CN116396845A - 一种基于led光源对实时荧光定量pcr仪进行相对检定校准的标准器 - Google Patents
一种基于led光源对实时荧光定量pcr仪进行相对检定校准的标准器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器，包括：装载板，其上间距均布有检测探头，每个检测探头均包含有独立的LED光源，并且检测探头的尺寸和布局与标准的96孔板吻合。每个所述检测探头底部为传热金属头，其内部设置有微温度传感器；中部为所述LED光源，其正上方设置有漫反射匀光片。该标准器的光路系统校准用LED光源输出荧光信号，通过高精度DAC数模转换电路输出精度和梯度可控荧光，克服了单一染料检定校准的系统误差，提高了光电系统检定的检测分辨率和灵敏度。采用LED光源输出稳定的荧光，便于实时荧光定量PCR分析仪器的检测。对比生物标准物质，大大降低了使用成本和保存环境的要求。
Description
技术领域
本发明涉及实时荧光定量PCR仪校准技术领域，尤其涉及一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器。
背景技术
PCR分析仪器是完成聚合酶链式反应的必备仪器，是微量核酸测量必需的主要设备之一，特别是随着实时荧光定量PCR仪的开发和发展，聚合酶链式反应分析仪在临床检验、检验检疫、法医鉴定、进出口商品检验等领域得到了广泛应用，在生命科学领域、食品科学领域、药物研发和生物技术产品开发领域、以及高等院校的检测分析实验室和研究机构中发挥着重要作用。然而目前该类仪器的校准，虽然新出了一个行业标准YYT1173-2010聚合酶链反应分析仪，但还没有针对荧光定量PCR仪的国家标准，其中ISO15189:2007医学检测实验室认可要求中，针对仪器设备的计量校准是必须的，目前各医疗机构针对没有计量标准的仪器设备的校准主要由相关仪器的生产厂家提供性能测试报告，缺乏第三方的独立性，溯源方面也存在一些问题，各检测实验室采用自校验的方式校准该类仪器，技术要求、校验条件、校验项目、校验方法、校验结果的处理各不相同。
目前，国内已经建立了一些农业、食品及医学检测领域的特定基因的PCR检测方法的国家标准或行业标准，如GB/T19438，1-2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》等。虽然目前刚刚制定了针对PCR仪的行业标准，但还没有国家标准，也没有相应的检定规程/校准规范，不能满足相关仪器生产厂家及应用单位的需求。部分厂家，如ABI通过定期运行ROI(RegionsofInterest)和背景校正克服背景荧光的信号强度随着许多外界因素(比如外来的污染、反应板/反应管的生产厂商不同、水的纯度等)而变化。传统的96孔板的仪器采用卤钨灯激发、CCD检测，这些光学结构在96孔板的顶部，每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同-边缘效应，对结果产生影响。
实时荧光定量PCR仪中大多采用CCD作为探测器，它最大的优点是能够同时扫描多个荧光信号，速度较快，但是灵敏度低，而且同时检测样品间的荧光信号存在干扰，使检测结果受到很大的影响。比较了大量的实时荧光定量PCR仪的文献之后发现，对基于CCD的实时荧光定量PCR仪的标定方面的报道较少，大多集中在如何检测荧光信号的研究上。这直接影响到生物PCR产品使用的可靠性、推广性、实验结果的社会认可以及产业化生产过程中的质量控制。很多厂家为了保证精确、准确的实验结果，这类仪器在实验过程中通常会使用Rox(一种荧光染料)或专用的Referencedye作为参照校正实验结果，执行纯荧光校正，价格昂贵。
研制实时荧光定量PCR仪校准装置，使得使用该类仪器检测工作的各类实验室和分析测试中心，能够更好的为科研、社会、经济建设和发展提供客观、可比、可溯源的检测数据。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明旨在提供一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器，用于其光路系统校准用LED光源输出荧光信号，通过高精度DAC数模转换电路输出精度和梯度可控荧光，克服了单一染料检定校准的系统误差，提高了光电系统检定的检测分辨率和灵敏度。采用LED光源输出稳定的荧光，便于实时荧光定量PCR分析仪器的检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器，其特征在于，所述标准器包括：
装载板，其上间距均布有检测探头，每个检测探头均包含有独立的LED光源，并且检测探头的尺寸和布局与标准的96孔板吻合。每个所述检测探头底部为传热金属头，其内部设置温度传感器(其为微温度传感器)；中部为所述LED光源，其正上方设置有漫反射匀光片。
所述LED光源的光源电路由微控制器、温度传感器、LED驱动单元、LED、电源模块、存储模块组成；所述微控制器根据温度的实时数据来判断PCR热循环状态和所处阶段，并控制LED驱动单元对LED光亮度输出的对应的光功率强度。
所述LED驱动单元由高精度的电压基准源、DAC转换器、可变恒流源组成。
所述LED光源为恒流源驱动，其波长为420nm-780nm。
控制电路，实时采集温度数据，来判断PCR热循环状态和所处阶段(基线期、指数增长期、线性增长期和平台期)，并控制所述LED光源的驱动单元对LED光源光亮度输出对应的光功率强度。
基于LED光源的荧光PCR荧光信号在反应的各个阶段的光功率值如下：
基线期：0.01pW/cm2/sr----1pW/cm2/sr；
指数增长期：43pW/cm2/sr----1nW/cm2/sr；
线性增长期:100nW/cm2/sr-----2uW/cm2/sr；
平台期：200nW/cm2/sr-----4uW/cm2/sr。
本发明的有益效果是：
1)该标准器的光路系统校准用LED光源输出荧光信号，通过高精度DAC数模转换电路输出精度和梯度可控荧光，克服了单一染料检定校准的系统误差，提高了光电系统检定的检测分辨率和灵敏度。采用LED光源输出稳定的荧光，便于实时荧光定量PCR分析仪器的检测。
2)对比生物标准物质，大大降低了使用成本和保存环境的要求。
附图说明
图1为本发明光源装置整体结构图。
图2为本发明每个独立的检测探头剖面结构图。
图3为本发明PCR循环示意图。
图4为本发明LED光源电路框图。
图5为本发明LED驱动单元框图。
图6为本发明PCR扩增荧光强度曲线。
图7为本发明参考光源校准装置校准曲线图。
图中：1-装载板；2-检测探头；3-温度传感器；4-LED光源；5-传热金属头；6-漫反射匀光片。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。
针对现有实时荧光定量PCR仪光路系统校准技术的不足，参照附图1～7所示，本申请提供一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器，所述标准器包括：
装载板如图1-2所示，其上间距均布有15个独立的检测探头，每个检测探头均包含有独立的温度传感器和LED光源，并且检测探头的尺寸和布局与标准的96孔板吻合。每个独立探头的底部为传热金属头，内部微温度传感器；中部为LED光源，光源正上方为漫反射匀光片。
其中，选型的LED光源的波长为420nm-780nm之间，波长范围在PCR仪仪器激发光和检测光波长范围(350nm-750nm)之内，能够满足实时荧光定量PCR仪标定需要。
研究荧光PCR扩增曲线，如图3所示，典型的扩增曲线包括基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即是基线。之后反应会进入指数增长期，这个期间扩增曲线具有高度重复性，在该期间，可设定一条荧光阈值线，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般会将荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为CT值，这个值与起始浓度的对数成线性关系。随着靶DNA片段的逐渐积累，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。
PCR反应达到平台期的时间主要取决于反应开始时样品中的靶DNA的含量和扩增效率，起始模板量越多到达平台期的时间就越短、扩增效率越高到达平台期的时间也越短。
由于荧光强度和DNA浓度有对应的线性关系，故荧光强度的变化也是和扩增曲线一样的，因此可以采用LED发光来模拟PCR反应中的荧光变化。由于LED的波长多元化，几乎可以完全覆盖荧光信号的所有波长，并且由于LED供电电流可以非常小，可以实现很小的光强，从而可以匹配荧光的光强度。LED采用恒流源驱动，由于恒流源稳定，这样LED模拟产生荧光信号会非常的精确稳定。由于荧光信号是和扩增循环周期相关联的，为了精确检测循环周期中的变性温度，退火温度以及延伸温度，需要在相关试剂孔位置增加高精度温度采集系统。
如图4所示，LED光源的光源电路由微控制器、温度传感器、LED驱动单元、LED、电源模块、存储模块等组成。通过高精度温度传感器实时采集温度信号，微控制器(控制电路)根据温度的实时数据来判断PCR热循环状态和所处阶段(基线期、指数增长期、线性增长期和平台期)，并控制LED驱动单元对LED光亮度输出的对应的光功率强度。PCR仪检测到参考光源发出的荧光强度显示当前的扩增曲线，采用LED来模拟荧光的方案，由于LED的波长多元化，可以完全覆盖荧光信号的所有波长，并且LED由于供电电流可以非常小，可以实现很小的光强，从而可以匹配荧光的光强度，LED采用恒流源驱动，确保产生稳定的模拟荧光，由于荧光信号是和扩增循环周期相关联的，为了精确检测循环周期中的变性温度，退火温度以及延伸温度，需要在相关试剂孔位置增加高精度温度采集系统。
如图5所示，LED驱动单元是精确模拟生物荧光发光的核心，包含一个高精度的电压基准源、DAC转换器、可变恒流源组成。每一个LED都由一个独立的LED驱动单元控制，通过可调的恒流源电路精确控制流经LED的电流，从而精确控制LED的发光亮度。在微控制器的控制下，DAC输出精确的、线性连续可调的模拟电压，该模拟电压输出给精密恒流源，可以实现nA-mA级的驱动电流精确控制；由于LED的发光亮度跟其驱动电流有对应关系，通过调节恒流源的电流，就可以精确控制LED的发光亮度。
基于LED光源的荧光PCR荧光信号在反应的各个阶段的光功率值如下：
基线期：0.01pW/cm2/sr----1pW/cm2/sr；
指数增长期：43pW/cm2/sr----1nW/cm2/sr；
线性增长期:100nW/cm2/sr-----2uW/cm2/sr；
平台期：200nW/cm2/sr-----4uW/cm2/sr。
参考光源校准装置，实现参考光源荧光检测线性度的标定。由于实时荧光定量PCR仪是一种相对测量的方法，所以本方法也采用相对标定的方法。只需标定参考光源通道间一致性、光强线性度，进一步计算出荧光强度检测重复性和荧光强度检测精密度，从而完成实时荧光定量PCR仪的相对检定校准。后续检定校准时，随着荧光的相对减弱，需要定期参考光源重新标定。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
Claims (6)
1.一种基于LED光源对实时荧光定量PCR仪进行相对检定校准的标准器，其特征在于，所述标准器包括：
装载板，其上间距均布有检测探头，每个检测探头均包含有独立的温度传感器和LED光源，并且检测探头的尺寸和布局与标准的96孔板吻合；
控制电路，实时采集温度数据，来判断PCR热循环状态和所处阶段，并控制所述LED光源的驱动单元对LED光源光亮度输出对应的光功率强度。
2.根据权利要求1所述的标准器，其特征在于：每个所述检测探头底部为传热金属头，其内部设置所述温度传感器；中部为所述LED光源，其正上方设置有漫反射匀光片。
3.根据权利要求2所述的标准器，其特征在于：所述LED光源的光源电路由微控制器、温度传感器、LED驱动单元、LED、电源模块、存储模块组成。
4.根据权利要求3所述的标准器，其特征在于：所述LED驱动单元由高精度的电压基准源、DAC转换器、可变恒流源组成。
5.根据权利要求4所述的标准器，其特征在于：所述LED光源为恒流源驱动，其波长为420nm-780nm。
6.根据权利要求5所述的标准器，其特征在于：基于LED光源的荧光PCR荧光信号在反应的各个阶段的光功率值如下：
基线期：0.01pW/cm2/sr----1pW/cm2/sr；
指数增长期：43pW/cm2/sr----1nW/cm2/sr；
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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