CN112834410B - 基于双芯光纤光操控的片状光显微成像方法及装置 - Google Patents

基于双芯光纤光操控的片状光显微成像方法及装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供的是一种基于双芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统。其特征是：该装置的光操控部分由两条输出端面加工成特定角度的两芯光纤相向安装组成。其中一条两芯光纤输出端面附近形成的聚焦光场稳定捕获待测细胞调节另一条两芯光纤各纤芯的输出功率，使细胞绕特定轴线旋转。当细胞每旋转至一定角度并达到稳定状态后，利用光片荧光显微技术获取某一层面细胞的结构图像，最终获取细胞的三维结构图像。本发明构建的系统可实现获取活体单细胞的高时间和高空间分辨率三维结构图像，具有光损伤小、结构简单、成本低廉、操作简便等特点。可应用于生物学、医学和生命科学等众多研究领域。

Description

基于双芯光纤光操控的片状光显微成像方法及装置
(一)技术领域
本发明提供的是一种基于双芯光纤光操控的片状光成像方法及装置，可用于通过光纤操控活体单细胞的旋转实现对细胞的层析成像，属于光学显微成像领域。
(二)背景技术
细胞是生命结构和功能的基本单位，对细胞的深入研究是揭示生命现象奥秘、改造生命和征服疾病的关键。细胞的个体之间，即使是具有相同遗传背景的体外培养细胞个体之间在酶活性、基因表达和细胞信号转导等方面都存在巨大的个体差异。通过对单细胞进行分析研究，可以发现在研究大量细胞群体时观察不到的现象和机制。目前，生命科学研究的热点之一是在分子水平上阐明单细胞的基本活动规律，这就要求对细胞内种类繁多的生物分子的物理化学性质开展系统的研究。
近年来，光片荧光显微镜逐渐成为热点话题，这是一种新型的、高效的成像方式。有别于传统的显微镜，光片荧光显微系统一般采用两个正交放置的显微物镜，其中一个物镜用来产生片状光，激发细胞一个薄层的荧光分子，起到照明的作用。另一个正交放置的检测物镜用来收集激发产生的荧光信号。当待测细胞放置在片状光的照明范围内时，只有片状光经过的部分才会激发细胞内被荧光标记的部分，被与光片照明的光路正交放置的检测光路所收集，得到荧光图像。因为光片只激发了样品的中很薄的一层，发射的照明光被充分利用，极大的降低了光毒性和光漂白性。同时，没有被光照的部分不会产生多余的荧光，有效的抑制了离焦的背景噪声。通过纵向的光片扫描或通过对细胞的微小位移即可获得一组细胞的层析图像，经过图像处理最终获得待测细胞的三维结构图像。如今的光片显微镜通过荧光标记、三维定位等各种方法结合，大大提高显微成像的倍数和分辨率。由于光片显微镜的的成像速度快，具有更小的光致损伤，并且对成像的对比度有很大改善，为研究细胞的动态过程提供了很好的成像手段，使研究人员能够在更小的尺度上对活体细胞的生命过程进行深入探究。显微成像技术发展的最终目的都是为了让人们对细胞乃至整个生命的过程和各种疾病的产生机制有更进一步的理解。
不仅是光片荧光显微镜本身，对样品实现精准稳定的操控在显微镜中起着至关重要的作用，受到了广泛的关注。在光片荧光显微成像系统中，为了获取细胞的三维结构图像可以通过加入扫描振镜移动光片来进行层析成像；或是加入微位移台来控制待测细胞的轴向移动。扫描振镜的价格昂贵，并且加入扫描振镜会使光片显微镜的结构变得复杂。使用微米级别的微位移台，细胞移动的精度达不到要求，使用纳米级别的微位移台虽然精度足够高，但高精度的微位移台成本昂贵。
本发明公开了一种基于双芯光纤光操控的光片荧光显微成像方法和系统，可广泛应用于获取细胞或微生物的高空间分辨率的三维结构图像。该设计采用高斯光束经过扩束和整形产生片状光，片状光经物镜聚焦在待测细胞中激发荧光分子产生荧光信号，通过检测物镜收集荧光信号并由CMOS相机记录以获取细胞的层析图像。通过光操控系统控制细胞旋转，得到不同角度上细胞的层析图像，经过图像重构获得细胞的三维结构图像。本设计的光操控系统采用两根双芯单模光纤来稳定捕获和精准旋转细胞，采用光纤来控制细胞的这种方式可以达到操控细胞的效果，同时节约了成本。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种结构简单紧凑，操控方便、非接触式的、易调节的基于双芯光纤的片状光成像方法及装置系统。
本发明的目的是这样实现的：
它由激光光源1、10、31；透镜2、3、13、14、25、28、柱透镜4；复消色差显微物镜5、9、CMOS相机6；成像镜头7、滤光片8、单模光纤15和16、23、24；光纤耦合器17、22、5/5分束镜12、27；渐变衰减片26、29；反射镜12、30以及待测细胞19组成。激光光源1发出激光经由透镜2、3扩束后经由柱透镜4后经由复消色差显微物镜5产生片状光20，片状光照射到待测细胞19上激发细胞内的荧光物质产生荧光信号，经过消色差显微物镜9经过滤光片8和成像镜头7的汇聚，到达CMOS相机6上被检测。激光光源10产生的激光通过5/5分束镜11分成两束，分别进入双芯光纤15、16，再通过光纤耦合器17的耦合到双芯光纤18形成聚焦光场，用来固定细胞，激光光源31产生的激光通过5/5分束镜27分成两束分别进入单芯光纤23、24，再通过光纤耦合器22耦合到双芯光纤21，通过调整渐变衰减片26、29来改变激光的功率达到控制细胞19绕特定轴线旋转的目的。
光片显微镜在成像时，首先由激光光源发出激光，经由扩束系统扩束，经过柱透镜的整形，最后形成片状光照射到待测样品上。光片的薄厚是决定光片显微镜的分辨率的一大重要因素，有如下公式：
Figure GDA0003795082460000031
其中ω0为光片束腰部分的厚度，b为光片的长度(即光片的视场范围)。
当光片照射到待测样品上时，激发细胞内的荧光标记染料并发出荧光，荧光通过检测物镜收集并传送到CMOS相机达到对细胞的一个薄层成像的效果。
为了实现对细胞的固定和操控，本发明设计了光操控的光镊装置，该光操控装置是分别通过两根双芯光纤18和21构成。其中光纤18用来使细胞固定，光纤21用来操控细胞。图二-b为光纤的摆放方式：其中一根两芯光纤纵向摆放，另一跟两芯光纤相对横向摆放。
如图二-a所示：两根双芯光纤相对放置，激光光源10发出的激光由5/5分束镜分成两束光，分得的两束光分别通过两个透镜耦合到一根两芯光纤中，最后经过特殊加工过的双芯光纤末端的聚焦作用下，形成聚焦光场，实现对细胞的固定。同理，光源31发出的激光由分束镜分成两束光，对两路的光束在耦合前加入渐变衰减片，渐变衰减片的作用是用来调整入射激光的功率，然后再对两束光进行耦合，这样光纤21就可以通过调整入射激光的功率来实现控制细胞绕特定轴线旋转的效果。
每控制细胞旋转一次并且待细胞稳定后，CMOS相机就会获取一次细胞其中一层的图像，当细胞经过多次旋转后，可获得细胞多个层面的结构，如图三所示。
(四)附图说明
图一是一种基于双芯光纤光操控的片状光成像方法及装置的系统的结构示意图。
图二是光操控部分的示意图，展示了光纤的主视图和侧视图的结构，该部分由两根双线光纤相对放置，分别用来固定细胞和操控细胞。
图三是对细胞进行成像的方法的示意图，通过图二光操控部分的固定和多次旋转一定的角度，来对细胞的不同层面进行成像。
附图标记说明：1-激光光源；2-透镜；3-透镜；4-柱透镜；5-复消色差显微物镜；6-CMOS相机；7-透镜；8-滤光片；9-复消色差显微物镜；10-激光光源；11-5/5分束镜；12-反射镜；13-透镜；14-透镜；15-单模光纤；16-单模光纤；17-光纤耦合器；18-双芯光纤；19-待测细胞；20-片状光；21-双芯光纤；22-光纤耦合器；23-单模光纤；24-单模光纤；25-透镜；26-渐变衰减片；27-5/5分束镜；28-透镜；29-5/5分束镜；30-反射镜；31-激光光源；
(五)具体实施方式
下面结合实例对本发明进行进一步的详细说明，以令本领域的技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
一种基于双芯光纤光操控的片状光成像方法及装置。其特征是：它由激光光源1、10、31；透镜2、3、13、14、25、28；柱透镜4；复消色差显微物镜5、9；CMOS相机6；成像镜头7；滤光片8；单模光纤15和16、23、24、光纤耦合器17、22；5/5分束镜12、27；渐变衰减片26、29；反射镜12、30以及待测细胞19组成。激光光源1发出激光经由透镜2、3扩束后经由柱透镜4后经由复消色差显微物镜5产生片状光20，片状光照射到待测细胞19上激发细胞内的荧光物质产生荧光信号，经过消色差显微物镜9经过滤光片8和成像镜头7的汇聚，到达CMOS相机6上被检测。激光光源10产生的激光通过5/5分束镜11分成两束，分别进入双芯光纤15、16，再通过光纤耦合器17的耦合到双芯光纤18形成聚焦光场，用来固定细胞，激光光源31产生的激光通过5/5分束镜27分成两束分别进入单芯光纤23、24，再通过光纤耦合器22耦合到双芯光纤21，通过调整渐变衰减片26、29来改变激光的功率达到控制细胞旋转的目的。
当光片照射到待测样品上时，激发细胞内的荧光标记染料并发出荧光，荧光通过检测物镜收集并传送到CMOS相机达到对细胞的一个薄层成像的效果。为了实现对细胞的固定和操控，本发明设计了光操控的光镊装置，该光操控装置是分别通过两根双芯光纤15和18构成。其中光纤15用来使细胞固定，光纤18用来操控细胞。图二-b为光纤的摆放方式：其中一根两芯光纤纵向摆放，另一跟两芯光纤相对横向摆放。
每控制细胞旋转一次并且待细胞稳定后，CMOS相机就会获取一次细胞其中一层的图像，当细胞经过多次旋转后，可获得细胞的三维形貌结构。
提供以上实例仅仅是为了描述本发明的目的，而并非限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求限定。不脱离本发明的精神和原理而做出的各种等同替换和修改均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.一种基于双芯光纤光操控的光片荧光显微成像系统，其特征是：由激光光源一(1)、激光光源二(10)、激光光源三(31)、透镜一(2)、透镜二(3)、透镜三(13)、透镜四(14)、透镜五(25)、透镜六(28)、柱透镜(4)、复消色差显微物镜一(5)、复消色差显微物镜二(9)、CMOS相机(6)、成像镜头(7)、滤光片(8)、单模光纤一(15)、单模光纤二(16)、单模光纤三(23)、单模光纤四(24)、光纤耦合器一(17)、光纤耦合器二(22)、双芯光纤一(18)、双芯光纤二(21)、5/5分束镜一(11)、5/5分束镜二(27)、渐变衰减片一(26)、渐变衰减片二(29)、反射镜一(12)、反射镜二(30)和待测细胞(19)组成，激光光源一(1)发出激光经由透镜一(2)、透镜二(3)扩束后经由柱透镜(4)后经由复消色差显微物镜一(5)产生片状光(20)，片状光照射到待测细胞(19)上激发细胞内的荧光物质产生荧光信号，经过复消色差显微物镜二(9)、滤光片(8)和成像镜头(7)的会聚，到达CMOS相机(6)上被检测，激光光源二(10)产生的激光通过5/5分束镜一(11)分成两束，分别进入单模光纤一(15)、单模光纤二(16)，再通过光纤耦合器一(17)耦合到双芯光纤一(18)形成聚焦光场，用来固定细胞(19)，激光光源三(31)产生的激光通过5/5分束镜二(27)分成两束分别耦合进入单模光纤三(23)和单模光纤四(24)，再通过光纤耦合器二(22)耦合到双芯光纤二(21)，通过调整渐变衰减片一(26)和渐变衰减片二(29)分别改变输入单模光纤三(23)和单模光纤四(24)的激光功率，达到控制细胞(19)绕特定轴线旋转的目的。
2.根据权利要求1所述的基于双芯光纤光操控的光片荧光显微成像系统，其特征是：通过双芯光纤一(18)和双芯光纤二(21)同时来操控细胞，两根光纤相对放置，其中双芯光纤一(18)双芯横向放置，另一根双芯光纤二(21)双芯纵向放置，双芯光纤一(18)的作用是稳定捕获待测细胞，以便于长时间观测，另一根双芯光纤二(21)的作用是当采集完细胞的一个平面的层析图像后，通过调整双芯光纤二(21)不同纤芯的输出功率操控细胞旋转一定的角度，以采集细胞不同平面的结构图像。
3.根据权利要求1所述的基于双芯光纤光操控的光片荧光显微成像系统，其特征是：由激光光源一(1)、透镜一(2)和透镜二(3)组成扩束系统，柱透镜(4)产生片状光再经由复消色差显微物镜一(5)照射到待测细胞(19)上，待测细胞(19)的一个层面经过片状光的激发，标记荧光染料的结构发出荧光，发射的荧光信号通过复消色差显微物镜二(9)收集，最终被CMOS相机接收成像，再经由双芯光纤二(21)使细胞旋转一定的角度，待细胞稳定后拍摄不同的层面，通过图像处理最终获得完整的细胞三维结构。
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