CN1156686C - 梯度场荧光关联谱仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种梯度场荧光关联谱仪，包括显微物镜、聚焦透镜、荧光激发光衰减片、单原子探测器和信号采集与处理系统等，还包括第二双色分束片和红外激光衰减片。荧光激发光经荧光激发光衰减片和第二双色分束片反射，最后被聚焦到被测样品内的某一点，激发该点内的分子产生荧光，该荧光经物镜收集后再经反射、滤光，汇聚到共焦小孔，再由单光子探测器接收，产生的光子接收信号进入处理系统。红外激光经衰减后透过第二双色分束片，与前述的荧光激发光合束，然后透过第一双色分束片，再聚焦到样品内的上述同一点，产生的激光梯度场对样品中该点处的分子运动产生控制作用。本发明的仪器能够完成现有荧光关联谱测量装置的全部功能，并能测量粒子的极化率及其变化。
Description
技术领域：
本发明涉及一种梯度场荧光关联谱仪，属生物测量仪器。
背景技术：
现有荧光相关谱仪利用测量微区内少量发光分子的荧光涨落信号，获得荧光粒子浓度、扩散速度等影响涨落的物理机制信息。荧光关联谱目前主要应用包括：测量生物分子的结构变化、微观化学反应、细胞内酶动力学过程，等等。这些测量可以针对溶液体系，也可以针对活细胞。现有技术基本测量装置如图1所示。其工作原理为：荧光激发光(8)经过衰减片(9)、全反射镜(12)，再透过双色分束片(2)，经过高数值孔径显微镜头(1)聚焦在溶液或活细胞样品(3)中，焦点(7)的体积一般远远小于一个立方微米。这个区域内少量荧光粒子所发出的背向荧光被显微镜头(1)收集，经过双色分束片(2)时被反射，与被散射的激发光分开。荧光经过滤光片(4)后进一步去除散射的激发光和其他杂光，然后由透镜(5)聚焦于共焦小孔(6)上，共焦小孔产生的空间滤波可以抑制焦点区(7)以外的荧光以及杂散光，焦点区中分子所发出的荧光信号被光子计数器(10)接受，并输入到信号系统(11)进行信号采集与处理。信号系统对光子计数数据进行自相关函数运算，获得自相关函数，然后利用最小二乘法拟合实验数据，从而获得荧光粒子的扩散系数和焦点区域内荧光粒子数目等一系列参数。
上述装置的测量过程包括两个关键步骤：通过硬件获得激光焦点区域中少量荧光分子产生的光子计数信号；通过软件拟合获得待测分子的一些参数。该方法的主要缺陷是：实验中几乎没有可调节的参数。一旦实验体系确定，拟合过程中的实验参数基本不能变化。当测量成分比较复杂的体系时，很难区分不同实验参数对测量结果的影响。并且，该方法没有考虑待测分子与激光场的非荧光相互作用。当进行双光子激发荧光测量时，高强度激光产生的梯度场可能影响分子的运动，从而使测量结果出现系统误差。另外，该方法只能测量与分子运动有关的参数，如结构和质量，不能测量与分子电子态分布有关的参数，如极化率。
发明内容：
本发明的目的是设计一种梯度场荧光关联谱仪，在已有的测量装置中加入另一束激光，产生梯度场，影响焦点区内分子的运动状态，以完成荧光关联谱仪的全部测量功能，同时通过一个强度可调的激光梯度场，对溶液样品中待测生物分子或粒子的扩散运动进行控制，测量分子的极化特征以及与极化有关的生化过程，并且适合于包含多种组分体系的测量。
本发明设计的梯度场荧光关联谱仪，包括显微物镜、第一双色分束片、滤光片、聚焦透镜、共焦小孔、荧光激发光衰减片、单原子探测器和信号采集与处理系统，还包括第二双色分束片和红外激光衰减片；荧光激发光经荧光激发光衰减片、第二双色分束片反射，反射光透过第一双色分束片后由显微物镜聚焦到被测样品内的某一点，激发该点内的分子产生荧光，该荧光经物镜收集后再经第一双色分束片反射，进而透过滤光片，由聚焦透镜汇聚到共焦小孔，经过共焦小孔的荧光由单光子探测器接收，单光子探测器产生的光子接收信号进入信号采集和处理系统；红外激光经红外激光衰减片后透过第二双色分束片，与前述的荧光激发光合束，然后透过第一双色分束片，再由显微物镜聚焦到样品内的上述同一点，产生的激光梯度场对样品中该点处的分子运动产生控制作用。
本发明设计的梯度场荧光关联谱仪，由于引入了可以独立调节的物理参数，本仪器能够区分不同实验因素对测量结果的影响。新的实验装置不但能够完成现有荧光关联谱测量装置的全部功能，并且能够定量测量粒子的极化率及其变化，以及测量影响极化率变化的一些生物过程，如氧化一还原反应。同时，本仪器适合于对包含多种组分的样品进行测量。
附图说明：
图1是已有技术中荧光关联谱仪的结构示意图。
图2是本发明设计的梯度场荧光关联谱仪的结构示意图。
图1和图2中，1是显微物镜，2是第一双色分束片，3是样品，4是滤光片，5是聚焦透镜，6是共焦小孔，7是激光聚焦点，8是荧光激发光，9是荧光激发光衰减片，10是单光子探测器，11是信号采集与处理系统，12是45°全反射镜，13是第二双色分束片，14是红外激光衰减片，15是红外激光。
具体实施方式：
本发明实验装置如图2所示：本发明设计的梯度场荧光关联谱仪，包括显微物镜1、第一双色分束片2、滤光片4、聚焦透镜5、共焦小孔6、荧光激发光衰减片9、单原子探测器10和信号采集与处理系统，还包括第二双色分束片13和红外激光衰减片14。荧光激发光经荧光激发光衰减片9、第二双色分束片13反射，反射光透过第一双色分束片2后由显微物镜1聚焦到被测样品3内的某一点7，激发该点内的分子产生荧光，该荧光经物镜1收集后再经第一双色分束片2反射，进而透过滤光片4，由聚焦透镜5汇聚到共焦小孔6，经过共焦小孔6的荧光由单光子探测器10接收，单光子探测器产生的光子接收信号进入信号采集和处理系统11；红外激光经红外激光衰减片14后透过第二双色分束片13，与前述的荧光激发光合束，然后透过第一双色分束片2，再由显微物镜1聚焦到样品内的上述同一点7，产生的激光梯度场对样品中该点处的分子运动产生控制作用。
本发明的发明点在于在全反射镜(12)的位置改放一个双色分束片(13)。一台红外激光器提供红外连续激光束(15)，它的强度可以通过更换衰减片(13)进行控制。红外激光(15)与用于进行荧光关联谱测量的可见激光(8)通过双色分束片(13)进行合束，并由成像系统聚焦于样品(3)中同一个探测点(7)。由于荧光关联测量采用的显微光学体系(图中虚线框标出部分)是消色差系统，本发明中采用的光路可以利用少量的光学器件保证两束激光的焦点完全重合，实验调节很简单，并且使数据拟合过程简化。红外激光的波长应选择在800纳米附近，探测区内激光能量控制在30毫焦以下。这可以使溶液中水分子的吸收最小，并且避免待测分子产生单光子和双光子荧光激发。当红外激光产生的梯度场与分子的热运动势接近时，分子的布朗运动收到扰动，其大小与激光的强度、空间分布和粒子的极化率有关。在实验中，针对同样实验条件，通过选择不同衰减片，调节红外激光的能量，能够获得对应不同梯度场的一系列荧光关联谱，使数据量加大。梯度场强度的变化完全独立于其他实验参数，使本仪器增强了区分不同实验参数影响的能力。我们已经从理论上推导出了包括梯度场影响的模拟公式。
下面介绍本发明的一个实施例。利用一台自制的荧光关联谱测量装置和一台超快激光系统，测试中超快激光工作于失锁模状态，输出为800nm左右连续激光。到达探测区内的梯度场激光最大功率为20mW。(实际应用中可以采用二极管激光器，结构简单并且十分便宜。)荧光激发光源为一台氩离子激光器，波长为488nm，最大输出功率为7mW。两束激光功率强度可通过衰减片分别进行控制。实验中光学系统(图中虚线框中部分)为倒置式荧光显微镜，测量时采用数值孔径为1.4的平场消色差油浸镜头。由于整个光学系统消色差性能很好，两束激光束在样品中的会聚点完全重合。
测量中采用的样品为掺有荧光分子的聚苯乙烯小球，直径分别为20，40和110nm，其吸收光谱峰位于500nm附近，荧光谱峰位于515nm附近。实验显示800nm的红外连续激光不能在荧光小球上产生单光子或双光子荧光激发。实验发现，激光梯度场对粒子运动的影响明显存在。微粒的极化率越大，激光梯度场的强度越大，粒子运动的影响就越大。采用20nm荧光小球，当梯度场激光的功率达到毫瓦时，小球的布朗运动受到明显影响。由于实际应用中许多生物分子的极化率大于20nm荧光小球，该实验结果证明可以利用本方法对生化分子的极化率进行测量。
Claims (1)
1、一种梯度场荧光关联谱仪，包括显微物镜、第一双色分束片、滤光片、聚焦透镜、共焦小孔、荧光激发光衰减片、单原子探测器和信号采集与处理系统，其特征在于还包括第二双色分束片和红外激光衰减片；荧光激发光经荧光激发光衰减片、第二双色分束片反射，反射光透过第一双色分束片后由显微物镜聚焦到被测样品内的某一点，激发该点内的分子产生荧光，该荧光经物镜收集后再经第一双色分束片反射，进而透过滤光片，由聚焦透镜汇聚到共焦小孔，经过共焦小孔的荧光由单光子探测器接收，单光子探测器产生的光子接收信号进入信号采集和处理系统；红外激光经红外激光衰减片后透过第二双色分束片，与前述的荧光激发光合束，然后透过第一双色分束片，再由显微物镜聚焦到样品内的上述同一点，产生的激光梯度场对样品中该点处的分子运动产生控制作用。
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