CN109035143B - 一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法，包括以下步骤：获取样品的三维图像，三维图像通过利用压电陶瓷位移台实现z轴快速扫描生物样品，收集样品中受激发射的荧光分子得到；对三维图像进行基于径向涨落的超分辨分析，通过分析所述荧光分子随时间的高阶变化生成第一超分辨图像；以第一超分辨图像为引导，对所述三维图像进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到最终超分辨图像。本发明首次将传统的二维超分辨径向涨落分析和二维贝叶斯分析扩展到三维，实现了三个维度的超分辨；以及本发明有机结合两种超分辨算法，提高超分辨算法的运算速度和超分辨图像的空间分辨率。
Description
技术领域
本发明涉及显微成像技术领域，更具体地，涉及一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法。
背景技术
光片荧光显微技术是二十一世纪前沿的光学显微成像方法，对现代生命科学研究具有重大意义。传统的宽场显微技术和共聚焦显微技术需要照射或扫描成像整个生物样本，光毒性较大同时获得的图像信噪较低，轴向分辨率差。而光片显微技术是利用微米级厚度的激发光片激发生物样品的荧光，在与激发光片方向垂直的方向探测样品的荧光信号，形成一张二维图像。光片显微成像只会激发焦平面附近的荧光分子，大大降低了光毒性和光漂白性，具有较高的成像速度和图像信噪比，提高了对生物样品进行长时间成像的能力。
为研究细胞内单分子水平的结构特征及其动态过程，国际上出现了很多打破衍射极限(200nm)的超分辨显微技术，如受激发射损耗(STED)技术、光激活定位显微(PALM)技术/随机光学重建(STORM)技术、结构光照明显微(SIM)技术、超分辨径向涨落分析技术和贝叶斯超分辨显微(3B)技术等。其中超分辨径向涨落分析方法是分析荧光分子的强度随时间的高阶变化来实现超分辨，而贝叶斯超分辨技术通过记录荧光分子的闪烁和漂白过程进行贝叶斯分析来实现单分子定位从而达到超分辨，该方法仅需较低的光功率和较短的数据采集时间，而且能够对非稀疏标记的生物样本实现超分辨，具有较高的生物兼容性。但是这两种超分辨算法各自都存在弊端，超分辨径向涨落分析得到的超分辨图像存在重构伪影，以及基于荧光分子的闪烁和漂白特性的贝叶斯分析的数据分析过程较长。同时目前的超分辨技术虽然能实现单分子的定位，但受到视场和分辨率之间耦合关系的限制，生物样品局限于单细胞水平，依旧无法满足大视场与高分辨率兼备的三维成像要求，对深组织大体积生物样品的三维超分辨技术是一大瓶颈。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于解决现有两种超分辨算法各自存在弊端，超分辨径向涨落分析得到的超分辨图像存在重构伪影，以及基于荧光分子的闪烁和漂白特性的贝叶斯分析的数据分析过程较长。同时目前的超分辨技术无法满足大视场与高分辨率兼备的要求，对深组织大体积生物样品的三维超分辨技术是一大瓶颈的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法，包括以下步骤：
获取样品的三维图像，通过利用压电陶瓷位移台实现z轴快速扫描生物样品，收集样品中受激发射的荧光分子得到三维图像。
对所述三维图像进行基于径向涨落的超分辨分析，通过分析所述荧光分子随时间的高阶变化生成第一超分辨图像；
以所述第一超分辨图像为引导，对所述三维图像进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到最终超分辨图像。
可选地，所述样品的三维图像通过以下步骤得到：
利用中高倍率物镜在大视场下构建薄而均匀的贝塞尔扫描光片，在覆盖大样品的同时，实现优于高斯光片的轴向分辨率；
利用所述贝塞尔扫描光片沿XY平面扫描样品，收集样品受激发射的荧光分子获得二维图像；
控制样品沿Z轴运动，实现对样品的多层扫描，得到样品的三维图像。
可选地，所述第一超分辨图像通过以下步骤得到：
将所述三维图像对应的数据分割为多个运算单元；
在三维坐标下对各个运算单元进行基于径向涨落的超分辨分析，所述基于径向涨落的超分辨分析的具体过程包括空间分析和时间分析：
a)空间分析：在三维坐标下分析各个运算单元，计算各个运算单元对应的各个子像素区域的径向对称程度，生成一系列径向度分布图；
b)时间分析：在三维坐标下对所述一系列径向度分布图的荧光分子的波动应用二阶自相关函数，通过高阶时间统计来分析径向度分布图序列，从而生成第一超分辨图像。
可选地，所述最终超分辨图像通过以下步骤得到：
在三维坐标下对各个运算单元进行以第一超分辨图像为引导的三维贝叶斯分析：根据第一超分辨图像进行贝叶斯分析模型中各个荧光分子的初始化分布，使用马尔可夫链模拟单个荧光分子在多帧图像中的闪烁与漂白，使用蒙特卡洛方法计算贝叶斯分析模型与样品三维图像的相似程度，根据与样品三维图像的相似程度逐个优化荧光分子的强度、半径以及位置，对贝叶斯分析模型中的每个荧光分子优化后，在优化后的贝叶斯分析模型中增删一个荧光分子，再计算该贝叶斯分析模型与样品三维图像的相似程度，继而进入到下一轮优化每个荧光分子的过程，持续到优化结果收敛到一个模型，再对该模型中的点进行高斯模糊最终获得超分辨图像。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明在获得同等分辨率图像的情况下，能够采用更低倍率，更长工作距离的物镜，结合中高倍率物镜和快速扫描贝塞尔光片，适合生物深组织成像。
本发明实现了大视场深组织与高分辨率兼备的三维显微成像，首次将传统的二维超分辨径向涨落分析和二维贝叶斯分析扩展到三维，实现了三个维度的超分辨；有机结合两种超分辨算法，提高超分辨算法的运算速度和超分辨图像的空间分辨率。
本发明利用三维超分辨径向涨落分析方法作为三维贝叶斯分析的前一步引导，缩短了超分辨数据处理时间，同时后续的三维贝叶斯分析既纠正了三维超分辨径向涨落分析中产生的重构伪影，又提高了图像的空间分辨率，本发明的三维超分辨算法在提高三维分辨率的同时也大大缩短了数据处理时间。相比使用高倍率物镜的传统超分辨技术，本发明的方法只需使用中高倍率的物镜，就可以实现在大视场下获取生物样品的三维超分辨图像。
附图说明
图1为本发明提供的贝塞尔光成像装置示意图；
图2为本发明提供的三维超分辨方法流程示意图；
图3为本发明提供的超分辨技术所需的图像序列采集过程示意图；
图4为本发明对原始图像序列进行三维超分辨处理获得三维超分辨图像的算法示意图；
图5为利用本发明提供的三维超分辨技术对Hek293细胞三维结构进行成像的结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
针对上述光片显微成像技术和超分辨技术共同面临的大视场与高分辨率难以兼容的问题，本发明提出了一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法。发明的核心内容为：基于贝塞尔光束的自恢复效应以及对生物组织散射不敏感的特性，在大视场下构建薄而均匀的贝塞尔扫描光片，在覆盖大样品的同时，实现优于高斯光片的轴向分辨率，以助于后续超分辨计算进一步达到更高的分辨率。本发明所需的三维图像采集方法与常规的显微镜完全兼容，在照明光路部分引入贝塞尔光片，通过压电陶瓷位移台实现快速而精确的z轴扫描，获取生物样品的三维图像。本发明针对以上两种超分辨算法存在的弊端，如超分辨径向涨落分析虽然大大减少了数据处理时间，但得到的超分辨图像中存在重建伪影的现象，以及基于荧光分子闪烁和漂白特性的贝叶斯分析的数据处理过程较长，对此加以改进，将二维算法扩展到三维，在三维坐标下有机结合这两种超分辨算法，提出一种以三维超分辨径向涨落分析为引导的基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析。
本发明对多帧三维图像进行三维超分辨径向涨落分析，得到三维超分辨图像，以此为引导，进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，最终实现三个维度上的超分辨。利用三维超分辨径向涨落分析方法作为三维贝叶斯分析的前一步引导，缩短了超分辨数据处理时间，同时后续的三维贝叶斯分析既纠正了三维超分辨径向涨落分析中产生的重构伪影，又提高了图像的空间分辨率，本发明的三维超分辨算法在提高三维分辨率的同时也大大缩短了数据处理时间。相比使用高倍率物镜的传统超分辨技术，本发明的方法只需使用中高倍率的物镜，就可以实现在大视场下获取生物样品的三维超分辨图像。
本发明的三维超分辨显微成像方法可以与任何三维显微成像方式集成，优选荧光显微镜成像，共聚焦荧光显微镜成像或光片显微成像。
图1为本发明提供的贝塞尔光成像装置示意图，如图1所示，包括：照明物镜和探测物镜。
本发明提供一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法，贝塞尔光片照明光路使用激光发射装置、准直装置、贝塞尔产生装置、贝塞尔扫描装置，贝塞尔产生装置为轴棱镜，贝塞尔扫描装置为扫描振镜加照明物镜的组合。首先使用四种波长(473nm、488nm、532nm、637nm)合一的激光器，以满足生物实验中不同荧光染料激发的波长需求，例如Alexa488、GFP、mCherry等，经过准直器后的准直高斯光束通过轴棱镜干涉转换成贝塞尔光束，同时不降低激光强度。接下来利用振镜扫描贝塞尔光束，形成一个薄而均匀的贝塞尔照明光片。探测显微系统包括探测物镜和sCMOS相机，探测物镜用于收集荧光分子产生的激发光，sCMOS相机用于对生物样品的每层曝光成像，通过压电陶瓷位移台实现快速而精确的z轴扫描，最终对二维图像进行堆叠得到样品的三维图像。
根据不同的生物样品和荧光染色质量，图像采集装置采用不同的速率和曝光时间连续采集样品的二维图像，通过压电陶瓷位移台实现快速而精确的z轴扫描，获取多帧样品的三维图像，图像序列被实时地写入计算机的高速固态硬盘阵列中，用于进行后期的三维超分辨重构算法，进一步提高样品的三维分辨率。
图2为本发明提供的三维超分辨方法流程示意图；如图2所示，包括：
S100，获取样品的三维图像，所述三维图像通过收集样品在贝塞尔光片扫描下受激发射的荧光分子得到。
S200，对三维图像进行基于径向涨落的超分辨分析，通过分析荧光分子随时间的高阶变化生成第一超分辨图像。
S300，以第一超分辨图像为引导，对三维图像进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到最终超分辨图像。
在一个具体示例中，本发明的基于扫描光片成像的三维超分辨方法中具体的超分辨处理过程为：在三维坐标下将原始三维图像序列A进行分割得到多个运算单元Bi，对Bi进行超分辨径向涨落分析，分析荧光分子随时间的高阶变化得到三维超分辨图像C，以三维超分辨图像C为引导，进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到三维超分辨图像D。如图4所示，原始三维图像序列A对应原始低分辨率图像，三维超分辨图像C对应SRRF超分辨图像。其中，SRRF超分辨图像又可称为超分辨径向涨落(super-resolutionradial fluctuations，SRRF)图像。
本发明的后期三维超分辨处理包含2个关键步骤：
1)在三维坐标下对运算单元Bi进行基于径向涨落的超分辨分析，通过分析荧光分子随时间的高阶变化生成三维超分辨图像C，SRRF超分辨的具体过程为空间分析和时间分析。
a)空间分析：在三维坐标下分析原始低分辨图像，计算子像素区域的径向对称程度，从而生成一系列径向度分布图。
b)时间分析：在三维坐标下，对上一步得到的径向度分布图的荧光分子的波动应用二阶自相关函数，通过高阶时间统计来分析径向度分布图序列，从而生成超分辨图像C。
2)在三维坐标下对运算单元Bi进行以SRRF超分辨图像C为引导的三维贝叶斯分析，三维贝叶斯分析的具体过程为根据SRRF超分辨图像C进行贝叶斯分析模型中点(此处点用于代表单个荧光分子)的初始化分布，如图4所示，第三幅图表示以SRRF图像作为初始点的分布示意图。使用马尔可夫链模拟单个荧光分子在多帧图像中的闪烁与漂白，如图3所示，使用蒙特卡洛方法计算模型与采集数据的相似程度，根据与原图的相似程度逐个优化荧光分子的强度，半径和位置，对模型中的每个荧光分子优化后，再考虑在现有的模型中增删一个点，再计算模型与采集数据的相似程度，继而进入到下一轮优化每个荧光分子的过程。这样的过程持续到结果收敛到一个模型，再对该模型中的点进行高斯模糊最终获得超分辨的输出图像D，如图4所示，第四幅图表示SRRF引导的3B超分辨图像。根据图4可知，经过本发明提供的超分辨率方法处理后，得到图像的分辨率大大提升。
在一个示例中，样品的三维图像通过以下步骤得到：
利用中高倍率物镜在大视场下构建薄而均匀的贝塞尔扫描光片，在覆盖大样品的同时，实现优于高斯光片的轴向分辨率；利用所述贝塞尔扫描光片沿XY平面扫描样品，收集样品受激发射的荧光分子获得二维图像；控制样品沿Z轴运动，实现对样品的多层扫描，得到样品的三维图像。
本发明中高倍率物镜和贝塞尔光片成像，并通过三维超分辨处理，既实现了大视场和深组织成像，又实现了三个维度的超分辨。
图5为利用本发明提供的三维超分辨技术对Hek293细胞三维结构进行成像的结果示意图。贝塞尔光片照射焦平面，通过快速且精确的压电陶瓷位移台实现z轴扫描，获取到多帧生物样品的三维图像。成像设置为20倍采集物镜+1微米厚照明光片，
图5中(a)为20倍采集物镜大视野成像结果。据此设置，在获得的低分辨三维图像中，在x-y方向，单个像素的尺寸为6.5微米/20＝0.325微米，在z方向，单个像素的尺寸为光片厚度的一半即0.5微米。根据奈奎斯特采样原理，图像对应的原始侧向和轴向分辨率分别为0.65微米和1微米。在实验采集过程中，我们采用0.5微米的扫描步长，获得多组200-400张的图像序列A，图5中(b)为低分辨率的原始图像(对应于前述的A)，上栏为堆叠的x-y平面图像，下栏为堆叠的y-z平面图像，细胞仅粗略的结构信息被解析，将原始三维图像序列A进行三维分割得到多个运算单元Bi，对Bi进行超分辨径向涨落分析得到三维超分辨图像C，图5中(c)为经过超分辨径向涨落分析得到的超分辨图像(对应于前述的C)，以三维超分辨图像C为引导，进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到三维超分辨图像D。图5中(d)为经过进一步三维贝叶斯分析的最终三维超分辨图像(对应于前述的D)，细胞的细节信息清晰可见，超分辨图像的理论xy方向(侧向)和z向(轴向)分辨率提升3倍。
本发明同时结合三维超分辨径向涨落分析与基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，大大缩短了运算时间，相比于传统的贝叶斯分析，本发明提出的三维超分辨算法运算速度提升了4倍。从各组图中裁剪出一个小区域进行放大观察，可以明显地判断出使用以三维超分辨径向涨落方法为引导的三维贝叶斯分析可获得显著增强的细节分辨能力。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种基于贝塞尔光片成像的三维超分辨方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取样品的三维图像，所述三维图像通过收集样品在贝塞尔光片扫描下受激发射的荧光分子得到；
对所述三维图像进行基于径向涨落的超分辨分析，通过分析所述荧光分子随时间的高阶变化生成第一超分辨图像；
所述第一超分辨图像通过以下步骤得到：将所述三维图像对应的数据分割为多个运算单元；在三维坐标下对各个运算单元进行基于径向涨落的超分辨分析，所述基于径向涨落的超分辨分析的具体过程包括空间分析和时间分析：a)空间分析：在三维坐标下分析各个运算单元，计算各个运算单元对应的各个子像素区域的径向对称程度，生成一系列径向度分布图；b)时间分析：在三维坐标下对所述一系列径向度分布图的荧光分子的波动应用二阶自相关函数，通过高阶时间统计来分析径向度分布图序列，从而生成第一超分辨图像；
以所述第一超分辨图像为引导，对所述三维图像进行基于荧光分子的闪烁和漂白特性的三维贝叶斯分析，得到最终超分辨图像。
2.根据权利要求1所述的三维超分辨方法，其特征在于，所述最终超分辨图像通过以下步骤得到：
在三维坐标下对各个运算单元进行以第一超分辨图像为引导的三维贝叶斯分析：根据第一超分辨图像进行贝叶斯分析模型中各个荧光分子的初始化分布，使用马尔可夫链模拟单个荧光分子在多帧图像中的闪烁与漂白，使用蒙特卡洛方法计算贝叶斯分析模型与样品三维图像的相似程度，根据与样品三维图像的相似程度逐个优化荧光分子的强度、半径以及位置，对贝叶斯分析模型中的每个荧光分子优化后，在优化后的贝叶斯分析模型中增删一个荧光分子，再计算该贝叶斯分析模型与样品三维图像的相似程度，继而进入到下一轮优化每个荧光分子的过程，持续到优化结果收敛到一个模型，再对该模型中的点进行高斯模糊最终获得超分辨图像。
3.根据权利要求1所述的三维超分辨方法，其特征在于，所述样品的三维图像通过以下步骤得到：
利用中高倍率物镜在大视场下构建薄而均匀的贝塞尔扫描光片，在覆盖大样品的同时，实现优于高斯光片的轴向分辨率；
利用所述贝塞尔扫描光片沿XY平面扫描样品，收集样品受激发射的荧光分子获得二维图像；
控制样品沿Z轴运动，实现对样品的多层扫描，得到样品的三维图像。
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