CN107129931B - 生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法 - Google Patents

生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法，包括计算机、数据传输单元、单片机、光源模组。光源模组根据不同的校准仪器而设计相应的外形；光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置均装有发光单元。本发明装置可以实现线性和重复性计量特性指标的校准。本发明的计量标准装置可以实现原位多波长条件下线性和重复性的校准，改变波长、发光强度时无需移动计量标准器，保证了重复性指标计量的可靠性。

Description

生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法
技术领域
本发明涉及生物分子光学检测器技术领域，特别是涉及一种生物分子光学检测器的计量标准装置及使用方法。
背景技术
随着生命科学的发展和生物技术的进步，生物测量被越来越广泛的应用于临床检验、食品安全、生物安全、药品检测等领域，涉及到核酸、蛋白、细胞、微生物等定性与定量工作，其中，对核酸和蛋白质这类生物大分子的准确测量已成为生物计量发展的重点。
核酸和蛋白质的分析手段多种多样，包括色谱法、光谱法、质谱法等，其中基于光学检测的仪器和方法近年来得到了长足的发展。例如，核酸分析常用的荧光实时定量PCR、蛋白质分析常用的荧光酶联免疫分析和化学发光免疫分析等都是基于光学检测的手段。为了保证基于这些光学检测手段核酸、蛋白质分析结果的准确可比，必须对生物分子光学检测器进行计量校准，其中线性与重复性成为这类检测器的核心计量特性指标。
为实现检测器的线性与重复性的计量校准，研制可溯源的标准光源成为其中的关键。前期已有报道使用LED光源、氚光源等进行校准，但是其发光强度的溯源成为难点，在不能实现有效发光强度溯源的情况下，往往将其转换为溯源到吸光度、透射比等物理参数上，不能够直接反映出光学检测器的线性。
因此，有必要研制出一种稳定的、可溯源的、多参数的、适用范围广的生物分子光学检测器的计量标准装置，实现线性和重复性计量特性指标的校准。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种生物分子光学检测器的计量标准装置。
本发明的第二目的是提供一种生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法。
一种生物分子光学检测器计量标准装置，包括计算机、数据传输单元、单片机、光源模组。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述光源模组根据不同的校准仪器而设计相应的外形；所述校准仪器包括实时荧光定量PCR板和酶标板。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置均装有发光单元。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述发光单元底部装有微型贴片LED；微型贴片LED之上装有特定波长的滤光片；滤光片之上覆盖有聚合物薄膜。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述微型贴片LED根据待校准仪器的波长不同，选择不同波长的LED作为初始光源；所述滤光片用于滤光后得到带宽10nm左右的窄带光；所述聚合物薄膜起保护和固定作用。
进一步而言，本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置的有益改进为，根据实际需要，可在光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置附近放置具有不同波长的发光单元。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述数据传输单元为计算机和单片机之间的传输媒介，通过有线或无线的方式连接；当采用有线连接方式时，采用串行通讯方式通过排线与单片机之间电性连接；当采用无线连接方式时，计算机与接收单元之间以串行通讯的方式通过排线电性连接；
单片机与发射单元之间电性连接；发射单元和接收单元之间通过射频或红外方式建立无线数据链路；
计算机的数据输入端与数据传输单元之间通过有线或无线方式连接；所述数据传输单元与单片机之间电性连接；所述可调光源与单片机之间电性连接。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置，其中，所述光源模组用于提供不同强度、不同波长的连续光或不同占空比的脉冲光实现对荧光酶标仪、化学发光分析仪、荧光实时定量PCR仪光学计量特性的校准；所述计算机用于提供频率、占空比等信息的人机交互界面；计算机上运行上位机程序，提供人机交互的界面，用于设置串口通讯参数、波长、脉冲频率、占空比等信息；所述单片机用于接收计算机发来的设置参数，在通过选取不同的IO口、改变IO口的脉冲频率与占空比的方式，驱动光源模组发出不同波长、不同频率、不同占空比的光信号。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法为，通过计算机发送波长、频率和占空比参数，实现对发光强度和频率的调整，通过检定合格示波器检测单片机IO口的波形，得到可溯源的时间和频率参数，从而将发光强度的溯源问题转换成时间和频率的溯源。
本发明所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法为，当进行线性校准时，首先根据待校准仪器的检测波长选择对应波长的光源模组，将光源模组放入到待校准仪器中；然后将占空比设置100％，通过改变闪烁频率，将待校准仪器的发光信号值调整到线性范围的最大值附近，然后分别设置占空比为100％、80％、60％、40％、20％和0，分别记录仪器的发光信号值；将占空比与对应的发光信号值进行线性拟合，并依据公式(1)计算各个信号值下的线性误差；
Figure BDA0001333277090000031
式中：
Figure BDA0001333277090000032
——斜率平均值；
n——不同占空比设置的个数；
Ii——不同占空比下仪器的信号强度；
Di——占空比；
Figure BDA0001333277090000033
式中：
Δi——线性误差；
Ki——某一占空比下的斜率；
当进行重复性校准时，在上述参数优化的基础上，设定占空比为20％，然后用待校准的仪器对该占空比下的发光强度重复测定20次，根据公式(3)计算信号的相对标准偏差作为重复性的表征；
Figure BDA0001333277090000034
式中：
xi---第i次测量值；
Figure BDA0001333277090000035
---n次测量值的平均值；
n---测量次数，此处n＝20。
本发明的生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法与现有技术相比，其突出效果在于：
(1)本发明为一种稳定的、可溯源的、多参数的、适用范围广的生物分子光学检测器的计量标准装置，可以实现线性和重复性计量特性指标的校准。
(2)本发明将绝对光强度的溯源转换成时间的溯源，能够准确、直接反映出光学检测器的线性。
(3)本发明的计量标准装置可以实现原位多波长条件下线性和重复性的校准，改变波长、发光强度时无需移动计量标准器，保证了重复性指标计量的可靠性。
(4)本发明的计量标准装置可通过无线方式与上位机通讯，标准装置在使用过程中不影响仪器关闭仓门等操作，能够保证仪器计量时的状态与检测时的状态完全一致，保证了计量结果的可靠性。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明的生物分子光学检测器计量标准装置及使用方法作进一步说明。
附图说明
图1为96孔酶标板光学模组示意图；
图2为光学模组发光单元组成示意图；
图3为包含不同波长发光单元的光学模组示意图。
具体实施方式
实施例1
生物分子光学检测器计量标准装置，包括计算机、数据传输单元、单片机、光源模组。数据传输单元为计算机和单片机之间的传输媒介，通过有线或无线的方式连接；当采用有线连接方式时，采用串行通讯方式通过排线与单片机之间电性连接；当采用无线连接方式时，计算机与接收单元之间以串行通讯的方式通过排线电性连接；
单片机与发射单元之间电性连接；发射单元和接收单元之间通过射频或红外方式建立无线数据链路；
计算机的数据输入端与数据传输单元之间通过有线或无线方式连接；所述数据传输单元与单片机之间电性连接；所述可调光源与单片机之间电性连接。
光源模组用于提供不同强度、不同波长的连续光或不同占空比的脉冲光实现对荧光酶标仪、化学发光分析仪、荧光实时定量PCR仪光学计量特性的校准；
计算机用于提供频率、占空比等信息的人机交互界面；计算机上运行上位机程序，提供人机交互的界面，用于设置串口通讯参数、波长、脉冲频率、占空比等信息；
单片机用于接收计算机发来的设置参数，在通过选取不同的IO口、改变IO口的脉冲频率与占空比的方式，驱动光源模组发出不同波长、不同频率、不同占空比的光信号。
光源模组根据不同的校准仪器而设计相应的外形；其中，校准仪器包括实时荧光定量PCR板和酶标板等。
光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置均装有发光单元2。以96孔实时荧光定量PCR板、酶标板为例，其光学模组示意图如图1所示，在96孔酶标板的典型位置A1、A6、A12、D1、D6、D12、H1、H6、H12位置上装有光学模组。
如图2所示，发光单元2底部装有微型贴片LED5；微型贴片LED5之上装有特定波长的滤光片4；滤光片4之上覆盖有聚合物薄膜3。微型贴片LED5根据待校准仪器的波长不同，选择不同波长的LED作为初始光源；滤光片4用于滤光后得到带宽10nm左右的窄带光；聚合物薄膜3起保护和固定作用。
结合图3所示，根据实际需要，可在光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置附近放置具有不同波长的发光单元(6、7、8、9)，实现同一块板对不同波长光学检测器的校准。
生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法：
通过计算机发送波长、频率和占空比参数，实现对发光强度和频率的调整，通过检定合格示波器检测单片机IO口的波形，得到可溯源的时间和频率参数，从而将发光强度的溯源问题转换成时间和频率的溯源。
当进行线性校准时，首先根据待校准仪器的检测波长选择对应波长的光源模组，将光源模组放入到待校准仪器中；然后将占空比设置100％，通过改变闪烁频率，将待校准仪器的发光信号值调整到线性范围的最大值附近，然后分别设置占空比为100％、80％、60％、40％、20％和0，分别记录仪器的发光信号值；将占空比与对应的发光信号值进行线性拟合，并依据公式(1)计算各个信号值下的线性误差；
Figure BDA0001333277090000051
式中：
Figure BDA0001333277090000052
——斜率平均值；
n——不同占空比设置的个数；
Ii——不同占空比下仪器的信号强度；
Di——占空比；
Figure BDA0001333277090000061
式中：
Δi——线性误差；
Ki——某一占空比下的斜率；
当进行重复性校准时，在上述参数优化的基础上，设定占空比为20％，然后用待校准的仪器对该占空比下的发光强度重复测定20次，根据公式(3)计算信号的相对标准偏差作为重复性的表征；
Figure BDA0001333277090000062
式中：
xi---第i次测量值；
Figure BDA0001333277090000063
---n次测量值的平均值；
n---测量次数，此处n＝20。
实施例2
生物分子光学检测器计量标准装置，包括计算机、数据传输单元、单片机、光源模组。数据传输单元为计算机和单片机之间的传输媒介，在上位机一侧，将控制软件GUI界面输入的波长、周期、占空比信息通过串行通讯的方式送入发射单元，通过AX5043射频芯片以433MHz载波进行无线射频传输；在计量测试端，同样由AX5043接收到射频信号，并从中解调出控制信息送入STC的51单片机，由该单片机根据波长信息驱动不同的IO端口以点亮与之相连的光源模组，实现波长的选择功能，同时根据设置的周期和占空比信息产生PWM调制信号，控制光源模组的亮度。光源模组由一个520nm的LED和一个中心波长520nm、带宽10nm的干涉滤光片组成，其发出的520nm的光用于模拟FAM的荧光信号。
当进行线性校准时，将计量测试端放入定量PCR仪中，首先将占空比设置为100％，通过改变周期，将发光强度调整到300000，然后分别设置占空比为100％、80％、60％、40％、20％和0，分别测量发光信号值，每种占空比下重复测量3次取平均，其值分别为300758、239001、181147、128591、69845、5642，线性相关系数0.999，反映出仪器线性良好。
当进行重复性校准时，在上述参数条件下，设定占空比为20％，然后用待校准的仪器对该占空比下的发光强度重复测定20次，测得发光强度平均值为68197，相对标准偏差仅为0.93％，证明仪器测量重复性良好。
为突出本发明的有益效果，还进行了以下对比例实验，
对比例1
采用标准品对仪器的线性和重复性进行校准。将FAM荧光素标准品用硼酸盐缓冲液进行稀释，不断调整浓度，然后在PCR扩增板的孔中加入40μL FAM荧光素标准溶液，测量其荧光强度值，使其荧光强度接近300000，然后将此溶液按照1：2的逐级梯度稀释，直至最低浓度标准品的荧光强度为5000左右或在检出限附近。将稀释得到的各个标准品溶液每个分析三次，测量其荧光强度，取平均值，然后对标准品的浓度与其荧光信号强度进行线性回归，线性相关系数为0.993。对荧光信号强度为70000左右的标准品溶液连续测量20次，计算荧光信号强度的相对标准偏差，为2.1％。
对比采用标准品校准的方式和本发明实施例的计量装置校准的方式，对于同一台仪器采用校准品校准时的线性和重复性都不如采用本发明实施例的计量标准装置的校准结果。
这主要是因为溶液中的分子荧光收到分子之间的相互作用、分子与溶剂之间的能量交换等，使其荧光信号强度与理论值发生偏离，同时也导致信号测量的重复性不佳。因此，采用荧光素标准品的校准方式，将不能真实的反映仪器的性能。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述生物分子光学检测器计量标准装置，包括计算机、数据传输单元、单片机和光源模组；
通过计算机发送波长、频率和占空比参数，实现对发光强度和频率的调整，通过检定合格示波器检测单片机IO口的波形，得到可溯源的时间和频率参数，从而将发光强度的溯源问题转换成时间和频率的溯源；
当进行线性校准时，首先根据待校准仪器的检测波长选择对应波长的光源模组，将光源模组放入到待校准仪器中；然后将占空比设置为100%，通过改变闪烁频率，将待校准仪器的发光信号值调整到线性范围的最大值附近，然后分别设置占空比为100%、80%、60%、40%、20%和0，分别记录仪器的发光信号值；将占空比与对应的发光信号值进行线性拟合，并依据公式（1）计算各个信号值下的线性误差；
式中：
——斜率平均值；
n——不同占空比设置的个数；
Ii——不同占空比下仪器的信号强度；
Di——占空比；
  式中：
Δi——线性误差；
Ki——某一占空比下的斜率；
当进行重复性校准时，在上述参数优化的基础上，设定占空比为20%，然后用待校准的仪器对该占空比下的发光强度重复测定20次，根据公式（3）计算信号的相对标准偏差作为重复性的表征；
  式中：
---第i次测量值；
---n次测量值的平均值；
n---测量次数，此处n=20。
2.根据权利要求1所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述光源模组根据不同的校准仪器而设计相应的外形；所述校准仪器包括实时荧光定量PCR板和酶标板。
3.根据权利要求2所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置均装有发光单元（2）。
4.根据权利要求3所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述发光单元（2）底部装有微型贴片LED（5）；微型贴片LED（5）之上装有特定波长的滤光片（4）；滤光片（4）之上覆盖有聚合物薄膜（3）。
5.根据权利要求4所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述微型贴片LED（5）根据待校准仪器的波长不同，选择不同波长的LED作为初始光源；所述滤光片（4）用于滤光后得到带宽10 nm左右的窄带光；所述聚合物薄膜（3）起保护和固定作用。
6.根据权利要求5所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：根据实际需要，可在光源模组的四角位置、中心位置、四边的中间位置附近放置具有不同波长的发光单元。
7.根据权利要求2-6任一项所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述数据传输单元为计算机和单片机之间的传输媒介，通过有线或无线的方式连接；当采用有线连接方式时，采用串行通讯方式通过排线与单片机之间电性连接；
单片机与发射单元之间电性连接；发射单元和接收单元之间通过射频或红外方式建立无线数据链路；
计算机的数据输入端与数据传输单元之间通过有线或无线方式连接；所述数据传输单元与单片机之间电性连接；可调光源与单片机之间电性连接。
8.根据权利要求7所述的生物分子光学检测器计量标准装置的使用方法，其特征在于：所述光源模组用于提供不同强度、不同波长的连续光或不同占空比的脉冲光实现对荧光酶标仪、化学发光分析仪、荧光实时定量PCR仪光学计量特性的校准；所述计算机用于提供频率、占空比等信息的人机交互界面；计算机上运行上位机程序，提供人机交互的界面，用于设置串口通讯参数、波长、脉冲频率、占空比等信息；所述单片机用于接收计算机发来的设置参数，再通过选取不同的IO口、改变IO口的脉冲频率与占空比的方式，驱动光源模组发出不同波长、不同频率、不同占空比的光信号。
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