JP2005176623A - 核酸検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決課題】 鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む。
【選択図】 図1
Description
(1) 鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程とを含む核酸検出方法。
0.1<{dNTP濃度/(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
(上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、aは増幅反応時に伸長する塩基数(1≦a)であり、bは増幅反応時のサイクル数である。)
(4) 上記一対のプライマーのうちいずれか一方のプライマーを、上記プローブと相補的な塩基配列と近接した領域にアニーリングするように設計することを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
(6) 上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、少なくとも1の補助的プライマーを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
(8) 上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、一対の第2プライマーセットを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする(1)記載の核酸検出方法。
0.1<{dNTP濃度/(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
(上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、aは増幅反応時に伸長する塩基数(1≦a)であり、bは増幅反応時のサイクル数である。)
0.9<{dNTP濃度/(dNTP濃度+ddNTP濃度)}a<0.99
(上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、aは増幅反応時に伸長する塩基数(1≦a)である。)
0.95<{dNTP濃度/(dNTP濃度+ddNTP濃度)}a<0.96
(上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、aは増幅反応時に伸長する塩基数(1≦a)である。)
1.目的
本発明の方法を用いることで、ゲノム等から安定して増幅産物を得ることを阻害することなく標識された一本鎖DNAを調整し、最終的には検出感度を上げる効果を証明する。
本実施例は、ゲノムDNAを鋳型としてPCR(Polymerase Chain Reaction)法により遺伝子増幅を行い、その増幅産物と担体に固相化されたプローブをハイブリダイゼーションさせ、その有無により変異を検出するrSSO(reverse Sequence Specific Oligonucleotide)法を用いて測定を行った。
本実施例では、鋳型DNAとしてアルデヒド脱水素酵素遺伝子を使用した。また、目的の変異部位としては、当該鋳型DNAアルデヒド脱水素酵素遺伝子(Accession No. BC002967)における1556番目の一塩基とした。本例では、この変異部位を含む64merのゲノム配列を挟むように一対のプライマーを設計した。具体的にはプライマーA(塩基配列;3'-AGC CCA GTC ACC CTT TGG TG -5';配列番号1)とビオチン化プライマーB(塩基配列;3'-CTT TGA CTG TGA CAG TTT TC -5';配列番号2)を使用した。
本実施例において、Luminexシステム(日立ソフトウェアエンジニアリング社)を用いて測定することにした。Luminexシステムでは、特殊なビーズを担体として用いるため、複数項目の同時測定が可能である。特殊なビーズとは、ポリスチレンから作られ、直径は約5.6μm、複数の蛍光物質を用いて染色され、それら蛍光物質の含有量を変えることで同じ溶液中に混在していても、その発色の違いから識別が可能である。それらのビーズにそれぞれ異なる抗体や核酸など生体高分子を結合させることで、それらの生体高分子と相互作用する生体高分子の存在の有無などを測定できる。つまり少量サンプルでも高感度に多項目の測定が可能であることを特徴とするシステムである。
1)ゲノム配列の増幅
ゲノムDNAを鋳型として、プライマーAとビオチン化プライマーBを使用し増幅を行う。本実施例では、PCR増幅を行う際に基質としてdNTP及びddNTPを使用し、その含有率を変えることでddNTPを用いる意味を評価した。実際には、全体の基質量と比べddNTPが、0/10000、1/10000、2/10000、3/10000、4/10000、5/10000、6/10000、7/10000、8/10000、9/10000、10/10000、15/10000、20/10000で評価を行う。他の条件は全て同じにして、94℃30秒→65℃30秒→72℃30秒を1サイクルとする反応を30サイクル行い、増幅反応を行った。
得られた増幅産物とLuminexビーズに固相化されているプローブを、94℃2分→50℃30分で熱変性およびハイブリダイゼーションを行う。
ハイブリダイゼーションしていない増幅産物やビオチン化プライマーBを洗浄などで除去した後、SA-PEでハイブリダイゼーションしている増幅産物を蛍光標識し、Luminex測定装置でその蛍光量を測定する。
図5は、本実施例で得られた結果をまとめたものであり、ddNTPを用いなかった時の蛍光値を1として棒グラフに示したものである。ddNTPの含有量を工夫することで、約4倍の蛍光値を得られることができる。
Claims (8)
- 鋳型となる核酸、一対のプライマー、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含む反応溶液で、上記核酸の所定の領域を増幅する増幅反応を行う工程と、
その後、反応液に含まれる増幅産物とプローブとのハイブリダイゼーションを行う工程と、
その後、上記増幅産物と上記プローブとのハイブリダイゼーションを検出する工程と、
を含む核酸検出方法。 - 上記デオキシヌクレオチド及び上記ジデオキシヌクレオチドの濃度比が下記式を満たす反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
0.1<{dNTP濃度/(dNTP濃度+ddNTP濃度)}ab<1.0
(上記式中、「dNTP濃度」は上記反応溶液中のデオキシヌクレオチド濃度であり、「ddNTP」は上記反応溶液中のジデオキシヌクレオチド濃度である。また、上記式中、aは増幅反応時に伸長する塩基数(1≦a)であり、bは増幅反応時のサイクル数である。) - 上記式中bは、20≦b≦24の範囲を満たすことを特徴とする請求項2記載の核酸検出方法。
- 上記一対のプライマーのうちいずれか一方のプライマーを、上記プローブと相補的な塩基配列と近接した領域にアニーリングするように設計することを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
- 上記一対のプライマーのうち少なくとも一方のプライマー及び/又は上記プローブを、予め標識しておくことを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
- 上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、少なくとも1の補助的プライマーを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
- 上記増幅反応ではアニーリング温度を、サイクルが進むたびに低い値となるように設定することを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
- 上記一対のプライマーと比較してTm値の低い、一対の第2プライマーセットを含む上記反応溶液を用いて、上記増幅反応を行うことを特徴とする請求項1記載の核酸検出方法。
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