JP6419532B2

JP6419532B2 - 顕微鏡および顕微鏡画像取得方法

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Publication number: JP6419532B2
Application number: JP2014224088A
Authority: JP
Inventors: 剛劉
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2014-11-04
Filing date: 2014-11-04
Publication date: 2018-11-07
Anticipated expiration: 2034-11-04
Also published as: JP2016090768A

Description

本発明は、顕微鏡および顕微鏡画像取得方法に関するものである。

従来、標本からの蛍光を検出する検出光学系の光軸に対して直交する平面に沿って、標本を挟んで対向する２方向から異なる波長の平面状の励起光を同時に標本に入射させるシート照明方式の顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。落射照明方式あるいは透過照明方式においては、共焦点光学系により１点または複数点に集光させた励起光を２次元的に走査することにより、光軸方向のボケ像の少ない２次元的な画像を取得するが、シート照明方式によれば、一度に広い範囲に照明でき、検出光学系の光軸方向の焦点面内で、照明光の焦点のあった範囲のみが照明されるため、画像の取得に要する時間を短縮することができる。

また、特許文献１の顕微鏡は、異なる波長の励起光を対向する方向から同時に同一の標本の同一の領域に入射させるものであり、各励起光に対応して発生する蛍光の波長も異なるので、同一の検出光学系によって一度に撮影し、かつ、波長ごとに蛍光画像を分離することができる。

国際公開第２０１１／１２０６２９号

しかしながら、対向する方向から同一の標本の近接または重複する領域に同時に照射して蛍光観察を行う場合には、一方の光路から入射された励起光の焦点深度の範囲内に、他方の光路から入射された励起光の焦点深度の範囲外に配される励起光が照射されるため、取得される蛍光画像が不鮮明になるという不都合がある。また、別の光路からの励起光が同時に入射しないように、切り替えて照明する場合には、光路の切替に時間がかかるため画像取得に長時間を有するという不都合があった。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、鮮明な蛍光画像を取得するために、異なる方向から同一波長または重複する波長の励起光を同一の標本の近接または重複する領域に、切り替えて照射しても画像の取得時間を高速にすることができるシート照明方式の顕微鏡および顕微鏡画像取得方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、該検出光学系の光軸に交差する平面に沿って、平面状の励起光を、前記標本の外部の異なる２以上の方向から、入射方向を択一的に切り替えて順次入射させるシート照明光学系と、入射方向が異なる前記励起光の入射時に前記検出光学系により取得された複数の蛍光画像を合成する画像処理部とを備え、前記シート照明光学系が、前記標本を前記検出光学系の光軸方向に移動させる移動機構を備え、前記画像処理部による合成処理の前後において同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替えるとともに、前記移動機構による前記標本の移動の前後において同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替える顕微鏡である。

本態様によれば、シート照明光学系により平面状の励起光が標本の外部から検出光学系の光軸に交差する平面に沿って入射されるので、その入射平面に検出光学系の焦点面を一致させることにより、焦点面に沿う広い範囲において発生した蛍光を検出光学系によって一度に検出することができる。この場合に、標本の外部の異なる２以上の方向から励起光を入射させることにより、各方向からの励起光の標本への入射深度を浅くすることができ、標本における散乱の影響を抑制して鮮明な蛍光画像を取得することができる。

異なる２以上の方向からの励起光を択一的に切り替えて順次入射させることにより、同一波長または重複する波長の励起光を同一の標本の近接または重複する領域に照射しても、複数方向からの励起光が混在することが無く、各励起光の焦点深度の範囲において鮮明な蛍光画像を取得することができる。画像処理部において、取得された複数の蛍光画像を合成することにより標本の広範囲にわたる蛍光観察を行うことができる。

そして、励起光の入射方向を順次切り替えて取得された１組の蛍光画像を画像処理部において合成した後、励起光の入射方向を前回最後の画像取得時と同一の入射方向から入射させる順序で順次切り替えて次の１組の蛍光画像を取得し合成画像に合成することにより、励起光の入射方向の切替回数を少なくし、高速に蛍光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記標本を前記検出光学系の光軸方向に移動させる移動機構を備え、該移動機構による前記標本の移動の前後において同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替える。
このようにすることで、移動機構の作動により、標本を検出光学系の光軸方向に移動させて、異なる位置で２次元的な蛍光画像を取得することにより、標本の３次元的な蛍光観察を行うことができる。この場合に、移動機構により標本を移動する前後において励起光の入射方向を変化させないことにより、励起光の入射方向の切替回数を低減して切替に要する時間を節約し、蛍光画像の取得に要する時間を短縮することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記励起光の波長を切替可能に設けられ、該励起光の波長の切替前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替えてもよい。
このようにすることで、シート照明光学系により励起光の波長を切り替えて、異なる波長の蛍光観察を行うことができる。この場合に、波長ごとに複数の入射方向から励起光を入射させて蛍光画像の取得を行うが、波長の切替前後において励起光の入射方向を変化させないことにより、励起光の入射方向の切替回数を低減して切替に要する時間を節約し、蛍光画像の取得に要する時間を短縮することができる。

また、上記態様においては、前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸を挟んで両側から、前記励起光を入射可能であってもよい。
このようにすることで、励起光は標本の半分の深さまで進達させれば済み、２方向からの励起光の入射によって、より効率的に、広範囲にわたる標本の鮮明な合成画像を取得することができる。

また、本発明の他の態様は、標本を通過する同一平面に沿う異なる複数の方向からいずれかの方向を択一的に選択する選択ステップと、該選択ステップにおいて選択された方向に沿って、該方向毎に異なる焦点位置を有する平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、該入射ステップによって前記励起光が入射されたときに、前記標本において発生する蛍光を前記平面に交差する検出方向において検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、前記選択ステップにより選択される方向を順次切り替えて、前記入射ステップおよび前記検出ステップを繰り返すことにより取得された複数の蛍光画像を合成する合成ステップと、前記選択ステップ、前記入射ステップ、前記検出ステップおよび前記合成ステップの後に前記標本を前記検出方向に移動させる移動ステップとを含み、該移動ステップの後に、前記選択ステップ、前記入射ステップ、前記検出ステップおよび前記合成ステップが繰り返され、連続する前記合成ステップによりそれぞれ合成される複数の蛍光画像を取得する際に前記選択ステップにより選択される方向が、各前記合成ステップの前後において同一の方向から前記励起光を入射させる順序で切り替えられ、前記選択ステップが、前記移動ステップによる前記標本の移動の前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で前記励起光の入射方向を選択する顕微鏡画像取得方法を提供する。

本態様によれば、選択ステップにおいて選択された一の方向から、入射ステップにおいて平面状の励起光が標本を通過する平面に沿って標本に入射され、該入射平面において発生した蛍光が、検出ステップにおいて励起光の入射平面に交差する検出方向から検出されて蛍光画像が取得される。選択ステップにより入射方向を順次切り替えて、入射ステップおよび検出ステップを繰り返すことにより、標本の異なる領域において合焦した複数の蛍光画像を取得することができる。そして、励起光の入射方向を順次切り替えて取得された１組の蛍光画像を画像処理部において合成した後、励起光の入射方向を前回最後の画像取得時と同一の入射方向から入射させる順序で順次切り替えて次の１組の蛍光画像を取得し合成画像に合成することにより、励起光の入射方向の切替回数を少なくし、高速に蛍光画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記標本を前記検出方向に移動させる移動ステップを含み、前記選択ステップが、前記移動ステップによる前記標本の移動の前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で前記励起光の入射方向を選択する。
このようにすることで、標本を検出方向に移動させて、異なる位置で２次元的な蛍光画像を取得することにより、標本の３次元的な蛍光観察を行うことができる。この場合に、選択ステップが、標本を移動する前後において励起光の入射方向を変化させないことにより、励起光の入射方向の切替回数を低減して切替に要する時間を節約し、蛍光画像の取得に要する時間を短縮することができる。

また、上記態様においては、前記励起光の波長を切り替える波長切替ステップを含み、前記選択ステップが、前記波長切替ステップによる前記波長の切替前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で前記励起光の入射方向を選択してもよい。
このようにすることで、波長切替ステップにより、励起光の波長を切り替えて、異なる波長の蛍光観察を行うことができる。この場合に、波長ごとに複数の入射方向から励起光を入射させて蛍光画像の取得を行うが、波長の切替前後において励起光の入射方向を変化させないことにより、励起光の入射方向の切替回数を低減して切替に要する時間を節約し、蛍光画像の取得に要する時間を短縮することができる。

本発明によれば、異なる方向から同一波長または重複する波長の励起光を同一の標本の近接または重複する領域に照射して鮮明な蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の参考実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。図１の顕微鏡の光源装置からの励起光を標本に対して（ａ）一方向、（ｂ）他方向から入射させる場合をそれぞれ示す側面図である。（ａ）図２（ａ）、（ｂ）図２（ｂ）の励起光の光路における標本に対する焦点深度の範囲をそれぞれ示す図である。本発明の参考実施形態に係る顕微鏡画像取得方法のフローチャートを示す図である。図３（ａ），（ｂ）の焦点位置において取得された蛍光画像を合成した合成画像を示す図である。（ａ）〜（ｄ）本発明の一実施形態に係る顕微鏡による励起光の標本に対する焦点深度の範囲をそれぞれ示す図である。本発明の一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法のフローチャートを示す図である。（ａ）〜（ｌ）図６の顕微鏡の変形例による励起光の標本に対する焦点深度の範囲をそれぞれ示す図である。

本発明の参考実施形態に係る顕微鏡１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、該顕微鏡本体２に接続される光源装置（シート照明光学系）３と、該光源装置３および顕微鏡本体２を制御する制御部４とを備えている。制御部４にはモニタ５が接続され、顕微鏡本体２により取得された画像を表示するようになっている。

顕微鏡本体２は、標本Ｓを搭載するステージ６と、該ステージ６に搭載された標本Ｓから発せられる蛍光を検出する検出光学系７とを備えている。検出光学系７は、該ステージ６に搭載された標本Ｓの鉛直上方に対向して配置される対物レンズ８と、該対物レンズ８により集光された標本Ｓからの蛍光を結像させる結像レンズ９と、該結像レンズ９により結像された蛍光を撮影する撮像素子１０とを備えている。図中、符号１１は、蛍光に含まれる励起光Ｌを除去するバリアフィルタを備えるフィルタホイールである。

光源装置３は、図２（ａ），（ｂ）に示されるように、略平行光からなる励起光Ｌを射出する励起光源１２と、該励起光源１２からの略平行光からなる励起光Ｌを２つの光路に分岐するハーフミラー１３と、分岐された２つの光路を経由した励起光Ｌを標本Ｓを挟んで対向する２方向から略平面状の励起光Ｌとして標本Ｓを通過する平面に沿って入射させる２つのシリンドリカルレンズ１４ａ，１４ｂとを備えている。

シリンドリカルレンズ１４ａ，１４ｂは、光軸に直交する一方向にパワーを有し、略平行光からなる励起光Ｌをその光束径寸法と同じ所定の幅寸法を有するライン状に集光するようになっている。図中、符号１５は光路を形成するミラーである。また、符号１６は２つの光路に設けられ、択一的に開閉されるシャッタである。

各シリンドリカルレンズ１４ａ，１４ｂにより集光される励起光Ｌの２つの光軸は、検出光学系７の光軸に直交する方向に沿って同一平面上に延びるように配置されている。これにより、各シリンドリカルレンズ１４ａ，１４ｂにより集光される励起光Ｌの開口数に応じた焦点深度の２倍の範囲内において、検出光学系７の焦点面に沿って略平面状の励起光（シート照明）Ｌが標本Ｓに照射され、焦点面の広い範囲にわたって一度に蛍光を発生させることができるようになっている。

本実施形態においては、標本Ｓの半分が、下式に示される励起光Ｌの焦点深度Ｚの２倍の範囲内に配置されるように設定されている。
Ｚ＝λ／ＮＡ^２
ここで、λは励起光Ｌの波長、ＮＡは開口数である。

制御部４は、顕微鏡本体２を制御する顕微鏡制御部（移動機構）１７と、光源装置３を制御する光源制御部１８と、撮像素子１０により取得された画像信号を処理してモニタ５に表示する画像を生成する画像処理部１９とを備えている。制御部４は、コンピュータにより構成され、画像処理部１９、顕微鏡制御部１７および光源制御部１８の動作（例えば、画像の生成、入力部２０からの指示入力の処理、各種電動部（例えば、ステージ６、レンズ切替器またはズーム機構、フィルタホイール１１、シャッタ１６など）やモニタ５の表示の制御、各種パラメータの記憶など）がこのコンピュータの演算処理装置とメモリにより実行される。

また、顕微鏡制御部１７および光源制御部１８は、コンピュータからの制御信号に基づいて各種電動部を駆動する制御基板を備えている。
顕微鏡制御部１７は、該顕微鏡制御部１７に接続された入力部２０からの入力によってステージ６を作動させて標本Ｓを移動させ、対物レンズ８や結像レンズ９を交換あるいは倍率調節し、フィルタホイール１１を作動させてフィルタを交換する等の顕微鏡本体２の制御を行うようになっている。

光源制御部１８は、図２（ａ）に示されるようにシャッタ１６を開閉して、標本Ｓに対して一方向（図２（ａ）の紙面に対して標本Ｓの左側）から励起光Ｌを入射させる光路（左側光路）に設定して蛍光画像の取得を行い、図２（ｂ）に示されるようにシャッタ１６を開閉して、標本Ｓに対して他方向（図２（ｂ）の紙面に対して標本Ｓの右側）から励起光Ｌを入射させる光路（右側光路）に切り替えて蛍光画像の取得を行うようになっている。

画像処理部１９は、光源装置３の左側光路から励起光Ｌを入射させたときに取得された蛍光画像と、光源装置３の右側光路から励起光Ｌを入射させたときに取得された蛍光画像とを合成して合成画像を生成するようになっている。
具体的には、画像処理部１９は、取得された複数の蛍光画像を合成する際に、各蛍光画像において対応する画素の輝度値あるいはコントラスト値を比較し、最大輝度値あるいは最大コントラスト値を有する画素を選択するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１を用いた顕微鏡画像取得方法について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図４に示されるように、まず、カウンタｋをリセットし（ステップＳ１）、次いで、光源制御部１８が、検出光学系７の焦点面に沿う２方向からいずれかの方向を選択する（選択ステップＳ２）。

選択ステップＳ２においては、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、最初はカウンタｋが１であるため左側光路が選択される（ステップＳ２２）。
そして、選択ステップＳ２において選択された左側光路に沿って、標本Ｓの左側に焦点位置を有する平面状の励起光Ｌを標本Ｓに入射させ（入射ステップＳ３）、励起光Ｌが入射されることにより標本Ｓの焦点面において発生する蛍光を検出光学系７によって検出して蛍光画像を取得する（検出ステップＳ４）。

この時点で、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数（３ａ）であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋは２であるため、ステップＳ２〜Ｓ５が繰り返される。
２回目の選択ステップＳ２においては、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、カウンタｋは２であるため、右側光路が選択される（ステップＳ２３）。

そして、選択ステップＳ２において選択された右側光路に沿って、標本Ｓの右側に焦点位置を有する平面状の励起光Ｌを標本Ｓに入射させ（入射ステップＳ３）、励起光Ｌが入射されることにより標本Ｓの焦点面において発生する蛍光を検出光学系７によって検出して蛍光画像を取得する（検出ステップＳ４）。

この段階で、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋが３であるため、上記２回の検出ステップＳ４において取得された２枚の蛍光画像が画像処理部１９において合成され、合成画像が生成される（ステップＳ７）。ここで、生成された合成画像はモニタ５に表示される（ステップＳ８）。そして、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ９）、ｋは４になる。
次に、画像生成を停止するか否かが判定される（ステップＳ１０）。画像生成が停止されない場合には、ステップＳ２からの工程が繰り返される。

再度、選択ステップＳ２に戻ると、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、カウンタｋが４であるため、励起光Ｌの入射光路の選択順序が反転されて右側光路が選択され（ステップＳ２３）、図３（ｂ）に示されるように、標本Ｓの右側の蛍光画像が取得される（ステップＳ３，Ｓ４）。そして、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数（３ａ）であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋは５であり３の倍数ではないため、ステップＳ２に戻り、カウンタｋが奇数であるため、左側光路が選択され（ステップＳ２２）、図３（ａ）に示されるように、標本Ｓの左側の蛍光画像が取得される（ステップＳ３，Ｓ４）。

そして、カウンタｋがインクリメントされることにより６となって、３の倍数となるので（ステップＳ５，Ｓ６）、上記２回の検出ステップＳ４において取得された２枚の蛍光画像が画像処理部１９において合成され、２枚目の焦点面Ｚ２における２次元の合成画像が生成される（ステップＳ７）。ここで、生成された合成画像はモニタ５に表示される（ステップＳ８）。そして、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ９）、ｋは７になる。次に、画像生成を停止するか否かが判定される（ステップＳ１０）。画像生成が停止されると処理が終了される。

取得された蛍光画像は、焦点位置を中心とした焦点深度の２倍の範囲に相当する帯状の領域（図３（ａ），（ｂ）にハッチングで示す領域Ｂ１，Ｂ２。）においてコントラストが高く、他の領域においてはコントラストが低くなっている。したがって、ステップＳ７においては、例えば、取得された蛍光画像の対応する画素のコントラスト値を比較し、コントラスト値が最大となる画素の輝度値を選択することにより、図５に示されるように、視野範囲Ａ内の広範囲にわたって焦点の合った鮮明な合成画像を得ることができる。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法によれば、標本Ｓの外部の異なる２方向から励起光Ｌを入射させることにより、各方向からの励起光Ｌの標本Ｓへの入射深度を浅くすることができ、標本Ｓにおける散乱の影響を抑制して鮮明な蛍光画像を取得することができる。

そして、異なる２方向からの励起光Ｌを択一的に切り替えて順次入射させることにより、同一波長または重複する波長の励起光Ｌを同一の標本Ｓの近接または重複する領域に照射しても、複数方向からの励起光Ｌが混在することが無く、各励起光Ｌの焦点深度の２倍の範囲において鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。

さらに、励起光Ｌの入射方向を左側光路、右側光路の順で切り替えて取得された１組の蛍光画像を１つの合成画像に合成してモニタ５に表示した後、励起光Ｌの入射方向を前回最後の画像取得時と同じ方向から始めて右側光路、左側光路の順で切り替えることで次の１組の蛍光画像を取得し合成画像に合成してモニタ５に表示する。これにより、励起光Ｌの入射方向の切替回数を少なくして画像取得時間の間隔を短縮し、高速に蛍光画像を取得してモニタ５に表示することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、画像処理部１９による合成画像の生成が、対応する画素のコントラスト値が最大となる輝度値の選択により行われることとしたが、対応する画素の輝度値が最大となる輝度値の選択により行うことにしてもよい。
また、本実施形態においては、ハーフミラー１３により励起光Ｌを２つの光路に分岐してシャッタ１６を択一的に開閉して光路を切り替えることとしたが、これに代えて、光路上に挿脱可能な全反射ミラーを設け、該全反射ミラーの挿脱切替によって励起光Ｌの方向を切り替えてもよい。この場合には、シャッタ１６は不要である。

次に、本発明の一実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡は、顕微鏡本体２のステージ６と光源装置３とが連動して制御される点で参考実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法と相違している。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡は、参考実施形態に係る顕微鏡１と同様にして、図６（ａ），（ｂ）に示されるように、検出光学系７の最初の焦点面Ｚ１において、標本Ｓの左右の光路からそれぞれ励起光Ｌを照射して２次元画像を合成した後に、図６（ｃ），（ｄ）に示されるように、顕微鏡制御部１７がステージ６を検出光学系７の光軸方向に所定量移動させて標本Ｓ内における検出光学系７の焦点面を次の焦点面Ｚ２に移動させ、その位置で蛍光画像を取得して２次元画像を合成することを順次繰り返すようになっている。検出光学系７の光軸方向に異なる位置において複数の合成画像を取得することにより、標本Ｓの３次元画像を合成することができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡の光源制御部１８は、隣接する焦点面において励起光Ｌを入射させる光路の選択順序を反転させるようになっている。例えば、最初の焦点面Ｚ１においては、左側光路、右側光路の順に励起光Ｌを入射させ、次の焦点面Ｚ２においては右側光路、左側光路の順に励起光Ｌを入射させるようになっている。さらに次の焦点面においては左側光路、右側光路の順に励起光Ｌを入射させるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡を用いた顕微鏡画像取得方法について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡画像取得方法は、図７に示されるように、まず、カウンタｋ，ｍをリセットし（ステップＳ１）、次いで、光源制御部１８が、検出光学系７の焦点面に沿う２方向からいずれかの方向を選択する（選択ステップＳ２）。

選択ステップＳ２においては、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、カウンタｋが１であるため左側光路が選択される（ステップＳ２２）。
そして、図６（ａ）に示されるように、選択ステップＳ２において選択された左側光路に沿って、標本Ｓの左側に焦点位置を有する平面状の励起光Ｌを標本Ｓに入射させ（入射ステップＳ３）、励起光Ｌが入射されることにより標本Ｓの焦点面において発生する蛍光を検出光学系７によって検出して蛍光画像を取得する（検出ステップＳ４）。

この時点で、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数（３ａ）であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋは２であり３の倍数ではないため、ステップＳ２〜Ｓ５が繰り返される。
２回目の選択ステップＳ２においては、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、カウンタｋが２であるため右側光路が選択される（ステップＳ２３）。

そして、図６（ｂ）に示されるように、選択ステップＳ２において選択された右側光路に沿って、標本Ｓの右側に焦点位置を有する平面状の励起光Ｌを標本Ｓに入射させ（入射ステップＳ３）、励起光Ｌが入射されることにより標本Ｓの焦点面において発生する蛍光を検出光学系７によって検出して蛍光画像を取得する（検出ステップＳ４）。

この段階で、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋが３であるため、上記検出ステップＳ４において取得された２枚の蛍光画像が画像処理部１９において合成され、１枚目の焦点面Ｚ１における２次元の合成画像が生成される（ステップＳ７）。ここで、カウンタｋ，ｍがインクリメントされ（ステップＳ８）、ｋは４，ｍは１となる。

次に、カウンタｍが所定値Ｍであるか否かが判定される（ステップＳ９）。所定値Ｍとしては、取得する２次元画像の枚数として、任意の値を予め設定しておく。カウンタｍが所定値Ｍではない場合には、顕微鏡制御部１７がステージ６を駆動して標本Ｓを検出光学系７の光軸方向に所定量移動させた後に（ステップＳ１０）、ステップＳ２からの工程が繰り返される。

再度、選択ステップＳ２に戻ると、カウンタｋが奇数であるか否かが判定され（ステップＳ２１）、カウンタｋが４であるため、励起光Ｌの入射光路の選択順序が反転されて右側光路が選択され（ステップＳ２３）、図６（ｃ）に示されるように、標本Ｓの右側の蛍光画像が取得される（ステップＳ３，Ｓ４）。そして、カウンタｋがインクリメントされ（ステップＳ５）、カウンタｋが３の倍数（３ａ）であるか否かが判定される（ステップＳ６）。カウンタｋは５であり３の倍数ではないため、ステップＳ２に戻り、カウンタｋが奇数であるため、左側光路が選択され（ステップＳ２２）、図６（ｄ）に示されるように、標本Ｓの左側の蛍光画像が取得される（ステップＳ３，Ｓ４）。

そして、カウンタｋがインクリメントされることにより６となって、３の倍数となるので（ステップＳ５，Ｓ６）、上記２回の検出ステップＳ４において取得された２枚の蛍光画像が画像処理部１９において合成され、２枚目の焦点面Ｚ２における２次元の合成画像が生成される（ステップＳ７）。
カウンタｍが所定値Ｍである場合には、画像処理部１９において、それまでに取得された複数枚の２次元の合成画像がさらに合成されて３次元の蛍光画像が合成される（合成ステップＳ１１）。

このように、本実施形態に係る顕微鏡および顕微鏡画像取得方法によれば、参考実施形態に係る顕微鏡１および顕微鏡画像取得方法と同様にして、視野範囲Ａ内の広範囲にわたって焦点の合った鮮明な合成画像を得ることができる。また、本実施形態によれば、標本を検出光学系の光軸方向への移動の前後において、励起光Ｌの入射光路を切り替えないので、シャッタ１６の開閉による光路の切替回数を削減することができ、最終的に３次元画像を取得するまでに要する時間を短縮することができるという利点がある。

なお、上記各実施形態においては、励起光Ｌの波長λを変化させない場合について説明したが、これに代えて、励起光Ｌの波長λを切り替えることにしてもよい。
この場合には、励起光Ｌの波長ごとに上述した一実施形態に係る顕微鏡画像取得方法を実施してもよいが、励起光Ｌの波長の切替時にも励起光Ｌの入射方向を変化させないことにしてもよい。

すなわち、図８に示されるように、まず、標本Ｓ内の検出光学系７の焦点面Ｚ１を固定して、波長λ１〜λ３の励起光Ｌを左右の光路から入射させる場合に、波長λ１においては、（ａ）左側光路、（ｂ）右側光路、波長λ２においては、（ｃ）右側光路、（ｄ）左側光路、波長λ３においては、（ｅ）左側光路、（ｆ）右側光路の順に入射させると波長の切替に伴う光路の切替回数も低減することができる。

次いで、標本Ｓを移動させて標本Ｓ内の検出光学系７の焦点面を焦点面Ｚ２に移動する。この場合に、（ｆ）の状態から波長λ３を変更することなく、焦点面のみ焦点面Ｚ２に移動して固定し、（ｇ）右側光路、（ｈ）左側光路、波長λ２に切り替えて、（ｉ）左側光路、（ｊ）右側光路、波長λ１に切り替えて、（ｋ）右側光路、（ｌ）左側光路の順に励起光Ｌを入射させると波長の切替および焦点面の切替に伴う光路の切替回数を最小限に抑えることができる。
切り替える焦点面の数および波長の数は任意でよい。

また、上記各実施形態においては、標本Ｓを挟んで両側の対向する２方向から励起光Ｌを入射させる場合について説明したが、これに代えて、異なる３以上の方向から励起光Ｌを入射させることにしてもよい。

１顕微鏡
３光源装置（シート照明光学系）
４制御部
７検出光学系
１９画像処理部
Ｓ標本

Claims

標本から発せられる蛍光を検出して蛍光画像を取得する検出光学系と、
該検出光学系の光軸に交差する平面に沿って、平面状の励起光を、前記標本の外部の異なる２以上の方向から、入射方向を択一的に切り替えて順次入射させるシート照明光学系と、
入射方向が異なる前記励起光の入射時に前記検出光学系により取得された複数の蛍光画像を合成する画像処理部とを備え、
前記シート照明光学系が、前記標本を前記検出光学系の光軸方向に移動させる移動機構を備え、前記画像処理部による合成処理の前後において同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替えるとともに、前記移動機構による前記標本の移動の前後において同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替える顕微鏡。
前記シート照明光学系が、前記励起光の波長を切替可能に設けられ、該励起光の波長の切替前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で、前記励起光の入射方向を切り替える請求項１に記載の顕微鏡。
前記シート照明光学系が、前記検出光学系の光軸を挟んで両側から、前記励起光を入射可能である請求項１または請求項２に記載の顕微鏡。
標本を通過する同一平面に沿う異なる複数の方向からいずれかの方向を択一的に選択する選択ステップと、
該選択ステップにおいて選択された方向に沿って、該方向毎に異なる焦点位置を有する平面状の励起光を前記標本に入射させる入射ステップと、
該入射ステップによって前記励起光が入射されたときに、前記標本において発生する蛍光を前記平面に交差する検出方向において検出して蛍光画像を取得する検出ステップと、
前記選択ステップにより選択される方向を順次切り替えて、前記入射ステップおよび前記検出ステップを繰り返すことにより取得された複数の蛍光画像を合成する合成ステップと、
前記選択ステップ、前記入射ステップ、前記検出ステップおよび前記合成ステップの後に前記標本を前記検出方向に移動させる移動ステップとを含み、
該移動ステップの後に、前記選択ステップ、前記入射ステップ、前記検出ステップおよび前記合成ステップが繰り返され、
連続する前記合成ステップによりそれぞれ合成される複数の蛍光画像を取得する際に前記選択ステップにより選択される方向が、各前記合成ステップの前後において同一の方向から前記励起光を入射させる順序で切り替えられ、
前記選択ステップが、前記移動ステップによる前記標本の移動の前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で前記励起光の入射方向を選択する顕微鏡画像取得方法。
前記励起光の波長を切り替える波長切替ステップを含み、
前記選択ステップが、前記波長切替ステップによる前記波長の切替前後において、同一の入射方向から前記励起光を入射させる順序で前記励起光の入射方向を選択する請求項４に記載の顕微鏡画像取得方法。