CN1605856A - 激光荧光关联谱单分子分析仪 - Google Patents

Abstract

一种激光荧光关联谱单分子分析仪，用于生命科学、化学、物理等领域对溶液中单个分子的研究。样品溶液置于盖玻片或样品池上，激光用于对溶液中的待研究分子进行激发，扩束的激光经激发滤光片过滤，再经双色镜反射进入显微镜物镜，经物镜聚焦后照射到盖玻片上方的样品溶液，样品溶液的发射荧光经过同一物镜穿过双色镜并经发射滤光片滤掉杂色光，然后经透镜聚焦到与单光子检测器耦合在一起的针孔，单光子检测器产生的信号经数据采集卡，从计算机输出。本发明具有操作简便、稳定，光损失小，灵敏度高等特点，可应用于活细胞内单个分子的研究、生物分子相互作用、高通量筛选、肿瘤早期诊断、核酸分析等方面的基础研究。

Description

  激光荧光关联谱单分子分析仪

技术领域

本发明涉及一种单分子分析仪，尤其涉及一种基于荧光关联谱(FluorescenceCorrelation Spectroscopy，FCS)技术的激光荧光关联谱单分子分析仪，用于生命科学、化学、物理学等领域中的溶液中单个分子的研究，属生命科学、分析化学检测技术以及光学仪器领域。

背景技术

单分子检测达到分子探测的极限，是人们长期以来追求的目标，它在生命科学、化学、物理学等领域具有重要的科学意义和应用前景。这种方法能在单分子水平上得到传统方法无法得到的重要信息，特别适合研究化学及生化反应动力学、生物分子相互作用、结构与功能信息、某些重大疾病早期诊断、病理研究以及高通量药物筛选等。目前单分子的检测主要采用原子力显微方法和激光荧光技术。其中激光诱导荧光法是单个分子检测的最有效的方法，特别适合溶液中单分子的研究。然而，由于单个分子的信号很弱，通常会湮没在散射光产生的背景噪音中。激光荧光单分子检测的关键技术就是如何降低散射光影响和提高单分子的荧光信号收集效率。荧光关联谱是通过降低样品的照射体积以减少散射光的影响，从而实现单分子检测的一种新型检测技术。这种方法虽于二十世纪70年代提出(Magde D.et al，Phys.Rev.Lett.，1972，29，705-708)，但直到90年代随着计算机技术、激光共焦技术以及光学检测技术的发展才使其真正得到迅速发展并实现了单分子检测(Rigler R.et al.，Eur.Biophys.J.，1993，22，169-175)。第一台商品化的荧光关联谱仪由德国Zeiss公司于1996年生产(ConfoCor)，并于1999年推出功能更强大的第二代产品ConfoCor 2。另外美国ISS公司也最新推出了商品名为ALBA的产品。目前这些仪器均采用共焦构型，在荧光收集方面采用两种模式：1光纤模式，即以光纤代替针孔，用光纤收集荧光。该模式简单，但荧光信号损失较大。2.透镜模式，即采用针孔滤去非焦点区的荧光，然后再用透镜聚焦。该模式复杂，难以保证检测器光敏区、针孔以及物镜焦点严格同轴，因此荧光信号损失也较大，而且调节过程非常复杂。

发明内容

本发明的目的在于针对以上装置存在的不足，设计一种新型激光荧光关联谱单分子分析仪，有效减少荧光损失，提高单分子检测的信噪比，特别适合单个分子的研究。

为实现以上目的，在本发明的技术方案中，针孔与单光子检测器的光敏感区紧紧耦合在一起，当对系统进行调节时，针孔与检测器同时移动，容易实现检测器光敏区、针孔和物镜焦点同轴；另外，针孔与光敏区贴在一起避免了光子多次聚焦和传输过程中的光能量损失，因此能显著提高检测灵敏度，并使调节方便。

本发明的工作原理是：在一个很小的照射微区内(～10^-15L)，荧光粒子由于布朗运动或化学反应导致进入或离开微区的分子数目总是在其平衡值处变化，因而产生荧光的涨落现象。对于单个粒子来说，荧光涨落的变化与粒子进出微区的时间(迟延时间)有关，该时间反映了不同粒子的性质以及生化反应动力学等方面的信息。

本发明以激光为激发光源，采用共焦构型，通过激光扩束和高数值孔径的物镜得到高聚焦的激光束，采用高灵敏单光子检测器将荧光信号转换为电信号，数据采集卡用于数据采集和实时分析。具体结构包括激光器，中性衰减片，扩束装置，光闸，激发滤光片，双色镜，显微镜物镜，载物台，盖玻片或样品池，样品盖，发射滤光片，透镜，针孔，单光子检测器，数据采集卡及计算机，盖玻片或样品池放于载物台上，样品溶液置于盖玻片或样品池上，激光器与扩束装置之间的光路上设置中性衰减片，扩束装置的输出光路上依次设置光闸、激发滤光片和双色镜，扩束的激光经激发滤光片过滤后经双色镜反射进入显微镜物镜，经物镜聚焦后照射到盖玻片或样品池上方的样品溶液，样品溶液的发射荧光经过物镜收集穿过双色镜并经发射滤光片过滤，然后经透镜聚焦到针孔，针孔与单光子检测器的光敏感区耦合，单光子检测器通过连接电缆与数据采集卡连接，数据采集卡通过连接电缆与计算机连接。

本发明工作时，打开激光器，待激光器稳定后，调节中性衰减片使激光强度达到要求；调节扩束装置，使激光束直径达到要求。激光器产生的激光束经过扩束装置后穿过激发滤光片，然后照射到双色镜，经双色镜反射后进入显微镜的物镜(高放大倍率和高数值孔径物镜)，聚焦于盖玻片(或样品池)上方的样品溶液，样品溶液经激光激发产生诱导荧光。由于在焦点处收集荧光，该荧光经过相同的物镜后发散为平行光，穿过同一双色镜并经发射滤光片过滤，然后用透镜聚焦于针孔。针孔与单光子检测器耦合在一起并置于透镜的焦点区，此焦点区正好是物镜的像平面。针孔与物镜焦点同轴可将激光在样品上的照射体积限定在很小的范围(小于10^-15L)。然后荧光穿过针孔后进入高灵敏的单光子检测器。单光子检测器产生的信号经数据采集卡，从计算机输出。

本发明所述的激光器包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器和染料激光器，可根据不同的研究目的进行选择。对不同的荧光染料，激发和发射滤光片、双色镜可以方便的更换；采用的显微镜物镜为高放大倍率(大于40)和高数值孔径(大于0.9)的水浸或油浸物镜；采用的盖玻片(或样品池)为无荧光盖玻片(或样品池)，厚度为0.13～0.17mm；样品溶液用18MΩ的超纯水配制；采用的针孔直径从15μm到300μm可变，可方便更换；采用的单光子检测器包括了雪崩二极管型的单光子计数器以及高灵敏的光放大管；采用数据采集卡进行实时快速采样。

本发明在滤去非焦点区的荧光和荧光收集方面提出了独到的模式，操作简单，灵敏度很高，稳定性好，适合生命科学、化学以及物理学等领域的基础研究，特别在活细胞内单个分子的研究、生物分子相互作用(如抗体-抗原)、高通量筛选、肿瘤早期诊断、核酸分析等方面的基础研究中有广阔的前景。

附图说明

图1是本发明的结构原理图。

在图1中，1激光器，2中性衰减片，3扩束装置，4光闸，5激发滤光片，6双色镜，7显微镜物镜，8载物台，9盖玻片(或样品池)，10样品盖，11样品溶液，12发射滤光片，13透镜，14针孔，15单光子检测器，16数据采集卡，17计算机，18连接电缆，19激发光束，20发射荧光。

图2为荧光素的荧光关联谱图。a中照射微区内有0.4个荧光素分子，b中有2个荧光素分子。

图3为罗丹明绿的荧光关联谱图。a中照射微区内有0.3个荧光素分子，b中有2个荧光素分子。

图4为山羊抗人IgG-FITC的荧光关联谱图。照射微区内有8个山羊抗人IgG-FITC分子。

图5为SYBR Green I染色的人四甲基叶酸还原酶基因PCR扩增产物的荧光关联谱图。a中照射微区内有22个DNA分子，b中有7个DNA分子。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案作进一步描述。

本发明的激光荧光关联谱单分子分析仪的结构原理如图1所示，主要由激光器1，中性衰减片2，扩束装置3，光闸4，激发滤光片5，双色镜6，显微镜物镜7，载物台8，盖玻片(或样品池)9，发射滤光片12，透镜13，针孔14，单光子检测器15，数据采集卡16及计算机17组成。盖玻片(或样品池)9放于载物台8上，样品溶液11置于盖玻片(或样品池)9上。激光器1与扩束装置3之间的光路上设置中性衰减片2，扩束装置3的输出光路上依次设置光闸4、激发滤光片5、双色镜6，扩束的激光19经激发滤光片5过滤后经双色镜6的反射进入显微镜物镜7，经物镜7聚焦后照射到盖玻片9上方的样品溶液11。发射荧光20经过物镜7穿过双色镜6并经发射滤光片12过滤，然后经透镜13聚焦到针孔14，针孔14与单光子检测器15的光敏感区耦合，单光子检测器15通过连接电缆18与数据采集卡16连接，数据采集卡16通过连接电缆18与计算机17连接。

首先打开激光器1，稳定15分钟，调节中性衰减片2使激发光束19的强度达到要求。调节扩束装置3使激发光束19的直径达到要求。加载样品时用光闸4切断光源。将盖玻片(或样品池)9置于载物台8上，将待分析的样品溶液20～30μL滴于盖玻片(或样品池)9上形成样品溶液11，然后盖上样品盖10。启动单光子检测器15、数据采集卡16和计算机17，拉开光闸4，扩束过的激发光束19经激发滤光片5滤光后被双色镜6反射进入显微镜物镜7的后孔，经显微镜物镜聚焦到样品溶液11上。发射荧光20穿过双色镜6后被发射滤光片12滤掉杂色光，由透镜13将其聚焦到针孔14并进入单光子检测器15，单光子检测器15产生的信号经数据采集卡16采集和实时分析由计算机17输出。

以下实施例是针对几种不同物质，利用本发明的激光荧光关联谱单分子分析仪得到的荧光关联谱图。实施例中采用组件为：

激光器：混合离子激光器；激发光束扩束后直径：10cm；激发/发射滤光片：485nm/530nm；双色镜：505DRLP；单光子检测器：雪崩二极管。

实施例1

荧光素分析：

采用35μm的针孔，样品实施过程如前述。附图2给出了荧光素的荧光关联谱图。图2a中照射微区内有0.4个荧光素分子，图2b中有2个荧光素分子。

实施例2

罗丹明绿分析：

采用35μm的针孔，样品实施过程如前述。附图3给出了罗丹明绿的荧光关联谱图。图3a中照射微区内有0.3个罗丹明绿分子，图3b中有2个罗丹明绿分子。

实施例3

山羊抗人IgG-FITC分析：

采用160μm的针孔，样品实施过程如前述。附图4给出了山羊抗人IgG-FITC的荧光关联谱图。图4中照射微区内有8个山羊抗人IgG-FITC分子。

实施例4

DNA片段(198bp)分析：

采用160μm的针孔，样品实施过程如前述。样品为人的四甲基叶酸还原酶基因PCR扩增产物并以SYBR Green I染色。附图5给出了DNA片断的荧光关联谱图。图5a中照射微区内有22个DNA分子，图5b中有7个DNA分子。

Claims (5)

1、一种激光荧光关联谱单分子分析仪，其特征在于由激光器(1)，中性衰减片(2)，扩束装置(3)，光闸(4)，激发滤光片(5)，双色镜(6)，显微镜物镜(7)，载物台(8)，盖玻片或样品池(9)，样品盖(10)，发射滤光片(12)，透镜(13)，针孔(14)，单光子检测器(15)，数据采集卡(16)及计算机(17)组成，盖玻片或样品池(9)放于载物台(8)上，样品溶液(11)置于盖玻片或样品池(9)上，激光器(1)与扩束装置(3)之间的光路上设置中性衰减片(2)，扩束装置(3)的输出光路上依次设置光闸(4)、激发滤光片(5)和双色镜(6)，扩束的激光(19)经激发滤光片(5)过滤后经双色镜(6)的反射进入显微镜物镜(7)，经物镜(7)聚焦后照射到盖玻片或样品池(9)上方的样品溶液(11)，样品溶液的发射荧光(20)经过物镜(7)穿过双色镜(6)并经发射滤光片(12)过滤，然后经透镜(13)聚焦到针孔(14)，针孔(14)与单光子检测器(15)的光敏感区耦合，单光子检测器(15)通过连接电缆(18)与数据采集卡(16)连接，数据采集卡(16)通过连接电缆(18)与计算机(17)连接。

2、根据权利要求1的激光荧光关联谱单分子分析仪，其特征在于所述激光器(1)为气体激光器、固体激光器、半导体激光器或染料激光器。

3、根据权利要求1的激光荧光关联谱单分子分析仪，其特征在于所述物镜(7)的放大倍率大于40，数值孔径大于0.9。

4、根据权利要求1的激光荧光关联谱单分子分析仪，其特征在于所述盖玻片或样品池(9)为厚度为0.13～0.17mm的无荧光片。

5、根据权利要求1的激光荧光关联谱单分子分析仪，其特征在于所述针孔(14)直径为15～300μm。

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