを用いることを特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、特に低温度アニーリング条件下でのプライマーのアニーリングを安定化させるため、界面活性剤および／または硫酸化合物を添加すること特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、特に低温度アニーリング条件下での温度設定を４０℃以下とすることを特徴とする核酸検出および同定法。
請求項１の核酸検出および同定法であって、１本鎖核酸の相互干渉物形成後、物理化学的刺激による解離変性状況を経時的に観測する方法が、物理化学的刺激と変性解離状況の関係を描画あるいはグラフ化したものの図形認識から行われることを特徴とする核酸検出および同定法。