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Zur
Erzeugung von Multi-Photonen-Fluoreszenz in einem Laser-Scanning
Mikroskop werden im allgemeinen ultrakurze, insbesondere Sub-Pikosekunden-Impulse
zur Beleuchtung der Probe verwendet. Bei großen spektralen
Impulsbandbreiten (> 1 nm)
werden die Lichtimpulse durch inhärente Dispersion der
optischen Medien verbreitert. Entsprechend S2ω ∝ Pavg 2/τ,
wobei τ die Impulsdauer ist, geht beispielsweise das 2-Photonen-Signal
bei größeren Impulsdauern zurück. Nun
kann dieser Verlust durch eine Erhöhung der mittleren Leistung,
so sie zur Verfügung steht, kompensiert werden. Es gibt
aber mehrere Gründe die für eine Kompensation
der Dispersion und damit Verkürzung der Impulsdauer sprechen:
- • Die Laserleistung durchstimmbarer
Lichtquellen geht an den Grenzen des Gain(Durchstimm-)bereiches
zurück, so dass man auf nahezu fourierbegrenzte Impulse
angewiesen ist, um ausreichend Signal generieren zu können,
vor allem wenn man tief in stark streuende Proben eindringen möchte
und dann auf Leistungsreserven zurückgreifen muss.
- • Parasitäre Ein-Photonen-Prozesse, zu denen nicht
zuletzt die „normale" Ein-Photonen-Streuung (Rayleigh-,
Mie-Streuung) gehört und die bei der Laserunterdrückung
(Block-Filter) Probleme bereiten kann (insbesondere bei Schwachlichtdetektion),
können auf diese Weise reduziert werden.
- • Bei der 2-Photonen Fluoreszenzspektroskopie entsteht
meistens sehr wenig Signal, weil die Konzentration an fluoreszierenden
Molekülen gering ist. Oft werden die „descanned"
Detektoren hierbei verwendet, so dass sich der Effekt noch verstärkt.
Auch hier sind nahezu fourierbegrenzte Impulse erforderlich.
- • Bei der Erzeugung der 2. bzw. 3. Harmonischen liefern
ebenso fourierbegrenzte Impulse das beste Signal. Das nichtlineare
Kontrastverfahren der THG verhält sich wie 1/τ2, so dass hier eine noch stärkere
Abhängigkeit von der Impulsdauer vorliegt.
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Für
Impulsbandbreiten < 30
nm bestimmt im Wesentlichen die Dispersion 2. Ordnung die Impulsverbreiterung
im Medium. Die wichtigsten Methoden zur Kompensation der Dispersion
2. Ordnung passieren auf der spektralen Winkeldispersion. Hierbei
wären der Prismenkompressor, der Gitterkompressor oder
der 4f-Aufbau mit spektraler Vorzerlegung und Amplituden- und/oder
Phasenmaske in der Fourierebene zu nennen (
DE19930532 A1 ). Die zuletzt
genannte Methode erlaubt auch kompliziertere Phasenverläufe,
so die Anstiege nicht zu groß sind, zu modellieren. Als
Phasenmasken kommen im Wesentlichen pixellierte LC-Masken, pixellierte
Spiegelarrays bzw. akusto-optische Masken zum Einsatz. Diese Masken
erlauben i. a. nur kleine Dispersionswerte (< 10000 fs
2)
zu kompensieren (geringer Phasenhub) und führen zu hohen
Anschaffungskosten für eine Impulskompressionseinheit im
4f-Setup. Im folgenden werden technische Lösungen aufgezeigt,
mit denen die hohe Anzahl der Steuerparameter und u. U. die hohen
Kosten vermieden werden können und die auch größere
Dispersionswerte zu kompensieren erlauben.
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Erfindung:
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Im
folgendem werden mehrere unterschiedliche Lösungsansätze
zur Kompensation der Dispersion auf der Basis des spektralen 4f-Aufbaus
verfolgt. Generell ist im Aufbau zwischen der Monochromator- und
Polychromatoranordnung (wird später näher beschrieben)
zu unterscheiden. Beide können zur Lösung des
Problems angewendet werden.
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Es
sind Anordnungen möglich, die reine Spiegel, einseitig
verspiegelte Transmissionsoptiken (z. B. konvex-plan-Linse mit verspiegelter
Planseite wie in 1 und 4 dargestellt)
oder reine Transmissionsoptiken (linsenartig) verwenden und dabei
die gleiche Wirkung erzielen. Je nach Anordnung erfolgt eine Zusammenführung
der spektral räumlich separierten Anteile durch dasselbe
dispersive Element (in Reflektion) oder mindestens ein weiteres
dispersives Element (Transmission), vorzugsweise in Zusammenwirken
mit entsprechenden Optiken, in Reflektion derselben Optik und in
Transmission einer weiteren Optik, insbesondere Fokussieroptik.
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Zur Überprüfung
der Auswirkung der eingesetzten Kompensation auf das Messsignal
erfolgt bei nichtlinearer Anregung einer realen Probe (z. B. SHG-
oder Zweiphotonenanregung) eine Detektion des angeregten Signals.
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a) Verwendung eines nichtveränderbaren
transmittierenden bzw. reflektierenden optischen Elements in der
Fourierebene des spektralen 4f-Aufbaus (1)
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Die
Dispersion des Mikroskops ist eine veränderliche Größe.
Sie verändert sich aufgrund der Wellenlängenabhängigkeit
der Brechzahl des optischen Materials und aufgrund der Verwendung
unterschiedlicher Objektive. Für geringe Dispersion bzw. hohe
spektrale Aufspaltung kann eine feste Freiform (gemeint im Sinne
der freien Vorwahl der fixierten Form eines reflektierenden oder
transmittierenden optischen Bauelementes) zur Kompensation der Dispersion
in der Fourierebene verwendet werden.
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Sie
kann in Form eines Spiegels bzw. einer Transmissionsoptik (Linse)
gestaltet sein. Im ersten Fall (Spiegel) reduziert sich die Aufbaulänge
um Faktor 2, Eingangs- und Ausgangsstrahl sind aber schwerer von
einander zu trennen.
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Generell
sollte die Form so gewählt werden, dass ein Dispersionswert
kompensiert wird, der einem typischen (häufig auftretenden)
Wert entspricht. Das erfolgt entweder durch vorherige Berechnung der
durch die verschiedenen Komponenten erzeugten Dispersion oder durch
eine Messung bei verschiedenen eingesetzten oder verschiedenen eingestellten
Formen und Auswahl des Optimums für eine Optikkonfiguration.
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Für
ein betrachtetes Gerät ergibt sich somit ein typischer
Wert der Kompensation. Für veränderte Optikkonfigurationen
(Objektiv) ist dann die Dispersion nicht vollständig aber
immer noch ausreichend kompensiert.
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1: Dispersionskompensation
mittels fester Freiform bzw. fester Approximationen (Sphäre,
Parabel mit fester Brennweite) in der Fourierebene eines 4f-Aufbaus.
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Einen
Grundaufbau der Anordnung zeigt 1.
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Ein
spektral breiter Eingangsimpuls gelangt von einer Lichtquelle auf
ein dispersives Element D, das ein Prisma P oder ein Gitter G sein
kann und der erzeugte spektrale Lichtfächer wird mit einer
Fokussieroptik FO räumlich separiert auf einen in der Fourierebene
(Abstand ist die Brennweite f) von FO angeordneten Spiegel SP oder
eine Linse (nicht dargestellt) gelenkt.
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Bei
Verwendung einer Linse in der Fourierebene als dispersionskompensierendes
Element und Verwendung in Transmission (ohne Rückseitenverspiegelung)
werden die Spektralanteile durch eine zweite Fokussieroptik (FO)
und ein zweites dispersives Element D wieder zusammengefügt.
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Der
Spiegel SP reflektiert entsprechend seiner Krümmungsform
die Spektralanteile und sorgt für eine Einebnung der spektralen
Phase, was zu einem zeitlich schmaleren Ausgangsimpuls in Richtung
der Mikroskopanordnung (Probenbeleuchtung) führt.
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Ein
Grundaufbau eines Laser-Scanning Mikroskopes ist beispielsweise
in
DE 19702753 A1 ,
EP 500717 A1 beschrieben
worden.
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Im
einfachsten Fall ist eine parabolische bzw. sphärische
Fläche ausreichend, wobei die Parabel bei Änderung
der Wellenlänge geringfügig kürzere Impulse
liefert, die Herstellungsaufwände für eine Parabel
aber höher sind.
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Wird
bei großer spektraler Auffächerung (große
Laserbandbreite oder große Gitterdispersion), die zur Vermeidung
von Abbildungsfehlern sinnvoll sein kann, die Laserwellenlänge,
beispielsweise bei durchstimmbaren Lasern, verändert, so
muss zur optimalen Ausleuchtung der Maske, d. h. um denselben spektralen
Bereich auf die Maske abzubilden, das dispersive Element nachgeführt
werden (hier als Monochromatoranordnung bezeichnet.). Die Nachführung
bedeutet eine Drehung des dispersiven Elementes um eine Drehachse
senkrecht zur dispersiven Aufspaltungsebene. Es ist aber damit zu
rechnen, dass für die veränderte Wellenlänge
das Freiform- bzw. sphärische/parabolische Profil weniger optimal
die Dispersion kompensiert. Aber die Impulse sind immer noch kürzer
als ohne Kompensation.
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b) Verwendung einer oder mehrerer adaptiver
Flüssigkeits-Linsen bzw. adaptiver sphärischer
Spiegel in der Fourierebene des spektralen 4f-Aufbaus (2)
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Zwar
erlaubt eine Flüssigkeitslinse nicht beliebige Phasenverläufe
zu generieren, aber schmalbandige ultrakurze Lichtimpulse (< 10 nm, 800 nm) brauchen
diese Verläufe auch nicht. Hier ist es ausreichend, wenn
die Dispersion 2. Ordnung kompensiert wird. Und dies lässt
sich näherungsweise schon mittels einer sphärischen
bzw. parabolischen adaptiven Linse/Spiegel erreichen.
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Bei
größeren Bandbreiten sind kompliziertere Formen
des Krümmungsverlaufs erforderlich.
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Die
Phasenfront bzw. Krümmung der Linsen bzw. Spiegel kann
vorteilhaft elektrisch eingestellt werden. Eine Änderung
der optischen Oberflächen bedeutet für die Linse
bzw. den Spiegel eine Änderung der Brennweite. Bei den
Linsen der Firma Varioptic können mittels elektrischer
Felder interne Grenzflächen zwischen nicht mischbaren Flüssigkeiten
unterschiedlicher elektrischer Leitfähigkeit verändert
werden (competitive electrowetting, Elektrokapillarität).
Es gibt auch adaptive Linsen, bei denen die optisch aktiven Flüssigkeitbereiche
durch magnetischen Flüssigkeitsbereiche über elektromagnetische Felder
verändert werden (magnetische Nanopartikel im Bereich von
2 bis 10 nm in wässriger, alkoholische oder organische
Lösungen → Adaptive Membranlinse mit Aktor aus
magnetischer Flüssigkeit, Institut für Mikrosystemtechnik
(IMTEK)). Die optisch aktive Flüssigkeit ist dabei von
einer deformierbaren Membran begrenzt.
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Ändert
sich die Dispersion im Mikroskop, weil z. B. mehr optisches Material
in den Beleuchtungsstrahlengang eingeführt wird (z. B.
anderes Objektiv) oder weil die Laserwellenlänge verändert
wird, so muss die Brennweite der adaptiven sphärischen
bzw. parabolischen Optik in der Fourierebene entsprechend der zu
kompensierenden Dispersion nachgeführt werden. Hierbei
sollte i. a. nur eine Stellgröße nötig
sein (1. Stellgröße: elektrische Spannung zur Änderung
der Oberflächenkrümmung). Zwei Stellgrößen
werden benötigt wenn eine große Laserbandbreite
bzw. ein großer Durchstimmbereich in Kombination mit großer
Dispersion vorliegt. Dann würde sich die Krümmung
der Optik in der Fourierebene über die Bandbreite bzw.
den Durchstimmbereich stark ändern, was dazu führen
würde, dass die Farben nach der Kompressoreinheit nicht
komplett überlappen. Auch u. U. im Fokus eines Objektivs
dann nicht. Deshalb wird der Schwerpunkt des Spektrums mit dem Scheitelpunkt
der Optik (Position bei der die Optik ihre maximale Dicke bzw. ihren
maximalen optischen Weg annimmt) zur Deckung gebracht. Dafür ist
eine Bewegung der Optik senkrecht zur Ausbreitung des Lichtes notwendig
(2. Stellgröße). Dadurch kann der Anstieg über
das Laserspektrum reduziert werden, was einen besseren Überlapp
der Farben zur Folge hat.
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Die
Anpassung der Krümmung der adaptiven Optik kann auf der
Basis gemessener Kalibrierwerte erfolgen oder aber man implementiert
einen geschlossenen Regelkreis der solange die Krümmung
optimiert, bis die minimale Impulsdauer erreicht ist. Dazu muss
ein Signal erzeugt werden dass sensitiv auf die Impulsdauer reagiert,
z. B. die integrale 2. Harmonische des Laserimpulses (3). Als
Optimierungsmethoden kommen deterministische (z. B. Simplex Downhill
[plus simulated annealing], Gerchberg-Saxton) oder aber evolutionäre
Algorithmen in Frage.
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Wird
bei großer spektraler Auffächerung (große
Laserbandbreite oder große Gitterdispersion) die Laserwellenlänge
verändert, so muss zur optimalen Ausleuchtung der Maske
das dispersive Element nachgeführt werden (Monochromatoranordnung). Die
Maske muss dann u. U. nicht bewegt werden.
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2: Dispersionskompensation
mittels einer oder mehrerer adaptiver Flüssigkeits-Linsen
bzw. adaptiver sphärischer Spiegel in der Fourierebene
des spektralen 4f-Aufbaus.
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2 zeigt
die Einstellung der Anordnung bezüglich des Spektralbereiches
durch Drehung DR des dispersiven Elementes D (Monochromatoranordnung)
bzw. alternativ der Verschiebung V des Spiegels SP zum Spektralbereich
nach der Fokussieroptik FO (Polychromatoranordnung), um den gewählten Schwerpunkt
des Laserspektrums mit dem Maximalhub der Optik (Scheitelpunkt)
in Übereinstimmung zu bringen. Im Unterschied zu 1 ist
die Krümmung des transmittierenden oder reflektierenden
optischen Elementes in der Fourierebene einstellbar (siehe Pfeil
PF-Krümmungsanpassung). Dargestellt ist eine reflektierende
Ausführung.
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3 zeigt
das Schema eines iterativen Regelkreises zur Realisierung der erfindungsgemäßen
Lösung. Der Lichtimpuls nach dem 4f-Setup wird in einem
Schritt A im Probenraum bewertet, z. B. durch integrale Messung
der 2. Harmonischen (SHG Signal). Es wird ein Rückkoppelsignal
RS erzeugt und in einem Schritt vom Optimierungsalgorithmus analysiert
und mit vorherigen Werten verglichen. Anschließend wird
vom Optimierungsalgorithmus in einem Schritt C eine neue Krümmung
und damit ein neuer Lichtimpuls l erzeugt und der Kreis wird erneut durchlaufen.
Auf diese Weise erreicht es das System durch Optimierung, den besten
(kürzesten) Impuls zu erzeugen.
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c) Verwendung eines diskreten nichtveränderbaren transmittierenden
bzw. reflektierenden optischen Elementes in der Fourierebene des
spektralen 4f-Aufbaus
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Die
Dispersion muss nicht kontinuierlich kompensiert werden können.
Im allgemeinen ist eine stufenweise Kompensation ausreichend. Dazu
wird eine diskrete Maske benötigt, deren Elemente seitlich
verschiebbar sind und eine sich ändernde Krümmung
gemäß der gewünschten negativen Dispersion besitzen.
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4a zeigt
die Dispersionskompensation unter Verwendung eines diskreten nichtveränderbaren
transmittierenden bzw. reflektierenden optischen Elementes DT bzw.
DR in der Fourierebene des spektralen 4f-Aufbaus. Auf den verschieblichen
Elementen DT bzw. DR sind transmittierende bzw. reflektierende Einzelelemente
ET bzw. ER angeordnet, die unterschiedliche Krümmungen
bzw. unterschiedliche freie Formen aufweisen.
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In 4b ist
ein aus einer vorderen Linse L und einem Glasteil mit verspiegelter
unterer Fläche SR bestehendes Element dargestellt dass
in seiner optischen Wirkung einem reflektierenden gekrümmten
Element ER (4a) gleichkommt. Das heißt, dass
jedes Einzelelement eine andere vorgewählte Krümmung
aufweisen kann und die Optimierung über den Austausch der
Einzelelemente erfolgt. Beispielsweise kann die Veränderung
der Krümmung der Einzelelemente der Krümmung der
Wellenlängenabhängigkeit der Dispersion eines
Objektivs folgen. Das Laserspektrum füllt dann immer nur
ein Segment der Maske, die Krümmung der Einzelelemente
kann bei starker spektraler Aufspaltung klein gehalten werden, chromatische
Fehler der Gesamtanordnung werden auf diese Weise reduziert. Die Wahl
der Krümmung der Einzelelemente kann durch vorherige Berechnung
der optimalen Flächen für die unterschiedlichen
eingesetzten Optiken der Gesamtanordnung erfolgen oder durch Bestimmung von
Kalibrierwerten mittels Ausmessen der Dispersion relevanter Optikkonfigurationen
der Gesamtanordnung. Die Verschiebbarkeit der Maske ist insbesondere
für die „Polychromatoranordnung„ wichtig, bei
dieser wird das dispersive Element bei Veränderung der
Wellenlänge nicht nachgeführt, sondern die Maske
selbst wird senkrecht zur optischen Achse in Aufspaltungsrichtung
der Dispersion verschoben, um den Scheitelpunkt der Optik in Übereinstimmung
mit dem gewählten Schwerpunkt des Laserspektrums zu bringen.
In der Monochromatoranordnung kann die Maske in der Fourierebene
unbeweglich angeordnet sein, durch Bewegung des dispersiven Elements wird
das Lichtspektrum geeignet zur Maske positioniert.
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Die
Auswahl des am besten geeigneten Elementes der Maske kann wiederum
nach gemessenen Kalibrierwerten bzw. durch einen automatisierten Regelkreis
erfolgen (3).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - DE 19930532
A1 [0002]
- - DE 19702753 A1 [0014]
- - EP 500717 A1 [0014]