WO2011120629A1 - Verfahren und anordnung zur mikroskopie - Google Patents

Verfahren und anordnung zur mikroskopie Download PDF

Info

Publication number
WO2011120629A1
WO2011120629A1 PCT/EP2011/001220 EP2011001220W WO2011120629A1 WO 2011120629 A1 WO2011120629 A1 WO 2011120629A1 EP 2011001220 W EP2011001220 W EP 2011001220W WO 2011120629 A1 WO2011120629 A1 WO 2011120629A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
excitation light
detector
focus
light
detection
Prior art date
Application number
PCT/EP2011/001220
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heinrich Kraft Albrecht Spiecker
Original Assignee
Lavision Biotec Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44144730&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2011120629(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Lavision Biotec Gmbh filed Critical Lavision Biotec Gmbh
Publication of WO2011120629A1 publication Critical patent/WO2011120629A1/de

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00Microscopes
    • G02B21/16Microscopes adapted for ultraviolet illumination ; Fluorescence microscopes
    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/10Scanning systems
    • G02B26/105Scanning systems with one or more pivoting mirrors or galvano-mirrors
    • GPHYSICS
    • G02OPTICS
    • G02BOPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B26/00Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements
    • G02B26/08Optical devices or arrangements for the control of light using movable or deformable optical elements for controlling the direction of light
    • G02B26/10Scanning systems
    • G02B26/12Scanning systems using multifaceted mirrors

Definitions

  • the present invention relates to an arrangement for microscopy according to the preamble of claim 1, and to a microscopy method.
  • SPIM selective plane illumination microscopy
  • the variants of ultramicroscopy shown in the publication are described there in detail with regard to their advantages and disadvantages. These are OPFOS, HROPFOS, TLSM, SPIM, OCPI, Ultramicroscopy, DSLM, mSPIM, HILO, OPM.
  • Fig. 1 shows such a conventional microscopy device.
  • the light band is generated from an excitation light source 1 by means of excitation optics 3, which is designed as cylinder optics, with which a light sheet is generated in the object 4 in the image plane of a flat detector 6, so that the light is axial with respect to the axis of Detection optics 5 is limited at the location of the line to a few microns.
  • the light band then expands to both sides. In order to obtain a three-dimensional representation of the object, this is moved according to the prior art relative to the optical system along the detection axis, so that is then recorded level by level.
  • US 2006/0017001 A1 is a modification of confocal microscopy.
  • the method uses an excitation beam which is coaxially irradiated through the detection optics and excites a line in the sample.
  • the beam is moved perpendicular to the sample by means of a scanner and thus stimulates the entire sample volume.
  • the method differs substantially from the above-mentioned methods in which substantially only one plane is excited.
  • the image of the line is imaged onto a CMOS camera which has a rolling shutter operation which allows only a narrow line area to be read on the detector and to allow that area to pass over the detector in synchrony with the movement of the line.
  • One way to improve the contrast is to periodically interrupt the light band and thus produce a striped, structured illumination of the sample (Breuninger et al., 2007). A plane of the object is then no longer recorded by means of an image, but one detects a series of images in which the stripe pattern is shifted step by step. This method is only useful if the fluorescence is excited sufficiently strong because the final image has the character of a difference signal. Sensitive samples and weak signals then bleach during data acquisition, so that a correct image can no longer be calculated. A disadvantage of this method is that still large parts of the entire image are illuminated and thus creates a high background, which contributes to image noise.
  • Another disadvantage is given by the sample. If there are absorbent particles or areas in the sample, they cast a shadow that runs in the image plane and thus becomes visible as a darker striped stripe in the image. This is particularly disadvantageous if the series of images (image stacks) are to be used for three-dimensional reconstruction or if methods of deconvolution to improve resolution should be used.
  • the shadowing is particularly strong when the aperture of the illumination light is low, as is the case in particular, when large samples are examined. For large samples, shadowing particles are more likely because the area to be detected is larger.
  • Shadowing can be reduced or avoided in various ways.
  • One method is to illuminate the sample from different directions (Huisken, J. and Stainier, D.Y.R. 2007) so that shadowing and impurities of the sample also act in different directions. This is also disclosed in DE 10 2007 015 063 A1. If the irradiation direction is changed by rotating the sample, series of images with different orientation of the sample can be taken. The difficulty is to correctly account for different shots. This is usually done in Fourier space with subsequent back transformation. Intersections of different shadows are difficult to treat.
  • Another method is to realize the illumination from different directions only within the illumination plane and thereby to rotate the illumination axis about the detection axis within an angular interval.
  • the sample remains unchanged with respect to the detection system, so that the fluorescence signal over all angles of rotation on the camera can be integrated in time. Shadows emanating from individual particles will then pivot within the illumination angle interval and will largely exit. All that remains is the volume of the particle itself and the core shadow area behind the particle.
  • the image quality is significantly improved over the method in which the illuminating light band is irradiated only from one direction.
  • the rotation of the light band can be realized by means of a mirror scanner, primarily by means of a polygon scanner, whose mirror is imaged into the sample in such a way that upon rotation of the polygon a rotation of the light sheet around the optical axis is generated.
  • the problem of generating a light sheet remains optically. Methods of shadow removal and image enhancement by means of structured illumination are difficult to combine because structured illumination only works well if the imprinted structure is stable during the exposure time and is not reduced in contrast by an angle scanning process.
  • the object of the invention is to provide a method and an arrangement that significantly improve conventional microscopy in terms of resolution and efficiency again. favorable In addition, it would be tig if the shadow removal is realized in a simple manner, an efficient use of the available light output is achieved, a variable light sheet width and / or an improved high-contrast resolution is achieved, which is almost identical at all points of the image plane.
  • a lighting or excitation light beam is focused in the sample plane in one or both directions. It is advantageous if the focus is telecentric. Before the light is focused into the sample, the beam is deflected by a scanner whose scan axis is substantially parallel to the detection axis. This ensures that the laser beam can be moved parallel through the sample plane. If the scanner carries out a sawtooth-shaped scanning movement, the focused beam sequentially illuminates a strip homogeneously. The sum of all stripes is composed of the light sheet used in the prior art.
  • the amplitude of the scanning movement is advantageously adjustable, so that the width of the "light sheet” can be adjusted.
  • the signal radiation generated in the sample plane eg fluorescence, second harmonic (SHG), third harmonic (THG) or scattered light, is determined by A detection optical unit is imaged onto a flat detector which permits random access, ie targeted access to selected areas.
  • the detector used is a camera with a roller shutter operation in which the active area of the detector is located
  • a strip of one or more image lines can be restricted and moved continuously perpendicular to the image lines during a photograph
  • the scanner and the camera are oriented such that the active image line or active image lines (active detector strip) substantially parallel to the instantaneous focus line imaged on the detector
  • the synchronization of the scanner and the camera is selected such that the image of the light emitted by the focus line is substantially coaxial with the active detector strip at each time the image is recorded on the detector.
  • the inventive micro-roscopy arrangement therefore uses a detector with a detector surface, ie with a two-dimensional arrangement of detector pixels.
  • a control It is intended to specify for each pixel whether this pixel should be read out or not. All the pixels to be read together form the "active area" of the detector surface to be read, the remaining pixels are not read out, ie the signal available to them is neglected, which has the advantage that only the actually interesting signals are taken into account and processed. In addition, background noise is suppressed by disregarding the inactive area of the detector, thereby significantly increasing the resolution of the microscope array.
  • the shape, the length and / or the width of the active detector area or detector strip which is the number and length of the active picture lines, can be set variably.
  • the light from an adjustable range around the beam waist of the exciting light beam is completely collected and the light from the areas of the image, which is further farther from the beam waist of the excitation light, not or only a small part is detected.
  • the beam waist can be displaced along the excitation beam axis with suitable optical measures.
  • This can advantageously be achieved by arranging the unit of scanner and telecentric foliation along the beam axis in a movable manner and, in turn, coupling the light into this unit in parallel with the excitation beam axis in the sample. This maintains the synchronization of the excitation scan process and its image on the detector with the active detector strip during the displacement of the scanning and focusing unit, so that the sharp area defined by the detection optics can be moved through the object along the image lines.
  • this movement is also motorized executable by a control unit, so that series of pictures can be recorded, so that each point of the object plane is swept over at least in one image of the series of the area, ie in sufficient proximity of the beam waist.
  • the container in which the sample is located is moved synchronously with the unit comprising the scanner and the telecentric focusing optics.
  • the optical path traveled by the excitation beam in the optically dense medium in the sample chamber be kept constant and thus the beam quality.
  • the sample is held on a holder within the container and is not moved with the container.
  • a further advantageous feature of the method is when an image with high contrast and largely homogeneous resolution is extracted from the image series by means of an evaluation unit.
  • the pixels from the series can be used, which have locally maximum intensity or maximum contrast.
  • the image is composed of the x% of the brightest or highest-contrast images at each location, where x is variable and z. B. may be 10, 15, 20 or 25.
  • a defined number "n" of adjacent images may also be included in the calculation: the fact that the image series captured by the displacement contains a series of locally different excitation profiles due to the local slight convergence or divergence of the light outside the beam waist, can be used to apply the mathematical methods of further increasing resolution and contrast, thus making the image series a kind of structured illumination.
  • Another advantage of capturing an image series is that the final image can be subsequently optimized for image brightness or resolution by including more or less images of the series in the local image generation.
  • An advantageous arrangement uses as a light source visible continuous lasers of different wavelengths, which are irradiated simultaneously or sequentially.
  • a supercontinuum laser can be used, which is limited to one or more wavelength ranges by means of dielectric or acousto-optic filters.
  • a short-pulse laser can also be used which excites a line within the sample by means of multiphoton excitation or generates SHG or THG light within a line.
  • a filter system is advantageously arranged so that in fluorescence detection the scattered light of the excitation light is blocked and specific fluorophores (or SHG or THG) are selected with respect to their detection wavelength.
  • a further advantageous variant of the method uses two or more cameras (for example, synchronously with one another), to which the fluorescent light is spectrally collected or split in accordance with its polarization, so that a plurality of dyes or light signals are obtained.
  • nals can be represented by means of one or more excitation wavelengths and one or more detection filters.
  • a further advantageous extension of the arrangement is that at least one further substantially identical scanning and lighting unit z. B. is arranged on the opposite side of the first unit and is used either simultaneously or sequentially.
  • the cameras could also be arranged at an angle of 90 ° to each other.
  • a further image enhancement is possible, especially in the case of large samples, in which the beam waist of the excitation light loses quality as it passes through the sample due to refraction, scattering and absorption.
  • the illumination from the opposite side and / or below 90 ° may be advantageous.
  • the additional illumination from another side can also be realized by means of a scanner, wherein the excitation light is directed to the scanner by means of optics on the different sides of the sample.
  • the scanner can also drive several intervals within the maximum scanning range, which are then directed to different sides of the sample without additional moving parts. In this case, within an interval (A), the beam may hit a mirror which generates the light band from one side and fall within a disjoint interval (B) onto another mirror which directs the light to another, preferably to the opposite side, deflects.
  • a further advantageous variant of the method is that in addition to and substantially coaxial with the excitation laser, a second laser is irradiated, which operates as a STED laser and with the aid of which the excitation volume can be reduced to a very small diameter, which then on the active strip (10) is displayed.
  • STED stands for "stimulated emission depletion”.
  • Bessel beams can be generated in which the excitation beam diameter is almost constant over a long distance.
  • the use of the revolving slit of the rolling shutter cuts the parts of the light out, which are generated or scattered outside the focal plane of the detection optics.
  • An axicon can be used to focus the excitation light.
  • the intensity distribution of the excitation or STED laser beam have different orders of Bessel functions, are tangentially polarized and / or are irradiated with different divergence, so that despite different wavelengths of the two lasers Maumaxima largely coincide and thus the excitation in the secondary maxima of the Bessel beam of the excitation laser is extinguished by the STED laser.
  • a feature of modern CMOS cameras is that several, in particular two separate stripes can run synchronously (but offset relative to one another) or alternately overlapping through the image. This makes it possible to use the beams from both sides simultaneously but separately on the camera.
  • the camera could also be controlled in such a way that several areas are simultaneously read into discrete pictures and saved. It may be advantageous if one area is read out coaxially with the excitation light beam and two further areas parallel adjacent, so that the scattered light component can thus be directly quantified and used to correct the image.
  • a mirrored scanner with a sawtooth pattern can be optimized by having a fast light switch turn off the light source when the scanner is running back. You can also use a chopper wheel for this. If the camera is programmed in such a way that the rolling shutter runs bidirectionally over the detector or sensor, the switching of the light source can be dispensed with. If a polygon scanner is used, the focused beam will only run from one direction over the detection surface. The rolling shutter can then be operated unidirectionally and it can be dispensed with a fast switching of the light source.
  • HILO Highly inclined and laminated optical sheet
  • OPM Oblique plane microscopy
  • the method according to the invention can also be combined with these methods if the excitation optics are similar to the light-sheet optics in this method. is used. However, it may be necessary to deviate from the telecentricity of the excitation light beam, since the magnification in these methods is not constant over the image field. Here, a trapezoidal distortion may need to be considered and corrected.
  • a further variant of the method combines the method with a stimulation pulse light source, which can be irradiated advantageously for local stimulation by the detection optics or from another direction in the sample.
  • the stimulation is temporally advantageously carried out so that the detection beam is in a defined position relative to the stimulation area. This makes it possible to stimulate without disturbing the detection.
  • Methods of stimulation can be performed by means of scanners, flash lamps with fixed or digital masks, which are made variable by means of LCD or DLP elements.
  • FIG. 1 shows a microscope arrangement according to the prior art
  • FIG. 2 shows a first exemplary embodiment of a microscope arrangement according to the invention
  • FIG. 3 shows the detector surface
  • Figure 4 shows a second embodiment of a microscope assembly according to the invention.
  • FIG. 5 shows a third embodiment of a microscope according to the invention.
  • the same components are provided throughout the figures with the same reference numerals.
  • FIG. 1 shows a conventional microscope arrangement according to the SPIM method (SPIM: selective plane illumination microscopy).
  • a light source 1 generates excitation light that excites a sample to emit signal radiation (eg, fluorescence, phosphorescence, second harmonic, third harmonic, or stray light).
  • the excitation radiation is focused into the sample volume 4 by means of focusing optics in order to produce a flat "light sheet" 14.
  • the focusing optics comprises a cylindrical lens and a focusing lens stored in a chamber.
  • the sample volume 4 is imaged onto a detector 6.
  • the detection direction defined by the detection optics 5 is perpendicular to the direction of incidence of the excitation light.
  • FIG. 2 shows a first exemplary embodiment of the microscopy arrangement according to the invention.
  • excitation light is also generated by means of a light source 1, which may, for example, be a laser or a superluminescent diode.
  • the excitation light passes over a deflection unit 2, for example a scanner.
  • the scanner 2 serves to displace the excitation light horizontally or vertically.
  • a focusing optics 3 generates a line focus of the excitation light in a sample volume 4.
  • the interaction of the scanner 2 with the focusing optics 3, the line focus in the horizontal direction within the sample volume 4 can be displaced, as indicated by the arrow 12.
  • the line focus of the excitation light could also be displaced vertically to illuminate a section in another plane of the sample.
  • the scanner 2 and the focusing optics 3 are located on a common displacement table, on which they can be displaced in a direction 1 1, ie on the sample 4 to or from the sample 4. As a result of the displacement movement, the focus of the excitation light can be displaced along the direction of irradiation within the sample volume 4.
  • the sample area is imaged onto a flat detector 6 with a detection area 7.
  • the focal plane of the detection optic 5 determines which region of the sample is sharply imaged on the detector 6.
  • the detection optics 5 is optimized for imaging the signal radiation, for example the fluorescence from the sample.
  • a filter can be provided in the detection optics 5 or at the detector 6, which essentially allows only the signal radiation to pass through.
  • the detector 6 is a CCD or CMOS camera.
  • FIG. 3 shows the detector surface 7 of the detector 6. 8 denotes the focused course of the excitation light whose beam waist is imaged onto the detector surface 7 via the detection optics 5.
  • 9 denotes the edges of the focal range of the excitation light within the detector surface 7. At these two points 9, the area of the excitation light, starting from the beam waist, has increased by the factor root of 2.
  • the active surface 10 of the detector surface 7 used for reading can be limited.
  • the active area 10 is restricted to the hatched area of the detector area 7.
  • the active region 10 thus forms a strip which comprises the image of the focus of the excitation light 8.
  • the width of the active area can also be chosen smaller than the width of the beam waist. Signal radiation from the regions of the sample which are imaged on the detector surface 7 outside the active region 10 are not detected by the restriction to the active surface 10. In this way, background noise is suppressed and the resolution of the microscope assembly is significantly increased.
  • Another advantage is that each area of the detector surface 7 has only a minimum exposure time. points, so that the dark current of the detector 6 is significantly reduced by this short exposure time.
  • the limitation of the active area 10 of the detector 6 can be effected by 'this allows a so-called "rolling-shutter mode" at a CCD or CMOS Kammera.
  • a (not shown) control defines the active area 10 of the detector surface 7 ,
  • the focus 8 of the excitation light is displaced in the direction 12 by means of the deflection unit 2, the image of the focus area 8 also moves on the detector surface 7, in the direction 13.
  • the active surface 10 of the detector 6 is then also displaced to compensate for the displacement of the detector Focusing area of the excitation light to follow.
  • the focus of the excitation light 8 on the detector surface 7 also moves in the direction 11, d. H. along the direction of irradiation.
  • the active area may also be limited in the direction 11, for example to the focus area 9 of the excitation light 8. In this case, the active area 10 should be adapted to the displacement of the focus of excitation light in the direction 11.
  • FIG. 4 shows a second embodiment of the microscopy arrangement according to the invention.
  • the excitation light can here be irradiated from the opposite directions into the sample volume 4. This is advantageous, above all, for larger samples in order to avoid the scattering in the sample by means of the choice of the irradiation direction.
  • first angle range A the light from the scanner 2 falls on a first deflection mirror and thus passes via a transfer optics 15 from the left into the sample volume 4.
  • second angle range 2 the excitation light - starting from the scanner 2 - reaches a second deflection mirror, to be radiated from there by means of a transfer optics 15 from the right into the sample volume 4.
  • Positions of the scanner 2 result in order to shift the focus of the excitation light in the horizontal direction, ie in the direction 12, within the sample volume 4.
  • the scanner 2, the transfer optics 15 and the deflection mirror is located on a common shift table drawn by dashed lines, whose displacement in the direction 11 displaces the focus of the excitation light within the sample 4 along the direction of irradiation.
  • FIG. 5 shows a further exemplary embodiment of a microscopy arrangement according to the invention, in which the excitation light can likewise be irradiated from two directions into the sample volume 4.
  • a sliding mirror is provided. If it is located in the beam path of the excitation light, the excitation light arrives via a scanner 2 and the focusing optics 3 from the left into the sample volume 4. If the displaceable mirror is not in the beam path, the excitation light enters the sample volume 4 from the right. Dashed line is again a translation table represented, which carries the optical elements and can be moved in the direction 11. As a result of this movement, the focus of the excitation light is displaced within the sample volume 4 along the irradiation direction. It is also conceivable that the displaceable mirror is a dichroic mirror that is permanently located in the beam path. In this way, the sample volume 4 can be illuminated from one direction with a different wavelength than from the other direction.
  • inventive microscopy arrangement and the inventive microscopy method can be changed in many ways.
  • the focusing optics can also produce a narrow light sheet in order to prevent saturation effects due to an excessive intensity of the excitation radiation.
  • the active area of the detector should then be adjusted accordingly.
  • Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.
  • mSPIM selective plane illumination microscopy

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Mikroskopieanordnung mit einer Lichtquelle (1) zum Erzeugen von Anregungslicht, beispielsweise zur Fluoreszenz, und mit einer Fokussieroptik (3) zum Fokussieren des Anregungslichts unter einer Einstrahlrichtung in ein Probenvolumen (4). Die Anordnung umfasst ferner einen Scanner (2) zum gesteuerten Verlagern des Fokus des Anregungslichts senkrecht zur Einstrahlrichtung, und eine Detektionsoptik (5) zum Abbilden von Signalstrahlung unter einer Detektionsrichtung auf einen Detektor (6) mit einer Detektorfläche (7). Erfindungemäß ist der auzulesende, aktive Bereich (10) der Detektorfläche (7) beschränkbar auf denjenigen Bereich, auf den mittels der Detektionsoptik (5) der Fokusbereich des Anregungslichts abgebildet ist. Eine Steuerung ist dazu konfiguriert, den aktiven Bereich (10) der Detektorfläche (7) einzustellen und das Auslesen des aktiven Bereichs (10) der Detektorfläche (7) zeitlich zu synchronisieren mit dem Einstrahlen des Anregungslichts. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein entsprechendes Mikroskopieverfahren.

Description

Verfahren und Anordnung zur Mikroskopie
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Anordnung zur Mikroskopie gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 , sowie auf ein Mikroskopieverfahren.
Das Verfahren der Ultramikroskopie wurde bereits von Siedentopf, H. and Zsigmondy, R. (1902) beschrieben. Dabei wird eine Ebene des Objektes durch ein Lichtband angeleuchtet und das erzeugte Streulicht senkrecht zu dieser Ebene mittels eines Mikroskopes abgebildet. Ein Überblick über den Stand der Technik wird in dem Artikel:„Selective plane Illumination microscopy techniques in evelopmental biology" von Jan Huisken und Didier Y.R.Stainer , Development 136, 1963-1975 (2009) gegeben.
Neben dem Begriff Ultramikroskopie wird die Technik als Selective plane Illumination microscopy (SPIM) bezeichnet. Dieser Begriff wurde von Stelzer (Huisken et al., 2004) geprägt.
Die in der Veröffentlichung dargestellten Varianten der Ultramikroskopie sind dort im Einzelnen bezüglich ihrer Vor- und Nachteile beschrieben. Es handelt sich um OPFOS, HROPFOS, TLSM, SPIM, OCPI, Ultramicroscopy, DSLM, mSPIM, HILO, OPM. Fig. 1 zeigt solch eine herkömmliche Mikroskopieanordnung. In den meisten der Methoden wird aus einer Anregungslichtquelle 1 das Lichtband mittels einer Anregungsoptik 3 erzeugt, die als Zylinderoptik ausgelegt ist, mit der ein Lichtblatt im Objekt 4 in der Bildebene eines flächigen Detektors 6 erzeugt wird, so dass das Licht axial bezüglich der Achse der Detektionsoptik 5 an der Stelle der Linie auf wenige Mikrometer eingeschränkt ist. Innerhalb der Detektions- ebene weitet sich das Lichtband dann zu beiden Seiten auf. Um eine dreidimensionale Darstellung des Objektes zu gewinnen, wird dieses nach dem Stand der Technik relativ zum optischen System entlang der Detektionsachse bewegt, so dass dann Ebene für Ebene aufgezeichnet wird.
In dem Verfahren High-resolution orthogonal-plane fluorescence optical sectioning (HROPFOS, Buytaert and Dirckx, 2007) wird die Probe zusätzlich entlang der Anregungsachse bewegt und nur das Licht aufgezeichnet, welches in der Fokallinie erzeugt wird. Ein Nachteil ist, dass die Technik aufgrund der Notwendigkeit, die Probe zu bewegen und lange zu bestrahlen, die Probe stärker ausbleicht und langsam ist. Das Verfahren digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM, Keller et al., 2008) verwendet kein Lichtband, welches durch eine Zylinderoptik erzeugt ist. Es wird ein Scanner verwendet, welcher einen fokussierten Strahl, der in der Bildebene verläuft, parallel bewegt. Dadurch wird ein Lichtband geschrieben, dessen Breite durch die Scanneramplitude eingestellt werden kann. Ein solches Verfahren wird auch in der DE 10 2008 018 476 A1 , der DE 10 2005 027 077 A1 oder der DE 10 2007 045 897 A1 beschrieben. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass die eingestrahlte Intensität' an jeder Stelle gleich ist und keine weiteren Maßnamen zur Homogenisierung des Lichtbandes eingesetzt werden müssen. Ein Nachteil des Verfahrens ist es, dass die lokale Lichtleistung wesentlich höher ist und damit die Bildra- te durch Sättigungseffekte limitiert ist.
Weitere Verfahren zur Mikroskopie mit dünnen Lichtblättern werden in der US 2009/0174937 A1 oder der WO 2010/014244 A2 beschrieben.
Ein weiterer Stand der Technik ist in US 2006/0017001 A1 angegeben, die eine Abwandlung der konfokalen Mikroskopie darstellt. Das Verfahren verwendet einen Anregungsstrahl, der koaxial durch die Detektionsoptik eingestrahlt wird und eine Linie in der Probe anregt. Der Strahl wird senkrecht zur Probe mittels eines Scanners bewegt und regt so das gesamte Probenvolumen an. Hierin unterscheidet sich das Verfahren wesentlich von den oben genannten Verfahren, bei denen im Wesentlichen nur eine Ebene angeregt wird. Das Bild der Linie wird auf eine CMOS-Kamera abgebildet, die einen Rolling-Shutter-Betrieb aufweist, mit dem es möglich ist, nur einen schmalen Zeilenbereich auf dem Detektor auszulesen und diesen Bereich synchron zur Bewegung der Linie über den Detektor laufen zu lassen.
Eine wesentliche Limitierung der SPIM-Technik liegt in der mangelnden Eindringtiefe, die durch die Streuung und Absorption des Lichtes in der Probe hervorgerufen wird. Sowohl das Anregungslicht, als auch das Detektionslicht werden in der Probe gestreut. Dieses Problem nimmt zu, wenn größere Proben untersucht werden sollen. Streulicht verringert den Kontrast in den aufgenommenen Bildern und kann dazu führen, dass schwach leuchtende Detailstrukturen auf einem hohen Untergrund nicht mehr dargestellt werden können. Generell muss bei Aufnahmen mit hohem Streulichtuntergrund mit viel Licht gearbeitet werden, damit die Photonenstatistik so weit heruntergedrückt wird, dass die Strukturen, die von Interesse sind, auf dem Streulichtuntergrund sichtbar bleiben. Eine wesentliche Verbesserung konnte durch Voie erreicht werden, der die Proben vor der Messung optisch geklärt hat. Dodt et. AI (2007) hat gezeigt, dass mittels hochaperturiger Objektive in Kombination mit optischer Klärung (Clearing) 3D-Bilder zum Beispiel von ganzen Embryonen oder aus dem Gehirn mit sehr guter Auflösung gewonnen werden können. Nachteilig ist, dass das Verfahren nur auf totes Material angewendet werden kann.
Eine Möglichkeit zur Verbesserung des Kontrastes liegt darin, das Lichtband periodisch zu unterbrechen und damit eine streifenartige, strukturierte Beleuchtung der Probe zu erzeugen (Breuninger et al., 2007). Eine Ebene des Objektes wird dann nicht mehr mittels eines Bildes aufgenommen, sondern man detektiert eine Serie von Bildern, bei denen das Streifenmuster schrittweise verschoben wird. Dieses Verfahren ist nur dann sinnvoll, wenn die Fluoreszenzen ausreichend stark angeregt werden, da das finale Bild den Charakter eines Differenzsignales hat. Empfindliche Proben und schwache Signale bleichen dann während der Datenaufnahme, so dass kein korrektes Bild mehr errechnet werden kann. Nachteilig an diesem Verfahren ist weiterhin, dass immer noch große Teile des gesamten Bildes beleuchtet werden und somit ein hoher Untergrund entsteht, der zum Bildrauschen beiträgt.
Ein weiterer wesentlicher Nachteil des Verfahrens ist die Tatsache, dass ein Lichtband nur dann dünn wird, wenn die Apertur des anregenden Strahls groß ist. Damit ist aber die nutzbare Länge des Strahls beschränkt und die Auflösung senkrecht zum Lichtband von der Position im Bildfeld abhängig. Je weiter der betrachtete Punkt von der Fokuslinie des Lichban- des entfernt ist, desto geringer ist die Auflösung. Voie et. al. (1992) gibt den Zusammenhang zwischen nutzbarer Länge des Lichtbandes b und der Dicke d im Fokus mit der Formel b = n π d2/(2A) an, wobei λ die Wellenlänge des anregenden Lichtes und n der Brechungsindex des Mediums ist. Die Dicke des Lichtbandes beträgt im Fall einer beugungsbegrenzten Optik d = Af/π, wobei f die F-Zahl der Anregungsoptik ist. Je größer also das zu betrachtende Objekt ist, desto kleiner muss die Apertur des Lichtbandes gewählt werden, um d heraufzusetzen. Die Dicke der angeregten Schicht nimmt damit zu, so dass die erreichbare Auflösung abhängig von der Objektgröße wird.
Ein weiterer Nachteil ist durch die Probe gegeben. Falls sich in der Probe absorbierende Partikel oder Bereiche befinden, werfen djese einen Schatten, der in der Bildeben verläuft und somit als dunkler gerichteter Streifen im Bild sichtbar wird. Dieser ist insbesondere dann von Nachteil, wenn die Bilderserien (Bildstapel) zur dreidimensionalen Rekonstruktion verwendet werden sollen bzw. wenn Verfahren der Dekonvolution zur Auflösungsverbesserung herangezogen werden sollen. Die Schattenbildung ist dann besonders stark, wenn die Apertur des Beleuchtungslichtes gering ist, wie dies insbesondere der Fall ist, wenn grolle Proben untersucht werden. Bei großen Proben sind zudem schattenbildende Partikel wahrscheinlicher, da die zu detektierende Fläche größer ist.
Schattenbildung kann auf verschiedene Weise reduziert beziehungsweise vermieden werden. Ein Verfahren ist es, die Probe aus unterschiedlichen Richtungen zu beleuchten (Huisken, J. and Stainier, D. Y. R. 2007), so dass Schattenbildung und Unreinheiten der Probe ebenfalls in unterschiedliche Richtungen wirken. Offenbart ist dies auch in der DE 10 2007 015 063 A1. Wird die Einstrahlungsrichtung geändert, indem die Probe gedreht wird, können Serien von Aufnahmen mit unterschiedlicher Orientierung der Probe aufgenommen werden. Die Schwierigkeit besteht darin, unterschiedliche Aufnahmen korrekt miteinander zu verrechnen. Dies geschieht in der Regel im Fourierraum mit anschließender Rücktransfor- mation. Kreuzungspunkte verschiedener Schatten sind dabei schlecht zu behandeln.
Ein weiteres Verfahren besteht darin, die Beleuchtung aus verschiedenen Richtungen nur innerhalb der Beleuchtungsebene zu realisieren und dabei die Beleuchtungsachse um die Detektionsachse innerhalb eines Winkelintervalls zu drehen. Die Probe bleibt dabei gegenüber dem Detektionssystems unverändert, so dass dass das Fluoreszenzsignal über alle Drehwinkel auf der Kamera zeitlich integriert werden kann. Schatten, die von einzelnen Partikeln ausgehen, schwenken dann innerhalb des Beleuchtungswinkelintervalls und mittein sich weitgehend heraus. Es bleibt lediglich das Volumen des Partikels selber und ein Kernschattenbereich hinter dem Partikel stark betroffen. Die Bildqualität ist wesentlich gegenüber dem Verfahren verbessert, bei dem das beleuchtende Lichtband lediglich aus einer Richtung eingestrahlt wird. Die Drehung des Lichtbandes kann mittels eines Spiegelscanners, vornehmlich mittels eines Polygonscanners, realisiert werden, dessen Spiegel so in die Probe abgebildet wird, dass bei Drehung des Polygons eine Drehung des Lichtblattes um die optische Achse erzeugt wird. Das Problem der Erzeugung eines Lichtblattes bleibt optisch bestehen. Verfahren der Schattenentfernung und der Bildverbesserung mittels strukturierter Beleuchtung können nur schwer kombiniert werden, da die strukturierte Beleuchtung nur dann vernünftig funktioniert, wenn die aufgeprägte Struktur während der Belichtungszeit stabil ist und nicht durch ein Winkelscanverfahren im Kontrast verringert wird.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Anordnung anzugeben, die herkömmliche Mikroskopie hinsichtlich Auflösung und Effizienz noch einmal deutlich verbessern. Güns- tig wäre es zudem, wenn dabei auf einfache Weise die Schattenentfernung realisiert wird, eine effiziente Nutzung der zur Verfügung stehenden Lichtleistung erfolgt, ein variable Lichtblattbreite und/oder eine verbesserte kontrastreiche Auflösung erzielt wird, die an allen Stellen der Bildebene nahezu gleich ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Anordnung zur Mikroskopie mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , bzw. durch ein Mikroskopieverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 11. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Grundidee eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung ist, dass ein Beleuch- tungs- oder Anregungslichtstrahl in der Probenebene in einer oder in beiden Richtungen fo- kussiert wird. Dabei ist es vorteilhaft, wenn die Fokussierung telezentrisch ist. Bevor das Licht in die Probe fokussiert wird, wird der Strahl über einen Scanner abgelenkt, dessen Scanachse im Wesentlichen parallel zur Detektionsachse verläuft. Damit wird erreicht, dass sich der Laserstrahl parallel durch die Probenebene bewegten lässt. Führt der Scanner eine sägezahnförmige Scanbewegung aus, so beleuchtet der fokussierte Strahl sequentiell homogen einen Streifen. Die Summe aller Streifen setzt sich zu dem Lichtblatt zusammen, das im Stand der Technik eingesetzt wird. Die Amplitude der Scanbewegung ist vorteilhaft einstellbar, so dass die Breite des„Lichtblattes" eingestellt werden kann. Die in der Probenebene erzeugte Signalstrahlung, also z. B. Fluoreszenz, Zweite Harmonische (SHG), Dritte Harmonische (THG) oder Streulicht, wird mittels einer Detektionsoptik auf einen flächigen Detektor abgebildet, der einen Random-Access^Zugriff erlaubt, d. h. einen gezielten Zugriff auf ausgewählte Bereiche. Vorteilhafterweise wird als Detektor eine Kamera mit einem Rol- ling-Shutter-Betrieb verwendet, bei dem der aktive Bereich des Detektors auf einen Streifen aus ein oder mehreren Bildzeilen eingeschränkt werden kann und während einer Aufnahme kontinuierlich senkrecht zu den Bildzeilen bewegt werden kann. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Scanner und die Kamera so orientiert, dass die aktive Bildzeile oder die aktiven Bildzeilen (aktiver Detektorstreifen) im Wesentlichen parallel zu der momentanen auf den Detektor abgebildeten Fokuslinie verlaufen. Die Synchronisation des Scanners und der Kamera ist so gewählt, dass das Bild des von der Fokuslinie ausgelösten Lichtes zu jedem Zeitpunkt der Bildaufnahme auf dem Detektor im Wesentlichen koaxial zum aktiven Detektorstreifen liegt.
Die erfindungsgemaiie Mi roskopieanordnung verwendet also einen Detekor mit einer Detektorfläche, d.h. mit einer zweidimensionalen Anordnung von Detektor-Pixeln. Eine Steue- rung ist dazu vorgesehen, für jeden Pixel festzulegen, ob dieser Pixel ausgelesen werden soll oder nicht. Alle auszulesenden Pixel bilden zusammen den auszulesenden„aktiven Be- reich" der Detektorfläche. Die übrigen Pixel werden nicht ausgelesen, d.h. das an ihnen zur Verfügung stehende Signal wird vernachlässigt. Dies bietet den Vorteil, dass nur die tatsächlich interessierenden Signale berücksichtigt und verarbeitet werden, so dass der Rechenaufwand insgesamt verringert wird. Außerdem wird ein Hintergrundrauschen durch das Nicht-Berücksichtigen der inaktiven Fläche des Detektors unterdrückt und die Auflösung der Mikroskopieanordnung auf diese Weise erheblich gesteigert.
Günstig ist es, wenn die Form, die Länge und/oder die Breite des aktiven Detektorbereichs bzw. Detektorstreifens, das ist die Anzahl und Länge der aktiven Bildzeilen, variabel eingestellt werden kann. Damit ist es möglich, dass das Licht aus einem einstellbaren Bereich um die Strahltaille des anregenden Lichtstrahls vollständig gesammelt wird und das Licht aus den Bereichen des Bildes, die weiter entfernt von der Strahltaille des Anregungslichts angeregt wird, nicht oder nur zu geringen Teil erfasst wird.
In Kombination mit dieser Eigenschaft ist es von Vorteil, wenn die Strahltaille mit geeigneten optischen Maßnahmen entlang der Anregungsstrahlachse verschoben werden kann. Dies kann vorteilhaft erreicht werden, indem die Einheit aus Scanner und telezentrischer Fol us- sierung entlang der Strahlachse beweglich angeordnet wird und die Einkopplung des Lichtes in diese Einheit wiederum parallel zu der Anregungsstrahlachse in der Probe erfolgt. Damit bleibt die Synchronisation des Anregungsscanprozesses und dessen Bildes auf dem Detektor mit dem aktiven Detektorstreifen bei der Verschiebung der Scan- und Fokussiereinheit erhalten, so dass der durch die Detektionsoptik definierte scharfe Bereich entlang der Bildzeilen durch das Objekt bewegt werden kann. Vorteilhaft ist diese Bewegung auch durch eine Steuereinheit motorisiert ausführbar, so dass Bilderserien aufgenommen werden können, so dass jeder Punkt der Objektebene zumindest in einem Bild der Serie von dem Bereich, also in ausreichender Nähe von der Strahltaille, überstrichen wird. Es kann auch von Vorteil sein, wenn synchron mit der Einheit aus Scanner und telezentrischer Fokussieroptik auch der Behälter bewegt wird, in dem sich die Probe befindet. Damit kann der optische Weg, den der Anregungsstrahl im optisch dichtem Medium in der Probenkammer zurücklegt, konstant gehalten werden und damit auch die Strahlqualität. Dabei kann es vorteilhaft sein, wenn die Probe auf einer Halterung innerhalb des Behälters gehalten wird und nicht mit dem Behälter bewegt wird. Ein weiteres vorteilhaftes Merkmal des Verfahrens ist es, wenn aus der Bildserie mittels einer Auswerteeinheit ein Bild mit hohem Kontrast und weitgehend homogener Auflösung extrahiert wird. Dabei sind Verfahren möglich, die lokal die Information aus der Bildserie verwenden. Dabei können zu Beispiel die Bildpunkte aus der Serie verwendet werden, die lokal maximale Intensität bzw. maximalen Kontrast aufweisen. Beispielsweise kann festgelegt werden, das an jedem Ort das Bild aus den x% hellsten oder kontrastreichsten Bildern zusammengesetzt wird, wobei x variabel ist und z. B. 10, 15, 20 oder 25 betragen kann. Optional kann auch eine definierte Anzahl„n" von benachbarten Bildern in die Berechnung einbezogen werden. Die Tatsache, dass die mittels der Verschiebung aufgenommene Bildserie auf Grund der lokalen leichten Konvergenz bzw. Divergenz des Lichtes außerhalb der Strahltaille eine Serie lokal unterschiedlich ausgedehnter Anregungsprofile enthält, kann verwendet werden, um die mathematischen Methoden der weiteren Auflösungs- und Kontrasterhöhung anzuwenden. Die Bildserie stellt somit eine Art strukturierter Beleuchtung dar.
Ein weiterer Vorteil der Aufnahme einer Bildserie ist es, dass somit das finale Bild nachträglich bezüglich der Bildhelligkeit oder Auflösung optimiert werden kann, indem mehr oder weniger Bilder der Serie in die lokale Bildgeneration einbezogen werden.
Eine vorteilhafte Anordnung verwendet als Lichtquelle sichtbare kontinuierliche Laser unterschiedlicher Wellenlängen, die simultan oder sequentiell eingestrahlt werden. Des Weiteren kann ein Superkontinuumlaser verwendet werden, der mittels dielektrischer oder akustoopti- scher Filter auf einen oder mehrere Wellenlängenbereiche eingeschränkt wird. Des Weiteren kann auch ein Kurzpulslaser angewendet werden, der mittels Mehrphotonenanregung eine Linie innerhalb der Probe anregt oder innerhalb einer Linie SHG- oder THG-Licht erzeugt.
In der Detektionsoptik wird vorteilhaft ein Filtersystem angeordnet, so dass bei Fluoreszenz- detektion das Streulicht des Anregungslichtes geblockt wird und spezifische Fluorophore (bzw. SHG oder THG) bezüglich ihrer Detektionswellenlänge selektiert werden.
Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens verwendet zwei oder mehr (z. B. synchron zueinander laufende) Kameras, auf die das Fluoreszenzlicht spektral oder entsprechend seiner Polarisation aufgespalten gesammelt wird, so dass mehrere Farbstoffe oder Lichtsig- nale mittels ein oder mehrerer Anregungswellenlängen und ein oder mehrerer Detektionsfil- ter dargestellt werden können.
Eine weitere vorteilhafte Erweiterung der Anordnung besteht darin, dass mindestens eine weitere im Wesentlichen identische Scan- und Beleuchtungseinheit z. B. auf der gegenüberliegenden Seite der ersten Einheit angeordnet wird und entweder zeitgleich oder sequentiell verwendet wird. Die Kameras könnten auch unter einen Winkel von 90° zueinander angeordnet sein. Damit ist eine weitere Bildverbesserung insbesondere bei großen Proben möglich, bei denen die Strahltaille des Anregungslichtes beim Durchgang durch die Probe durch Brechung, Streuung und Absorption an Qualität verliert. Hier kann dann die Beleuchtung von der gegenüberliegenden Seite oder/und unter 90° vorteilhaft sein.
Die zusätzliche Beleuchtung von einer anderen Seite kann auch mittels eines Scanners realisiert werden, wobei das Anregungslicht nach dem Scanner mittels Optiken auf die verschiedenen Seiten des Probe gelenkt wird. Dazu sind eventuell Zwischenabbildungen vorteilhaft. Der Scanner kann auch innerhalb des maximalen Scanbereiches mehrere Intervalle ansteuern, die dann ohne zusätzliche bewegliche Teile auf verschiedene Seiten der Probe gelenkt werden. Dabei kann der Strahl innerhalb eines Intervalls (A) auf einen Spiegel treffen, der das Lichtband von einer Seite erzeugt, und innerhalb eines disjunkten Intervalls (B) auf einen anderen Spiegel fallen, der das Licht auf eine andere, vorzugsweise auf die gegenüberliegende Seite, umlenkt.
Eine weitere vorteilhafte Variante des Verfahrens ist es, dass zusätzlich und im Wesentlichen koaxial zum Anregungslaser eine zweiter Laser eingestrahlt wird, der als STED-Laser arbeitet und mit Hilfe dessen das Anregungsvolumen auf einen sehr kleinen Durchmesser reduziert werden kann, der dann auf den aktiven Streifen (10) abgebildet wird. STED steht für„stimulated emission depletion".
Für den Anregungslaser und auch für einen eventuell eingesetzten STED-Laser können Strahlen eingesetzt werden, die durch Phasenmasken oder polarisationsdrehende Masken speziell geformt sind. Damit können z.B. Besselstrahlen erzeugt werden, bei denen der Anregungsstrahldurchmesser auf einer langen Strecke nahezu konstant ist. Die Verwendung der mitlaufenden Schlitzblende des Rolling-Shutters schneidet dabei die Teile des Lichtes heraus, die außerhalb der Schärfeebene der Detektionsoptik erzeugt oder gestreut werden. Zum Fokussieren des Anregungslichts kann ein Axicon verwendet werden.
Im Falle des Einsatzes der STED-Technik ist es von Vorteil, wenn die Intensitätsverteilung des Anregungs- bzw. STED-Laserstrahls unterschiedliche Ordnungen von Besselfunktionen aufweisen, tangential polarisiert sind und/oder mit unterschiedlicher Divergenz eingestrahlt werden, damit trotz unterschiedlicher Wellenlängen der beiden Laser die Nebenmaxima weitgehend aufeinanderfallen und somit durch den STED-Laser die Anregung in den Nebenmaxima des Besselstrahls des Anregungslasers ausgelöscht wird.
Eine Eigenschaft moderner CMOS-Kameras ist es, dass mehrere, insbesondere zwei getrennte Streifen synchron (aber relativ zueinander versetzt) oder alternierend überlappend durch das Bild laufen können. Damit ist es möglich, die Strahlen von beiden Seiten zeitgleich aber auf der Kamera getrennt voneinander zu verwenden.
Die Kamera könnte auch so angesteuert werden, dass mehrere Bereiche gleichzeitig in dis- junkte Bilder ausgelesen und gespeichert werden. Dabei kann es von Vorteil sein, wenn ein Bereich koaxial mit dem Anregungslichtstrahl und zwei weitere Bereiche parallel angrenzend ausgelesen werden, so dass der Streulichtanteil damit direkt quantifiziert und zur Korrektur des Bildes verwendet werden kann.
Die Verwendung eines Spiegelscanners mit einem sägezahnartigen Verlauf kann optimiert werden, indem ein schneller Lichtschalter die Lichtquelle ausschaltet, wenn der Scanner zurückläuft. Dafür kann auch ein Chopperrad verwendet werden. Wird die Kamera so programmiert, dass der Rolling Shutter bidirektional über den Detektor bzw. Sensor läuft, so kann auf das Schalten der Lichtquelle verzichtet werden. Wird ein Polygonscanner verwendet, so läuft der fokussierte Strahl nur aus einer Richtung über die Detektionsfläche. Der Rolling Shutter kann dann unidirektional betrieben werden und es kann auf ein schnelles Schalten der Lichtquelle verzichtet werden.
Die Verfahren Highly inclined and laminated optical sheet (HILO) microscopy Tokunaga et al. (2008) und Oblique plane microscopy (OPM) Dunsby (2008) erzeugen das Lichtblatt durch die Anregungsoptik selber. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch mit diesen Methoden kombiniert werden, wenn die Anregungsoptik analog zur Lichtblattoptik in diesen Verfah- ren eingesetzt wird. Es muss allerdings eventuell von der Telezentrizität des Anregungslichtstrahls abgewichen werden, da die Vergrößerung in diesen Verfahren über das Bildfeld nicht konstant ist. Hier muss eventuell eine trapezförmige Verzerrung berücksichtigt und korrigiert werden.
Eine weitere Variante des Verfahrens kombiniert das Verfahren mit einer Stimulationspulslichtquelle, die für die lokale Stimulation vorteilhaft durch die Detektionsoptik oder aus einer anderen Richtung in die Probe eingestrahlt werden kann. Dabei wird die Stimulation zeitlich vorteilhaft so ausgeführt, dass der Detektionsstrahl sich in einer definierten Position relativ zum Stimulationsbereich befindet. Damit wird es möglich zu stimulieren, ohne dass die De- tektion gestört ist. Gleichzeitig ist es möglich, durch Variation des Zeitablaufs zwischen Stimulation und Scanner das präzise zeitliche Verhalten der Probe als Folge der Stimulation zu untersuchen. Methoden der Stimulation können mittels Scanner, Blitzlampen mit festen oder digitalen Masken, die mittels LCD- oder DLP-Elementen variabel gestaltet werden, durchgeführt werden.
Im Folgenden werden vorteilhafte Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand einer Zeichnung näher dargestellt. Im Einzelnen zeigen:
Figur 1 eine Mikroskopieanordnüng nach dem Stand der Technik,
Figur 2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung,
Figur 3 die Detektorfläche,
Figur 4 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung und
Figur 5 ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung. Gleiche Komponenten sind in den Figuren durchgängig mit gleichen Bezugszeichen versehen.
Figur 1 zeigt eine herkömmliche Mikrpskopieanordnung nach dem SPIM-Verfahren (SPIM: selective plane Illumination microscopy). Bei dieser herkömmlichen Mikroskopieanordnung erzeugt eine Lichtquelle 1 Anregungslicht, das eine Probe zur Abgabe von Signalstrahlung (beispielsweise Fluoreszenz, Phosphoreszenz, Zweite Harmonische, Dritte Harmonische oder Streulicht) anregt. Die Anregungsstrahlung wird mittels einer Fokussieroptik in das Probenvolumen 4 fokussiert, um dort ein möglichst flaches„Lichtblatt" 14 zu erzeugen. Beispielsweise umfasst die Fokussieroptik dazu eine Zylinderlinse und eine Fokussierlinse. Im Probenvolumen 4 befindet sich eine Probe, die dort beispielsweise mittels einer Halterung oder in einer Kammer gelagert ist.
Durch eine Detektionsoptik 5 wird das Probenvolumen 4 auf einen Detektor 6 abgebildet. Die durch die Detektionsoptik 5 definierte Detektionsrichtung steht dabei senkrecht auf der Einstrahlrichtung des Anregungslichts.
Figur 2 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung. Auch bei der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung wird Anregungslicht mittels einer Lichtquelle 1 erzeugt, bei der es sich beispielsweise um einen Laser oder um eine Superlumineszenzdiode handeln kann. Das Anregungslicht läuft über eine Ablenkungseinheit 2, beispielsweise einen Scanner. Der Scanner 2 dient dazu, das Anregungslicht horizontal oder vertikal zu verlagern.
Eine Fokussieroptik 3 erzeugt einen Linienfokus des Anregungslichts in einem Probenvolumen 4. Durch das Zusammenspiel des Scaners 2 mit der Fokussieroptik 3 kann der Linienfokus in horizontaler Richtung innerhalb des Probevolumens 4 verlagert werden, wie dies durch den Pfeil 12 angedeutet ist. Optional könnte der Liniefokus des Anregungslichts auch vertikal verlagert werden, um einen Ausschnitt in einer anderen Ebene der Probe zu beleuchten. Im dargestellten Ausführungsbeispiel befinden sich der Scanner 2 und die Fokussieroptik 3 auf einem gemeinsamen Verschiebetisch, auf dem sie in einer Richtung 1 1 verlagert werden können, d. h. auf die Probe 4 zu oder von der Probe 4 fort. Durch die Verschiebebewegung kann der Fokus des Anregungslichts entlang der Einstrahlrichtung innerhalb des Probenvolumens 4 verlagert werden.
Über eine Detektionsoptik 5 wird das Probegebiet auf einen flächigen Detektor 6 mit einer Detektionsfläche 7 abgebildet. Die Schärfebene der Detektionsoptk 5 bestimmt, welcher Bereich der Probe scharf auf den Detektor 6 abgebildet wird. Die Detektionsoptik 5 ist optimiert zum Abbilden der Signalstrahlung, beispielsweise also der Fluoreszenz aus der Probe. Um Hintergrundlicht zu unterdrücken, kann in der Detektionsoptik 5 oder am Detektor 6 ein Filter vorgesehen sein, der im Wesentlichen nur die Signalstrahlung passieren lässt.
Bei dem Detektor 6 handelt es ich um eine CCD- oder eine CMOS-Kamera. Figur 3 zeigt die Detektorfläche 7 des Detektors 6. Mit 8 ist der fokussierte Verlauf des Anregungslichts bezeichnet, dessen Strahltaille über die Detektionsoptik 5 auf die Detektorfläche 7 abgebildet wird. Mit 9 sind die Ränder des Schärfebereichs des Anregungslichts innerhalb der Detektorfläche 7 bezeichnet. An diesen beiden Stellen 9 hat sich die Fläche des Anregungslichts, ausgehend von der Strahltaille, um den Faktor Wurzel aus 2 vergrößert.
In der erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung ist die zum Auslesen verwendete, aktive Fläche 10 der Detektorfläche 7 beschränkbar. In Figur 3 ist die aktive Fläche 10 auf den schraffierten Bereich der Detektorfläche 7 beschränkt. Der aktive Bereich 10 bildet damit einen Streifen, der die Abbildung des Fokus des Anregungslichts 8 umfasst. Die Breite des aktiven Bereichs kann auch kleiner als Breite der Strahltaille gewählt werden. Signalstrahlung aus den Bereichen der Probe, die außerhalb des aktiven Bereichs 10 auf die Detektorfläche 7 abgebildet werden, werden durch die Beschränkung auf die aktive Fläche 10 nicht erfasst. Auf diese Weise wird ein Hintergrundrauschen unterdrückt und die Auflösung der Mikroskopieanordnung erheblich gesteigert. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass jeder Bereich der Detektorfläche 7 nur eine minimale Belichtungsdauer auf- weist, sodass der Dunkelstrom des Detektors 6 durch diese kurze Belichtungszeit erheblich reduziert wird.
Die Beschränkung der aktiven Fläche 10 des Detektors 6 kann bei einer CCD- oder CMOS-Kammera dadurch erfolgen, dass' diese einen sogenannten „Rolling-Shutter- Betrieb" ermöglicht. Eine (nicht dargestellte) Steuerung definiert dabei den aktiven Bereich 10 der Detektorfläche 7.
Wird der Fokus 8 des Anregungslichts mittels der Ablenkungseinheit 2 in Richtung 12 verlagert, verlagert sich auch die Abbildung des Fokusbereichs 8 auf der Detektorfläche 7, und zwar in Richtung 13. Die aktive Fläche 10 des Detektors 6 wird dann ebenfalls verlagert, um der Verlagerung des Fokusbereichs des Anregungslichts zu folgen.
Wird der Verschiebetisch mit dem Scanner 2 und der Fokussieroptik 3 in Richtung 11 verschoben, verlagert sich der Fokus des Anregungslichts 8 auf der Detektorfläche 7 ebenfalls in Richtung 11 , d. h. entlang der Einstrahlrichtung. Die aktive Fläche kann in Richtung 11 ebenfalls beschränkt sein, beispielsweise auf den Schärfebereich 9 des Anregungslichts 8. In diesem Fall sollte die aktive Fläche 10 an die Verlagerung des Foku- ses Anregungslichts in Richtung 11 angepasst werden.
Figur 4 zeigt ein zweites Ausführungsbeispie) der erfindungsgemäßen Mikroskopiean- ordnung. Im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel kann das Anregungslicht hier aus entgegensetzten Richtungen in das Probenvolumen 4 eingestrahlt werden. Dies ist vor allem bei größeren Proben vorteilhaft, um mittels der Wahl der Einstrahlungsrichtung die Streuung in der Probe zu vermeiden.
In einem ersten Winkelbereich A fällt das Licht vom Scanner 2 auf einen ersten Umlenkspiegel und gelangt auf diese Weise über eine Transferoptik 15 von links in das Probenvolumen 4. In einem zweiten Winkelbereich 2 gelangt das Anregungslicht - ausgehend vom Scanner 2 - auf einen zweiten Umlenkspiegel, um von dort mittels einer Transferoptik 15 von rechts in das Probenvolumen 4 eingestrahlt zu werden. Dargestellt sind jeweils drei unterschiedliche Pfade des Anregungslichts, die sich bei unterschiedlichen Winkel- Stellungen des Scanners 2 ergeben, um den Fokus des Anregungslichts in horizontaler Richtung, d. h. in Richtung 12, innerhalb des Probenvolumens 4 zu verlagern. Der Scanner 2, die Transferoptik 15 und die Umlenkspiegel befindet sich auf einem strichliert gezeichneten, gemeinsamen Verschiebetisch, dessen Verlagerung in Richtung 11 den Fokus des Anregungslichts innerhalb der Probe 4 entlang der Einstrahlrichtung verlagert.
Figur 5 zeigt ein weiters Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Mikroskopieanordnung, bei der das Anregungslicht ebenfalls aus zwei Richtungen in das Probenvolumen 4 eingestrahlt werden kann. In diesem Fall ist ein verschiebbarer Spiegel vorgesehen. Befindet er sich im Strahlengang des Anregungslichts, gelangt das Anregungslicht über einen Scanner 2 und die Fokussieroptik 3 von links in das Probenvolumen 4. Befindet sich der verschiebbare Spiegel nicht im Strahlengang, gelangt das Anregungslicht von rechts in das Probenvolumen 4. Strichliert ist wiederum ein Verschiebetisch dargestellt, der die optischen Elemente trägt und in Richtung 11 verschoben werden kann. Durch diese Bewegung wird der Fokus des Anregungslichts innerhalb des Probenvolumens 4 entlang der Einstrahlrichtung verlagert. Denkbar ist es auch, dass es sich bei dem verschiebbaren Spiegel um einen dichroitischen Spiegel handelt, der sich dauerhaft im Strahlengang befindet. Auf diese Weise kann das Probenvolumen 4 aus einer Richtung mit einer anderen Wellenlänge beleuchtet werden als aus der anderen Richtung.
Ausgehend von dem dargestellten Ausführungsbeispielen lassen sich die erfindungemä- ße Mikroskopieanordnung und das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren auf vielfache Weise verändern.
Beispielsweise kann statt des Rolling Shutters auch eine verfahrende, mechanische Schlitzblende verwendet werden.
Alternativ zum Erzeugen eines Linienfokus: kann die Fokussieroptik auch ein schmales Lichtblatt erzeugen, um Sättingungseffekten durch eine zu hohe Intensität der Anregungsstrahlung vorzubeugen. Die aktive Fläche des Detektors sollte dann entsprechend angepasst werden. Literatur
(1) Siedentopf, H. and Zsigmondy, R. (1902)
Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Ann. Phys. 10, 1-39
(2) Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J. and Stelzer, E. H. K. (2004) Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane Illumination micros- copy. Science 305, 1007-1009
(3) Huisken und Didier Y.R.Stainer (2009)
Selective plane Illumination microscopy techniques in evelopmental biology. Development 136, 1963-1975 (2009)
(4) Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J. and Stelzer, E. H. K. (2008) Recon- struction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science 322, 1065-1069
(5) Buytaert, J. A. N. and Dirckx, J. J. J. (2007)
Design and quantitative resolution measurements of an optical Virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two- micrometer slicing resolution. J. Biomed. Opt. 12, 014039.
(6) A. H. Voie, D. H. Brund and F. A. Spelman (1992)
Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.
(7) Dodt, H. U., Leischner, U., Schierloh, A., Jährling, N., Mauch, C, Deininger.K., Deussing, J. M., Eder, M., Zieglgänsberger, W. and Becker, K. (2007)
Ultramicroscopy: three-dimensional visualizatidn of neuronal networks in thewhole mouse brain. Nat. Methods 4, 331-336
(8) Breuninger, T.( Greger, K. and Stelzer, E. H. K. (2007)
Lateral modulation boosts image quality in Single plane Illumination fluorescence microscopy. Opt. Lett. 32, 1938-1940
(9) Huisken, J. and Stainier, D. Y. R. (2007)
Even fluorescence excitation by multidirectional
selective plane Illumination microscopy (mSPIM). Opt. Lett. 32, 2608- 2610 (10) Tokunaga, M.( Imamoto, N. and Sakata-Sogawa, K. (2008)
Highly inclined thin Illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat. Methods 5, 159-161
(11) Dunsby, C. (2008)
Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Opt. Express 16, 20306- 20316
(12) Wolleschensky, R. (2008)
Arrangement for microscopic Observation and/or
detection in a light scanning microscope with line scanning and use.
US Patent Appl. US 20080030850.

Claims

Patentansprüche
Mikroskopieanordnung mit
- einer Lichtquelle (1) zum Erzeugen von Anregungslicht,
- einer Fokussieroptik (3) zum Fokussieren des Anregungslichts unter einer Einstrahlrichtung in ein Probenvolumen (4),
- einem Scanner (2) zum gesteuerten seitlichen Verlagern des Fokus des Anregungslichts,
- einer Detektionsoptik (5) zum Abbilden von Signalstrahlung aus den Probenvolumen unter einer Detektionsrichtung auf einen Detektor (6) mit einer Detektorfläche (7), wobei die durch die optische Achse der Detektionsoptik (5) definierte Detektionsrichtung einen Winkel von 60° bis 120°, insbesondere 90°, mit der Einstrahlrichtung einschließt,
dadurch gekennzeichnet,
dass der auszulesende, aktive Bereich (10) der Detektorfläche (7) beschränkbar ist auf denjenigen Bereich der Detektorfläche (7), auf den mittels der Detektionsoptik (5) der Fokusbereich des Anregungslichts abgebildet ist,
und dass eine Steuerung dazu konfiguriert ist, den aktiven Bereich (10) der Detektorfläche (7) anzupassen an eine Verlagerung des Fokusbereichs des Anregungslichts durch den Scanner, und das Auslesen des aktiven Bereichs (10) der Detektorfläche (7) zeitlich zu synchronisieren mit dem Einstrahlen des Anregungslichts in das Probenvolumen (4).
Mikroskopieanordnung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mechanische, optische und/oder elektronische Mittel vorgesehen sind zum Beschränken des aktiven Bereichs (10) der Detektorfläche (7).
Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Form, Länge und/oder Breite des aktiven Bereichs (10) der Detektorfläche (7) einstellbar sind.
4. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Bereich (10) der Detektorfläche (7) weniger als 25%, vorzugsweise maximal 10%, der gesamten Detektorfläche (7) beträgt.
5. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Licht mittels der Fokussieroptik (3) eine im Wesentlichen linienförmige Beleuchtung der Probe erzeugt, die in der Schärfeebene der Detekti- onsoptik (5) liegt und in dieser Ebene bewegbar ist.
6. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokussieroptik (3) relativ zum Probenvolumen (4) bewegbar ist, um den Fokus des Anregungslichts innerhalb des Probenvolumens (4) entlang der Einstrahlrichtung zu verlagern.
7. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (1) ein Laser, eine Superlumineszenzdiode oder ein Superkontinuumlaser ist.
8. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der flächige Detektor (6) eine CCD- oder CMOS-Kamera ist.
9. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Beschränkung des aktiven Bereich (1 ) der Detektorfläche (7) auf dem Detektor dieser eine Rolling-Shutter-Betriebsart aufweist, wobei der aktive Bereich mit der Scanbewegung des Anregungslichtes synchronisiert ist.
10. Mikroskopieanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (5) einen Filter aufweist.
11. Verfahren zur Mikroskopie mit folgenden Schritten:
- Fokussieren von Anregungslicht unter einer Einstrahlrichtung in ein Probenvolumen (4),
- Abbilden eines Probengebietes aus dem Probenvolumen (4) mittels einer Detek- tionsoptik (5) auf einen flächigen Detektor (6), wobei die durch die Detektionsoptik (5) definierte Detektionsrichtung einen Winkel von 60° bis 120°, insbesondere 90°, mit der Einstrahlrichtung einschließt,
- Beschränken der aktiven Fläche (10) des Detektors (6) mittels mechanischer, optischer oder elektronischer Mittel auf einen Auslesebereich, der die Abbildung des Fokus des Anregungslichts umfasst,
- Verlagern des Fokus des Anregungslichts innerhalb des Probenvolumens (4) senkrecht zu und/oder entlang der Einstrahlrichtung,
- Anpassen der aktiven Fläche (10) des Detektors an die Verlagerung des Fokus des Anregungslichts, so dass die verlagerte aktive Fläche (10) des Detektors (6) erneut die Abbildung des Fokus des Anregungslichts umfasst.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht zu einem Linienfokus innerhalb des Probenvolumens (4) fokussiert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in der Probe Streulicht, Fluoreszenz, Phosphoreszenz, SHG und/oder THG auslöst, die als Signalstrahlung auf dem Detektor gemessen wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Anregungslicht in einem ersten Zeitintervall (A) in einer ersten Einstrahlrichtung und in einem zweiten Zeitintervall (B) in einer zweiten Einstrahlrichtung in das Probenvolumen (4) eingestrahlt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass Form, Länge und/oder Breite des aktiven Bereichs (10) der Detektorfläche (7) eingestellt werden.
PCT/EP2011/001220 2010-03-29 2011-03-11 Verfahren und anordnung zur mikroskopie WO2011120629A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102010013223.3 2010-03-29
DE102010013223.3A DE102010013223B4 (de) 2010-03-29 2010-03-29 Verfahren und Anordnung zur Mikroskopie

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011120629A1 true WO2011120629A1 (de) 2011-10-06

Family

ID=44144730

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2011/001220 WO2011120629A1 (de) 2010-03-29 2011-03-11 Verfahren und anordnung zur mikroskopie

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102010013223B4 (de)
WO (1) WO2011120629A1 (de)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015064582A (ja) * 2014-10-24 2015-04-09 浜松ホトニクス株式会社 画像取得装置及び撮像装置
CN104584533A (zh) * 2013-02-01 2015-04-29 浜松光子学株式会社 图像取得装置以及摄像装置
CN104677871A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 中国科学院自动化研究所 多光子激发光片照明显微成像系统
JP2016090768A (ja) * 2014-11-04 2016-05-23 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法
JP2016090767A (ja) * 2014-11-04 2016-05-23 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法
EP3088933A1 (de) 2015-05-01 2016-11-02 Olympus Corporation Mikroskop und mikroskopbilderfassungsverfahren
US10007100B2 (en) 2014-11-04 2018-06-26 Olympus Corporation Light sheet illumination microscope and light sheet illumination method
CN108227233A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 清华大学 基于光片结构光的显微层析超分辨率成像方法及系统
US10181190B2 (en) 2014-11-04 2019-01-15 Olympus Corporation Microscope and microscope image acquisition method
US10459210B2 (en) 2014-04-08 2019-10-29 European Molecular Biology Laboratory Optical arrangement and method for imaging a sample
US10567681B2 (en) 2015-06-17 2020-02-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Multi-line detection method
US10684457B2 (en) 2017-03-30 2020-06-16 Olympus Corporation Microscope apparatus
CN113805220A (zh) * 2021-09-28 2021-12-17 复旦大学 一种基于光度立体的固体核径迹三维测量系统
WO2023103960A1 (zh) * 2021-12-10 2023-06-15 中国科学院深圳先进技术研究院 一种三维成像装置和成像方法

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102013021222B4 (de) * 2013-12-17 2023-05-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Mikroskop und Mikroskopieverfahren
US20150198794A1 (en) 2014-01-14 2015-07-16 Applied Scientific Instrumentation, Inc. Light sheet generator
DE102015109430B3 (de) * 2015-06-12 2016-08-04 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Optische Messvorrichtung und optisches Messverfahren
US10866396B2 (en) 2015-08-24 2020-12-15 Leica Microsystems Cms Gmbh Illumination arrangement for a light sheet microscope
LU92807B1 (de) * 2015-08-27 2017-03-01 Leica Microsystems Beleuchtungsanordnung für ein Lichtblatt-Mikroskop
DE102016105798A1 (de) * 2016-03-30 2017-10-05 Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts, Universitätsmedizin Verfahren zum Erzeugen eines Mikroskopbildes
LU93225B1 (de) 2016-09-16 2018-03-19 Leica Microsystems Verfahren zur Erzeugung von Vorschaubildern mit einem Schiefeebenenmikroskop sowie Schiefeebenemikroskop und Bilderzeugungsvorrichtung für ein Schiefeebenemikroskop
DE102017121483B3 (de) 2017-09-15 2019-03-07 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe, Steuereinheit hierfür und Mikroskop-Anordnung
EP3614190A1 (de) * 2018-08-20 2020-02-26 Till GmbH Mikroskopvorrichtung mit virtuellem objektiv
DE102018220779A1 (de) * 2018-12-03 2020-06-04 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Nachweisverfahren von induzierten Lichtsignalen in einer dreidimensionalen Region einer Probe
US20200408691A1 (en) * 2019-06-27 2020-12-31 Nikita Vladimirov Multi-view light-sheet microscope with an optical arm combiner
DE102022117270B3 (de) 2022-07-12 2023-10-26 Leica Microsystems Cms Gmbh Abbildungsvorrichtung mit einem Kameraadapter, Verfahren und Computerprogrammprodukt

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060017001A1 (en) 2004-07-23 2006-01-26 Paul Donders Method and apparatus for fluorescent confocal microscopy
DE102005027077A1 (de) 2004-11-04 2006-05-11 Leica Microsystems Cms Gmbh Lichtscheibenmikroskop
US20070109633A1 (en) * 2002-12-09 2007-05-17 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie (Embl) Single plane illumination microscope
US20080030850A1 (en) 2004-07-16 2008-02-07 Carl Zeiss Jena Gmbh Arrangement for microscopic observation and/or detection in a light scanning microscope with line scanning and use
DE102007015063A1 (de) 2007-03-29 2008-10-02 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Optische Anordnung zum Erzeugen eines Lichtblattes
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
US20090174937A1 (en) 2006-04-20 2009-07-09 Washington University In St. Louis Objective-coupled selective plane illumination microscopy
DE102008018476A1 (de) 2008-04-11 2009-10-15 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Mikroskopievorrichtung
WO2010014244A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 The Regents Of The University Of California, San Francisco Multidirectional selective plane illumination microscopy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7772569B2 (en) * 2008-04-01 2010-08-10 The Jackson Laboratory 3D biplane microscopy

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070109633A1 (en) * 2002-12-09 2007-05-17 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie (Embl) Single plane illumination microscope
US20080030850A1 (en) 2004-07-16 2008-02-07 Carl Zeiss Jena Gmbh Arrangement for microscopic observation and/or detection in a light scanning microscope with line scanning and use
US20060017001A1 (en) 2004-07-23 2006-01-26 Paul Donders Method and apparatus for fluorescent confocal microscopy
DE102005027077A1 (de) 2004-11-04 2006-05-11 Leica Microsystems Cms Gmbh Lichtscheibenmikroskop
US20090174937A1 (en) 2006-04-20 2009-07-09 Washington University In St. Louis Objective-coupled selective plane illumination microscopy
DE102007015063A1 (de) 2007-03-29 2008-10-02 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Optische Anordnung zum Erzeugen eines Lichtblattes
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
DE102008018476A1 (de) 2008-04-11 2009-10-15 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Mikroskopievorrichtung
WO2010014244A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 The Regents Of The University Of California, San Francisco Multidirectional selective plane illumination microscopy

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. H. VOIE; D. H. BRUND; F. A. SPELMAN, ORTHOGONAL-PLANE FLUORESCENCE OPTICAL SECTIONING: THREE-DIMENSIONAL IMAGING OF MACROSCOPIC BIOLOGICAL SPECIMENS, 1992
BREUNINGER, T.; GREGER, K.; STELZER, E. H. K.: "Lateral modulation boosts image quality in single plane illumination fluorescence microscopy", OPT. LETT., vol. 32, 2007, pages 1938 - 1940, XP002529108, DOI: doi:10.1364/OL.32.001938
BUYTAERT, J. A. N.; DIRCKX, J. J. J.: "Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring twomicrometer slicing resolution", J. BIOMED. OPT., vol. 12, 2007, pages 014039
DODT, H. U.; LEISCHNER, U.; SCHIERLOH, A.; JÄHRLING, N.; MAUCH, C.; DEININGER,K.; DEUSSING, J. M.; EDER, M.; ZIEGLGÄNSBERGER, W.: "Ultramicroscopy: three-dimensional. visualization of neuronal networks in thewhole mouse brain", NAT. METHODS, vol. 4, 2007, pages 331 - 336
DUNSBY, C.: "Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy", OPT. EXPRESS, vol. 16, 2008, pages 20306 - 20316
HUISKEN J ET AL: "Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM)", OPTICS LETTERS, OSA, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, WASHINGTON, DC, US, vol. 32, no. 17, 1 September 2007 (2007-09-01), pages 2608 - 2610, XP002508397, ISSN: 0146-9592, [retrieved on 20070827], DOI: DOI:10.1364/OL.32.002608 *
HUISKEN, J.; STAINIER, D. Y. R.: "Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM)", OPT. LETT., vol. 32, 2007, pages 2608 - 2610, XP001507615, DOI: doi:10.1364/OL.32.002608
HUISKEN, J.; SWOGER, J.; DEL BENE, F.; WITTBRODT, J.; STELZER, E. H. K.: "Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy", SCIENCE, vol. 305, 2004, pages 1007 - 1009, XP002659026, DOI: doi:10.1126/science.1100035
HUISKEN; DIDIER Y.R.STAINER: "Selective plane illumination microscopy techniques in evelopmental biology", DEVELOPMENT, vol. 136, 2009, pages 1963 - 1975, XP055006180, DOI: doi:10.1242/dev.022426
JAN HUISKEN; DIDIER Y.R.STAINER: "Selective plane illumination microscopy techniques in evelopmental biology", DEVELOPMENT, vol. 136, 2009, pages 1963 - 1975, XP055006180, DOI: doi:10.1242/dev.022426
KELLER, P. J.; SCHMIDT, A. D.; WITTBRODT, J.; STELZER, E. H. K.: "Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy", SCIENCE, vol. 322, 2008, pages 1065 - 1069, XP002607760, DOI: doi:10.1126/science.1162493
SIEDENTOPF, H.; ZSIGMONDY, R.: "Über Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser", ANN. PHYS., vol. 10, 1902, pages 1 - 39
TOKUNAGA, M.; IMAMOTO, N.; SAKATA-SOGAWA, K.: "Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells", NAT. METHODS, vol. 5, 2008, pages 159 - 161

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104584533B (zh) * 2013-02-01 2018-03-13 浜松光子学株式会社 图像取得装置以及摄像装置
CN104584533A (zh) * 2013-02-01 2015-04-29 浜松光子学株式会社 图像取得装置以及摄像装置
US10602087B2 (en) 2013-02-01 2020-03-24 Hamamatsu Photonics K.K Image acquisition device, and imaging device
US10362245B2 (en) 2013-02-01 2019-07-23 Hamamatsu Photonics K.K. Imaging device that performs rolling readout of pixel rows to acquire an image of an object
US10142566B2 (en) 2013-02-01 2018-11-27 Hamamatsu Photonics K.K. Rolling readout type camera and imaging method for using the same
DE112014000195B4 (de) * 2013-02-01 2016-07-28 Hamamatsu Photonics K.K. Bilderfassungsvorrichtung und Bildgebungsvorrichtung
US9423601B2 (en) 2013-02-01 2016-08-23 Hamamatsu Photonics K.K. Image acquisition device, and imaging device that scans an object with illumination light to acquire an image of the object
US10459210B2 (en) 2014-04-08 2019-10-29 European Molecular Biology Laboratory Optical arrangement and method for imaging a sample
US11237374B2 (en) 2014-04-08 2022-02-01 European Molecular Biology Laboratory Optical arrangement and method for imaging a sample
JP2015064582A (ja) * 2014-10-24 2015-04-09 浜松ホトニクス株式会社 画像取得装置及び撮像装置
US10007100B2 (en) 2014-11-04 2018-06-26 Olympus Corporation Light sheet illumination microscope and light sheet illumination method
JP2016090767A (ja) * 2014-11-04 2016-05-23 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法
US10181190B2 (en) 2014-11-04 2019-01-15 Olympus Corporation Microscope and microscope image acquisition method
JP2016090768A (ja) * 2014-11-04 2016-05-23 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法
CN104677871A (zh) * 2015-02-27 2015-06-03 中国科学院自动化研究所 多光子激发光片照明显微成像系统
US10054781B2 (en) 2015-05-01 2018-08-21 Olympus Corporation Microscope, sheet-illumination microscope, and microscope-image acquiring method
EP3088933A1 (de) 2015-05-01 2016-11-02 Olympus Corporation Mikroskop und mikroskopbilderfassungsverfahren
US10567681B2 (en) 2015-06-17 2020-02-18 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Multi-line detection method
US10684457B2 (en) 2017-03-30 2020-06-16 Olympus Corporation Microscope apparatus
CN108227233B (zh) * 2017-12-27 2020-02-21 清华大学 基于光片结构光的显微层析超分辨率成像方法及系统
CN108227233A (zh) * 2017-12-27 2018-06-29 清华大学 基于光片结构光的显微层析超分辨率成像方法及系统
CN113805220A (zh) * 2021-09-28 2021-12-17 复旦大学 一种基于光度立体的固体核径迹三维测量系统
WO2023103960A1 (zh) * 2021-12-10 2023-06-15 中国科学院深圳先进技术研究院 一种三维成像装置和成像方法

Also Published As

Publication number Publication date
DE102010013223A1 (de) 2011-09-29
DE102010013223B4 (de) 2016-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102010013223B4 (de) Verfahren und Anordnung zur Mikroskopie
DE102011000835B4 (de) Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
EP2195697B1 (de) Verfahren zur untersuchung einer probe
EP2641078B1 (de) Tiefenauflösungsgesteigerte mikroskopie
EP2350726B1 (de) Kombinationsmikroskopie
EP2444833B1 (de) SPIM-Mikroskop mit sequenziellem Lightsheet
DE102011051042B4 (de) Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes
EP2480923B1 (de) Mikroskop
DE102008009216A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zum räumlich hochauflösenden Abbilden einer Struktur einer Probe
DE102009044983A1 (de) Mikroskop
DE102009044986A1 (de) Mikroskop
DE102013022538B3 (de) Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes und Mikroskopievorrichtung
DE102009043747A1 (de) Verfahren zur Erzeugung eines Mikroskopbildes und Mikroskop
EP3283917B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer probe
LU92925B1 (de) Verfahren zum Untersuchen einer Probe mittels Lichtblatt-Mikroskopie und Lichtblatt-Mikroskop
DE102007047468A1 (de) Verfahren und Anordnung zur optischen Erfassung einer beleuchteten Probe
EP3482247B1 (de) Verfahren zum untersuchen einer probe sowie vorrichtung zum ausführen eines solchen verfahrens
DE102021123130A1 (de) Vorrichtung und verfahren zur lichtfeldmikroskopie

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11708409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11708409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1