CN113533277A - 基于四芯光纤主动光操控的光片荧光显微成像方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的是一种基于四芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：该装置由激光器输出的激光光束经一根输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤的纤芯传输后，在水平位置的两根纤芯的输出端形成贝塞尔光场，捕获活体单细胞。经调制的激光脉冲经另外两根垂直位置的纤芯传输后，在输出端形成推动和制动光场，来对细胞的精准主动光操控。当细胞旋转后并达到稳定状态，对细胞进行层析成像。通过驱动细胞连续转动获取整个细胞内部的三维结构荧光图像。本发明构建的方法和系统可对活体单细胞进行高时间和空间分辨率三维层析成像，具有光损伤小、空间分辨率高、操作灵活、成本低等特点，在医学和生命科学等研究领域中具有广泛的应用前景。

Description

基于四芯光纤主动光操控的光片荧光显微成像方法及装置
(一)技术领域
本发明提供的是一种基于四芯光纤主动光操控的光片荧光显微成像方法及装置，通过一根四芯光纤稳定捕获并精准操控活体单细胞的旋转角度，实现细胞内片状光束的快速扫描，获取高时间和空间分辨率的细胞三维结构层析图像，属于光操控和光学显微成像领域。
(二)背景技术
细胞是生命结构和功能的基本单位，没有细胞就没有完整的生命，对细胞的深入研究是探索生命奥秘、征服疾病和改造生命的关键。自细胞被发现以来，广大科研工作者对其物理、化学和生物学等特性开展了广泛而深入的研究工作，揭示了众多关于细胞的秘密。
长期以来，人们普遍认为构成不同种类细胞族群的单个细胞的生物学特性基本是一致的。基于这种认识，通常的生命科学研究主要以大量同类型细胞构成的细胞族群为研究对象。近年来，人们逐渐认识到构成同类型细胞族群的细胞个体之间存在着显著的微观不均一性，即异质性特征。有研究证明，即便是同一族群的细胞个体，在基因的转录和翻译、蛋白活性，以及多个水平上都会存在显著的差异，基于大量细胞的研究结果很难以反映单细胞水平上的生命活动规律。因此，基于单细胞的分析技术将能在更深层次上揭示生命活动的本质和基本规律，为探究重大疾病的起因、发展和治疗提供更加可靠的科学依据。
光学显微技术对于发现细胞结构，以及研究其功能起到了至关重要的作用。随着对细胞结构和功能研究的深入，我们所面临的挑战是以展开生命活动的大环境活细胞作为“试管”，在尽量避免影响细胞自身性质及其所处微环境的前提下，以非接触、无损伤的方式获取活体单细胞的亚细胞精细结构图像信息，细胞生命过程中不同种类生物分子的空间分布及其变化信息，以及细胞器和生物分子、不同种类生物分子之间相互作用过程的功能信息，为在更深层次上揭示生命活动的本质和基本规律提供可靠的科学依据。
随着荧光标记技术、激光技术、微弱信号探测技术和计算机技术的发展，现代显微成像技术能够以前所未有的时间和空间分辨率记录生物系统的时空信息，改变我们看待、记录、解释和理解生物事件的方式。特别是将激光光束扫描和共焦探测结合在一起的激光扫描共焦荧光显微技术(Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy，LSCM)，基于自体荧光或通过荧光标记提供高的化学特异性和成像对比度，利用安装在光电探测器共轭位置处的共焦光阑有效消除离焦荧光信号的影响，从而实现具有高空间分辨率的三维光学层析成像。
然而，在LSCM系统中，待测样品沿激发光传输光路的焦平面附近区域的荧光团均被激发，大大降低了激发效率。其次，样品中的许多内源性荧光和非荧光有机成份也会被激发。在对待测活体生物样品进行长时间成像过程中，连续长时间照射引起的光毒性、光损伤和光致漂白等是其无法回避的问题。此外，在系统中使用激光光束扫描和在探测器前安装共焦光阑，导致系统结构复杂，造价昂贵，成像时间长。因此，广大科研工作者一直致力于开发一种能够在较长观察时间内，快速获取较大体积的活体单细胞具有高时空分辨率三维结构层析图像的显微成像方法。
近年来，使用薄片状激光束实现的光片荧光显微技术(Light SheetFluorescence Microscopy，LSFM)已被证明是实现这种具有挑战性目标的首选技术之一。LSFM包括激发光路和探测光路两个主要的组成部分。激发光路中使用通常称为“光片”的薄片状激光束作为激发光，激发片状照明区域内的荧光团。探测光路使用宽场荧光信号并行探测方式，在与片状激发光平面垂直的方向收集产生的荧光信号。通过片状激发光在细胞内部的纵向快速扫描，获取待测细胞样品具有高空间分辨率的三维结构层析图像。LSFM这种高效的激发和探测方式不仅有效避免了片状照明区域以外的荧光团和内源有机分子的光漂白和光损伤等问题，减少了整个样品所受到的光毒性的影响，保证了在长时间研究过程中待测活体生物样品的活力，而且有效避免了离焦荧光信号的干扰，大大提高了系统的信噪比。由于上述优点，LSFM提出后就引起了国内外科研工作者的广泛关注。
在使用LSFM获取细胞完整的三维结构图像时，需要实现片状光束在细胞内部的快速扫描。现在常用的技术是在系统中另外加入特殊的固定装置对待测细胞进行处理。通过片状光束的纵向扫描或者利用微位移台来控制待测细胞纵向平移或轴向转动，实现对细胞的层析成像。这就无法避免样品制备过程中对其活性的影响，以及在长时间的成像研究过程中，液态环境的扰动对成像质量的影响。此外，系统中增加光束扫描装置或微位移台，大大增加了系统的复杂程度和成本，降低了系统的可操作性和灵活性。
将LSFM与光镊(Optical Tweezers,OTs)技术有机地结合在一起，使研究人员从对活细胞进行被动的观察转而成为主动的操控，为解决上述问题提供了一种有效的途径。OTs技术利用光场的力学效应，可以在不影响细胞内部及周围环境的条件下，以非接触、无损伤的方式稳定捕捉、精准操控和快速筛选单个病毒、细胞甚至生物大分子，为长时间观察处于液态环境中的活细胞获取其内部结构，进而深入研究细胞生命活动过程的生物调控机制等打开了大门。
传统OTs系统不仅需要使用一个大数值孔径物镜和复杂的光路系统，而且在使用过程中受到许多因素，如工作距离和基片兼容性等的限制，系统体积庞大、造价昂贵、灵活性差。基于光纤实现的光纤光镊(Optical Fiber Tweezers， OFTs)技术可以对液态环境中的活体单细胞进行捕获、拉伸、移动和旋转等精准操控，可以灵活地在介质中任意移动，且系统结构简单、体积小、可操作性强，具有很高的可集成度和灵活性。
本发明公开了一种基于四芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统，可广泛应用于以非接触、无损伤的方式稳定捕获和精准操控活体单细胞，从而快速获取活体单细胞的高空间分辨率三维结构图像。该设计通过基于四芯光纤的光操控系统稳定捕获活体单细胞，并对其旋转角度进行精准光操控。当细胞旋转一个角度达到稳定后，利用片状光束激发照明层面内的荧光团。光轴与照明平面相垂直的显微物镜收集产生的荧光信号，并由CMOS相机记录以获取细胞的荧光层析图像。通过对细胞连续转动过程中转动角度的精准光操控，实现片状光束在细胞内部的快速扫描，从而获得活体单细胞的三维结构荧光图像。本设计所实现的方法和系统不仅可以以非接触的方式、无损伤的方式稳定捕获和精准操控活体单细胞，而且可以快速获取活体单细胞的高空间分辨率三维结构图像。该设计有效克服了荧光显微技术光损伤和光毒性的问题，具有结构简单、灵活性高、易于操作、成本低廉等特点，在生物学、医学和生命科学等众多研究领域中具有广泛的应用前景。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种基于四芯光纤主动光操控的光片荧光显微成像方法及装置系统。不仅可以以非接触的方式、无损伤的方式稳定捕获和精准操控活体单细胞，而且快速获取活体单细胞的高空间分辨率三维结构图像。有效克服了荧光显微技术光损伤和光毒性的问题，具有结构简单、灵活性高、易于操作、成本低廉等特点。
本发明的目的是这样实现的：
它由激光光源1、24；单模光纤2、4、5、8、9、14、15；分束器3、7、 13；频率调制器6；时间延迟器10；强度调制器11、12；光纤耦合器16；四芯光纤17；透镜25、26；柱透镜27；复消色差显微物镜20、28；滤光片21；成像镜头22；CMOS相机23；以及待测活体单细胞18组成。
光操控装置是一条固定在放置待测细胞的培养皿内，输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤17。其中两个纤芯与水平面平行，另两个纤芯垂直于水平面。实现细胞转动角度精准主动光操控的四芯光纤光镊端面结构如图2-a所示。激光光源1输出的激光束通过光纤2传输后，经分束器3按一定强度比例分成两束。其中一束激光经单模光纤5传输后，经分束器13分为强度相等的两束。两束激光经单模光纤14和15传输后，由光纤耦合器16耦合进输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤中水平位置的两根纤芯。经纤芯传输后在输出端形成贝塞尔光场，作为捕获光以稳定捕获活体单细胞18。
另一束激光经单模光纤4传输后，经频率调制器6调制产生具有一定重复频率的激光脉冲。激光脉冲经分束器7按一定比例分为两束，分别耦合进单模光纤8、9。通过强度调制器11、12调节两束激光脉冲的强度，时间延迟器10调节两束激光脉冲之间的时间间隔。两束激光脉冲经光纤耦合器16耦合进四芯光纤垂直位置的两根纤芯，经纤芯传输后在加工成特定角度锥台的光纤输出端形成贝塞尔光场。具有一定时间延迟的激光脉冲，分别作用在被捕获的活体单细胞18两端，分别作为推动细胞18转动的推动光和停止细胞转动的制动光。由于水平位置的两个纤芯到光纤中心距离大于垂直位置的两个纤芯到光纤中心距离。输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤的端面的横截面结构如图二-b所示。因此，被捕获的活体单细胞18在作用在细胞一端的推动光脉冲的作用下，绕捕获光形成的转动轴转动。当转动一个角度时，具有一定时间延迟的制动光脉冲作用在细胞的另一端，从而对细胞的转动施加制动力。通过改变推动光脉冲和制动光脉冲的强度和两者之间的时间延迟，从而对细胞转动角度进行稳定而精准的主动光操控。
当活体单细胞18转动至一个角度并稳定后，激光光源24输出的激光束经由透镜25、26扩束后，经柱透镜27后耦合进复消色差显微物镜28，形成片状光19。
在光片荧光显微镜中，激光光源发出激光经由扩束系统扩束，经过柱透镜整形，最后通过显微物镜在待测样品上形成光片照明。光片束腰部分的厚度ω0决定了光片荧光显微镜的空间分辨率，可以表示为：
Figure BDA0003157621600000061
其中，f为焦距；λ为光源波长；Dl为瑞丽长度。而光片的长度b决定了光片荧光显微镜的视场范围可以表示为：
Figure BDA0003157621600000062
当光片19照射到待测活体单细胞18上时，激发细胞中照明范围内的荧光团，激发产生的荧光信号通过光轴与光片平面垂直的检测物镜20收集，并由CMOS相机23探测接收。
四芯光纤中垂直位置的两个纤芯中的推动脉冲与制动脉冲交替产生，并且制动脉冲通过时间延迟器10的延时略微滞后于推动脉冲，目的是为了给细胞一定的时间旋转。纤芯8中的推动脉冲，使细胞旋转，细胞旋转一定角度后推动脉冲停止，纤芯9产生制动脉冲来使细胞停止旋转，细胞停止后的一段时间内没有脉冲光的输入，细胞处于静止状态，这段时间用于细胞成像，一段时间后再继续重复上述过程。实现细胞转动角度的精准主动光操控，作用在细胞上的激光脉冲的时序图如图3所示。
每控制细胞至一个角度并稳定后，CMOS相机23记录细胞在该角度上的一幅层析荧光图像。通过细胞转动角度的精准主动光操控，实现片状光19在细胞内部连续快速扫描，获得细胞的高空间分辨率三维结构图像。在细胞转动过程中，光片扫描实现层析成像，获取细胞三维结构图像的过程如图4所示。
(四)附图说明
图1是一种基于四芯光纤主动光操控的光片荧光显微成像装置的系统结构示意图。
图2是光操控部分系统结构示意图，展示了光纤的侧视图和立体图的结构，该部分由四根单模光纤耦合到一根四芯光纤，用来稳定捕获待测细胞，并对其转动角度进行精准主动光操控和操控细胞。
图3是对实现细胞转动角度的精准主动光操控，作用在细胞上的激光脉冲的时序图。
图4是细胞转动过程中，光片扫描实现层析成像，获取细胞三维结构图像的过程。
附图标记说明：1-激光光源；2-单模光纤；3-分束器；4-单模光纤；5- 单模光纤；6-频率调制器；7-分束器；8-单模光纤；9-单模光纤；10-时间延迟器；11-强度调制器；12-强度调制器；13-分束器；14-单模光纤；15-单模光纤； 16-光线耦合器；17-四芯光纤；18-待测细胞；19-片状光；20-复消色差显微物镜；21-滤光片；22-成像镜头；23-CMOS相机；24-激光光源；25-透镜；26-透镜；27-柱透镜；28-复消色差显微物镜。
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于四芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：它由激光光源1、24；单模光纤2、4、5、8、9、14、15；分束器3、7、13；频率调制器6；时间延迟器10；强度调制器11、12；光纤耦合器16；四芯光纤 17；透镜25、26；柱透镜27；复消色差显微物镜20、28；滤光片21；成像镜头22；CMOS相机23；以及待测细胞18组成。
激光光源1发出的激光光束通过光纤2传输到分束器3分成两束，分别耦合进单模光纤4、5。单模光纤5中的激光光束经过分束器13分为均匀的两束，经单模光纤14、15传输后，经光纤耦合器16耦合进输出端面加工成特定角度的锥台四芯光纤中水平位置的两个纤芯，在输出端形成贝塞尔光场，稳定捕获待测细胞18。单模光纤4中的激光光束经过频率调制器6的调制产生激光脉冲，经过分束器7分为两束耦合进单模光纤8、9。单模光纤9中的激光脉冲经强度调制器12对其强度进行调制，产生强度合适的激光脉冲。经单模光纤传输后的激光脉冲经光纤耦合器16耦合进输出端面加工成特定角度的锥台的四芯光纤中垂直位置的两个纤芯中的一个纤芯。由于水平位置的两个纤芯到光纤中心距离大于垂直位置的两个纤芯到光纤中心距离。激光脉冲在输出端输出的激光脉冲作用在细胞的一端，作为推动细胞旋转的推动光。单模光纤8中的激光脉冲经过强度调制器11对其强度进行调制，并经时间延迟器10产生一定时间延迟的激光脉冲。经单模光纤传输后的激光脉冲经光纤耦合器16耦合进输出端面加工成特定角度的锥台的四芯光纤中垂直位置的两个纤芯中的另一个纤芯。在输出端输出的激光脉冲作用在细胞的另一端，作为使停止细胞旋转的制动光。
当待测细胞绕特定转动轴转动至一个角度并达到稳定后，激光光源24 发出激光经由透镜25、26扩束后，经由柱透镜27整形后，由复消色差显微物镜28产生片状光19，片状光19照射到待测细胞18上。片状光照明细胞内的一个层面，激发该层面内细胞中的荧光物质产生荧光信号，由复消色差显微物镜20收集，经过滤光片21和成像镜头22，由CMOS相机23检测接收，获取光片照明区域的层析荧光图像。
在获取特定种类的活体单细胞的三维结构层析图像的过程中，捕获光的强度保持不变。对于不同种类的细胞，需要调整激光强度实现对细胞的稳定捕获。激光光束经频率调制器产生激光脉冲，经强度调制器调制后使推动光脉冲的强度需要略大于制动光的强度。被捕获的细胞在推动光脉冲的作用下开始旋转，当激光脉冲消失后，细胞由于惯性的作用还会旋转。此时，为实现细胞旋转角度的精准主动控制，需要具有一定时间延迟的制动光脉冲作用在细胞的另一端，产生与细胞转动方向相反的制动力，从而精准控制细胞的转动角度。在具有一定重复频率的推动和制动光脉冲的连续作用下，细胞绕捕获轴连续旋转，从而实现照明光片在细胞内的快速扫描，获得细胞的三维结构层析荧光图像。
为了使CMOS相机能够及时记录荧光信号，推动光脉冲之间的时间间隔要略大于相机的曝光时间。被捕获的细胞在推动光脉冲的推动阶段，惯性旋转阶段，以及制动脉冲的制动阶段所旋转过的角度之和，就是细胞每一次旋转转动的角度。细胞的旋转角度可以通过控制激光脉冲的强度，以及脉冲之间的时间间隔来精准控制，从而满足对体积和质量不同的细胞的转动角度进行精确的主动光操控。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.本发明提供的是一种基于四芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：它由激光光源1、24；单模光纤2、4、5、8、9、14、15；分束器3、7、13；频率调制器6；时间延迟器10；强度调制器11、12；光纤合束器16；四芯光纤17；透镜25、26；柱透镜27；复消色差显微物镜20、28；滤光片21；成像镜头22；CMOS相机23；以及待测活体单细胞18组成。激光器1输出的激光光束耦合进一根输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤17的各纤芯。四芯光纤17固定在放置待测细胞的培养皿内，其中两束激光光束经水平位置两个纤芯传输后，在加工成锥台的输出端形成贝塞尔光场，实现稳定捕获活体单细胞18。另外两束激光光束经调制后，形成具有一定时间间隔和重复频率的两束激光脉冲。两束激光脉冲经垂直位置的两个纤芯传输后，在输出端形成的光场分别作用在被捕获的细胞两端，施加方向相反的周期性的光推动力和制动力，从而实现对被捕获的活体单细胞18转动角度进行稳定而精准的主动光操控。当活体单细胞18转动至一个角度并稳定后，激光光源24输出的激光束经由扩束整形后，耦合进复消色差显微物镜28形成片状光束19照射到被捕获的活体单细胞18上。激发光片照明层面内的荧光物质产生的荧光信号经复消色差显微物镜20收集，由CMOS相机23记录一副荧光层析图像。通过细胞转动角度的连续精准主动光操控，实现光片在细胞内部的快速扫描，获取细胞的高空间分辨率三维结构图像。
2.根据权利要求1所述的光操控装置。其特征是：所述光操控装置是一条固定在放置待测细胞的培养皿内，输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤17。其中两个纤芯与水平面平行，另两个纤芯垂直于水平面。激光光源1输出的激光束通过光纤2传输后，经分束器3按一定强度比例分成两束。其中一束激光经单模光纤5传输后，经分束器13分为强度相等的两束。两束激光经单模光纤14和15传输后，由光纤耦合器16耦合进输出端加工成特定角度锥台的四芯光纤中水平位置的两根纤芯。经纤芯传输后在输出端形成捕获光场，作为捕获光以稳定捕获活体单细胞18。另一束激光经单模光纤4传输后，经频率调制器6调制产生具有一定重复频率的激光脉冲。激光脉冲经分束器7按一定比例分为两束，分别耦合进单模光纤8、9。通过强度调制器11、12调节两束激光脉冲的强度，时间延迟器10调节两束激光脉冲之间的时间间隔。两束激光脉冲经光纤耦合器16耦合进四芯光纤垂直位置的两根纤芯，经纤芯传输后在加工成特定角度锥台的光纤输出端形成贝塞尔光场。具有一定时间延迟的激光脉冲，分别作用在被捕获的活体单细胞18两端，分别作为推动细胞18转动的推动光和停止细胞转动的制动光。由于水平位置的两个纤芯到光纤中心距离大于垂直位置的两个纤芯到光纤中心距离。因此，被捕获的活体单细胞18在作用在细胞一端的推动光脉冲的作用下，绕捕获光形成的转动轴转动。当转动一个角度时，具有一定时间延迟的制动光脉冲作用在细胞的另一端，从而对细胞的转动施加制动力。通过改变推动光脉冲和制动光脉冲的强度和两者之间的时间延迟，从而对细胞转动角度进行稳定而精准的主动光操控。
3.根据权利要求1所述的光片荧光显微镜系统。其特征是：所述的光片显微镜系统是当活体单细胞18在光操控装置驱动下每转动至一个角度稳定后，激光光源24输出的激光束经由透镜25、26扩束后，经柱透镜27后耦合进复消色差显微物镜28，形成片状光19照射到被捕获的活体单细胞18的一个层面上，激发该层面上的荧光物质，产生的荧光信号由光轴与照明光片平面相垂直的检测物镜20收集，经滤光片21和成像镜头22，由CMOS相机23记录一副荧光层析图像。通过细胞转动角度的精准主动光操控，实现片状光19在细胞内部连续快速扫描，获得细胞的高空间分辨率三维结构图像。
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