KR102619825B1 - 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 - Google Patents
초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법을 개시한다. 본 발명은 광스위칭제, Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함하고, 상기 광스위칭제는 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 상기 형광체를 광스위칭시키는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 이미징 버퍼 용액에 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 형광체를 광스위칭시킬 수 있는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함하여 형광체에 빠른 광 스위칭 현상을 일으키는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법에 관한 것이다.
최근 빛의 회절 한계라고도 불리는 광학 현미경의 이론적인 해상도를 뛰어넘은 초고해상도 형광 현미경 기술이 다양하게 개발되었다. 그 중에서 STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 기술은 싸이올(thiol) 계열의 이미징 버퍼 용액의 존재 하에 광 스위칭(photoswitching) 현상을 일으켜서 겹쳐져 있는 형광 분자(형광체 또는 형광 염료에 대응)들을 시간별로 분리하여 초고해상도로 이미징하는 기술이다.
종래의 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy: 초고해상도 형광 현미경 기술) 이미징을 위해서는 한정된 종류(MEA (2-mercaptoethylamine), BME(beta-mercaptoethanol))의 싸이올(thiol)을 기반으로 한 이미징 버퍼 용액만 사용되었다.
따라서, 상기와 같은 STORM 기술은 한정된 종류(MEA, BME)의 싸이올(thiol)을 기반으로 한 이미징 버퍼 용액만 사용함으로써, 때에 따라 MEA, BME 에 민감한 샘플(예: 살아있는 세포)이나 냄새에 영향 받을 수 있는 경우 싸이올(thiol) 약품을 초미량을 사용하여야 되거나 사용하기 어려운 단점이 있다.
본 발명의 실시예는, 환원제로 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제를 사용하여 생세포에 독성(toxicity)이 낮아 생 세포 이미징(live-cell imaging)이 가능하게 하거나 기존에 사용하던 MEA 또는 BME와 같은 싸이올(thiol) 화합물을 대체할 수 있는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 실시예는, 이미징 버퍼 용액에 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 형광체를 광스위칭시킬 수 있는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함하여 형광체에 빠른 광 스위칭 현상을 일으킬 수 있는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 광스위칭제, Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함하고, 상기 광스위칭제는 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 상기 형광체를 광스위칭시킨다.
상기 광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride), 시스테인(Cysteine), 글리신(Glycine) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 일 수 있다.
상기 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템은 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 글루코스(glucose) 및 과산화수소분해효소(catalase)를 포함할 수 있다.
상기 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포를 고정하는 단계; 상기 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계; 상기 형광표지된 세포를 제1항에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계; 및 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계; 를 포함하고, 상기 이미징 버퍼 용액은 상기 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 상기 형광체를 광스위칭시키는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함한다.
상기 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은, 상기 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계를 진행한 다음, 상기 형광 신호를 필터링하는 단계;를 진행할 수 있다.
상기 광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride), 시스테인(Cysteine), 글리신(Glycine) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.
상기 광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 일 수 있다.
상기 형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 환원제로 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제를 사용하여 생세포에 독성(toxicity)이 낮아 생 세포 이미징(live-cell imaging)이 가능하게 하거나 기존에 사용하던 MEA 또는 BME와 같은 싸이올(thiol) 화합물을 대체할 수 있는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 이미징 버퍼 용액에 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 형광체를 광스위칭시킬 수 있는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함하여 형광체에 빠른 광 스위칭 현상을 일으킬 수 있는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액 및 이를 이용한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 포함되는 광스위칭제를 도시한 화학식이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 도시한 흐름도이다.
도 3은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 4는 도 3에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 5는 도 3에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 6은 비교예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 7은 도 6에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 8은 도 6에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 9는 광스위칭제를 포함하지 않는 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 10은 도 9에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 11은 도 9에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 12는 실시예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 13은 도 12에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 14는 도 12에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 15는 실시예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 16은 도 15에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 17은 도 15에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 18은 실시예 3에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 19는 도 18에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 20은 도 18에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 21은 실시예 4에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 22는 도 21에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 23은 도 21에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 24는 실시예 5에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 25는 도 24에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 26은 도 24에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 27은 실시예 6에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 28은 도 27에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 29은 도 27에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 30은 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 31은 도 30에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 32는 도 30에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 33은 염화암모늄(Ammonium chloride)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 34는 도 33에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 35는 도 33에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 36은 시스테인(Cysteine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 37은 도 36에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 38은 도 36에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 39는 글리신(Glycine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 40은 도 39에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 41은 도 39에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 42는 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 43은 도 42에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 44은 도 42에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 도시한 흐름도이다.
도 3은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 4는 도 3에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 5는 도 3에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 6은 비교예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 7은 도 6에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 8은 도 6에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 9는 광스위칭제를 포함하지 않는 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 10은 도 9에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 11은 도 9에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 12는 실시예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 13은 도 12에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 14는 도 12에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 15는 실시예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 16은 도 15에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 17은 도 15에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 18은 실시예 3에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 19는 도 18에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 20은 도 18에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 21은 실시예 4에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 22는 도 21에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 23은 도 21에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 24는 실시예 5에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 25는 도 24에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 26은 도 24에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 27은 실시예 6에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 28은 도 27에 따른 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 29은 도 27에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 30은 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 31은 도 30에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 32는 도 30에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 33은 염화암모늄(Ammonium chloride)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 34는 도 33에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 35는 도 33에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 36은 시스테인(Cysteine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 37은 도 36에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 38은 도 36에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 39는 글리신(Glycine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 40은 도 39에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 41은 도 39에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
도 42는 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 43은 도 42에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 44은 도 42에 따른 반치폭을 도시한 그래프이다.
이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.
또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or'이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or'를 의미한다. 즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다'라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.
또한, 본 명세서 및 청구항들에서 사용되는 단수 표현("a" 또는 "an")은, 달리 언급하지 않는 한 또는 단수 형태에 관한 것이라고 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 일반적으로 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
아래 설명에서 사용되는 용어는, 연관되는 기술 분야에서 일반적이고 보편적인 것으로 선택되었으나, 기술의 발달 및/또는 변화, 관례, 기술자의 선호 등에 따라 다른 용어가 있을 수 있다. 따라서, 아래 설명에서 사용되는 용어는 기술적 사상을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 되며, 실시예를 설명하기 위한 예시적 용어로 이해되어야 한다.
또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 설명 부분에서 상세한 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 아래 설명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가지는 의미와 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 이해되어야 한다.
한편, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의하여 한정되지 않는다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
한편, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 포함되는 광스위칭제를 도시한 화학식이다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 광스위칭제, Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 환원제로 광스위칭제를 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 포함되는 광스위칭제는 환원제 역할을 하는 동시에 광스위칭 역할을 할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 이미징 버퍼 용액에 환원제로 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 형광체를 광스위칭시킬 수 있는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함함으로써, 형광체에 빠른 광 스위칭 현상을 일으켜 광 스위칭 특성 및 해상도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 포함되는 광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride), 시스테인(Cysteine), 글리신(Glycine) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제를 사용하여 생세포에 독성(toxicity)이 낮아 생 세포 이미징(live-cell imaging)이 가능하다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 이미징 버퍼 용액의 농도에 따라 형광 세기 및 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭이 조절되어, 광 스위칭 특성 및 해상도가 조절될 수 있다.
광 스위칭 현상이라 함은 형광 염료가 형광을 낼 수 있는 온-상태(on-state)와 형광을 낼 수 없는 오프-상태(off-state)를 리버서블(reversible)하게 왔다갔다 할 수 있는 현상을 의미한다.
이 때에 이미징 버퍼 용액의 농도가 형광 염료의 온-상태(on-state)에서 오프-상태(off-state)로 변하는 과정에 영향을 줄 수 있기 때문에 두 상태(state) 간의 population 이 조절될 수 있고, 이에 따라 광 스위칭 속도가 조절될 수 있다. 뿐만 아니라 일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 이미징 버퍼 용액 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full with at half maximum, FWHM)은 하나의 형광체가 프레임(frame) 별로 광 스위칭(photoswitching)되며 그 발광(emission)이 촬영될 때의 위치에 대한 분포를 의미한다. 즉, 높은 정확도(high precision)로 발광(emission)이 촬영되는 형광체의 경우에는 좁은 영역의 분포를 가져서 작은 반치폭(FWHM) 값을 가지나, 낮은 정확도(low precision)를 갖는 형광체의 경우에는 넓은 영역에 퍼져서 이미지됨으로써, 그 분포 영역이 넓어져서 큰 반치폭(FWHM) 값을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)이 감소됨에 따라 해상도가 향상될 수 있다. 즉, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치는 해상도의 기준을 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)으로 결정할 수 있다.
또한, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치(예; STORM)에서 하나의 형광체가 카메라에 이미징될 때의 형광 세기(Brightness, 광자수(photon number)를 의미함)는 그 형광체의 위치에 대한 정확도(precision)를 결정할 수 있다.
즉, 밝은 형광체(brightness 가 높을수록)의 경우에는 높은 세기의 선명한 점상 확산 함수(Point spread function, PSF)를 만듦으로써 그 위치(centroid)가 매우 높은 정확도(high precision)로 결정될 수 있는 반면에 어두운 형광체(brightness가 낮을수록)의 경우에는 점상 확산 함수가 선명하지 않게 만들어지면서 그 위치(centroid)가 낮은 정확도(low precision)로 불확실하게 결정될 수 있다.
이론적으로 이러한 정위 에러(localization error)의 정도는 에 반비례하기 때문에, 형광 세기(brightness)가 높을수록 높은 정확도(small error)로 위치를 잡을 수 있어 해상도가 증가될 수 있다.
이미징 버퍼 용액의 농도는 이미징 버퍼 용액에 포함되는 광스위칭제의 농도와 대응될 수 있다.
광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 일 수 있고, 광스위칭제의 농도가 1 mM 미만이면 광 스위칭 속도가 너무 저하되는 문제가 있고, 너무 높은 경우에는 오히려 형광 세기가 감소되는 문제가 있다.
바람직하게는, 광스위칭제로 붕소수소화 소듐(sodium borohydride)을 사용하는 경우, 붕소수소화 소듐(sodium borohydride)의 농도는 10mM 일 수 있다. 광스위칭제로 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide)을 사용하는 경우, 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide)의 농도는 5mM 일 수 있다. 광스위칭제로 염화암모늄(Ammonium chloride)을 사용하는 경우, 염화암모늄(Ammonium chloride)의 농도는 5mM 일 수 있다. 광스위칭제로 시스테인(Cysteine)을 사용하는 경우, 시스테인(Cysteine)의 농도는 5mM 일 수 있다. 광스위칭제로 글리신(Glycine)을 사용하는 경우, 글리신(Glycine)의 농도는 5mM 일 수 있다. 광스위칭제로 디티오트레이톨(Dithiothreitol)을 사용하는 경우, 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도는 5mM 일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액을 포함한다.
Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액은 이미징 버퍼 용액에서 pH 버퍼로 사용될 수 있고, 바람직하게는 Tris-HCl 8.0 버퍼 용액(buffer solution)이 사용될 수 있다.
바람직하게는. Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)의 농도는 50mM 있고, 이는 Alexa fluor 647 염료가 최대한의 밝기를 낼 수 있는 pH를 유지해줄 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 탈산소화시키는 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함하고, 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템은 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 글루코스(glucose) 및 과산화수소분해효소(catalase)를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 글루코스 산화효소(glucose oxidase)의 농도는 0.5 mg/mL 일 수 있고, 이는 최적화되었다고 알려진 농도이다.
글루코스(glucose)의 농도는 5% 일 수 있고, 이는 빛의 특성으로 인해 일어나는 구면수차(spherical aberration)를 줄이기 위해 굴절률(refractive index)을 맞춰줄 수 있는 농도이다.
과산화수소분해효소(catalase)의 농도는 0.16 mM 일 수 있고, 이는 최적화되었다고 알려진 농도이다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 초고해상도 형광 현미경에 사용될 수 있고, 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), STED(Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM(PhotoActivation Localization Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy) 중 어느 하나일 수 있으나, 바람직하게는, STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.
STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 기술은 이미징 버퍼 용액의 존재 하에 광스위칭(photoswitching) 현상을 일으켜서 겹쳐있는 형광 분자들을 시간별로 분리하여 초고해상도로 이미징하는 기술이다.
따라서, 종래에는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 MEA 또는 BME이 사용되었으나, MEA 또는 BME는 민감한 샘플(예: 살아있는 세포)에 사용하는 경우, 싸이올 약품을 초미량 사용해야 하거나, 사용하기에 어렵다는 문제가 있었으나, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액을 사용함으로써, 샘플에 따라 영향을 적게 받는 화학 물질을 선택하여 이미징 버퍼 용액을 제조할 수 있어, 응용성을 확대시킬 수 있다.
특히, 글리신(glycine)의 경우, 살아있는 세포에 대해 독성(toxicity)이 매우 낮기 때문에 생세포 이미징(live-cell imaging)에 활용될 수 있다.
더욱이, MEA 또는 BME의 경우 싸이올이기(thiol group) 때문에 역겨운 냄새가 발생하여 냄새에 민감한 실험 환경 또는 실험자가 사용하기 어려운 문제가 있으나, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 싸이올이기를 포함하지 않는 환원제를 사용하여 냄새 발생을 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 포함되는 환원제는 MEA 또는 BME에 비해 값이 저렴하기 때문에 실험 비용 감소시킬 수 있다.
실시예에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액은 광스위칭 현상을 기반으로 한 초고해상도 형광 현미경 기술 (STORM) 뿐만 아니라, 광스위칭 현상을 필요로 하는 단분자 광학 메모리(single-molecule optical memory) 분야 등에 적용될 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액을 이용한 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법에 대해 설명하기로 한다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법을 도시한 흐름도이다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계(S110), 배양된 세포를 고정하는 단계(S120), 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계(S130), 형광표지된 세포를 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계(S140) 및 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계(S150)를 포함한다.
먼저, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계(S110) 및 배양된 세포를 고정하는 단계(S120)를 진행한다.
세포는 세포, 세포 유형, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 다당류, 무코다당류, 프로테오글리칸, 지질, 미생물, 바이러스 및 분자 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있고, 바람직하게는, 단백질일 수 있다.
세포의 배양 방법 및 고정 방법으로는 당분야에 사용되는 다양한 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
이 후, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계(S130)를 진행한다.
고정된 세포는 원하는 타겟에 형광체를 표지하고, 형광체를 표지하는 방법은 당분야에서 알려져 있는 다양한 항체염색(immunolabeling) 방법이 사용될 수 있으며, 항체염색(immunolabeling) 방법은 permeabilization 단계, blocking 단계 및 antibody labeling 단계를 포함할 수 있다.
형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지될 수 있다.
이 후, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 형광표지된 세포를 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계(S140)를 진행한다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법에 사용되는 이미징 버퍼 용액은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액과 동일한 구성을 포함하고 있으므로, 이미징 버퍼 용액에 대한 상세한 설명은 생략하기로 한다.
이미징 버퍼 용액은 광스위칭제, Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함할 수 있다.
광스위칭제는 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 형광체를 광스위칭시킬 수 있다.
광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride), 시스테인(Cysteine), 글리신(Glycine) 및 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 일 수 있다.
형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지될 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계(S150)를 진행한다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 이미징하기 위한 초고해상도 형광 현미경의 레이저 파워(Laser Power)는 100mW 내지 150mW일 수 있고, 레이저 파워가 100 mW 미만이면 형광 세기가 약해지고 광 스위칭이 빠르게 일어나지 않아 해상도가 낮아지는 문제가 있고, 150 mW를 초과하면 샘플구조를 파괴하고 염료의 광퇴색을 일으킬 수 있다는 문제가 있다.
바람직하게는, 형광 분자로부터 나온 형광은 EM-CCD 또는 sCMOS 카메라 센서를 통해 검출되고 픽셀 별로 읽혀지는 형광 세기를 기반으로 이미지를 얻을 수 있다.
이 때에 백그라운드 형광세기에 대해 한계 값을 설정하면, 각 프레임(frame)에서 한계 값 이상의 시그널에 대해 점 퍼짐 함수(PSF: Point Spread Function)를 인식하고, 각 점 퍼짐 함수의 형광세기에 알맞은 2차원 가우시안 곡선(curve)으로 고정(fitting) 함으로써 점 퍼짐 상수의 중심(centroid)을 단일 분자의 위치로써 정할 수 있다.
각 프레임별로 얻은 중심(centroid) 들을 모두 모으고, 시간에 따른 이동(drift)에 대해 보정함으로써 최종적인 STORM 이미지를 복원(reconstruction)할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법의 이미징 시간은 미세소관처럼 높은 밀도의 구조를 이미징할 경우, 60Hz 기준 10분 내지 15분일 수 있고, 이미징 시간이 10분 미만이면 이미징 질이 낮아지는 문제가 있다.
초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), STED(Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM(PhotoActivation Localization Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy) 중 어느 하나일 수 있으나, 바람직하게는, STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.
실시예에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계(S150)를 진행한 다음, 형광 신호를 필터링하는 단계(S160)를 진행할 수 있다.
초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 광 스위칭이 잘 일어나지 않고 형광체의 밝기가 낮아 잘못된 형광 신호(localization)가 발생할 수 있으며, 이러한, 시그널 오류는 점상 확산 함수(Point spread function, PSF)가 2차원 가우시안 함수로 잘 고정(fitting)되지 않아 백그라운드 신호로 분류되기 때문에 발생할 수 있다.
백그라운드 신호(Background signal)는 형광체의 형광 방출이 없는 상태에서 가까운 프레임(frame) 간의 픽셀 신호 강도(pixel signal intensity)의 평균(average) 값이며, 식별(identified)된 각 로컬라이징(localization) 당 백그라운드(background) 값이 주어질 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 일정 세기 이상의 백그라운드 신호를 제거함으로써, 느린 광스위칭 현상을 나타내는 잘못된 백그라운드 신호를 제거하고, localization precision 을 향상시킬 수 있다.
바람직하게는, 필터링은 EM-CCD 카메라 센서에서 감지되는 800(A.U.) 내지 2000(A.U.) 의 백그라운드 신호를 제거하여 필터링을 진행함으로써, 겹쳐져 발광하여 잘못 배치(assign)되었던 시그널 오류를 제거하여 초고해상도 이미지의 질을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 값은 백그라운드 히스토그램(BG histogram)에서의 녹색 채널(green channel)에 대한 범위일 수 있다.
각 로컬라이징(localization)에 대해 백그라운드 값에 대한 분포를 그려보았을 때, 높은 백그라운드와 낮은 백그라운드의 두 곡선(curve)으로 크게 나뉘며, 이 때 높은 백그라운드에 해당하는 로컬라이징(localization)을 시그널 오류로 판단하여 이들을 제거할 수 있다.
실시예에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경 기술(STORM) 뿐만 아니라 다양한 형광 이미징 또는 형광 분석에 적용이 가능하다.
실험예 1: 이미징 버퍼 용액의 제조
[비교예 1]: MEA 100mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, MEA 100mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[비교예 2]: BME 0.14mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, BME 140mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 1]: 붕소수소화 소듐(sodium borohydride) 10mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 붕소수소화 소듐(sodium borohydride) 10mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 2]: 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 5mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 5mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 3]: 염화암모늄(Ammonium chloride) 5mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 염화암모늄(Ammonium chloride) 5mM 을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 4]: 시스테인(Cysteine) 5mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 시스테인(Cysteine) 5mM 을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 5]: 글리신(Glycine) 5mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 글리신(Glycine) 5mM 을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
[실시예 6]: 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 5mM
먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, 디티오트레이톨(Dithiothreitol) 5mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다.
실험예 2: 초고해상도 STORM 촬영
세포주는 COS-7 세포주로 세포주들의 배양용액은 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)을 넣어 사용하고 세포는 95% 공기/5% CO2의 습한 조건의 배양기에서 온도 36.5 ℃에서 배양하였다.
배양용액은 3 ~ 4일에 한번씩 교체하고 세포는 일주일마다 분주해 주었다. 3% 파라폼알데하이드(PFA) + 0.1% 글루타르알데하이드(GA)로 세포를 고정해주고, 일반적인 면역형광법을 통하여 이미징할 타겟에 형광을 표지한다.
STORM 촬영 전 형광을 표지한 세포에 이미징 버퍼를 넣는다. 그리고 100mW 내지 150mW 의 레이저를 이용하여 형광을 발하게 한다. 그리고 타겟으로부터 발하는 형광은 전하 증폭 전하 결합 소자 센서(Electron multiplying Charge-Coupled Device, EMCCD) 를 통해 이미징한다.
도 3은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 4는 도 3에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 5는 도 3에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 3을 참조하면, 일반 형광 이미징 방법보다 초고해상도 STORM 이미징 방법으로 촬영하였을 때, 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.
도 4 및 도 5를 참조하면, 빠른 광 스위칭 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 6은 비교예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 7은 도 6에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 8은 도 6에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 6을 참조하면, 일반 형광 이미징 방법보다 초고해상도 STORM 이미징 방법으로 촬영하였을 때, 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.
도 7 및 도 8을 참조하면, 빠른 광 스위칭 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 9는 광스위칭제를 포함하지 않는 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 10은 도 9에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 11은 도 9에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 9 내지 도 11을 참조하면, 광스위칭 특성이 거의 나타나지 않고 형광체들이 겹쳐져 보여 해상도가 매우 낮은 이미지가 수득되는 것을 알 수 있다.
도 12는 실시예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 13은 도 12에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 14는 도 12에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 12 내지 도 14를 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광 세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭을 보여주고 있어, 붕소수소화 소듐(sodium borohydride) 10mM를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적으로 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 13에서 도시한 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM) 프로파일은 하나의 형광체가 프레임(frame) 별로 광 스위칭(photoswitching)되며 그 발광(emission)이 촬영될 때의 위치에 대한 분포를 도시한 것으로, 높은 정확도(high precision)로 발광(emission)이 촬영되는 형광체의 경우에는 좁은 영역의 분포를 가져서 작은 반치폭(FWHM) 값을 가지나, 낮은 정확도(low precision)를 갖는 형광체의 경우에는 넓은 영역에 퍼져서 이미지됨으로써, 그 분포 영역이 넓어져서 큰 반치폭(FWHM) 값을 가질 수 있다.
따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)이 감소됨에 따라 해상도가 향상되기에, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치는 해상도의 기준을 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)으로 결정할 수 있다. 즉, 반치폭(FWHM)은 해상도에 대응될 수 있다.
도 14에서 도시한 강도 프로파일(Intensity profile, time trace)은 광 스위칭 현상을 보여주기 위한 데이터로서, 각 형광체가 위치한 픽셀(pixels) 공간에서 신호 강도(signal intensity)의 변화를 프레임(frame) 당 나타낸 데이터이다.
이를 통해 발광 온-상태(fluorescence on-state) 및 발광 오프 상태(fluorescence off-state)를 구별할 수 있으며, 두 상태(state) 간의 전환(conversion)인 광 스위칭(photoswitching) 현상이 얼마나 빠르게 많이 일어나는지를 확인할 수 있다.
또한, 광 스위칭(Photoswitching) 현상은 빠르게 일어나고, 온-상태 시간(on-state time)이 짧을수록 다른 형광체의 발광과 겹칠 확률이 줄어들어 해상도를 높이고 좋은 질(quality)의 초고해상도 STORM 데이터(data)를 얻을 수 있다.
도 15는 실시예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 16은 도 15에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 17은 도 15에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 15 내지 도 17을 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭을 보여주고 있어, 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide) 5mM를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적으로 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 18은 실시예 3에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 19는 도 18에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 20은 도 18에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 18 내지 도 19를 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭 특성을 나타내는 것으로 보아, 염화암모늄(Ammonium chloride) 5mM를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적인 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 21은 실시예 4에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 22는 도 21에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 23은 도 21에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 21 내지 도 23을 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭 특성을 나타내는 것으로 보아, 시스테인(Cysteine) 5mM를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적인 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 24는 실시예 5에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 25는 도 24에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 26은 도 24에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 24 내지 도 26을 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭 특성을 나타내는 것으로 보아, 글리신(Glycine) 5mM를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적인 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
도 27은 실시예 6에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영된 세포 내 미세소관의 일반 형광 이미지 및 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 28은 도 27에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이며, 도 29은 도 27에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 27 내지 도 29를 참조하면, 각 조건에서의 시간에 따른 형광세기 측정 그래프는 빠른 광스위칭 특성을 나타내는 것으로 보아, 디티오트레이톨(Dithiothreitol)를 기반으로 한 이미징 버퍼 용액이 효과적인 초고해상도 이미징을 나타내는 것을 알 수 있다.
표 1은 비교예 1, 비교예 2, 실시예 1 내지 실시예 6에 따른 형광세기 및 해상도를 도시한 표이다.
[표 1]
표 1은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 이용하여 측정한 단분자 형광 세기를 100% 및 해상도를 20 nm 이라고 할 때에, 실시예 1 내지 실시예 6에 따른 이미징 버퍼 용액에서 측정한 단분자 형광 세기와 해상도이다.
표 1을 참조하면, 실시예 1 내지 실시예 6은 비교예 1 및 2보다 형광 세기가 월등히 향상되어 광스위칭 특성이 향상되는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 1 내지 실시예 6은 비교예 1 및 2보다 반치폭이 감소되는 것으로 보아, 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.
도 30은 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 31은 도 30에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 32는 도 30에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이다.
표 2는 도 31 및 도 32에 따른 실험 데이터를 기재한 표이다.
[표 2]
도 30 내지 도 32 및 표 2를 참조하면, 페리시안화칼륨의 농도가 증가됨에 따라 형광세기는 감소되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭은 증가되는 것으로 보아 광스위칭 특성 및 해상도는 농도가 증가됨에 따라 감소되는 것을 알 수 있다.
일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 페리시안화칼륨의 농도 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
한편, 이미징 버퍼 용액에 페리시안화칼륨을 포함하는 경우, 비교예 1의 형광 세기(100%) 및 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(20nm) 대비 모든 농도에서 광스위칭 특성 및 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.
즉, 페리시안화칼륨의 경우, 1mM의 농도에서 가장 밝은 단분자 형광 세기를 가지고 가장 높은 해상도를 보임을 알 수 있다.
도 33은 염화암모늄(Ammonium chloride)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 34는 도 33에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 35는 도 33에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이다.
표 3은 도 34 및 도 35에 따른 실험 데이터를 기재한 표이다.
[표 3]
도 33 내지 도 35 및 표 3을 참조하면, 염화암모늄의 농도가 증가됨에 따라 형광세기는 감소되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭은 증가되는 것으로 보아 광스위칭 특성 및 해상도는 농도가 증가됨에 따라 감소되는 것을 알 수 있다.
일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 염화암모늄의 농도 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
한편, 이미징 버퍼 용액에 염화암모늄을 포함하는 경우, 비교예 1의 형광 세기(100%) 및 반치폭(20nm) 대비 모든 농도에서 광스위칭 특성 및 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.
즉, 염화암모늄의 경우, 1mM의 농도에서 가장 밝은 단분자 형광 세기를 가지고 가장 높은 해상도를 보임을 알 수 있다.
도 36은 시스테인(Cysteine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 37은 도 36에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 38은 도 36에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이다.
표 4는 도 37 및 도 38에 따른 실험 데이터를 기재한 표이다.
[표 4]
도 36 내지 도 38 및 표 3을 참조하면, 시스테인(Cysteine)의 농도가 1mM 및 10mM인 경우, 형광 세기가 월등히 향상되고, 10mM 를 포함하는 경우, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭도 감소되어, 비교예 1의 형광 세기(100%) 및 반치폭(20nm) 대비 광스위칭 특성 및 해상도가 월등히 향상되는 것을 알 수 있다.
일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 시스테인의 농도 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
즉, 시스테인의 경우, 10mM의 농도에서 가장 밝은 단분자 형광 세기를 가지고 가장 높은 해상도를 보임을 알 수 있다.
도 39는 글리신(Glycine)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 40은 도 39에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 41은 도 39에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이다.
표 5는 도 40 및 도 41에 따른 실험 데이터를 기재한 표이다.
[표 5]
도 39 내지 도 41 및 표 5를 참조하면, 글리신(Glycine)의 농도가 3mM, 5mM 및 10mM인 경우, 형광 세기가 월등히 향상되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭도 감소되어, 비교예 1의 형광 세기(100%) 및 반치폭(20nm) 대비 광스위칭 특성 및 해상도가 월등히 향상되는 것을 알 수 있다.
일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 글리신(Glycine)의 농도 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
즉, 글리신(Glycine)의 경우, 3mM의 농도에서 가장 밝은 단분자 형광 세기를 가지고 가장 높은 해상도를 보임을 알 수 있다.
도 42는 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도를 변화시켜 촬영된 세포 내 미세소관의 초고해상도 STORM 이미지이고, 도 43은 도 42에 따른 형광세기를 도시한 그래프이며, 도 44은 도 42에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이다.
표 6은 도 43 및 도 44에 따른 실험 데이터를 기재한 표이다.
[표 6]
도 42 내지 도 44 및 표 6을 참조하면, 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도가 3mM 이상인 경우, 형광 세기가 월등히 향상되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭도 감소되어, 비교예 1의 형광 세기(100%) 및 반치폭(20nm) 대비 광스위칭 특성 및 해상도가 월등히 향상되는 것을 알 수 있다.
일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 농도 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다.
즉, 디티오트레이톨(Dithiothreitol)의 경우, 10mM의 농도에서 가장 밝은 단분자 형광 세기를 가지고 가장 높은 해상도를 보임을 알 수 있다.
한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시 예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
Claims (11)
- 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제, Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함하고,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제는 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 상기 형광체를 광스위칭시키고,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride) 및 글리신(Glycine) 중 어느 하나를 포함하며,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제의 농도에 따라 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM) 및 형광 세기가 조절되고,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 인 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템은 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 글루코스(glucose) 및 과산화수소분해효소(catalase)를 포함하는 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액.
- 제1항에 있어서,
상기 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 이미징인 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액.
- 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계;
상기 배양된 세포를 고정하는 단계;
상기 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계;
상기 형광표지된 세포를 제1항에 따른 초고해상도 형광 현미경용 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계; 및
초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계;
를 포함하고,
상기 이미징 버퍼 용액은 상기 형광체의 공액 결합(conjugated bond)에 결합되어 상기 형광체를 광스위칭시키고, 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제(photoswitching reagent)를 포함하며,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제는 붕소수소화 소듐(sodium borohydride), 페리시안화칼륨(potassium ferricyanide), 염화암모늄(Ammonium chloride) 및 글리신(Glycine) 중 어느 하나를 포함하고,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제의 농도에 따라 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM) 및 형광 세기가 조절되고,
상기 싸이올(thiol)을 포함하지 않는 광스위칭제의 농도는 1 mM 내지 10 mM 인 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법.
- 제6항에 있어서,
상기 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법은,
상기 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계를 진행한 다음,
상기 형광 신호를 필터링하는 단계;
를 진행하는 것을 하는 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법.
- 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)인 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법.
- 삭제
- 제6항에 있어서,
상기 형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법.
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