CN113564232A - 一种模拟荧光基团扩增反应的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种模拟荧光基团扩增反应的方法，使用本方法所述标准装置对实时荧光定量PCR仪进行检测和校准，所述标准装置包括检测端和电路板，所述检测端包括标准光源；开启实时荧光定量PCR仪和标准装置，设置所对应的qPCR程序和校准测试程序，标准装置放入实时荧光定量PCR仪中；运行所述qPCR程序，检测端采集到实时荧光定量PCR仪的加热模块的温度数据；所述标准装置根据校准测试程序采集到的温度数据和预设的发光比例，控制发光亮度，从而模拟荧光基团扩增反应的亮度变化；所述标准装置的光亮变化被实时荧光定量PCR仪所检测，生成模拟荧光基团扩增反应的检测数据，最后根据所述检测数据分析实时荧光定量PCR仪的性能。

Description

一种模拟荧光基团扩增反应的方法
技术领域
本发明涉及实时荧光定量PCR仪检测技术领域，尤其涉及一种模拟荧光基团扩增反应的方法，并采用了分子诊断检测的配套标准装置。本发明还特别涉及一种体外诊断检测仪器，尤其涉及实时荧光定量PCR仪的配套校准装置，还属于分子诊断检测仪器中的分子生物信息分析处理系统，同时涉及体外诊断检测仪器中的各类体外诊断用试剂、试纸及其配套设备与耗材。
背景技术
实时荧光定量PCR仪是用来监测循环过程的荧光，与实时设备相连的计算机收集荧光数据，数据通过开发的实时自动分析软件以标准曲线的形式显示。实时荧光定量PCR仪主要是采用外标准曲线法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。目前实时荧光定量PCR仪在基因表达研究、转基因研究、基因的多态性研究、药物疗效考核、病原体检测等诸多领域广泛应用。
实时荧光定量PCR仪的温场模块和光学系统需要通过监测来实现对基因扩增反应前仪器参数的校准和反应过程中的实时监控。
目前，可以实现对实时荧光定量PCR仪的温场部分的物理监测，但是，针对实时荧光定量PCR仪的光路系统，则主要还是通过生物化学方法，缺乏完善的物理方法。常用的生物化学方法有：采用厂家提供的生物试剂测试盘或质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质等对其荧光强度精密度、样本精密度、荧光线性相关性和样本线性相关性进行检测。这种生物化学方法具有以下几个共性问题：(1)采用这种方式的检测实质上是对仪器本身检测结果的一种对照及判断，不可追溯过程及相关参数，无法判断结果的偏差是由温控系统还是光路系统导致的。无法说明实时荧光定量PCR仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系，误差多少及误差来源等。(2)仅能够针对孔与孔间的组合线性进行测量，所得结果仅能代表荧光定量PCR仪孔与孔间的平均结果，不能代表单孔的线性。(3)不具备直接参数的溯源性。(4)所采用的试剂及标准物质均属于消耗品，只能单次使用，长期使用成本高；同时，试剂及标准物质一般需要存放在-80℃环境下才能保持其特性不发生改变，一旦取出后必须使用，不能反复冻融。
对于模块加热的聚合酶链反应(PCR)分析仪计量性能的校准，已有JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》和医药行业规范YY/T《1173-2010聚合酶链反应分析仪》(以下均简称规范)做出了明确规定，实时荧光定量PCR仪属于一种定量PCR仪，可以参照规范执行。对于光路系统的检测，规范明确记载了采用质粒DNA标准物质或荧光染料标准物质进行梯度稀释来进行样本线性及荧光线性的检测。规范中要求样本线性是以系列稀释的标准物质(至少5个)扩增Ct值与浓度对数值进行线性回归，计算其线性回归系数。目前的标准品一般稀释包括S1-S77个梯度浓度的标准物质，也可以是5个或6个，每个梯度浓度有多个重复孔(比如6个孔)，然后以这6个重复孔的平均Ct值作为这一浓度的Ct值结果。NTC是阴性对照，即没有初始DNA，整个过程荧光发光信号理论值为0或很低的发光亮度，重点是也不会发生变化。当使用标准物质进行浓度稀释的过程中，人为操作肯定会引入一定的误差，误差值有可能会比较大，直接影响到最终的检测结果。
发明内容
本公开的目的在于至少部分地克服现有技术的缺陷，提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法，用于对实时荧光定量PCR仪进行检测和校准。
本公开的目的还在于提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法，用于对实时荧光定量PCR仪的光路系统和温场同时进行物理方法的检测和校准。
本公开的目的还在于提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法，克服了标准物质校准时必须设置重复孔，利用重复孔检测计算平均值的问题。
本公开的目的还在于提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法，能够有效降低生物化学方法的使用成本，同时克服校准材料不能重复使用、储存条件要求高的问题。
为达到上述目的或目的之一，本公开提供了如下技术方案：
一种模拟荧光基团扩增反应的方法，用于对实时荧光定量PCR仪进行检测和校准，所述方法包括：构造一个标准装置，包括检测端和电路板，所述检测端被设置用于采集温度和模拟荧光基团发光亮度，所述检测端包括标准光源、温度探头和外壳；开启实时荧光定量PCR仪和标准装置，设置实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序，设置标准装置配套的校准测试程序，并且将标准装置放入实时荧光定量PCR仪中；运行所述qPCR程序，检测端采集到实时荧光定量PCR仪的加热模块的温度数据，并将所述温度数据传输到标准装置软件中；所述标准装置根据校准测试程序采集到的温度数据和预设的发光比例，控制标准光源的发光亮度，从而模拟荧光基团扩增反应过程的荧光信号强度；标准光源的发光亮度被实时荧光定量PCR仪所检测，并生成模拟荧光基团扩增反应的检测数据。
根据本发明的一个优选实施例，所述控制标准光源的发光亮度包括控制标准光源发光的开启、控制标准光源发光比例的变化过程和控制标准光源停止发光。
根据本发明的一个优选实施例，所述控制标准光源的发光亮度的方法包括电压控制、电流控制或者占空比控制。
根据本发明的一个优选实施例，所述控制标准光源的发光亮度的方法，设置了分压控制，分压控制精度达到10微伏。
根据本发明的一个优选实施例，所述模拟荧光基团扩增反应过程，包括预模拟阶段、模拟荧光信号强度递增阶段、模拟荧光信号强度锐减阶段和关闭模拟；所述关闭模拟是指当标准装置采集温度达到设置的关闭温度时，控制标准光源(3)停止发光。
根据本发明的一个优选实施例，所述预模拟阶段，控制发光亮度为0，所述标准光源不发光。
根据本发明的一个优选实施例，所述模拟荧光信号强度递增阶段包括模拟荧光基团扩增反应的基线期、模拟荧光基团扩增反应的指数扩增期、模拟荧光基团扩增反应的线性扩增期和模拟荧光基团扩增反应的平台期，控制标准光源的发光亮度从20％开始按照一定的发光比例递增至100％。
根据本发明的一个优选实施例，所述模拟荧光基团扩增反应的基线期，控制标准光源的发光亮度恒定在20％，模拟实时定量荧光PCR仪的背景噪声，此时标准光源的发光亮度未达到荧光定量PCR的荧光检测阈值；所述模拟荧光基团扩增反应的指数扩增期，控制标准光源的发光亮度首先每个循环依次递增0.11％或0.12％，模拟实时定量荧光PCR仪的信噪比过程，直至标准光源的发光亮度超过实时定量荧光PCR仪的荧光检测阈值，能够被实时荧光定量PCR仪检测到，标准光源的发光亮度为前一循环发光亮度的基础上的递增0.2％，所对应的循环数为Ct值；所述模拟荧光基团扩增反应的线性扩增期是在Ct值后的一个循环，控制标准光源的发光亮度呈几何倍数增加，直至达到亮度100％；所述模拟荧光基团扩增反应的平台期，标准光源的亮度保持100％不变。
根据本发明的一个优选实施例，所述模拟荧光信号强度锐减阶段为模拟荧光基团扩增反应的熔解过程，控制标准光源的发光亮度先从100％迅速锐减降至60％，当标准装置采集到的温度高于熔解温度0.2℃时，控制标准光源的发光亮度继续迅速下降至20％，模拟熔解过程就是模拟一半DNA解链时荧光亮度变化过程。
根据本发明的一个优选实施例，根据模拟荧光基团扩增反应所得Ct值可以计算出定量分析扩增反应起始的待测样本浓度。
根据本发明的一个优选实施例，所述检测端包括标准装置、温度探头和外壳；所述外壳包裹在所述标准光源的外侧，所述外壳由透光材料制成；所述标准光源可溯源至我国光学国家标准，具备溯源性；所述温度探头由热敏电阻元件及外面包裹的金属外壳组成；所述热敏电阻元件与所述金属外壳通过导热密封胶固定；所述透光材料制成的外壳与所述金属外壳通过螺纹连接；所述检测端与电路板用螺丝固定连接；所述检测端与电路板的连接处设有直径为2-3mm的透光点；所述透光点的材质可以与包裹标准光源的所述外壳的材质一致，可以是PE透光材料、多孔有机硅材料或亚克力材料。
根据本发明的一个优选实施例，所述标准光源的发射光为混合光，光谱范围为320-780nm；所述标准光源搭配固定波长的滤光片，能够发出固定波长的标准光；所述温度探头的热敏电阻元件的检测范围为0-120℃，通过五点六段修正法可达到精度为±0.05℃。
根据本发明的一个优选实施例，所述检测端和实时荧光定量PCR仪的PCR反应孔是相贴合的。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种模拟荧光基团扩增反应的方法，采用标准光源模拟荧光基团，具体做法是通过对标准光源的亮度进行程序控制从而模拟荧光基团的扩增反应，被实时荧光定量PCR仪采集到标准装置提供的变化后，可生成检测结果，对检测结果进行分析并与标准装置的结果数据进行比对，可对实时荧光定量PCR仪的光路系统是否准确可靠进行检测。
根据本发明所述的方法，控制标准光源的光亮变化是根据对实时荧光定量PCR仪温场采集到温度变化作为控制信号的，通过对检测结果进行分析，不仅可以对仪器本身温场和光路系统进行结果检测，还可分析测量结果的偏差是由实时荧光定量PCR仪温场导致的还是光路系统导致的，说明实时荧光定量PCR仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系，误差多少及误差来源等问题，并给出对最终定量结果的相关性影响关系。
所构造的标准装置属于一种小型仪器设备，相对于试剂及标准物质等耗材来说，不属于消耗品，一次购置可长期使用，使用方便，长期使用成本低；同时仪器设备对存储环境要求低，不需要放置在冰箱等低温存储仪器设备中，不存在像标准物质类似的较短的有效期和较严格的存储条件，而且还可以反复使用，此外，除了可以避免生物化学方法检测存在的固有缺陷以外，还可以减少人为误差的影响。
根据本发明所述的方法，所述标准光源有国际标准和国家标准，解决模拟荧光基团扩增反应的亮度变化所使用的标准光源的直接参数可以溯源的具体问题，具备溯源性。
根据本发明所述的方法，所述的标准装置可以仅仅包含一个检测端，解决能够校准荧光定量PCR仪的单孔的线性问题，不需要进行重复孔的检测以计算平均值。
本发明提供了一种新的模拟荧光基团扩增反应的方法，可以实现对标准的PCR扩增曲线中四个时期的荧光信号变化进行相关性模拟，进一步的，该模拟方法可以采集背景噪声、信噪比、可以模拟扩增的全过程，还可以模拟荧光基团熔解过程。
具体来说，根据本发明的模拟荧光基团扩增反应的方法，其中对所述的标准光源的发光亮度的控制，是基于对荧光基团在扩增反应中的荧光信号的变化来进行相关性模拟的。在扩增反应过程中，实时荧光定量PCR仪每个循环都会进行一次荧光信号的收集，一个标准的PCR扩增曲线中，荧光信号的变化可分为基线期、指数扩增期，线性增长期和平台期四个阶段。标准光源的亮度变化即是对这四个时期的荧光信号变化进行相关性模拟。在基线期，PCR反应处于起始阶段，扩增产物很少，所产生的荧光信号很低，属于系统背景情况；考虑到基线期，扩增产物也会产生较低的荧光信号，虽然未达到荧光定量PCR的荧光检测阈值，但仍有变化，标准光源也能够模拟这一信噪比过程；指数扩增期，每一循环后PCR产物呈指数倍增加，直至到达线性增长期的稳定的线性扩增阶段，每一循环后PCR产物呈几何倍数增加，标准光源的亮度也按既定荧光信号变化先后模拟了指数、几何倍数变化；到达平台期，PCR产物的荧光信号达到最高值，标准光源的亮度也达到100％；最后，PCR产物的荧光信号熔解，标准装置还能够模拟荧光基团熔解过程的荧光信号变化，标准光源亮度先从100％下降至60％，再在达到熔解温度时下降至20％，即可采集到扩增曲线中的熔解曲线部分，规范使用标准物质校准时是不包括熔解曲线部分，因此与规范所校准的数据相比，本发明的模拟荧光基团扩增反应的方法检测指标更全面。
在整个荧光定量PCR反应过程中，本发明的模拟荧光基团扩增反应的方法实现了模拟了荧光采集背景噪声采集过程、模拟了荧光信噪比过程、模拟荧光基团指数化扩增过程、模拟荧光基团线性扩增过程、模拟荧光基团终点扩增过程以及模拟荧光基团熔解过程。由此可知，本方法不仅可以追溯荧光定量PCR仪的扩增过程及相关参数、判断扩增结果的偏差是由温控系统还是光路系统导致的，还可以分析实时荧光定量PCR仪的温度和荧光对最终定量结果的影响关系，误差多少及误差来源等具体数值。
Ct值是实时荧光定量PCR仪的关键参数，在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到荧光检测阈值时所经过的扩增循环次数为Ct值；当基线期循环后发生的下一个循环超出荧光检测阈值(如设置标准光源的发光亮度为20％对应的荧光信号强度为荧光检测阈值)，当前经历过的标准循环数即标准Ct值，通过与实时荧光定量PCR仪生成的Ct值结果进行对比分析，能够分析出实时荧光定量PCR仪的光路系统的准确性及可靠性。
除此之外，通过本方法在整个实时荧光定量PCR反应过程中采集到熔解温度Tm，在Tm+0.2℃时，迅速将标准光源亮度下降至20％，即模拟一半双链DNA解链的过程，通过这一过程，可对被测实时荧光定量PCR仪生成的熔解温度及熔解峰相关参数与输入的标准熔解温度进行对比分析，也能够分析出实时荧光定量PCR仪的温场的准确性和可靠性。
本发明提供了一种新的模拟荧光基团扩增反应的方法，尤其是用于对实时荧光定量PCR仪的温场和光路系统校准的物理方法，具体可以用于分析的性能数据比较全面，可以包括：Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、通道峰高一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比温度的分析包括:温度准确性、孔间温差、温度过冲、升降温速率等等。
本发明提供了一种新的模拟荧光基团扩增反应的方法，其中模拟荧光基团扩增反应的亮度变化，是通过控制所述标准光源的发光强度实现的；控制发光强度的方法可以包括电压控制、电流控制、占空比控制。所使用的标准装置设置了用于分压的系统电源，所述的系统电源文波小，干扰小，保证了对标准光源稳定的电源输出，可以实现对检测端中标准光源亮度的精确控制，分压控制精度可以达到10微伏，最多可精确到1微伏，从而控制标准光源亮度的绝对亮度分辨率可以达到绝对亮度的万分之一。
本发明还提供了一种模拟基因扩增标准曲线的方法，所述校准测试程序设置包括模拟不同浓度标准物质扩增反应的基线期、指数扩增期和线性扩增期，直至模拟不同浓度标准物质扩增反应的亮度达到到100％即可停止。
本发明提供的模拟基因扩增标准曲线的方法，需要选择含多个检测端数量的不同的标准装置的排布设置。所述选用不同数量检测端的标准装置的排布设置是根据所模拟的目标标准物质的不同浓度进行选择的，最少模拟5个浓度梯度，每个浓度梯度模拟1次，或者模拟多次。每个浓度梯度模拟1次的，由于模拟孔位排布的不同，可以有不同的设置；所述目标标准物质的每个浓度梯度模拟多次的，标准装置的排布设置，由于模拟次数的不同和孔位排布的不同，也可以有不同的设置。每个浓度梯度模拟多次的，多次检测数据理论值应该是一致的；多次检测数据有偏差的，反应了偏差所在孔的性能偏差。不同标准装置的排布设置包括设置确定浓度的未知样本，或者不设置确定浓度的未知样本；不同标准装置的排布设置还包括设置阴性对照，或者不设置阴性对照。设置阴性对照时，所在孔的标准装置对应的校准测试程序全程模拟亮度无变化，始终为0。因此，模拟基因扩增标准曲线的方法目的更明确，更有针对性。
本发明提供的模拟基因扩增标准曲线的方法，可以替代校准规范和行业标准中的质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质或染料标准物质等等的运用，还可以用于进行样本线性及荧光线性的检测。
本发明的模拟荧光基团扩增反应的方法，该方法包括使用所述标准装置，所述标准装置包括检测端和电路板。所述检测端包含标准光源、温度探头和外壳。检测端的一端为标准光源，另一端为温度探头。所述标准光源的外侧包裹有透光材料所制成的外壳；所述标准光源采用LED冷光源，也可以采用其他光源；所述标准光源的光谱范围应包含各类荧光基团的发射波长，如FAM、SYBR GREEN、CY-3、JOE、VIC、TAMRA、ROX、TEXAS RED、CY-5等。所述标准光源发射光可以为混合光，光谱范围为320-780nm，也可搭配固定波长的滤光片使用，使其发出固定波长的标准光，适配不同荧光基团的发射波长，比如当荧光标记物为FAM时，标准光源的发射光选择混合光并搭配520nm滤光片使用；所述标准光源还可以选择某种荧光基团的专用的标准光源装置；所述标准光源可溯源至我国光学国家标准，具备溯源性；所述透光材料可以是PE透光材料，也可以是多孔有机硅材料、亚克力等能够让光源稳定、均匀发射出来的透光材料。所述温度探头由热敏电阻元件及外面包裹的金属外壳组成，所述热敏电阻元件的检测范围为0-120℃，通过五点六段修正法可达到精度为±0.05℃；所述热敏电阻元件与所述金属外壳通过导热密封胶固定；所述金属外壳可选用紫铜镀金、纯铝、纯铜、纯金等导热系数相对较高的材料，尤其是导热系数高的金属材料，导热系数λ>90W/m·K；所述包裹标准光源的透光材料的外壳与包裹热敏电阻元件的金属外壳通过螺纹连接固定。所述检测端和实时荧光定量PCR仪的PCR反应孔是相贴合的，以便能采集到真实的温场数据。
所述检测端与电路板用螺丝固定连接，连接处设有可使得标准光源的光线穿过的透光点，所述透光点直径为2-3mm，所述透光点的材质可以与标准光源的外侧包裹的透光材料一致，以确保光源能够均匀、稳定地发射出来并被被测实时荧光定量PCR仪的光路系统采集到。
所述电路板可以是PCB板，也可以是FPCB板；所述电路板上还覆盖有支撑底板，所述电路板与所述支撑底板固定连接；所述支撑底板优选碳纤维底板；所述电路板上还设有无线通讯模块，所述无线通讯模块与所述控制电路相连；所述无线通讯模块采用蓝牙(BlueTooth)通讯协议，也可以采用其他无线通讯方式或有线通讯方式，作用是与PC端或APP端建立通讯连接；所述电路板在电路设计上，标准光源亮度的变化是通过电压控制的，为实现标准光源上述亮度的精确变化及其线性满足条件，即保证标准光源绝对亮度分辨率达到绝对亮度的万分之一，电压控制设置了系统电源进行分压控制，这样分压控制精度至少要达到10μV，系统电源的设置实现了电压纹波小，稳定性高，输出精度高；所述结构电路对标准光源亮度的控制方法还可以采用电流、占空比等控制方式。不同的控制方法在电路板上设置时均要考虑保证标准光源绝对亮度分辨率达到万分之一精度的目的。
所述标准装置的检测端可以是一个，此时的标准光源在10％～100％亮度区间内线性＞0.998，线性可以修正，通过修正线性＞0.999。当检测端是一个时，能够实现对实时荧光定量PCR仪的单孔扩增过程进行进行温场校准和光路系统的线性分析；标准装置可以直接用单孔的方式来实现，更有准确性和针对性。所述标准装置也可以包含多个检测端，多个检测端按一定排列固定在一个电路板上作为一套标准装置使用，多个检测端的数量可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个……；多个检测端的数量最多不超过实时荧光定量PCR仪所适配板型的板孔数量的最大值；多个检测端使用时，标准光源可以按照同样的控制程序模拟发光，也可按照不同的控制程序模拟发光；多个检测端可以模拟起始浓度不同的样本荧光的变化，通过不同的校准测试程序模拟发光，基于与qPCR程序中每一个循环扩增产物量的线性关系，能够定量分析起始模板的样本浓度；多个检测端使用时，所绘制的标准曲线的线性回归系数能够无限接近于1，从而得到更加理想和准确的Ct值和标准曲线，避免了传统生化方法因样本、酶以及各种客观或人为原因带来的不必要偏差或误差；多个检测端按照不同的控制程序模拟发光时，还可以根据需求目的的不同，设计不同的控制程序，针对性更明确；多个检测端模拟同一浓度样本时，检测结果可以反应相应的每个孔的差值，不是计算平均值，检测孔目标更明确；多个检测端的使用方式更灵活。
此外，本发明模拟荧光基团扩增反应的方法所使用的标准装置，是一种使用方法对实时荧光定量PCR仪进行检测和校准的装置，可以作为一种小型仪器设备进行反复使用，节省传统标准耗材试剂及标准物质的消耗，此外该物理仪器存储条件要求低，使用方便，可以克服生物化学方法在检测实时荧光定量PCR仪光路系统时存在的固有问题和缺陷。
附图说明
图1为根据本发明的实施例的模拟荧光基团扩增反应的方法实施流程框图；
图2为根据本发明的模拟荧光基团扩增反应的方法的一个温度和光亮度控制流程的框图；
图3为标准装置的单个检测端结构示意图；
图4为标准装置的单个检测端所述标准光源外侧包裹的透光材料的外壳的整体结构示意图；
图5为一种含15个检测端的标准装置及配套外接电源盒的外观结构示意图；
图6为实时荧光定量PCR仪根据图2流程所绘制的扩增曲线；
图7为实时荧光定量PCR仪用基因突变标准物质校准绘制的标准曲线；
图8为7个检测端的标准装置模拟6种浓度的排布设置绘制的标准曲线理想结果图；
图9为实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序对本实施例的过程自动制作的扩增曲线图；
图10为实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序对本实施例的过程自动制作的熔解曲线图；
图中：1、温度探头；2、外壳；3、标准光源；4、螺纹；5、电路板；6、支撑板；7、导热密封胶；8、透光点；9、Ct值；10、荧光检测阈值；11、排线；12、电源；13、开关。
具体实施方式
本申请的发明人经过大量的基础研究，创造性地发现了一种模拟荧光基团扩增反应的方法，尤其适用于对实时荧光定量PCR仪的温场和光学系统同时进行检测和校准。基于此，下面将结合附图详细描述本发明优选的实施例，其中相同或相似的标号表示相同或相似的元件。另外，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以助于对本发明披露实施例的全面理解。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。在其他情况下，公知的结构和装置以图示的方式体现以简化附图。
本发明提供了一种模拟荧光基团扩增反应的方法，以及本方法所使用的用于实时荧光定量PCR仪反应过程中温场与光路的监测的标准装置。
根据本发明的总体构思，提供了一种模拟荧光基团扩增反应的方法，该方法使用过程中还涉及到一种标准装置，通过使用标准装置中的标准光源来模拟荧光基团在扩增反应中的亮度变化，所述标准装置通过引入热敏电阻元件及标准光源，可以采集实时荧光定量PCR仪的多孔金属加热模块孔内的温度，并根据温度能够循环控制标准光源的发光亮度，从而模拟荧光基团扩增反应的光亮变化，这种变化被实时荧光定量PCR仪进行实时光学检测，最后通过实时荧光定量PCR仪生成的荧光检测数据，结合采集到模块孔内的温度数据和标准光源发光亮度的变化数据，可以绘制扩增曲线和标准曲线，通过数据对比和所绘制的曲线可以对实时荧光定量PCR仪的温场及光路系统的准确度和灵敏度进行具体分析。
图1示出了根据本发明的一种模拟荧光基团扩增反应的方法实施流程图。图中实时荧光定量PCR仪简写成qPCR仪，qPCR仪配套安装的软件系统简写为qPCR仪软件，qPCR仪软件对应的运行程序简写成qPCR程序；标准装置配套安装的软件为标准装置软件，标准装置软件对应的运行程序为校准测试程序，包括温度程序和光学程序。首先，打开qPCR仪，启动qPCR仪上配套的qPCR仪软件；根据实际情况在qPCR仪软件的操作界面设置qPCR程序；所述qPCR程序的设置包括设置温度程序和设置光学程序，具体的还需要设置被测荧光标记物的类型等等数据，所述常用的荧光标记物有FAM、SYBR GREEN、CY-3、CY-5、JOE、VIC、TAMRA、ROX、TEXAS RED等等，比如可以选择SYBR GREEN；通过USB适配器连接标准装置和配套的标准装置软件；标准装置及配套的标准装置软件连接，并激活标准装置；将本方法所构造的标准装置放入到被测qPCR仪中，所述检测端和qPCR仪的PCR反应孔的底端应该是相贴合，打开标准装置软件，启动校准测试程序。
所述校准测试程序的具体运行流程如下：在qPCR仪上配套的qPCR仪软件上点击开始,运行预先设置的qPCR程序；在qPCR仪开启运行的同时，检测端开始采集qPCR仪的加热模块(block)的孔内温度，标准装置软件通过检测端完成对qPCR仪的加热模块温度的测试和采集；同时，检测端内的标准光源根据预设的qPCR程序中的温度循环数据所对应标准装置软件设置的发光比例，通过标准装置软件调整控制标准光源的发光亮度，qPCR仪采集到标准装置提供的光亮变化数据，生成检测结果，对检测结果进行分析并与标准装置软件中所用的校准测试程序记录的数据结果进行比对，对比分析即可汇总得出qPCR仪的温场和光路系统的性能数据。
标准装置配套的标准装置软件中所用的校准测试程序记录的数据、qPCR仪配套的qPCR仪软件所采集到的数据，均可通过各自的软件系统进行自动分析，也可以分别导出后进行对比分析。在qPCR仪配套的qPCR仪软件上可以对标准装置模拟亮度变化的采集结果进行分析，得到整个扩增过程中采集到的荧光信号值、曲线、熔解曲线、Ct值等；将qPCR仪上导出的数据输入到标准装置配套软件中，进行比对分析，可以生成温度准确性、孔间温差、温度过冲、升降温速率、Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、通道峰高一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比等等性能评价结果。
需要说明的是：qPCR仪软件和标准装置软件采集的数据可以通过qPCR仪软件和标准装置软件进行自动分析，还可以分别导出，导出后人工进行整理和对比分析。无论是系统分析还是人工分析，最终都可以分析得出本实时荧光定量PCR仪的温场和光路的准确度、分析误差及误差来源等相关评价结果。
图2中示出了模拟荧光基团扩增反应的方法在一个具体扩增反应程序中的具体实施流程。图2中实时荧光定量PCR仪简称为qPCR仪，实时荧光定量PCR简称为qPCR，打开qPCR仪，将本方法所构造的标准装置连同配套的USB适配器放入到被测qPCR仪中，开启qPCR仪上配套的qPCR软件，同时还需要开启标准装置配套的标准装置软件，根据预设控制温度程序设置被测qPCR仪温度反应程序；设置qPCR反应样品及荧光标记物的类型等等；标准装置以温度作为控制信号，本实施例中通过标准装置软件预设温度t1(如30℃)作为启动信号，标准装置开始准备工作,预设温度t2(如85℃)和温度t3(如60℃)作为发光控制信号，预设关闭温度t4(如75℃)，预设样本的熔解温度Tm＝70℃。
标准装置的预模拟阶段：首先当标准装置采集温度达到启动温度t1＝30℃，标准装置收到启动信号被启动进入启动状态，标准装置开启，此时对应的PCR循环数n＝0；实时荧光定量PCR仪按照预设程序进行加温或降温控制。其次，识别到一个t2，再识别到一个t3算一个循环，即当标准装置每采集到一次t2＝85℃和t3＝60℃，则代表实时荧光定量PCR仪完成1个循环，PCR循环数n＝n+1，前3个循环不发光。即当n＜3，对应的PCR循环数(n+1)＜4，即前3个PCR循环，标准装置进入预模拟阶段，此时相对发光强度I＝0％，即标准光源不发光，此时标准装置主要对实时荧光定量PCR仪的温场进行检测。
标准装置的背景噪声采集过程：此阶段PCR扩增处于基线期，虽然扩增产物按照指数扩增，但是产生的荧光信号很低，属于系统背景情况，标准装置恒定给出固定的亮度20％，从而模拟荧光采集背景噪声过程。即当PCR循环数n≥3，同时满足n≤13，3≤n≤13时，4≤PCR循环数(n+1)≤14，即当第4到14个PCR循环时，相对发光强度为固定值，即相对发光强度I＝20％；从模拟的亮度20％开始，本方法所模拟的荧光基团的一个标准扩增曲线可以开始绘制，直至亮度递增到100％。
标准装置模拟信噪比过程:此时PCR扩增处于扩增反应的指数扩增期，虽然扩增产物按照指数扩增，荧光信号也在以指数增长变化，但是荧光信号未达到荧光定量PCR的荧光检测阈值，所以标准装置在这一周期的循环(第15-23个循环)中，每个循环亮度进行小幅度递增，即每个循环递增0.11％，从而模拟本阶段的信噪比过程。即当PCR循环数n＞13，同时满足n≤23，13＜n＜23时，14＜PCR循环数(n+1)＜24，即当第15到23个PCR循环时，开始模拟背景信噪比部分，每个循环的相对发光强度增加0.11％，即相对发光强度I(n+1)＝In+0.11％。
标准装置模拟标准Ct值：该循环为扩增反应指数扩增期的后期，即标准装置给出的相对发光强度为前一循环亮度的基础上增加0.2％，达到荧光检测阈值，I(n+1)＝In+0.2％，即当PCR循环数n≥23，同时满足PCR循环数(n+1)＝24，即PCR循环数到标准循环数，即Ct值＝n+1＝24时，相对发光强度I＝I+0.2％，此时标准装置给出的相对发光强度与实时荧光定量PCR仪生成的Ct值结果进行对比，即可分析光路系统准确性及可靠性。
标准装置模拟荧光基团线性化扩增过程：标准Ct值的下一个循环，该阶段为PCR反应的线性扩增期，理想条件下，每一循环后PCR产物呈几何倍数增加，但其增长无明确的数学关系，标准光源的亮度按预设的发光比例模拟指数和几何倍数变化，直至达到亮度I＝100％，PCR扩增反应随后进入平台期。即当PCR循环数n≥24，同时满足n＜35，24≤n＜35时，25≤PCR循环数(n+1)＜36,即当第25到35个PCR循环时,相对发光强度按既定程序模拟线性递增，直至I＝100％；
标准装置模拟荧光基团平台期扩增、熔解过程：当PCR循环数n＝36，当PCR循环到达平台期，PCR产物几乎不再增加，荧光信号几乎也无增长，该阶段标准光源的亮度保持I＝100％，直到荧光基团开始熔解过程。预设温度达到Tm+0.2℃启动模拟熔解过程，熔解过程开始，此时的扩增曲线进入到熔解曲线环节；标准光源亮度快速从I＝100％下降至I＝60％；当PCR循环数进入熔解过程的下一个循环，即当PCR循环数n＝37的过程后，当标准装置采集到的温度高于预设熔解温度(如Tm＝70℃)0.2℃时，进入下一个循环，即采集温度T＝70℃+0.2℃＝70.2℃时进入第38个循环，迅速将标准光源的亮度控制下降至20％，I＝20％，即模拟一半双链DNA解链的过程，标准装置给出的相对发光强度I＝100％下降至I＝20％；通过这个模拟熔解的过程，可对被测实时荧光定量PCR仪生成的熔解温度及熔解峰相关参数与输入标准熔解温度进行对比分析，以分析光路系统准确性和可靠性。
标准装置模拟关闭：当进入熔解曲线环节后的一个循环时，即PCR循环数(n+1)＝39时，标准装置采集温度达到关闭温度，如t4＝75℃，标准装置配套的标准装置软件启动关闭流程，标准装置被关闭，标准光源亮度I＝0％。
需要说明的是：以上根据图2仅仅描述了模拟荧光基团扩增反应的方法在一个具体扩增程序的具体实施流程，该流程中所设定的温度、Ct值，循环数仅仅是一个具体的应用实例，不构成对本模拟方法的限制。该模拟方法中预设的控制温度、循环次数均可以根据实际应用实例进行调整。实际模拟过程中，可以根据具体的PCR反应所使用的荧光标记物类型、样本的变性或熔解温度、PCR循环数等等具体情况进行具体应用数据的修改设置。
图3为本发明模拟荧光基团扩增反应的方法所构造的一种优选的标准装置的单个检测端的截面示意图。图3可见所述检测端包含标准光源3、温度探头和外壳2。检测端的一端有温度探头，另一端为标准光源3。所述标准光源的外侧包裹有透光材料所制成的外壳2。所述温度探头由热敏电阻元件1及外面包裹的金属外壳组成，所述热敏电阻元件的检测范围为0-120℃，通过五点六段修正法可达到精度为±0.05℃；所述热敏电阻元件的直径为0.5mm；所述热敏电阻元件与所述金属外壳通过导热密封胶7固定；所述金属外壳可选用紫铜镀金、纯铝、纯铜、纯金等高导热系数材料。所述标准光源3采用LED冷光源，也可以采用其他光源；所述标准光源3发射光为混合光，光谱范围为(320-780)nm，也可搭配固定波长的滤光片使用，使其发出固定波长的标准光，适配不同荧光基团的发射波长，如荧光标记物为FAM时，标准光源3的发射光选择混合光并搭配520nm滤光片使用；所述标准光源3也可以选择某种荧光基团的专用的光源；所述标准光源3可溯源至我国光学国家基准，具备溯源性。所述外壳2由透光材料制成，所述透光材料可以是PE透光材料，也可以是多孔有机硅材料、亚克力等能够让光源稳定、均匀发射出来的透光材料；所述检测端的外壳2和实时荧光定量PCR仪的PCR反应孔是相贴合的，以便能采集到真实的温场数据；所述单个检测端的高度为21.5mm。此外，所述检测端的下部还设有可使得标准光源的光线穿过的透光点8，所述透光点8的直径可以是2-3mm，所述透光点的材质可以与标准光源的外壳2所用的透光材料的材质一样，以确保光源能够均匀、稳定地发射出来并被被测实时荧光定量PCR仪的光路系统采集到。
此外，所述透光材料制成的外壳2与所述金属外壳通过螺纹4连接。
图4为图3所述单个检测端中所述标准光源外侧包裹的透光材料的外壳的整体结构示意图，是本发明模拟荧光基团扩增反应的方法所构造的一种优选标准装置的单个检测端的外壳所使用透光材料的立体结构示意图。图4整体是所述标准装置的外壳结构，图中示出了所述包裹标准光源3的外壳2的透光材料从图4中我们还可以看到外壳上端包含有螺纹4结构，检测端的温度探头中包裹热敏电阻元件的金属外壳就通过所述的螺纹4结构与图4的透光材料制成的外壳相连接后共同组成了一个单个的检测端。
图5为一种含15个检测端的标准装置及配套外接电源盒的外观结构示意图。本发明模拟的方法需要使用到标准装置，但是根据实施目的的不同，所使用的标准装置的排布有多种方式。实际使用中，所述标准装置的检测端可以是一个，也可以包含多个检测端，多个检测端的数量可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个……由于本发明所述模拟荧光基团扩增反应的方法也可以用于模拟基因扩增标准曲线，因此用于模拟基因扩增标准曲线时，由于规范要求至少包含5个标准物质浓度，因此基因扩增标准曲线时模拟标准装置中检测端数量最少5个。
图5中可见含有15个检测端，实际实施时，多个检测端的数量最多不超过实时荧光定量PCR仪配置板型PCR板孔的最大数量。比如，如果PCR仪适配板型为96孔板，则所述检测端数量最多可以设置96个，如果PCR仪适配板型为384孔板，则所述检测端数量最多可以设置384个，多个检测端按一定排列固定在一个电路板上作为一套装置使用。多个检测端使用时，标准光源可以按照同样的控制程序模拟发光，也可按照不同的控制程序模拟发光；多个检测端按照不同的控制程序模拟发光时，可以使每个检测端模拟起始浓度不同的样本中的荧光基团的变化，从而通过得到的标准曲线进行分析。
图5为一种含15个检测端的标准装置的排布，从该图排布上，我们仍然可见看到标准装置的热敏电阻元件1、透光材料制成的外壳2、电路板5及支撑板6。图3所述的检测端与电路板5通过螺丝固定连接，所述电路板5为PCB电路板。所述电路板5上设有无线通讯模块，所述无线通讯模块采用蓝牙(BlueTooth)通讯协议，也可以采用其他无线通讯方式或有线通讯方式，作用是与PC端或APP端建立通讯连接；所述电路板5在电路设计上，标准光源3亮度的变化是通过电压控制的，为实现标准光源3上述亮度的精确变化及其线性满足条件，即保证标准光源3绝对亮度分辨率达到绝对亮度的万分之一，电压控制分辨率要达到10μV，电源电压需要实现纹波尽量小，稳定性高，输出精度高，为此目的电路板5上还设置了系统电源，用于实现分压。图5所示的电路板5设置了用于分压的系统电源，所述的系统电源是指标准装置的电路板上安装的分电源，用于分压后实现对检测端亮度的精确控制。系统电源文波小，干扰小，保证了对标准光源稳定的电源输出，还可以实现对检测端亮度的精确控制，分压控制精度可以达到10微伏，最多可精确到1微伏，从而控制标准光源亮度的绝对亮度分辨率可以达到绝对亮度的万分之一。这种通过分压方法实现了对模拟光学设备的精度控制是发明人经过大量的基础研究，创造性地发明成果。
所述系统电源的设置包括单片机、ADC、DAC、运放。单片机的作用是做整个系统控制，控制ADC,控制DAC，控制存储。运放是用来控制驱动LED，由于运放的输出阻抗很低，可以精准控制LED亮度。ADC的作用是做温度采集。DAC是用来控制LED亮度，DAC可以实现精准模拟量输出。系统电源有三路：单片机供电、ADC和DAC供电和运放供电。图5中含有2个DAC有16个通道，分别对应15个光源点(对应于15个检测端)，目前还有1个剩余。DAC输入可调的模拟信号给运放，运放就会根据输入信号给出不同的电压变化，控制而检测端的标准光源的亮度。
所述电路板5还可以设置有存储器、固件区和模拟开关等等部件。
所述电路板5对标准光源3亮度的控制方法还可以采用电流、占空比等控制方式。
所述电路板5上还覆盖有支撑底板6，所述电路板5与所述支撑底板6固定连接，所述支撑底板6优选碳纤维底板。
图5所示的标准装置还示出了一种配套的外接电源盒的外观结构示意图。实际应用时，图中标准装置放置在实时荧光定量PCR仪中的，所述的标准装置与图中所示的配套外接电源盒通过排线11连接，配套外接电源盒主体中设置有电源12，此外图中可以看到外接电源盒上还设置有开关13，所述的开关主要用于控制电源的开启和关闭。
实际使用中，标准装置的外接电源可以设置由电池供电，也可以通过USB接口直接连接电脑供电，电池供电可以设置不同的供电来源，包括设置成干电池、铅蓄电池或者锂电池，也可以是不同的型号，包含1号、2号、3号、5号、7号等等，比如说可以设置成3节7号电池、2节5号电池，形状上也可以设置成纽扣电池、柱状电池、方形电池等等。
图6为实时荧光定量PCR仪根据图2流程所绘制的扩增曲线。所述的扩增曲线是根据图2流程的标准装置模拟数据所作出的一个标准扩增曲线。图中横坐标表示循环数，纵坐标表示标准光源亮度对应的实时荧光定量PCR仪检测出的荧光强度。图中标准曲线对应于图2实施例中的第4到第35个循环，即标准装置的标准光源亮度从I＝20％到I＝100％的模拟过程。图中横坐标代表PCR循环数，纵坐标代表荧光强度，从图中可见当PCR循环数到第24个循环时，标准扩增曲线与虚线的交叉点对应的横坐标即为标准循环数，即Ct值9，图中Ct值＝24。图中虚线对应的纵坐标即为荧光检测阈值10，图中的荧光检测阈值10为当标准光源亮度从I＝21.2％时对应的荧光强度。
实施例1：实时荧光定量PCR仪用标准物质校准的应用。
实验材料：来自中国计量科学研究院的EGFR-1(18-；19-，20-；21-)基因突变标准物质为国家级标准物质，标准物质编号为GBW(E)090640。详见下表1所示。
表1：实时荧光定量PCR仪用基因突变标准物质的基本信息
Figure BDA0003193878740000161
第一步，配制标准物质；
实时荧光定量PCR仪校准用标准物质的制备，用经过校准的精密天平(0.000001g)进行实时荧光定量PCR仪校准用标准物质的系列配制，其中国家级标准物质(GBW(E)090640)拷贝数浓度为1.28×1014copy/uL，相对于荧光定量PCR仪而言，浓度太高，实时定量PCR仪的样本合适浓度为1.0×102copy/μL-1.0×108copy/uL之间。因此，将标准物质配制标识浓度为1.28×1014copy/uL作为最初始的标准用，然后对它进行
梯度稀释得到所需的各种浓度梯度，其中S1-S7为PCR校准用质粒DNA标准物质浓度，U1和U2为确定浓度的未知样本，NTC为阴性对照，具体如下表2所示。
表2：实时荧光定量PCR仪不同浓度梯度的标准物质配置表
简称 名称 实际浓度
S1 Stander 1.04×10<sup>7</sup>copy/uL
S2 Stander 1.06×10<sup>6</sup>copy/uL
S3 Stander 1.06×10<sup>5</sup>copy/uL
S4 Stander 1.07×10<sup>4</sup>copy/uL
S5 Stander 1.12×10<sup>3</sup>copy/uL
S6 Stander 1.10×10<sup>2</sup>copy/uL
S7 Stander 1.11×10<sup>1</sup>copy/uL
U1 Unknown 2.58×10<sup>4</sup>copy/uL
U2 Unknown 1.29×10<sup>4</sup>copy/uL
NTC NegativeControl 0
第二步，配制PCR反应体系；
包括试剂:灭菌双蒸水ddH2O，10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl2，dNTPs，10μmol/L探针，10μmol/L引物1，10μmol/L引物2，5U/μL Taq酶，DNA。
第三步，校准板的排布和制备；
将配制好的校准用标准物质实时荧光定量PCR反应体系按96孔板型排布，将其分别加入到96孔PCR反应管中，具体的排布见下表3所示。
表3：实时荧光定量PCR仪校准用标准物质校准板的排布
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1
B U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1 U1
C S1 S1 S1 S1 S1 S1 S2 S2 S2 S2 S2 S2
D S3 S3 S3 S3 S3 S3 S4 S4 S4 S4 S4 S4
E S5 S5 S5 S5 S5 S5 S6 S6 S6 S6 S6 S6
F S7 S7 S7 S7 S7 S7 NTC NTC NTC NTC NTC NTC
G U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2
H U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2 U2
第四步，进行PCR反应；
根据国家校准规范的要求，设定本次PCR扩增的温度控制程序，如下表4所示。
表4：实时荧光定量PCR仪温度控制程序设置
Figure BDA0003193878740000181
第五步，PCR反应完成后的结果，对相同浓度的6个孔的实际检测值计算平均值，详见下表5。
表5：标准物质实测校准结果Ct值的平均值汇总计算表
简称 起始样本量 浓度对数值 Ct平均值
S1 100000000 8 20.34753
S2 10000000 7 23.89119
S3 1000000 6 27.84867
S4 100000 5 30.88146
S5 10000 4 33.82133
S6 1000 3 37.33841
S7 100 2 39.17926
以标准物质浓度的对数值为横坐标，以每一标准物质对应的Ct值为纵坐标，绘制质粒DNA标准物质梯度稀释的标准曲线，详见图7。
从图7中可以得到R2＝0.9936，从而计算出线性回归系数R＝0.9967。
实施例2：实时荧光定量PCR仪用标准装置校准的应用
第一步，选用不同数量标准装置的排布设置，由于《聚合酶链反应分析仪(PCR)校准规范》JJF1527-2015要求至少包含5个浓度梯度，因此至少需要布置含有5个检测端的标准装置，为了同标准物质的校准结果进行对比，因此不同检测端对浓度梯度模拟的设置浓度如下表6所示。
表6实时荧光定量PCR仪不同浓度梯度的标准装置的配置表
名称 模拟起始样本浓度 不同浓度的对数值 对应的Ct值
S1 1.0×108copy/uL 8 19
S2 1.0×107copy/uL 7 23
S3 1.0×106copy/uL 6 27
S4 1.0×105copy/uL 5 31
S5 1.0×104copy/uL 4 35
S6 1.0×103copy/uL 3 39
S7 1.0×102copy/uL 2 43
NTC 0 0 -
此外，为了充分表明本标准装置在检测标准曲线中的灵活运用，下面以表7-表11具体列举了不同数量检测端在对实时荧光定量PCR反应体校准时的排布设置，以下均按96孔板型为例设置排布。
表7含5个检测端的标准装置模拟5种浓度的排布设置
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S3
B
C
D S4
E
F
G
H S2 S5
表8含7个检测端的标准装置模拟7种浓度的排布设置
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S2 S3
B
C
D S4
E
F
G
H S5 S6 S7
表9含7个检测端的标准装置模拟6种浓度的排布设置
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S2 S3
B
C
D S4
E
F
G
H S5 S6 NTC
表10含15个检测端的标准装置模拟7种浓度的排布设置
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S1 S2 S2 S3
B
C
D S3 S4 S4
E S5 S5
F
G
H S6 S6 S7 S7 NTC
表11含96个检测端的标准装置模拟7种浓度的排布设置
Figure BDA0003193878740000191
Figure BDA0003193878740000201
此外，需要强调的是，在实际使用中，含多个检测端的标准装置在排布设置是可以根据实施目的进行灵活调整的。
第二步，进行PCR反应；
由于本实施例主要是同标准物质校准曲线结果对比，因此，设定的PCR扩增的温度控制程序同表4。相应的，设置标准装置配套的标准装置软件，按照标准装置采集到的温度和对应的循环数，在PCR反应过程中，采用电压控制的方式控制标准光源的亮度。
需要说明的是，使用标准装置校准更有针对性，比如在做具体扩增实验前，根据实际试验扩增样本DNA的类型和目的，选用不同的排布类型和设置具体的模拟温度。同样，控制程序也可以进行相应的调整，可以设置不同的温度控制点，这样校准的结果更具针对性，相应的准确率也会更高。例如，在做非洲猪瘟的检测中，可预先利用本方法模拟非洲猪瘟质粒DNA标准物质的标准曲线，对实时荧光定量PCR仪进行校准和质控检测，然后，再使用经过校准和质控的实时荧光定量PCR仪进行非洲猪瘟样本的检测。因此，我们可以看出使用标准装置进行标准曲线的绘制更具针对性，实际应用目的更明确。
本实施例目的是和标准物质模拟的基因扩增标准曲线做对比，因此使用的PCR扩增的温度控制程序同表4。实际运用过程中，根据使用目的设置不同的扩增程序，比如可以根据标准装置设置的控制亮度的温度程序来设置实时荧光定量PCR仪扩增的温度控制程序，相对不同使用目的，操作也会更灵活。
第三步，PCR反应完成后的结果，以标准装置模拟的标准物质的不同浓度的对数值为横坐标，以标准装置模拟的标准物质的不同浓度所对应的Ct值为纵坐标，绘制标准装置模拟梯度的标准曲线。图8为根据表8所示的含7个检测端的标准装置模拟6种浓度的排布设置绘制的标准曲线理想结果图，图中所示结果是一种模拟的理想值，前提是实时荧光定量PCR仪的温场和光学系统都是准确、无偏差。
利用标准装置模拟标准曲线的结果图，可以根据检测出来的Ct值的实测结果手动绘制，也可以由实时荧光定量PCR仪的系统根据实测的Ct值自动生成。
通过模拟标准曲线的理想结果和实测结果进行对比，如果理想结果和实测结果不一样，就能够推测差值是由实时荧光定量PCR仪本身的设备性能误差导致的。
通过实施例1和实施例2的对比可知，标准装置的绘制的标准曲线的线性理论值应该是1。当然，如果实时荧光定量PCR仪最终检测生成的标准曲线线性≠1，就必然是实时荧光定量PCR仪设备本身引起的，可能是光路系统不准确、边缘效应等原因导致的，可用来分析设备本身的性能问题。此外，如果发现线性≠1，还可以用来评价荧光定量PCR仪各个检测孔的均匀性。
对于实时荧光定量PCR仪所测得的荧光信号值、曲线、熔解曲线、Ct值、温度准确性、孔间温差、温度过冲、升降温速率、Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、通道峰高一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比等等结果和性能评价的分析过程，规范中已有明确要求。本发明通过模拟荧光基团扩增反应的方法以及通过模拟基因扩增标准曲线的方法进行分析具体参数性能均可以参照已有的规范进行。
由于规范有明确的《校准原始记录(参考)格式》、《校准证书结果页(参考)格式》和《温度和Ct值测量结果的不确定度评定示例》模板，通过类似表8含7个检测端的标准装置的排布设置，标准装置进行物理方式模拟的结果同标准物质进行校准结果进行对比分析，由于规范分析结果格式的篇幅限制，下表12仅仅列举了其中的“Ct值示值误差、Ct值均匀度和Ct值精密度”的记录和对比结果。
表12：Ct值示值误差、Ct值均匀度和Ct值精密度对比校准结果
Figure BDA0003193878740000211
实施例3：标准装置模拟基因扩增过程的应用。
第一步，选择标准装置的排布设置。
表13：模拟基因扩增过程的标准装置排布
Figure BDA0003193878740000212
Figure BDA0003193878740000221
表13为模拟96孔PCR反应管选用的标准装置排布，其中S表示相同的模拟控制程序在96孔PCR反应管中对应的位置。
第二步，进行PCR反应；
设定的PCR扩增的qPCR程序中包括温度控制程序，具体温度控制程序见表14。
表14：模拟基因扩增过程的温度控制程序
Figure BDA0003193878740000222
qPCR程序的主要设置还包括设置荧光标记物类型，实时荧光定量PCR仪的选项包括FAM，SYBR，CY3，CY5等，本次模拟基因扩增过程设置选择的是FAM。
设置标准装置排布对应位置配套的校准测试程序，按照标准装置采集到的温度和发光比例控制标准光源的亮度。
完成qPCR程序和校准测试程序的设置后，将标准装置放入实时荧光定量PCR仪中，点击开启实时荧光定量PCR仪配套软件中的“RUN”启动运行qPCR扩增程序，同时，标准装置的校准测试程序根据采集到的温度自动启动模拟。
此处需要说明的是：实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序和标准装置配套的校准测试程序的设置，同将标准装置放入实时荧光定量PCR仪中的步骤没有先后顺序关系。
第三步，PCR反应完成。实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序运行结束，取出标准装置，查看检测数据进行检测结果的分析比对。具体数据分析内容如下：
在qPCR仪上对标准装置输入相对亮度的采集结果进行分析，得到整个扩增过程中采集到的荧光信号值、曲线、熔解曲线、Ct值等，并导出数据；将检测结果数据输入到标准装置配套软件中，进行比对分析，生成温度准确性、孔间温差、温度过冲、升降温速率、Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、通道峰高一致性、线性灵敏系数、熔解温度漂移、熔解温度比等检测结果
标准装置模拟基因扩增过程的检测结果如下：
标准装置模拟基因扩增过程的扩增曲线详见图9，图9为实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序对本实施例的过程自动制作的扩增曲线图，其中横坐标表示循环数，纵坐标表示标准光源亮度对应的实时荧光定量PCR仪检测出的荧光强度。标准装置模拟基因扩增过程的熔解曲线详见图10，图10为实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序对本实施例的过程自动制作的熔解曲线图，其中横坐标表示温度，纵坐标表示对荧光强度求导的值。
标准装置模拟基因扩增过程的数据分析结果如下表：
表15：标准装置模拟数据分析结果汇总表
Figure BDA0003193878740000231
上表汇总了标准装置模拟基因扩增过程中的Ct值示值误差、Ct值均匀度、Ct值精密度、熔解温度漂移(ΔTm)、通道峰值高度一致性(CPHC)和线性灵敏系数(LSF)，从表中数据可以看出利用标准装置可以分析每个采样孔的相关性能数据，不是性能参数的平均值，相对准确性和针对性更强。
根据本发明提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法，以标准光源模拟荧光基团在扩增反应中的变化，并提供了一种标准装置，通过引入热敏电阻元件及标准光源，可以采集实时荧光定量PCR仪的多孔金属加热模块孔内温度，并根据温度循环控制标准光源的发光亮度，以模拟荧光基团扩增反应的光亮变化，并被实时荧光定量PCR仪接收检测，通过实时荧光定量PCR仪生成的荧光检测数据，结合采集温度及标准光源发光亮度，对实时荧光定量PCR仪的温场及光路系统的准确度和灵敏度进行检测和分析。
根据本发明提供一种模拟荧光基团扩增反应的方法及构造的标准装置可对实时荧光定量PCR仪的光路系统是否准确可靠进行检测。可检测标准基因扩增过程，也可以对熔解曲线法的熔解过程进行检测。同时，标准装置中标准光源的光亮变化控制是依靠实时荧光定量PCR仪温场提供的温度信号进行控制的，通过对检测结果进行分析，还可分析测量结果的偏差是由实时荧光定量PCR仪温场导致的还是光路系统导致的，并给出相关性。标准光源可溯源至我国光学国家基准，具备溯源性。物理装置可作为标准器反复使用，节省试剂及标准物质的消耗。
本发明还提供了一种模拟基因扩增标准曲线的方法，可以用于替代现有规范中用质粒DNA标准物质、核糖核酸标准物质或染料标准物质来进行样本线性及荧光线性的检测；还可以模拟各种不同DNA样本的标准物质梯度稀释的标准曲线，对荧光定量PCR仪进行线性检测或质量控制；通过这种方法可以模拟各种不同DNA样本的标准物质的标准曲线，有针对性地对设备进行校准测试；所述标准装置可作为仪器设备反复使用，存储条件要求低，使用方便，从而节省试剂及标准物质的消耗，降低成本；此外，使用所述标准装置模拟基因扩增标准曲线的方法，直接用单孔的方式来实现，不是平均值，更有准确性和针对性。
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对具体细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围主要以所附权利要求及其等同替换为主。

Claims (10)

1.一种模拟荧光基团扩增反应的方法，用于对实时荧光定量PCR仪进行检测和校准，其特征在于，所述方法包括：
构造一个标准装置，包括检测端和电路板(5)，所述检测端被设置用于采集温度和模拟荧光基团发光亮度，所述检测端包括标准光源(3)；
开启实时荧光定量PCR仪和标准装置，设置实时荧光定量PCR仪配套的qPCR程序，设置标准装置配套的校准测试程序，并且将标准装置放入实时荧光定量PCR仪中；
运行所述qPCR程序，检测端采集到实时荧光定量PCR仪的加热模块的温度数据，并将所述温度数据传输到标准装置软件中；
所述标准装置根据校准测试程序采集到的温度数据和预设的发光比例，控制标准光源(3)的发光亮度，从而模拟荧光基团扩增反应过程的荧光信号强度；
标准光源(3)的发光亮度被实时荧光定量PCR仪所检测，并生成模拟荧光基团扩增反应的检测数据。
2.根据权利要求1所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述控制标准光源(3)的发光亮度包括控制标准光源(3)发光的开启、控制标准光源(3)发光比例的变化过程和控制标准光源(3)停止发光。
3.根据权利要求1所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述控制标准光源(3)的发光亮度的方法包括电压控制、电流控制或者占空比控制。
4.根据权利要求3所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述控制标准光源(3)的发光亮度的方法，设置了分压控制，分压控制精度达到10微伏。
5.根据权利要求1所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述模拟荧光基团扩增反应过程，包括预模拟阶段、模拟荧光信号强度递增阶段、模拟荧光信号强度锐减阶段和关闭模拟；所述关闭模拟是指当标准装置采集温度达到设置的关闭温度时，控制标准光源(3)停止发光。
6.根据权利要求5所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述预模拟阶段，控制发光亮度为0，所述标准光源(3)不发光。
7.根据权利要求5所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述模拟荧光信号强度递增阶段包括模拟荧光基团扩增反应的基线期、模拟荧光基团扩增反应的指数扩增期、模拟荧光基团扩增反应的线性扩增期和模拟荧光基团扩增反应的平台期，控制标准光源(3)的发光亮度从20％开始按照一定的发光比例递增至100％。
8.根据权利要求7所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述模拟荧光基团扩增反应的基线期，控制标准光源(3)的发光亮度恒定在20％，模拟实时定量荧光PCR仪的背景噪声，此时标准光源(3)的发光亮度未达到荧光定量PCR的荧光检测阈值(10)；所述模拟荧光基团扩增反应的指数扩增期，控制标准光源(3)的发光亮度首先每个循环依次递增0.11％或0.12％，模拟实时定量荧光PCR仪的信噪比过程，直至标准光源(3)的发光亮度超过实时定量荧光PCR仪的荧光检测阈值(10)，能够被实时荧光定量PCR仪检测到，标准光源(3)的发光亮度为前一循环发光亮度的基础上的递增0.2％，所对应的循环数为Ct值(9)；所述模拟荧光基团扩增反应的线性扩增期是在Ct值(9)后的一个循环，控制标准光源(3)的发光亮度呈几何倍数增加，直至达到亮度100％；所述模拟荧光基团扩增反应的平台期，标准光源的亮度保持100％不变。
9.根据权利要求5所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：所述模拟荧光信号强度锐减阶段为模拟荧光基团扩增反应的熔解过程，控制标准光源(3)的发光亮度先从100％迅速锐减降至60％，当标准装置采集到的温度高于熔解温度0.2℃时，控制标准光源(3)的发光亮度继续迅速下降至20％。
10.根据权利要求8所述的模拟荧光基团扩增反应的方法，其特征在于：根据模拟荧光基团扩增反应所得Ct值(9)计算出定量分析扩增反应起始的待测样本浓度。
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