JP2006078772A

JP2006078772A - 共焦点顕微鏡

Info

Publication number: JP2006078772A
Application number: JP2004262610A
Authority: JP
Inventors: Kenta Mikuriya; 健太御厨; Koshi Kei; 虹之景; Takashi Yoshida; 隆司吉田
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2006-03-23
Also published as: US20060050375A1

Abstract

【課題】ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激を行う機能を付加し、ニポウディスク方式特有の高速な画像計測により、光刺激や蛍光褪色の反応をリアルタイムで観察できる共焦点顕微鏡を実現する。
【解決手段】少なくとも顕微鏡とニポウディスク方式の共焦点スキャナから構成され、共焦点画像により試料の観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記顕微鏡に接続され、前記試料に刺激を与えるレーザ光を出力するレーザ光出力手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
【選択図】図１

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関し、詳しくは、観察試料に対し光刺激を行う機能を備えた共焦点顕微鏡の改良に関するものである。

共焦点顕微鏡は、試料の収束光点を走査し、試料からの戻り光を結像させて画像を得ることにより試料を観察するもので、生物やバイオテクノロジーなどの分野における生きた細胞の生理反応観察や形態観察あるいは半導体市場におけるＬＳＩの表面観察などに使用されている。

図４は、従来の共焦点顕微鏡の一例を示した構成図である。
図４において、共焦点スキャナ１１０は、顕微鏡１２０のポート１２２に接続してあり、レーザ光１１１は、マイクロレンズディスク１１２のマイクロレンズ１１７により個別の光束に集光され、ダイクロイックミラー１１３を透過後、ピンホールディスク（以下、ニポウディスクという。）１１４の個々のピンホール１１６を通過し、顕微鏡１２０の対物レンズ１２１により、ステージ１２３上の試料１４０に集光される。

試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１２１を通り、ニポウディスク１１４の個々のピンホール上に集光される。個々のピンホールを通過した蛍光信号は、ダイクロイックミラー１１３で反射され、リレーレンズ１１５を介してイメージセンサ１３１に結像されるように共焦点スキャナ１１０より出射される。このような装置では、図示しないモータでニポウディスク１１４を一定速度で回転させており、この回転よるピンホール１１６の移動により試料１４０への集光点を走査している。

ニポウディスク１１４のピンポールが並んでいる平面と、試料１４０の被観察平面と、イメージセンサ１３１の受光面とは互いに光学的に共役関係に配置してあるので、イメージセンサ１３１上には試料１４０の光学的断面像、即ち共焦点画像が結像される（例えば、特許文献１参照。）。
また、上述のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡の他にガルバノミラーを用いて試料への集光点を走査し、共焦点画像を取得するものもある（例えば、特許文献２参照。）。

特開平５−６０９８０号公報特開平５−２１００５１号公報

このような共焦点顕微鏡を用いた画像計測では、細胞などの試料に対して光刺激行い、時間経過に対する状態変化（フォトアクチベーションやＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）など）を観察したいという要求がある。フォトアクチベーションとは、例えば細胞の所定の部分に画像測定用レーザ光以外の第２のレーザのスポット光を照射して、その部分の蛍光色を変化させてマーキングする。このマーキングが時間経過により、細胞に広がっていく様子を観察するものである。
また、ＦＲＡＰ（蛍光褪色法）とは、蛍光タンパクを発現した細胞の蛍光を、第２のレーザ光の照射により部分的に褪色させて、細胞における蛍光褪色後のタンパク質の局在変化を観察するものである。

しかしながら、上述の従来のニポウディスク方式の共焦点顕微鏡には、試料に光刺激を与えてその変化を観察する機能を備えたものはない。
また、ガルバノミラー方式の共焦点顕微鏡では２次元走査のためのガルバノミラーの制御に時間がかかり、光刺激や蛍光褪色などの高速な反応についてはリアルタイムでの画像計測が困難であるという問題があった。

本発明は、このような従来の共焦点顕微鏡が有していた問題を解決しようとするものであり、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激を行う機能を付加し、ニポウディスク方式特有の高速な画像計測により、光刺激や蛍光褪色の反応をリアルタイムで観察できる共焦点顕微鏡を実現することを目的とするものである。

本発明は次の通りの構成になった共焦点顕微鏡である。

（１）少なくとも顕微鏡とニポウディスク方式の共焦点スキャナから構成され、共焦点画像により試料の観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記顕微鏡に接続され、前記試料に刺激を与えるレーザ光を出力するレーザ光出力手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。

（２）前記試料に刺激を与えるレーザ光のスポット径を調整する可変絞り手段を備えたことを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡。

（３）前記試料に刺激を与えるレーザ光を２次元に走査させる走査手段を有することを特徴とする（１）または（２）に記載の共焦点顕微鏡。

（４）前記レーザ光出力手段は、前記試料に刺激を与えるレーザ光と、このレーザ光が前記試料へ照射される位置を示すためのレーザ光とを合波して出力することを特徴とする（１）から（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

（５）前記共焦点顕微鏡は、フォトアクチベーションまたは蛍光褪色に用いられることを特徴とする（１）から（４）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。

本発明によれば、以下のような効果がある。

請求項１および請求項５に記載の発明によれば、ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激用のレーザ光を照射する機能を備えたことによって、フォトアクチベーションやＦＲＡＰなどが可能となる。また、蛍光観察、すなわち画像計測はニポウディスク式共焦点スキャナで行うことで高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係る高速反応をリアルタイムで観察することができる。

請求項２に記載の発明によれば、可変絞り手段を設けて、光刺激用レーザ光の照射ＮＡ（開口数）を変えることにより、光刺激のスポット径を可変にし、光刺激する範囲の大きさを変えられるようになる。

請求項３に記載の発明によれば、光刺激用のレーザ光の２次元スキャンにより、試料の形状に合わせた光刺激を可能にする。

請求項４に記載の発明によれば、光刺激用のレーザ光と刺激を与えている位置を示すためのレーザ光とを合波して試料に照射することにより、光刺激用のレーザ光が紫外光であっても位置表示用のレーザ光により励起された蛍光波長が可視光であるため、光刺激を行うポイントが目視可能となる。

以下図面を用いて本発明を詳細に説明する。図１は本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。

図１において、顕微鏡１の第１のポート１１には共焦点スキャナ１１０が取り付けられ、波長λ１のレーザ光１１１（第１のレーザ光）を試料１４０に照射する共焦点顕微鏡を構成する。顕微鏡１内に入ったレーザ光１１１は、ダイクロイックミラー１３を透過して対物レンズ１４により、ステージ１６上の細胞などの試料１４０に集光される。このレーザ光１１１の照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１４を通り、ダイクロイックミラー１３を透過し共焦点スキャナ１１０を介して従来例と同様にイメージセンサ１３１に結像される。

顕微鏡１の第２のポート１２にはレーザ光出力手段２が取り付けられる。このレーザ光出力手段２は、レーザ光源２１とコリメータレンズ２２を備えている。レーザ光源２１はλ２の波長の第２のレーザ光２３を発光し、コリメータレンズ２２は、この第２のレーザ光２３を平行光にして第２のポート１２から顕微鏡１内に入れる。顕微鏡１に入った第２のレーザ光２３は、ダイクロイックミラー１３で反射して、対物レンズ１４により、試料１４０上に波長λ２の光刺激用レーザ光の光ビームスポットを結像させる。
なお、この場合のλ１とλ２との関係は、λ２＜λ１である。

ニポウディスク方式の共焦点顕微鏡に光刺激用の第２のレーザ光を照射する機能を備えたことによって、フォトアクチベーションのアプリケーションやＦＲＡＰなどが可能となる。また、蛍光観察、すなわち画像計測はニポウディスク式共焦点スキャナで行うことで高速性（例えば１０００フレーム／秒のスキャンスピード）が実現できるため、光刺激や蛍光褪色に係る高速反応をリアルタイムで観察することができる。

ここで、図１に示した構成において、第２のレーザ光２３が例えば紫外光のような可視光でない場合、第２のレーザの照射ポイントが目視できないことになる。この問題を解決するため、図２に示すように、第２のレーザ光のビームスポットに可視光のレーザスポットを重ねるようにする。

図２は、本発明に係る第２の実施例を示した構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。
図２において、顕微鏡１の第１のポート１１には共焦点スキャナ１１０が取り付けられ、波長λ１のレーザ光１１１を照射する共焦点顕微鏡を構成する。顕微鏡１内に入ったレーザ光１１１は、ダイクロイックミラー１３を透過して対物レンズ１４により、ステージ１６上の試料１４０に集光される。このレーザ光１１１の照射により試料１４０が蛍光する。試料１４０から出た蛍光信号は、再び対物レンズ１４を通り、ダイクロイックミラー１３を透過し共焦点スキャナ１１０を介して従来例と同様にイメージセンサ１３１に結像される。

顕微鏡１の第２のポート１２にはレーザ光出力手段３が取り付けられる。このレーザ光出力手段３は、レーザ光源３１，３５、コリメータレンズ３２，３６、ダイクロイックミラー３４、全反射ミラー３７、可変絞り手段３８を備えている。
レーザ光源３１は実線で示した波長λ２の第２のレーザ光３３を発光する。コリメータレンズ３２は、この第２のレーザ光３３を平行光にする。ダイクロイックミラー３４は、その分光特性により、平行光となった第２のレーザ光３３を透過させる。可変絞り手段３８は、ダイクロイックミラー３４を透過した第２のレーザ光３３のビーム径を可変させる。可変絞り手段３８を通った第２のレーザ光３３は、顕微鏡１の第２のポート１２から顕微鏡１内に入る。顕微鏡１に入った第２のレーザ光３３は、ダイクロイックミラー１３で反射して、対物レンズ１４により、試料１４０上に波長λ２の光刺激用レーザ光の光ビームスポットを結像させる。

また、レーザ光源３５は破線で示した波長λ３の第３のレーザ光３９を発光する。コリメータレンズ３６は、この第３のレーザ光３９を平行光にする。全反射ミラー３７は、平行光になった第３のレーザ光３９を反射してダイクロイックミラー３４に当てる。ダイクロイックミラー３４は、その分光特性により、第３のレーザ光３９を反射し、可変絞り手段３８を介して第２のポート１２から顕微鏡１内に入れる。顕微鏡１に入った第３のレーザ光３９は、ダイクロイックミラー１３で反射して、対物レンズ１４により、試料１４０上に波長λ３の光ビームスポットを結像させる。これにより第２の蛍光信号１５が発生する。この第２の蛍光信号１５は、再び対物レンズ１４を通り、ダイクロイックミラー１３を透過し共焦点スキャナ１１０を介し、レーザ光１１１による蛍光信号と同様にイメージセンサ１３１に結像される。なお、λ１，λ２，λ３の関係はλ２＜λ１＜λ３となっている。また、第２の蛍光信号１５は、可視光であってλ３よりも長波長である。

λ２とλ３の光を合波して試料１４０に照射することにより、第２のレーザ光（λ２）が紫外光であっても第３のレーザ光（λ３）により励起された蛍光波長が可視光であれば、光刺激を行うポイントが目視可能となる。
また、可変絞り手段３８を設けて、第２，第３のレーザ光の照射ＮＡ（開口数）を変えることにより、光刺激のスポット径を可変にし、光刺激する範囲の大きさを変えられるようにしている。

図３は本発明に係る第３の実施例を示した構成図である。前出の図と同様の構成要素には同様の符号を付けてその部分の説明は省略する。
図３において、共焦点スキャナ１１０および顕微鏡１の構成は、前出の図２で示したものと同様である。
顕微鏡１の第２のポート１２にはレーザ光出力手段４が取り付けられる。このレーザ光出力手段４は、レーザ光源３１，３５、コリメータレンズ３２，３６、ダイクロイックミラー３４、全反射ミラー３７、走査手段４０を備えている。

レーザ光源３１，３５、コリメータレンズ３２，３６、ダイクロイックミラー３４、全反射ミラー３７の構成及び動作は図２で示した第２の実施例と同様であり、この構成に走査手段４０を付加した。

走査手段４０は、ミラースキャン型の走査系を構成するものである。図示しないが、例えばガルバノミラーを用いて２次元でレーザ光を走査する。ガルバノミラーは、ＤＣモータにより縦・横方向に回転できる機構になっている。制御ユニットからの信号によりＤＣモータを制御してガルバノミラーを回転させて、２次元の任意の位置にレーザスポットを照射することができる。

走査手段４０から出力された第２，第３のレーザ光３３，３９が顕微鏡１に入り、ダイクロイックミラー１３で反射され、対物レンズ１４で集光されて試料１４０にスポット光を照射する。走査手段４０の第２，第３のレーザ光３３，３９の２次元スキャンにより、試料１４０の形状に合わせた光刺激を可能にする。また、第２の実施例と同様に、光刺激を与える第２のレーザ光３３が紫外光であっても、第３のレーザ光３９により、刺激を与えている部分を目視することができる。

なお、本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形をも含むものである。

本発明に係る共焦点顕微鏡の一実施例を示す構成図である。本発明に係る共焦点顕微鏡の第２の実施例を示す構成図である。本発明に係る共焦点顕微鏡の第３の実施例を示す構成図である。従来の共焦点顕微鏡の一例を示す構成図である。

符号の説明

１顕微鏡
２レーザ光出力手段
３レーザ光出力手段
４レーザ光出力手段
１１第１のポート
１２第２のポート
１３ダイクロイックミラー
１４対物レンズ
１５第２の蛍光信号
１６ステージ
３１レーザ光源
３２コリメータレンズ
３３第２のレーザ光
３４ダイクロイックミラー
３５レーザ光源
３６コリメータレンズ
３７全反射ミラー
３８可変絞り手段
４０走査手段
１１０共焦点スキャナ

Claims

少なくとも顕微鏡とニポウディスク方式の共焦点スキャナから構成され、共焦点画像により試料の観察を行う共焦点顕微鏡において、
前記顕微鏡に接続され、前記試料に刺激を与えるレーザ光を出力するレーザ光出力手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡。
前記試料に刺激を与えるレーザ光のスポット径を調整する可変絞り手段を備えたことを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
前記試料に刺激を与えるレーザ光を２次元に走査させる走査手段を有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の共焦点顕微鏡。
前記レーザ光出力手段は、前記試料に刺激を与えるレーザ光と、このレーザ光が前記試料へ照射される位置を示すためのレーザ光とを合波して出力することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。
前記共焦点顕微鏡は、フォトアクチベーションまたは蛍光褪色に用いられることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の共焦点顕微鏡。