CN107490568B - 基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法，该成像装置在于沿光束传播方向依次由超连续谱激光源（1）、光纤（3）、二向色镜（6）、激发光束滤光片（7）、损耗光束滤光片（19）、光程调节台（8）、第一偏振分光棱镜PBS（9、20）、相位光栅（11、16、22、27）、第二偏振分光棱镜PBS（18、29）、二向色镜（30）、样品台（31）、发射滤光片（33）、相机（34）组成。本发明提供的成像装置能产生比现有成像技术更小的有效照明光斑，对应的显微成像方法（SSTED‑SIM）与现有技术相比，能实现更高的成像分辨率，抗噪声效果好，成像的强度和分辨率都有较大提高。

Description

基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置和方法
技术领域
本发明涉及光学显微镜技术领域，具体涉及一种基于荧光分子受激发射损耗特性的非线性结构化光照明超分辨率显微成像装置及其成像方法。
背景技术
现代的生命科学研究中，显微镜是必不可少的研究工具。然而由于光的衍射，传统的光学显微镜存在分辨率的极限，这个分辨率的极限即为衍射极限，可以由瑞利判据(Rayleigh criterion)给出：R＝0.61λ/NA，其中λ是光的波长，NA是显微物镜的数值孔径，所以衍射极限约为200nm。近年来，出现了各种用于提高光学显微镜分辨率的方法，实现在细胞水平上的超分辨成像能力。
超分辨成像显微技术主要包括三大类：1.随机光学重构显微镜(StochasticOptical Reconstruction Microscopy，STORM)和光激活定位显微镜(Photo ActivatedLocalization Microscopy,PALM)；2.结构光照明显微镜(Structured IlluminationMicroscope，SIM)；3.受激发射损耗显微镜(Stimulated Emission DepletionMicroscopy，STED)。
PALM/STORM的成像原理相同，都是利用荧光分子的随机逐个激发发射荧光光子，通过点扩散函数数字化获得其中心位置，从而突破光波衍射现象对成像分辨率的限制。尽管PALM/STORM采用面探测成像，但每次只对少量荧光分子成像，需要反复激活-淬灭荧光分子进行成像，要获得一幅完整的细胞超分辨图像，一般需要采集1万张图像，数据量大，成像时间很长，这使得实验大多数在固定的细胞上完成，无法进行活细胞研究。
STED显微成像技术受到了特别关注，它是一种从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术，可以在活细胞上看到纳米尺度的蛋白质。STED的原理为：首先，使用一束激光在样品表面聚焦产生一个艾里斑，艾里斑区域内的荧光分子激发至激发态，使其发光；然后，再用另一束波长较长的激光在样品表面相同位置区域聚焦产生一个面包圈样的空心光斑，将第一束光斑中的大部分荧光物质通过受激发射损耗过程淬灭至基态。通过限制受激发射抑制的区域，就能获得小于衍射极限的发光点，由此显著地提高显微镜的分辨率。
然而目前，最佳的活细胞高分辨率显微镜成像方法仍然是线性SIM，虽然其分辨率是有限的。显微镜的衍射极限傅立叶域上作为图像的一个低通滤波器，通过切断高频率分量来限制图像的分辨率。SIM采用莫尔条纹原理获得截止频域以外的傅里叶频域分量。在线性SIM中，傅立叶带宽被扩大了2倍，从而使分辨率提高了2倍至约100nm的级别。而非线性SIM则提供了一个无需修改SIM显微镜的方法来提高分辨率，从理论上讲，非线性效应可用于非线性SIM来实现小于100nm的分辨率。最先提出的非线性SIM是基于荧光分子激发态饱和效应的非线性结构光照明显微镜(SSIM)，可以使分辨率达到50nm，之后陆续出现了多种非线性SIM。在多种非线性效应中，STED应用于非线性SIM(STED-SIM)的可行性已经在实践中得以验证。STED效应的切换时间大约在200ps，能实现高帧率采样，进而实现快速成像。非线性SIM则由于非线性效应产生了更高阶谐波分量，能进一步扩展的傅里叶频域带宽。而在扩展傅立叶频带时的信噪比(SNR)是依赖于高次谐波的强度。
理论上，STED-SIM具有提高分辨率的无限能力。但在实际中，改变激发光强度与STED强度所造成噪声增减程度并不一致。增加激发光照明模式的强度将产生一个整体明亮的图像，因此，随着荧光强度非线性的增加，直流分量光子散粒噪声也随之增大，导致信噪比趋于平缓；相反，增加STED的强度将生成一个较暗的图像。随着STED强度的增加，光子散粒噪声降低，但是信噪比仍然要受相机本身暗电流噪声以及人为造成的噪声的影响，致使成像分辨率受限。
发明内容
为了改善上述问题，本发明提供一种新的基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像装置和成像方法(SSTED-SIM)。通过本发明的成像装置，产生皆为网格状但相位差为π的结构型激发光和损耗光(STED光)，可以得到比上述STED-SIM更小的发光点，从而可以在同等噪声条件下，更好地实现超分辨成像。
一方面，本发明提供了一种基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像装置，其特征在于，沿光束传播方向依次由超连续谱激光源(1)、光纤(3)、二向色镜(6)、激发光束滤光片(7)、损耗光束滤光片(19)、光程调节台(8)、第一偏振分光棱镜PBS(9、20)、相位光栅(11、16、22、27)、第二偏振分光棱镜PBS(18、29)、二向色镜(30)、样品台(31)、发射滤光片(33)、相机(34)组成。
超连续谱激光源(1)用于提供激发光束和损耗光束。
激发光束和损耗光束通过光纤(3)耦合后输出激光束，激光束通过二向色镜(6)分成两束，并分别通过激发光束滤光片(7)和损耗光束滤光片(19)，分别得到激发光束和损耗光束；
激发光束和损耗光束分别通过第一偏振分光棱镜PBS(9、20)后，形成两束线偏振光束；
线偏振光束分别通过相位光栅(11、16、22、27)后，各自衍射，得到四束激发光和四束损耗光；
所有光束通过正透镜后，垂直方向和水平方向上的光束都变得相互平行；
四束激发光和四束STED光再分别通过第二偏振分光棱镜PBS(18、29)和二向色镜(30)后，两两合束得到四束合成光束，然后传播到位于样品台(31)的目标物体处。
相机(34)放置在发射滤光片(33)后，用于采集荧光图像，其中相机(34)优选sCMOS相机。
光程调节台(8)放置在激发光束滤光片(7)之后，用于控制激发光束的延迟，使激发光束和损耗光束可同时达到样品台，实现最好的成像效果。
另一方面本发明提供了一种基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.对采集的荧光图像处理后，生成非零空间频率的有效照明光强分布图；
b.将网格状的有效照明光强分布图分别沿着x、y两个方向进行m*m次相移，得到m*m幅有效照明图像，并将有效照明图像分别与艾里斑进行卷积运算，构成m*m幅原始图，其中m为正整数；
c.利用m*m幅原始图，以及对应的x方向和y方向的相位，求解得到m*m幅频域分量图；
d.对频域分量图中的m*m个频域分量进行组合，得到重建高分辨率图像所需的完整的傅里叶频域分量；
e.将傅里叶频域分量经过傅里叶反变换后得到时域图像，即为重建的高分辨率图像。
用于生成非零空间频率的有效照明光强分布图的函数表示为：
Figure BDA0001373723460000031
其中，x、y分别表示水平和竖直两个方向的坐标，i0为激发光的强度，a为损耗光的强度，k0代表频率、
Figure BDA0001373723460000032
分别代表光束在水平和竖直两个方向的相位。
其中正整数m的值在硬件允许的条件下，取值越大越好，m优先取值为9、10、11、12、13中的任意一个；a/i0的优选值为4或者5。
综上所述，本发明的关键点在于通过基于受激发射损耗特性的非线性结构化显微成像装置，产生比现有非线性SIM成像技术更小的有效照明光斑，其原理为在于通过双向(横向和纵向)结构化的激发光激励，双向结构化的STED光损耗抑制，从而得到超小尺寸的有效荧光斑。
在实际应用中，本发明提供的基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像方法(SSTED-SIM)与现有技术SSIM相比，能实现更高的成像分辨率；与现有技术STED-SIM显微成像相比，抗噪声效果好，成像的强度和分辨率都有较大提高。
在原理上，现有技术SSIM是通过更强的照明使荧光信号饱和，使得荧光和照明光不再符合线性关系，等效荧光信号近似于矩形形状，从而包含高频的调制频率，进而通过傅里叶变化，提取高频率的信息；现有技术STED-SIM显微成像的关键是如何形成具有超小尺寸的物体照亮光斑，其中激发光斑是一束聚焦的实心光斑，而抑制光斑是由四束STED光，两个方向衍射产生的网格状光斑，所以STED-SIM显微镜的分辨率主要是由有效荧光光斑的大小及损耗效果决定的。
而本发明中实现SSTED-SIM超分辨成像方法的关键虽然也是如何形成具有超小尺寸的激发光斑和抑制光斑，分辨率也主要是由有效荧光光斑的大小及损耗效果决定的，但是本发明中激发光斑和损耗光斑都是由四束光形成的网格光斑，其中，激发光斑和损耗光斑的相位相差π，因此同样的环境下，本发明提供的SSTED-SIM成像方法比现有技术STED-SIM显微成像的抗噪性更好。
附图说明
图1是本发明提供的基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像装置的光路结构示意图。
图2是本发明提供的基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像方法示意图。
图3是有效照明光束剖面图。
图4是谐波分量强度的变化曲线示意图。
其中，超连续谱激光源1，透镜2，光纤3，透镜4，反射镜5，二向色镜6，激发光束滤光片7，光程调节台8，偏振分光棱镜9，透镜10，相位光栅11，透镜12，反射镜13，反射镜14，透镜15，相位光栅16，透镜17，偏振分光棱镜18，损耗光束滤光片19，偏振分光棱镜20，透镜21，相位光栅22，透镜23，反射镜24，反射镜25，透镜26，相位光栅27，透镜28，偏振分光棱镜29，二向色镜30，样品台31，透镜32，发射光滤光片33，相机34。
具体实施方式
为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。
图1示出本发明提供的一种基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像装置。装置中各光路部件标记说明如表1所示。
Figure BDA0001373723460000051
表1光路图部件说明
其中，超连续谱激光源1来提供激发光源和损耗光源，经光纤3耦合后获得理想光束，再经过二向色镜6将激发光和损耗光分开，然后分别通过激发光束滤光片7和损耗滤光片19。光程调节台8放在激发光路径上控制激发光束的延迟，设置光程调节台8的目的是为了匹配激发光和损耗光的光程，因为该光源为脉冲光源，需要匹配光程以保证激发脉冲和损耗脉冲同时抵达样品。激发光束和损耗光束分别通过第一偏振分光棱镜(PBS)9和20后，形成两束线偏振光束；其中一束由相位光栅在x方向上分为两束后再经过物镜后干涉，另一束由相位光栅在y方向上分为两束后再经过物镜后干涉，从而激发光和损耗光形成二维干涉条纹。通过正透镜后，垂直方向和水平方向上的光束都变得相互平行。四束激发光和四束损耗光再分别由第二偏振分光棱镜(PBS)18和29重新组合，四束平行的激发光和四束平行的损耗光通过二向色镜30后，两两合束，然后传播到照亮的目标物体处(样品台31还放置了物镜和目标物体)，相机34放在发射滤光片33后是用于采集荧光图像。在这里相机34优选sCMOS相机,并且光束在进行干涉前都是相互平行。
图2展示了一种基于受激发射损耗特性的非线性结构化超分辨率显微成像方法(SSTED-SIM)。其中，图2(a)为模拟物体的图像，其中包含了一个25nm宽的圆环，以及三对间隔分别为20nm,30nm,40nm的横条纹和纵条纹；图2(b)提供的是一个非零空间频率的有效照明光强分布的示意图，其生成函数表示为：
Figure BDA0001373723460000061
(其中i0＝1，a＝4)。
其中，x、y分别表示水平和竖直两个方向的坐标，i0为激发光的强度，a为损耗光的强度，k0代表频率、
Figure BDA0001373723460000062
分别代表光束在水平和竖直两个方向的相位。
图2(b)展示的网格状光强分布图沿着横纵(即x、y)两个方向进行m*m次相移，在该实施例中选取m＝9，即9*9次相移，得到81幅有效照明图像，并使之分别与艾里斑进行卷积运算，构成81幅实现重建高分辨图像的原始图，图2(c)为81幅图中之一。
通过得到的这81幅图片，以及其对应的x方向和y方向的相位，可相应求解出81幅频域分量图；其中，图2(d)显示了重建高分辨图像的其中一部分频域分量；图2(e)为81个频域分量组合而成，显示了重建高分辨率图像所需的完整的傅里叶频域图像。图2(f)则为图2(e)中的傅里叶频域分量经过傅里叶反变换后得到的时域图像，即为SSTED-SIM成像最终结果—高分辨率重构图像。
图3中所示分别为SSTED-SIM，STED-SIM，SSIM对应的有效照明光束截面图，可以看出，本发明提供的SSTED-SIM成像方法对应的有效照明光束,其半高宽比STED-SIM，SSIM都要小，从而说明本发明提供的SSTED-SIM成像方法的有效照明光斑的能量相比STED-SIM，SSIM更集中，反映出本发明提供的SSTED-SIM成像方法的有效照明光斑相比STED-SIM，SSIM更小，因而具有更好的抗噪性和成像分辨率。
图4为在SSTED-SIM，STED-SIM，SSIM，这几种非线性SIM不断增加激发光照明强度时，相应的频域谐波分量强度的变化曲线示意图，由此能反映出在实际成像中同等信噪比(SNR)条件情况下，SSTED-SIM，STED-SIM，SSIM分别重建傅里叶高频分量，即实现高分辨率成像的能力。其中，图4(a)为SSIM超分辨成像技术的傅里叶谐波分量强度随照明强度增大而变化的曲线，从图中可以看出，SSIM随着照明强度的增大，高频分量是自限制的，从而也注定了SSIM在实际情况下在傅里叶空间很难扩展到高频谐波分量区域，从而限制了成像的分辨率。图4(b)所示分别为SSTED-SIM超分辨成像技术和STED-SIM超分辨成像技术的傅里叶谐波分量强度随照明强度增大而变化的曲线，从图中可以看出在同等SNR条件下，SSTED-SIM比STED-SIM的抗噪性更强，并且能在更低的照明强度下，实现更高阶的傅里叶谐波分量的重建。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (4)

1.一种基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置的超分辨率显微成像方法，所述基于受激发射损耗特性的超分辨率显微成像装置包括：沿光束传播方向依次设置超连续谱激光源(1)、光纤(3)、二向色镜(6)，超连续谱激光源(1)用于提供激发光束和损耗光束；经由超连续谱激光源(1)提供的激发光束和损耗光束经光纤(3)耦合后，再经过二向色镜(6)分离得到激发光束和损耗光束，以分别形成激发光路和损耗光路；沿激发光路传播方向依次设置有激发光束滤光片(7)、光程调节台(8)和第一偏振分光棱镜PBS(9)，激发光束经第一偏振分光棱镜PBS(9)后得到两束线偏振光束，其中一束线偏振光束由相位光栅(11)在x方向上分为两束激发光；另一束线偏振光束由相位光栅(16)在y方向上分为两束激发光；四束激发光由第二偏振分光棱镜PBS(18)重新组合；沿损耗光路传播方向依次设置有损耗光束滤光片(19)和第一偏振分光棱镜PBS(20)，损耗光束经第一偏振分光棱镜PBS(20)后得到两束线偏振光束，其中一束线偏振光束由相位光栅(22)在x方向上分为两束损耗光；另一束线偏振光束由相位光栅(27)在y方向上分为两束损耗光；四束损耗光由第二偏振分光棱镜PBS(29)重新组合；四束激发光和四束损耗光通过二向色镜(30)后，两两合束得到四束合成光束；在二向色镜(30)后，沿光束传播方向依次设置样品台(31)、发射滤光片(33)和相机(34)；所述相机(34)放置在发射滤光片(33)后，用于采集荧光图像，其中相机(34)为sCMOS相机；
其特征在于，所述超分辨率显微成像方法包括以下步骤：
a.对采集的荧光图像处理后，生成非零空间频率的有效照明光强分布图；
b.将网格状的有效照明光强分布图分别沿着x、y两个方向进行m*m次相移，得到m*m幅有效照明图像，并将有效照明图像分别与艾里斑进行卷积运算，构成m*m幅原始图，其中m为正整数；
c.利用m*m幅原始图，以及对应的x方向和y方向的相位，求解得到m*m幅频域分量图；
d.对频域分量图中的m*m个频域分量进行组合，得到重建高分辨率图像所需的完整的傅里叶频域分量；
e.将傅里叶频域分量经过傅里叶反变换后得到时域图像，即为重建的高分辨率图像。
2.如权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于，用于生成非零空间频率的有效照明光强分布图的函数表示为：
Figure FDA0002543071430000011
其中，x、y分别表示水平和竖直两个方向的坐标，i0为激发光的强度，a为损耗光的强度，k0代表频率、
Figure FDA0002543071430000012
分别代表光束在水平和竖直两个方向的相位。
3.如权利要求2所述的显微成像方法，其特征在于，正整数m取值为9、10、11、12、13中的任意一个；a/i0的值为4或者5。
4.如权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于，所述光程调节台(8)放置在激发光束滤光片(7)和第一偏振分光棱镜PBS(9)之间，用于控制激发光束的延迟，使激发光束和损耗光束可同时到达样品台。
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