WO2015008415A1 - 構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置 - Google Patents

構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置 Download PDF

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light beam
wavelength
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浩明 中山
大内　由美子
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Definitions

  • the present invention relates to a structured illumination apparatus and a structured illumination microscope apparatus.
  • the specimen In the field of specimen (specimen) observation and measurement, to achieve a resolution that exceeds the performance of the objective lens, the specimen is illuminated with spatially modulated illumination light (structured illumination light) to produce an image (modulated image).
  • structured illumination light structured illumination light
  • a structured illumination microscope (SIM) that generates a super-resolution image (demodulated image) of a sample by acquiring and removing (demodulating) a modulation component included in the modulated image has been proposed ( For example, see Patent Document 1).
  • a light beam emitted from a light source is split into a plurality of light beams by a diffraction grating or the like, and interference fringes are formed by causing these light beams to interfere in the vicinity of a sample.
  • This is structured illumination light.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a structured illumination apparatus and a structured illumination microscope apparatus capable of obtaining a desired super-resolution effect at each of a plurality of wavelengths. To do.
  • a diffraction unit that diffracts an emitted light beam from a light source that emits light of a plurality of wavelengths simultaneously or sequentially into a plurality of diffracted light beams, and the diffraction unit that is diffracted by the diffraction unit
  • An optical system that forms interference fringes by a plurality of diffracted light beams on the sample surface, the optical system including a first optical system and the plurality of diffracted light beams on the pupil plane or the pupil vicinity surface of the first optical system.
  • the magnification characteristic dY ( ⁇ ) of the second optical system with respect to the plurality of wavelengths satisfies the following condition.
  • the “magnification characteristic” here is a shift between wavelengths of the height of light rays (height from the optical axis) that has passed through the second optical system, and is the second after aberration correction. This includes both lateral chromatic aberration remaining in the optical system and lateral chromatic aberration intentionally generated in the second optical system.
  • An aspect of the structured illumination microscope apparatus exemplifying the present invention is an aspect of the structured illumination exemplifying the present invention, and forms an observation light beam from the sample modulated by the interference fringes on a photodetector.
  • An imaging optical system is an aspect of the structured illumination microscope apparatus exemplifying the present invention, and forms an observation light beam from the sample modulated by the interference fringes on a photodetector.
  • a diffraction unit that diffracts an emitted light beam from a light source that emits light of a plurality of wavelengths simultaneously or sequentially into a plurality of diffracted light beams, and is diffracted by the diffraction unit.
  • an optical system for forming interference fringes due to the plurality of diffracted light beams on a sample surface the optical system configured to transmit a first optical system and the plurality of diffracted light beams to a pupil plane or a pupil of the first optical system.
  • a magnification characteristic dY ( ⁇ ) of the second optical system for the plurality of wavelengths satisfies the following condition.
  • lambda is the each of the plurality of wavelengths, dY (lambda), when the reference wavelength of the plurality wavelength is lambda 0, the reference wavelength lambda 0 Is the difference between the image height 2f ⁇ ⁇ 0 / P of each of the plurality of wavelengths and the image height 2f ⁇ ⁇ / P of each of the plurality of wavelengths, fo being the focal length of the reference wavelength ⁇ 0 of the first optical system, f is the focal length of the reference wavelength ⁇ 0 of the second optical system, P is the structural period of the diffractive portion, and NA is the numerical aperture of the first optical system.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining a function of a light beam selector 18. It is a figure explaining the rotation mechanism 18A of the light beam selection part 18. FIG. It is a figure explaining operation
  • FIG. 16A is a configuration diagram of a condensing optical system (lenses 17A, 21A, and 23) in the TIRF-SIM mode of the second embodiment
  • FIG. 16B is a diagram in the TIRF mode of the second embodiment.
  • FIG. It is a condition correspondence table of the condensing optical system (lens 317,321,323) of 3rd Embodiment.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the structured illumination microscope apparatus 1.
  • TIRFM total reflection fluorescence microscope
  • the TIRFM-SIM mode is a mode in which an extremely thin layer on the surface of the sample (specimen) 2 having fluorescence is observed.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 includes a laser unit 100, an optical fiber 11, an illumination optical system 10, an imaging optical system 30, an imaging element 42, a control device 43, an image storage / An arithmetic device 44 and an image display device 45 are provided.
  • the illumination optical system 10 is an epi-illumination type, and the sample 2 is illuminated using the objective lens 31 and the dichroic mirror 33 of the imaging optical system 30.
  • the laser unit 100 includes a first laser light source 101, a second laser light source 102, shutters 103 and 104, a mirror 105, a dichroic mirror 106, and a lens 107.
  • Each of the first laser light source 101 and the second laser light source 102 is a coherent light source, and the emission wavelengths thereof are different from each other.
  • the wavelength ⁇ 1 of the first laser light source 101 is longer than the wavelength ⁇ 2 of the second laser light source 102 ( ⁇ 1> ⁇ 2).
  • the first laser light source 101, the second laser light source 102, and the shutters 103 and 104 are driven by the control device 43, respectively.
  • the optical fiber 11 is composed of, for example, a polarization-preserving single mode fiber in order to guide the laser light emitted from the laser unit 100.
  • the position of the output end of the optical fiber 11 in the direction of the optical axis O can be adjusted by the position adjusting mechanism 11A.
  • the position adjusting mechanism 11A is driven and controlled by the control device 43.
  • a piezo element or the like is used as the position adjusting mechanism 11A.
  • the polarization plane of the laser light is preserved before and after the optical fiber 11. This is effective for maintaining the quality of polarized light.
  • the polarizing plate 13 is essential.
  • the illumination optical system 10 includes, in order from the emission end side of the optical fiber 11, a collector lens 12, a polarizing plate 13, a light beam branching unit 14, a condensing lens 17, a light beam selecting unit 18, a lens 21, and a field of view.
  • a diaphragm 22, a field lens 23, an excitation filter 24, a dichroic mirror 33, and an objective lens 31 are disposed.
  • the light beam branching unit 14 includes a translation mechanism 15 and a diffractive optical element (diffraction grating) 16.
  • the light beam selection unit 18 includes a half-wave plate 19, a light beam selection member 20, and a rotation mechanism 18A. And are provided. Each of the beam splitter 14 and the beam selector 18 is driven by the control device 43.
  • an objective lens 31 In the imaging optical system 30, an objective lens 31, a dichroic mirror 33, an absorption filter 34, and a second objective lens 35 are arranged in this order from the sample 2 side.
  • Specimen 2 is, for example, fluorescent cells (cells stained with a fluorescent dye) arranged on parallel flat glass surfaces, or fluorescent living cells (moving cells stained with fluorescent dyes) present in a petri dish. ) And so on. In this cell, both the first fluorescent region excited by light of wavelength ⁇ 1 and the second fluorescent region excited by light of wavelength ⁇ 2 are expressed.
  • the objective lens 31 is configured as an immersion type (oil immersion type) objective lens in order to enable total reflection fluorescence observation. That is, the gap between the objective lens 31 and the glass of the specimen 2 is filled with the immersion liquid (oil).
  • the image sensor 42 is a two-dimensional image sensor composed of a CCD, a CMOS, or the like.
  • the image sensor 42 captures an image formed on the imaging surface 41 and generates an image. This image is taken into the image storage / arithmetic unit 44 via the control unit 43.
  • the frame period (imaging repetition period) of the image sensor 42 depends on the rate-determining among the imaging time of the image sensor 42 (that is, the time required for charge accumulation and charge readout), the time required for switching the direction of interference fringes, and other required times. Determined.
  • the control device 43 drives and controls the laser unit 100, the position adjusting mechanism 11A, the light beam branching unit 14, the light beam selecting unit 18, and the image sensor 42.
  • the image storage / arithmetic unit 44 performs a calculation on the image given through the control unit 43, stores the calculated image in an internal memory (not shown), and sends it to the image display unit 45.
  • the laser light having a wavelength ⁇ 1 (first laser light) emitted from the first laser light source 101 is incident on the mirror 105 via the shutter 103, it reflects off the mirror 105 and enters the dichroic mirror 106.
  • the laser light having the wavelength ⁇ 2 (second laser light) emitted from the second laser light source 102 enters the beam splitter 106 via the shutter 104 and is integrated with the first laser light.
  • the first laser beam and the second laser beam emitted from the dichroic mirror 106 enter the incident end of the optical fiber 11 through the lens 107.
  • the laser light incident on the incident end of the optical fiber 11 propagates inside the optical fiber 11 to generate a point light source at the output end of the optical fiber 11.
  • the laser light emitted from the point light source is converted into a parallel light beam by the collector lens 12 and is incident on the diffraction grating 16 of the light beam branching section 14 via the polarizing plate 13 and is branched into diffracted light beams of respective orders.
  • These orders of diffracted light beams (hereinafter referred to as “diffracted light beam groups”) are collected by the condenser lens 17 at different positions on the pupil conjugate plane 25.
  • the pupil conjugate plane 25 is the focal position (rear focal position) of the lens 17, and the lens 23 and the lens 21 are arranged with respect to the pupil 32 of the objective lens 31 (the position where the ⁇ first-order diffracted light is condensed). It is a conjugate position.
  • the lens 17 is disposed so that the focal position (back focal position) of the lens 17 coincides with the pupil conjugate plane 25.
  • conjugate position includes a position determined by a person skilled in the art in consideration of design-related matters such as aberrations and vignetting of the lenses 17 and 21 and 23.
  • the polarizing plate 13 can be omitted, but it is effective for reliably cutting off the excess polarization component. Further, in order to increase the utilization efficiency of the laser light, it is desirable that the axis of the polarizing plate 13 coincides with the polarization direction of the laser light emitted from the optical fiber 11.
  • the diffracted light beams of respective orders toward the pupil conjugate plane 25 are incident on the light beam selector 18 disposed in the vicinity of the pupil conjugate plane 25.
  • the light beam selection unit 18 selects only one pair of diffracted light beams (here, ⁇ ) among the incident diffracted light beams of each order. Only the first-order diffracted light beam) is selectively passed.
  • the ⁇ first-order diffracted light beam that has passed through the light beam selection unit 18 forms a conjugate plane with the diffraction grating 16 near the field stop 22 by the lens 21. Thereafter, each of the ⁇ first-order diffracted light beams is converted into convergent light by the field lens 23, further reflected by the dichroic mirror 33 after passing through the excitation filter 24, and condensed at different positions on the pupil plane 32 of the objective lens 31. To do.
  • Each ⁇ 1st-order diffracted light beam collected on the pupil surface 32 becomes a parallel light beam when emitted from the tip of the objective lens 31 and interferes with each other on the surface of the sample 2 to form interference fringes.
  • This interference fringe is used as structured illumination light.
  • the incident angle when entering the surface of the specimen 2 satisfies the evanescent field generation condition.
  • This condition is called a total reflection condition (TIRF condition) or the like.
  • TIRF condition total reflection condition
  • the condensing point of the ⁇ 1st-order diffracted light beam on the pupil surface 32 may be stored in a predetermined annular zone (TIRF region) located on the outermost periphery of the pupil surface 32 (for details) Later).
  • TIRF region predetermined annular zone located on the outermost periphery of the pupil surface 32 (for details) Later).
  • the modulated image is imaged by the image sensor 42 and taken into the image storage / arithmetic unit 44 via the control unit 43. Further, the captured modulation image is subjected to a known demodulation calculation (details will be described later) in the image storage / arithmetic unit 44 to generate a demodulated image (super-resolution image).
  • the super-resolution image is stored in an internal memory (not shown) of the image storage / arithmetic unit 44 and is sent to the image display unit 45.
  • a known demodulation operation for example, a method disclosed in US Pat. No. 8,115,806 is used, which will be described in detail later.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining the light beam branching portion 14
  • FIG. 2A is a view of the diffraction grating 16 of the light beam branching portion 14 as viewed from the optical axis O direction
  • FIG. It is a figure which shows the positional relationship of the condensing point which a 1st-order diffracted light beam forms in a pupil conjugate plane.
  • 2A is a schematic diagram, the structure period of the diffraction grating 16 illustrated in FIG. 2A is not necessarily the same as the actual structure period.
  • the diffraction grating 16 is a diffraction grating having periodic structures in a plurality of different directions within a plane orthogonal to the optical axis O of the illumination optical system 10.
  • the material of the diffraction grating 16 is, for example, quartz glass.
  • the diffraction grating 16 has a periodic structure in each of the first direction V1, the second direction V2, and the third direction V3 that are different by 120 °, and the structural period in these three directions is common. .
  • the periodic structure of the diffraction grating 16 is either a concentration type periodic structure formed using density (transmittance) or a phase type periodic structure formed using steps (phase difference).
  • the phase difference type periodic structure is preferable in that the diffraction efficiency of ⁇ first-order diffracted light is high.
  • Such parallel light beams incident on the diffraction grating 16 are divided into a first diffracted light beam group branched in the first direction V1, a second diffracted light beam group branched in the second direction V2, and a third light beam branched in the third direction V3. It is converted into a diffracted light beam group.
  • the first diffracted light beam group includes a 0th-order diffracted light beam and a ⁇ 1st-order diffracted light beam, and of these, the ⁇ 1st-order diffracted light beams having common orders travel in a symmetric direction with respect to the optical axis O.
  • the second diffracted light beam group includes a 0th-order diffracted light beam and a ⁇ 1st-order diffracted light beam, and of these, the ⁇ 1st-order diffracted light beams having common orders travel in a symmetric direction with respect to the optical axis O. To do.
  • the third diffracted light beam group includes a 0th-order diffracted light beam and a ⁇ 1st-order diffracted light beam, and of these, the ⁇ 1st-order diffracted light beams having common orders travel in a symmetric direction with respect to the optical axis O. To do.
  • the ⁇ 1st order diffracted light beam of the first diffracted light beam group, the ⁇ 1st order diffracted light beam of the second diffracted light beam group, and the ⁇ 1st order diffracted light beam of the third diffracted light beam group are brought into the pupil conjugate plane by the condenser lens 17 described above. Are condensed at different positions.
  • the condensing points 25d and 25g of the first-order diffracted light beams of the first diffracted light beam group are symmetric with respect to the optical axis O, and the arrangement direction of the condensing points 25d and 25g is This corresponds to the first direction V1.
  • the wavelength of the laser light emitted from the optical fiber 11 is ⁇
  • the structural period of the diffraction grating 16 is P
  • the focal length of the lens 17 is fc
  • D is represented by the following formula.
  • the condensing points 25c and 25f of the ⁇ 1st-order diffracted light beams of the second diffracted light beam group are symmetric with respect to the optical axis O, and the arrangement direction of the condensing points 25c and 25f corresponds to the second direction V2. . If the wavelength ⁇ is the same, the height from the optical axis O to the condensing points 25c and 25f of the second diffracted light beam group is from the optical axis O to the condensing points 25d and 25g of the first diffracted light beam group. Is the same as the height of
  • the condensing points 25b and 25e of the ⁇ first-order diffracted light beams of the third diffracted light beam group are symmetric with respect to the optical axis O, and the arrangement direction of the condensing points 25b and 25e corresponds to the third direction V3. . If the wavelength ⁇ is the same, the height from the optical axis O to the condensing points 25b and 25e of the third diffracted light beam group is from the optical axis O to the condensing points 25d and 25g of the first diffracted light beam group. Is the same as the height of
  • a condensing point here is a gravity center position of the area
  • the translation mechanism 15 is composed of a piezo motor or the like.
  • the translation mechanism 15 is a diffraction grating that extends in a direction perpendicular to the optical axis O of the illumination optical system 10 and is non-perpendicular to each of the first direction V1, the second direction V2, and the third direction V3. 16 is translated.
  • the diffraction grating 16 is translated in this direction, the fringe phase of the structured illumination light shifts (details will be described later).
  • 3 and 4 are diagrams for explaining the light beam selector 18.
  • the half-wave plate 19 of the light beam selection unit 18 sets the polarization direction of the incident diffracted light beam of each order
  • the light beam selection member 20 of the light beam selection unit 18 is This is a mask that selectively allows only one group of ⁇ first-order diffracted light beams to pass through among the first to third diffracted light beam groups.
  • the rotation mechanism 18A of the light beam selection unit 18 rotates the light beam selection member 20 around the optical axis O so that the selected ⁇ first-order diffracted light beam is between the first to third diffracted light beam groups.
  • the half-wave plate 19 is rotated around the optical axis O in conjunction with the light beam selection member 20 to change the polarization direction when the selected ⁇ 1st-order diffracted light beams are incident on the sample 2. Keep polarized.
  • the light beam selector 18 switches the stripe direction of the structured illumination light while maintaining the stripe state of the structured illumination light.
  • the rotating mechanism 18A includes, for example, a holding member (not shown) that holds the light beam selection member 20 and can rotate around the optical axis O, and a first (not shown) formed around the holding member. , A second gear (not shown) that meshes with the first gear, and a motor (rotary motor) (not shown) connected to the second gear. When this motor is driven, the second gear rotates, the rotational force is transmitted to the first gear, and the light beam selection member 20 rotates around the optical axis O.
  • the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is ⁇ 1st order diffracted light beam with respect to the branch direction (any one of the first direction V1 to the third direction V3) of the selected ⁇ 1st order diffracted light beam. It is necessary to set so that the polarization direction of
  • the fast axis of the half-wave plate 19 is a direction in which the amount of phase delay when light polarized in the direction of the axis passes through the half-wave plate 19 is minimized. It is.
  • the opening pattern of the light beam selection member 20 includes a first opening portion 20A and a second opening portion 20B through which one and the other of ⁇ first-order diffracted light beams belonging to the same diffracted light beam group are individually passed.
  • the length of each of the first opening 20A and the second opening 20B around the optical axis O is set to a length that allows the linearly polarized diffracted light beam to pass in the above-described direction. Therefore, the shape of each of the first opening 20A and the second opening 20B is a shape close to a partial ring shape.
  • first reference position the rotation position of the half-wave plate 19 when the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is parallel to the direction of the axis of the polarizing plate 13
  • the amount of rotation of the half-wave plate 19 from the first reference position is controlled to one half of the amount of rotation of the light beam selection member 20 from the second reference position. It should be.
  • the rotation amount of the half-wave plate 19 from the first reference position is ⁇ / 2
  • the rotation amount of the light beam selection member 20 from the second reference position is set to ⁇ .
  • the rotation mechanism 18A of the light beam selection unit 18 selects the first-order diffracted light beam (the branch direction is the first direction V1) of the first diffracted light beam group, as shown in FIG.
  • the light beam selection direction of the selection member 20 is rotated rightward from the second reference position by the rotation angle ⁇ 1
  • the fast axis direction of the half-wave plate 19 is rotated rightward from the first reference position. Rotate by angle ⁇ 1 / 2.
  • the polarization direction of the diffracted light beam of each order before passing through the half-wave plate 19 is parallel to the direction of the axis of the polarizing plate 13 as indicated by a broken line double arrow in FIG.
  • the polarization direction of each order diffracted light beam after passing through the half-wave plate 19 is rotated to the right by the rotation angle ⁇ 1
  • the polarization direction of the selected ⁇ 1st order diffracted light beam is As indicated by a solid double-pointed arrow in FIG. 4A, the ⁇ first-order diffracted light beams are perpendicular to the branching direction (first direction V1).
  • the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is a direction according to the branching direction (first direction V1) of the ⁇ first-order diffracted light beam selected by the light beam selection member 20, and is 1/2.
  • the polarization direction (the axial direction of the polarizing plate 13) that the ⁇ 1st-order diffracted light beam incident on the wave plate 19 had, and the polarization direction (first) that the ⁇ 1st-order diffracted light beam emitted from the half-wave plate 19 should have. Is set in the direction of a bisector of an angle formed by (perpendicular to the direction V1).
  • the rotation mechanism 18A of the light beam selector 18 selects the ⁇ first-order diffracted light beam (the branch direction is the second direction V2) of the second diffracted light beam group, as shown in FIG.
  • the light beam selection direction of the selection member 20 is rotated rightward from the second reference position by the rotation angle ⁇ 2
  • the fast axis direction of the half-wave plate 19 is rotated rightward from the first reference position. Rotate by angle ⁇ 2 / 2.
  • the polarization directions of the diffracted light beams of the respective orders before passing through the half-wave plate 19 are parallel to the direction of the axis of the polarizing plate 13 as indicated by the broken line in FIG. 4B.
  • the polarization direction of each order of the diffracted light beam after passing through the half-wave plate 19 is rotated to the right by the rotation angle ⁇ 2, so the polarization direction of the selected ⁇ 1st order diffracted light beam is As shown by the solid line double arrow in FIG. 4B, these are perpendicular to the branching direction (second direction V2) of the ⁇ first-order diffracted light beams.
  • the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is a direction according to the branching direction (second direction V2) of the ⁇ first-order diffracted light beam selected by the light beam selection member 20, and is 1/2.
  • the polarization direction (the axial direction of the polarizing plate 13) that the ⁇ first-order diffracted light beam incident on the wave plate 19 had, and the polarization direction (second) that the ⁇ 1st-order diffracted light beam emitted from the half-wave plate 19 should have. Is set in the bisector direction of the angle formed by (perpendicular to the direction V2).
  • the rotation mechanism 18A of the light beam selector 18 selects the ⁇ first-order diffracted light beam (the branch direction is the third direction V3) of the third diffracted light beam group, as shown in FIG.
  • the light beam selection direction of the selection member 20 is rotated from the second reference position to the left (seen from the sample side; hereinafter the same) by the rotation angle ⁇ 3
  • the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is
  • the first reference position is rotated to the left by the rotation angle ⁇ 3 / 2.
  • the polarization direction of the diffracted light beam of each order before passing through the half-wave plate 19 is parallel to the direction of the axis of the polarizing plate 13 as shown by the broken line in FIG. 4C.
  • the polarization directions of the diffracted light beams of the respective orders after passing through the half-wave plate 19 are rotated to the left by the rotation angle ⁇ 3. Therefore, the polarization directions of the selected ⁇ 1st order diffracted light beams are As shown by the actual double-headed arrow in FIG. 4C, these are perpendicular to the branching direction (third direction V3) of the ⁇ first-order diffracted light beams.
  • the direction of the fast axis of the half-wave plate 19 is a direction according to the branching direction (third direction V3) of the ⁇ first-order diffracted light beam selected by the light beam selection member 20, and is 1/2.
  • the polarization direction (the axial direction of the polarizing plate 13) that the ⁇ 1st-order diffracted light beam incident on the wave plate 19 had, and the polarization direction (third) that the ⁇ 1st-order diffracted light beam emitted from the half-wave plate 19 should have.
  • the direction of the bisector of the angle formed by perpendicular to the direction V3.
  • the rotation mechanism 18A of the light beam selection unit 18 only needs to interlock the half-wave plate 19 and the light beam selection member 20 with a gear ratio of 2: 1.
  • the rotatable half-wave plate 19 is used to keep the ⁇ first-order diffracted light beam incident on the specimen 2 as S-polarized light.
  • a fixedly arranged liquid crystal element may be used, and the liquid crystal element may function as the half-wave plate 19. If the orientation of the liquid crystal element is electrically controlled, the refractive index anisotropy of the liquid crystal element can be controlled, so that the fast axis as a half-wave plate can be rotated around the optical axis O.
  • there are other methods for keeping the ⁇ first-order diffracted light beam incident on the specimen 2 in S-polarized light (described later).
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the function of the light beam selection unit 18 described above.
  • a double arrow surrounded by a circular frame indicates the polarization direction of the light beam
  • a double arrow surrounded by a square frame indicates the axial direction of the optical element.
  • a plurality of (six in the example shown in FIG. 6) notches 20C are formed on the outer peripheral portion of the light flux selecting member 20, and the rotation mechanism 18A includes these notches 20C.
  • a timing sensor 20D for detecting the notch 20C is provided.
  • the rotation mechanism 18A can detect the rotation position of the light beam selector 18 and thus the rotation position of the half-wave plate 19.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the operation of the translation mechanism 15 of the light beam branching section 14.
  • the modulated image generated by the structured illumination microscope apparatus 1 includes, in the structure of the sample 2, the 0th order modulation component, the + 1st order modulation component, which is the structure information whose spatial frequency is modulated by the structured illumination light, ⁇ 1 This is because the next modulation component is included, and in order to make these three unknown parameters known by demodulation calculation (details will be described later), the number of modulated images equal to or greater than the number of these unknown parameters is required.
  • the translation mechanism 15 of the light beam splitting unit 14 is in a direction perpendicular to the optical axis O of the illumination optical system 10 as shown in FIG.
  • the diffraction grating 16 is shifted in a non-perpendicular direction (x direction) with respect to all of the first direction V1, the second direction V2, and the third direction V3.
  • the shift amount L of the diffraction grating 16 necessary for shifting the phase of the interference fringes by a desired shift amount ⁇ is the same as when the light beam selection direction by the light beam selection unit 18 is the first direction V1 and in the second direction V2. And when in the third direction V3 are not necessarily the same.
  • the structural period of each of the first direction V1, the second direction V2, and the third direction V3 of the diffraction grating 16 is P, and the shift direction (x direction) of the diffraction grating 13 and the first direction.
  • the angle formed by the direction V1 is set as ⁇ 1
  • the angle formed by the shift direction (x direction) of the diffraction grating 16 and the second direction V2 is set as ⁇ 2
  • the shift amount L in the x direction of the diffraction grating 16 necessary for setting the phase shift amount of the interference fringes to a desired value ⁇ is the wavelength selection direction (the first direction V1, the second direction V2, and the third direction V3). Any one) and the angle ⁇ formed by the x direction are expressed as shown in Expression (1).
  • the shift amount L in the x direction of the diffraction grating 16 necessary for setting the phase shift amount ⁇ of the interference fringes to 2 ⁇ is P / (a ⁇ 2 ⁇
  • the phase of the structured illumination light can be shifted by one period only by shifting the diffraction grating 16 by a half period (because the fringe period of the interference fringes composed of ⁇ first-order diffracted light is 2 of the structural period of the diffraction grating 16. Equivalent to twice).
  • the used wavelength ⁇ can be switched between ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • the diffraction angle of the ⁇ first-order diffracted light generated in the diffraction grating 16 also varies, for example, as shown by the dotted line and the solid line in FIG.
  • the height from the optical axis O to the condensing point of the ⁇ first-order diffracted light on the pupil plane 32 is, for example, a white point and a black point in FIG. It fluctuates as shown in.
  • the converging point of the ⁇ first-order diffracted light may deviate from the TIRF region by switching the use wavelength ⁇ .
  • the lenses 17, 21, and 23 (hereinafter referred to as “collecting optical system”) positioned between the diffraction grating 16 and the objective lens 31 in the illumination optical system 10 are predetermined. Chromatic aberration of magnification is given. This lateral chromatic aberration is set so that the condensing point of ⁇ first-order diffracted light continues to fall within the TIRF region regardless of switching of the wavelength ⁇ used. This will be described in detail below.
  • FIG. 9 is a configuration diagram of the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23).
  • each of the lenses 17, 21, and 23 is a single cemented lens formed by cementing a convex lens and a concave lens, and the entire condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) is used.
  • the following conditional expression is satisfied regardless of the switching of the wavelength ⁇ .
  • dY ( ⁇ ) is the chromatic aberration of magnification at the wavelength ⁇ of the condensing optical system at an image height of 2f ⁇ ⁇ 0 / P, where ⁇ 0 is the reference wavelength of the used wavelength ⁇ .
  • fo is the focal length of the objective lens 31
  • f is the focal length of the entire focusing optical system (lenses 17, 21, and 23)
  • P is the structural period of the diffraction grating 16
  • NA is the numerical aperture of the objective lens 31
  • M is the number of directions of the periodic structure of the diffraction grating 16
  • nw is the refractive index of the sample 2.
  • nw is substantially equal to the refractive index of water.
  • M 3.
  • conditional expression (2)
  • the diffraction angle ⁇ of the first-order diffracted light generated in the diffraction grating 16 according to the laser light having the wavelength ⁇ used is shown in FIG. It is expressed as follows. That is, the diffraction angle ⁇ of the first-order diffracted light is expressed by the following formula.
  • conditional expression (2) is a conditional expression for keeping the condensing point of ⁇ first-order diffracted light in the TIRF region (maintaining the TIRF condition) regardless of switching of the used wavelength ⁇ . .
  • FIG. 11 shows lens data of the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) of the present embodiment
  • FIG. 12 shows a condition correspondence table of the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) of the present embodiment. It is.
  • the reference wavelength ⁇ 0 is 588 nm.
  • the third row from the bottom of FIG. 12 shows the lateral chromatic aberration dY (405) for 405 nm, the lateral chromatic aberration dY (436) for 436 nm, the lateral chromatic aberration dY (486) for 486 nm, the lateral chromatic aberration dY (588) for 588 nm, and the lateral chromatic aberration for 656 nm.
  • dY (656) is shown.
  • each of these lateral chromatic aberrations dY (405), dY (436), dY (486), dY (588), and dY (656) is a conditional expression. Satisfies (2).
  • the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) of the present embodiment can change the condensing point of ⁇ first-order diffracted light even if the operating wavelength ⁇ is switched between 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm. It is possible to keep it in the TIRF region (maintaining the TIRF condition).
  • the height from the optical axis O to the focal point on the pupil plane 32 is shown for each wavelength as follows.
  • the height is 2.95 mm at a wavelength of 405 nm, the height is 2.79 mm at a wavelength of 436 nm, the height is 2.70 mm at a wavelength of 486 nm, the height is 2.82 mm at a wavelength of 588 nm, and the height is 2.98 mm at a wavelength of 656 nm. is there.
  • the height from the optical axis O to the condensing point is a predetermined value or more ( 2.70 mm or more), and its height falls within a predetermined range (within a range of 2.70 mm to 2.98 mm).
  • the height from the optical axis O to the condensing point is maintained at a predetermined value or more (2.70 mm or more), and the deviation between the wavelengths of that height is maintained.
  • Chromatic aberration of magnification of the condensing optical system is adjusted so that is within a predetermined value (about 0.5 mm or less).
  • the two wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 emitted from the laser unit 100 may be selected as any two of 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm.
  • the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) of the present embodiment has a predetermined lateral chromatic aberration (three steps from the bottom in FIG. 12) in order to maintain the TIRF condition regardless of switching of the used wavelength ⁇ .
  • the axial chromatic aberration of the condensing optical system (lenses 17, 21, 23) of this embodiment is in the range of ⁇ 0.119 mm to +0.586 mm as shown in FIG. (Approximately 0.8 mm).
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment it is possible to omit the focus adjustment of the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) when switching the use wavelength ⁇ .
  • focus adjustment may be performed when the use wavelength ⁇ is switched.
  • This focus adjustment is performed by adjusting the position of the exit end of the optical fiber 11 in the optical axis O direction by the position adjusting mechanism 11A or by adjusting the position of at least one of the lenses 17, 21, and 23 in the optical axis O direction. be able to.
  • the position adjustment of the diffraction grating 16 in the optical axis O direction may be performed as necessary.
  • the number of wavelengths of laser light that can be emitted from the laser unit 100 is two, but may be three or more. In that case, the three wavelengths emitted by the laser unit 100 may be selected from any one of 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm.
  • the wavelength of the laser beam that can be emitted by the laser unit 100 is selected from 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm. However, it is selected as an arbitrary wavelength within the range of 405 nm to 656 nm. Also good. This is because the condensing optical system (lenses 17, 21, and 23) of the present embodiment satisfies the conditional expression (2) for an arbitrary use wavelength within a range of 405 nm to 656 nm.
  • the chromatic aberration of magnification such that the focal point stays in the TIRF region regardless of the switching of the used wavelength ⁇ is obtained. 23), but when the TIRF is not necessary (that is, when the structured illumination microscope apparatus 1 is used in the SIM mode instead of the TIRF-SIM mode), the focal point is not within the TIRF region. It doesn't matter.
  • the diffraction grating 16 inserted in the optical path is It is only necessary to switch between the diffraction grating for the TIRF-SIM mode and the diffraction grating for the SIM mode.
  • the structural period differs between the diffraction grating for the TIRF-SIM mode and the diffraction grating for the SIM mode.
  • the super-resolution effect SR is the ratio SR of the resolution R of the structured illumination microscope apparatus when the sample is not modulated and the resolution (R + K) of the structured illumination microscope apparatus when the sample 5 is modulated. (R + K) / R.
  • K 2d / ⁇ ⁇ (fo ⁇ ⁇ ) with respect to the focal length fo of the objective lens.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 is equipped with a function of separating and detecting a plurality of fluorescence having different wavelengths.
  • the structured illumination microscope apparatus of the present embodiment is a modification of the structured illumination microscope apparatus of the first embodiment, differences from the first embodiment will be described here.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 is used in the total reflection illumination fluorescence observation mode (TIRF-SIM mode) with structured illumination.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 according to the present embodiment uses structured illumination. It is possible to switch between the total reflection illumination fluorescence observation mode (TIRF-SIM mode) and the total reflection illumination fluorescence observation mode (TIRF mode) by unstructured illumination.
  • the specimen 2 can be observed with a high resolution, it is necessary to perform imaging for a plurality of frames in order to obtain a super-resolution image of one frame. Further, if the number of directions M of the periodic structure of the diffraction grating 16 is 2 or more (if a plurality of pairs of diffracted lights are generated simultaneously), the frame rate when acquiring a series of modulated images can be increased. Since only one pair of diffracted light contributes to each modulated image, the utilization efficiency of laser light is poor.
  • the specimen 2 cannot be observed with high resolution, there is an advantage that it does not take time because it is not necessary to perform imaging for a plurality of frames in order to obtain an observation image of one frame. Further, since the laser light is guided to the specimen 2 without using the diffraction grating 16, the utilization efficiency of the laser light is high.
  • FIG. 14 and 15 are configuration diagrams of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment.
  • FIG. 14 shows the TIRF-SIM mode
  • FIG. 15 shows the TIRF mode.
  • the beam splitter 14 (diffraction grating 16) can be inserted into and removed from the optical path of the illumination optical system 10.
  • a condenser lens 17A for the TIRF-SIM mode and a condenser lens 17B for the TIRF mode are disposed so as to be interchangeable.
  • the lens 21A for the TIRF-SIM mode and the lens 21B for the TIRF mode are arranged interchangeably as the lens 21.
  • the condensing optical system in the TIRF-SIM mode includes the condensing lens 17A, the lens 21A, and the field lens 23, and the condensing optical system in the TIRF mode (FIG. 15) includes the condensing lens 17B, The lens 21B and the field lens 23 are used (the field lens 23 is shared by both modes of the condensing optical system).
  • the ⁇ first-order diffracted light generated by the diffraction grating 16 behaves in the same manner as that in the first embodiment, so that ⁇ first-order diffracted light is formed on the pupil plane 32.
  • the focal point falls within the TIRF region (FIG. 8B).
  • the emission end (laser light secondary light source) of the optical fiber 11 is removed from the optical axis O, and the height from the optical axis O to the secondary light source is the secondary light source.
  • the laser light emitted from is adjusted so as to form a condensing point in the TIRF region (FIG. 8B).
  • the rotation position of the light beam selection member 20 in the TIRF mode is set to a position that does not obstruct the optical path of the laser light toward the TIRF region (FIG. 8B).
  • FIG. 16A is a configuration diagram of the condensing optical system (lenses 17A, 21A, and 23) in the TIRF-SIM mode
  • FIG. 16B is a condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) is a configuration diagram.
  • each of the lenses 17A and 21A in the TIRF-SIM mode is composed of three cemented lenses.
  • each of the lenses 17B and 21B in the TIRF mode is Consists of a single cemented lens.
  • the chromatic aberration of magnification that satisfies the conditional expression (2) is given to the entire condensing optical system (lenses 17A, 21A, and 23) in the TIRF-SIM mode regardless of switching of the used wavelength ⁇ .
  • the diffraction grating 16 since the diffraction grating 16 is not used, the phenomenon shown in FIG. 8 (diffraction angle fluctuation due to wavelength switching) does not occur if the condensing optical system is aberration-free. For this reason, the overall lateral chromatic aberration of the condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) in the TIRF mode is minimized.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment can maintain the TIRF condition regardless of switching between the TIRF-SIM mode and the TIRF mode and switching of the used wavelength ⁇ in each mode.
  • FIG. 17 shows lens data of the condensing optical system (lenses 17A, 21A, 23) in the TIRF-SIM mode of this embodiment
  • FIG. 18 shows the condensing optical system (lens of the TIRF-SIM mode of this embodiment).
  • 17A, 21A, 23) is a condition correspondence table.
  • the condensing optical system (lenses 17A, 21A, 23) in the TIRF-SIM mode of the present embodiment maintains the TIRF condition even when the operating wavelength ⁇ is switched between 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm. Is possible.
  • the height from the optical axis O to the focal point on the pupil plane 32 is shown for each wavelength as follows.
  • the height is 2.97 mm at a wavelength of 405 nm, the height is 2.80 mm at a wavelength of 436 nm, the height is 2.71 mm at a wavelength of 486 nm, the height is 2.82 mm at a wavelength of 588 nm, and the height is 2.98 mm at a wavelength of 656 nm. is there.
  • the height from the optical axis O to the condensing point is a predetermined value or more ( 2.71 mm or more) and the height falls within a predetermined range (2.71 mm to 2.98 mm).
  • the height from the optical axis O to the condensing point is maintained at a predetermined value or more (2.71 mm or more), and the deviation between the wavelengths of the height is maintained.
  • Chromatic aberration of magnification of the condensing optical system is adjusted so that is within a predetermined value (about 0.5 mm or less).
  • the two wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 emitted from the laser unit 100 may be selected as any two of 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm.
  • the condensing optical system (lenses 17A, 21A, 23) in the TIRF-SIM mode of the present embodiment has a predetermined lateral chromatic aberration (from the bottom of FIG. 18) in order to maintain the TIRF condition regardless of the switching of the use wavelength ⁇ .
  • the axial chromatic aberration of this condensing optical system (lenses 17A, 21A, 23) is in the range of ⁇ 0.105 mm to +0.019 mm as shown in FIG. About 0.15 mm).
  • the structured illumination microscope apparatus 1 in the TIRF-SIM mode of the present embodiment can omit the focus adjustment of the condensing optical system (lenses 17A, 21A, and 23) when the used wavelength ⁇ is switched.
  • focus adjustment may be performed when the used wavelength ⁇ is switched in the TIRF-SIM mode.
  • This focus adjustment is performed by adjusting the position of the exit end of the optical fiber 11 in the optical axis O direction by the position adjusting mechanism 11A or by adjusting the position of at least one of the lenses 17A, 21A, and 23 in the optical axis O direction. be able to.
  • the position adjustment of the diffraction grating 16 in the optical axis O direction may be performed as necessary.
  • FIG. 20 shows lens data of the condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) in the TIRF mode of the present embodiment.
  • FIG. 21 shows condensing optical systems (lenses 17B, 21B, and 23) in the TIRF mode of the present embodiment. 23) lateral chromatic aberration.
  • each of the lateral chromatic aberrations dY (405), dY (436), dY (486), dY (588), and dY (656) in the TIRF mode is extremely narrow from ⁇ 0.0012 mm to +0.0031 mm. It is in range. That is, the lateral chromatic aberration in the TIRF mode is suppressed to near zero.
  • the condensing optical system in the TIRF mode of the present embodiment maintains the TIRF condition even when the operating wavelength ⁇ is switched between 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm. Is possible.
  • the position of the optical fiber is adjusted so that the height from the optical axis O to the condensing point on the pupil plane 32 is 2.7 mm when the use wavelength ⁇ is 561 nm.
  • the height from the optical axis O to the condensing point is shown for each wavelength as follows.
  • the height is 2.7031 mm at a wavelength of 405 nm
  • the height is 2.7002 mm at a wavelength of 436 nm
  • the height is 2.6688 mm at a wavelength of 486 nm
  • the height is 2.7 mm at a wavelength of 588 nm
  • the height is 2.7014 mm at a wavelength of 656 nm. is there.
  • the height from the optical axis O to the condensing point is a predetermined value or more (The height is maintained within a predetermined range (within a range of 2.6688 to 2.7031 mm, that is, within a range of 2.7 + 0.0031 mm to 2.7 ⁇ 0.0012 mm).
  • the height from the optical axis O to the focal point is maintained at a predetermined value or more (2.6688 mm or more), and the deviation between the wavelengths of the height is maintained.
  • the chromatic aberration of magnification of the condensing optical system is adjusted so as to be within a predetermined value (about 0.01 mm or less).
  • the two wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 emitted from the laser unit 100 may be selected as any two of 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm.
  • the axial chromatic aberration of the condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) in the TIRF mode of the present embodiment is within the range (about 0.4 mm) from ⁇ 0.192 mm to +0.184 mm as shown in FIG. ing.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 in the TIRF mode of the present embodiment can omit the focus adjustment of the condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) when the used wavelength ⁇ is switched.
  • focus adjustment may be performed when the used wavelength ⁇ is switched in the TIRF mode.
  • This focus adjustment is performed by adjusting the position of the exit end of the optical fiber 11 in the optical axis O direction by the position adjusting mechanism 11A or by adjusting the position of at least one of the lenses 17B, 21B, and 23 in the optical axis O direction. be able to.
  • the position of the diffraction grating 16 in the optical axis direction may be adjusted as necessary.
  • the number of wavelengths of laser light that can be emitted from the laser unit 100 is two, but may be three or more. In that case, the three wavelengths emitted by the laser unit 100 may be selected from any one of 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm.
  • the wavelength of the laser beam that can be emitted by the laser unit 100 is selected from 405 nm, 436 nm, 486 nm, 588 nm, and 656 nm. However, it is selected as an arbitrary wavelength within the range of 405 nm to 656 nm. Also good.
  • the condensing optical system (lenses 17A, 21A, 23) in the TIRF-SIM mode of the present embodiment satisfies the conditional expression (2) for any wavelength used within the range of 405 nm to 656 nm, and the TIRF of the present embodiment
  • the condensing optical system (lenses 17B, 21B, and 23) in the mode lateral chromatic aberration is suppressed in the wavelength range of 405 nm to 656 nm.
  • TIRF-SIM mode of the present embodiment in order to perform total reflection fluorescence observation (TIRF), a chromatic aberration of magnification that keeps the condensing point within the TIRF region regardless of switching of the used wavelength ⁇ is obtained. (If applied to the lenses 17A, 21A, and 23), but the TIRF is not necessary (that is, when the structured illumination microscope apparatus 1 is used in the SIM mode instead of the TIRF-SIM mode), the focal point is in the TIRF region. You don't have to be in
  • the super-resolution effect can be set to 1.75 or more.
  • the lower limit of the conditional expression is set to (0.8 ⁇ af ⁇ / P). More preferably.
  • the diffraction grating 16 inserted in the optical path is You may switch between the diffraction grating for TIRF-SIM mode and the diffraction grating for SIM mode.
  • the structural period differs between the diffraction grating for the TIRF-SIM mode and the diffraction grating for the SIM mode.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 is equipped with a function of separating and detecting a plurality of fluorescence having different wavelengths.
  • the structured illumination microscope apparatus of the present embodiment is a modification of the structured illumination microscope apparatus of the first embodiment, differences from the first embodiment will be mainly described here.
  • a chromatic aberration of magnification is generated in the condensing optical system, thereby causing a deviation between wavelengths of the height from the optical axis O to the condensing point on the pupil plane of the objective lens (deviation caused by a diffraction angle difference).
  • the shift between the wavelengths of the height from the optical axis O to the condensing point on the pupil conjugate plane of the objective lens (the shift due to the diffraction angle difference), that is, the arrangement of the optical path selection member
  • the shift between the wavelengths of the height from the optical axis O to the condensing point on the surface is suppressed (the shift due to the diffraction angle difference).
  • the illuminating device of the structured illumination microscope includes the structured illuminating device and another illuminating device (for example, It is possible to switch to a normal illumination device, and there is also a system configuration advantage that other illumination devices (for example, an ordinary illumination device) can share a part of the structured illumination device. .
  • FIG. 24 is a configuration diagram of the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment.
  • elements having the same functions as those shown in FIG. 24 are identical to elements having the same functions as those shown in FIG. 24.
  • the diffraction grating 16 and the translation mechanism 15 of the light beam branching section 14 are disposed on a uniaxial stage 51 whose position can be adjusted in the optical axis O direction.
  • the amount of movement of the diffraction grating 16 and the translation mechanism 15 on the optical axis O by the uniaxial stage 51 is controlled by the control device 43.
  • a mirror 52 is inserted in the optical path between the optical path selection unit 18 and the lens 321, and the mirror 52 is configured to be detachable from the optical path.
  • the illumination device of the structured illumination microscope 1 functions as a normal epifluorescent illumination device, not a structured illumination device.
  • the functions of the lens 317, the lens 321, and the field lens 323 shown in FIG. 24 correspond to the functions of the lens 17, the lens 21, and the field lens 23 in the first embodiment, respectively. Since the correction state is different from the correction state of the lateral chromatic aberration in the first embodiment, a different number is assigned.
  • a fiber light source device 61 using a mercury lamp as a light source includes a fiber light source device 61 using a mercury lamp as a light source, a second optical fiber 62, a collector lens 63, a relay lens 64, an ND filter 65, and an aperture stop 66. And are arranged.
  • the light from the fiber light source device 61 is introduced as illumination light onto the optical axis O ′ of the epi-fluorescent illumination device 60 via the second optical fiber 62.
  • the illumination light is converted into parallel light by the collector lens 63, and forms a light source image at the position of the aperture stop 66 under the action of the relay lens 64.
  • the ND filter 65 of the epi-fluorescent illumination device 60 is used for adjusting the brightness of the epi-fluorescent illumination device 60.
  • the illumination light from the epi-fluorescent illumination device 60 is reflected by the mirror 52, then passes through the lens 321, the field stop 22, and the field lens 323, further passes through the excitation filter 24, and then is reflected by the dichroic mirror 33, and the objective lens.
  • a light source image image of the emission end of the second optical fiber 62
  • the specimen 2 is illuminated uniformly through the objective lens 31. That is, the epi-illumination fluorescent illumination device 60 uniformly illuminates the specimen 2 using the lens 321 and the field lens 323 of the structured illumination device (illumination optical system 10).
  • fluorescence is generated from the fluorescent region of the sample 2.
  • the fluorescence generated in the fluorescent region is converted into parallel light by the objective lens 31 as in the first embodiment, and then transmitted through the dichroic mirror 33 and the barrier filter 34, and the imaging element 42 via the second objective lens 35.
  • a fluorescent image of the specimen 2 is formed on the imaging surface 41 of the sample.
  • the wavelengths of the first laser light source 101 and the second laser light source 102 used in the illumination optical system 10 and the wavelength of the fiber light source device 61 used in the epi-illumination fluorescent illumination device 60 are different, they are as follows. That's fine.
  • a fluorescent cube 72 formed by integrating the excitation filter 24, the dichroic mirror 33, and the barrier filter 34 is prepared, and a fluorescent cube 73 having a separation wavelength different from that of the fluorescent cube 72 is prepared.
  • the fluorescent cube turret 70 is attached.
  • the fluorescent cube turret 70 is rotatable around a predetermined axis 71, and when the cube turret 70 rotates around the axis 71 by a predetermined angle, the fluorescent cube arranged on the optical axis O of the objective lens 31 becomes a fluorescent cube. Switch between 72 and 73.
  • the lens members of the collector lens 63 and the relay lens 64 of the epi-illumination fluorescent illumination device 60 those having corrected aberrations are used in the same manner as lenses generally used in the epi-illumination fluorescent illumination device of an inverted microscope. Accordingly, the lens member of the lens 321 and the field lens 323 used for the epi-illumination of the epi-illumination fluorescent device 60 is also subjected to aberration correction (magnification) as in the case of the lens generally used in the epi-fluorescence illumination device of the inverted microscope. The chromatic aberration is corrected to approximately zero).
  • the function of correcting the converging position deviation on the pupil plane due to the diffraction angle difference between a plurality of wavelengths by the lateral chromatic aberration is applied to the entire condensing optical system (lenses 17, 21, and 23).
  • the lens 317 it is necessary to apply only to the lens 317, not to the entire condensing optical system (lenses 317, 321, 323). This will be described in detail below.
  • equation (2) is the following equation (2), as in the first embodiment.
  • dY ( ⁇ ) is the chromatic aberration of magnification at the wavelength ⁇ of the condensing optical system at an image height of 2f ⁇ ⁇ 0 / P, where ⁇ 0 is the reference wavelength of the used wavelength ⁇ .
  • fo is the focal length of the objective lens 31
  • f is the focal length of the entire condensing optical system (lenses 317, 321, and 323)
  • P is the structural period of the diffraction grating 16
  • NA is the numerical aperture of the objective lens 31
  • M is the number of directions of the periodic structure of the diffraction grating 16
  • nw is the refractive index of the sample 2.
  • FIG. 25 is a configuration diagram of the lens 317 of the present embodiment.
  • the configuration of the lens 317 of this embodiment is a three-group six-lens configuration.
  • the optical surfaces r 1 and r 2 indicate the optical surfaces of the diffraction grating 16, and it is assumed that a step serving as the diffraction grating is imprinted on the r 1 surface of the parallel plate.
  • the lens 317 has a three-group configuration in the present embodiment in order to impart lateral chromatic aberration necessary for the condensing optical system to the lens 317 alone. is there.
  • FIG. 26 shows lens data of the lens 317.
  • FIG. 27 shows the light ray height of each wavelength on the arrangement surface (pupil conjugate surface) of the light beam selection member 20 (this height is determined by the power of the lens 317), lens The focal lengths of the lens 321 and the field lens 323, the projection magnification from the arrangement surface of the light beam selection member 20 to the pupil plane 32, and the height of the condensing point on the pupil plane 32 of the objective lens 31 from the optical axis O are shown.
  • the light beam selection unit 18 is conjugate with the pupil plane 32 of the objective lens 31, and the projection magnification from the arrangement surface of the light beam selection member 20 onto the pupil plane 32 is the ratio of the power of the lens 321 and the field lens 323.
  • FIG. 28 is a condition correspondence table of the condensing optical system (lenses 317, 321, 323) of the present embodiment.
  • the wavelength of the first laser light source 101 is 486 nm
  • a laser light source with a wavelength of 405 nm and a laser light source with a wavelength of 436 nm can be mounted as the second laser light source 102.
  • the reference wavelength ⁇ 0 is 486 nm
  • the used wavelengths ⁇ are 405 nm and 436 nm.
  • the third row from the bottom of FIG. 28 shows lateral chromatic aberrations dY (405) and dY (436) for 405 nm and 436 nm.
  • the condensing optical system (lenses 317, 321, and 323) of the present embodiment allows the ⁇ first-order diffracted light generated in the diffraction grating 16 to be the objective lens even when the wavelength ⁇ used is switched between 405 nm, 436 nm, and 486 nm. It is possible to keep the condensing points formed on the 31 pupil planes 32 in the TIRF region (maintaining the TIRF condition).
  • the height from the optical axis of the condensing point on the pupil plane 32 is substantially the same between the wavelengths (height is 2.85 mm to 2.88 mm). That is, it can be said that the chromatic aberration of magnification is adjusted so that the deviation between the wavelengths of the height of the condensing point is sufficiently within a range of about 0.5 mm and the deviation is substantially zero.
  • the two wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 2 emitted from the laser unit 100 may be selected as any two of 405 nm, 436 nm, and 486 nm.
  • the condensing optical system (lenses 317, 321, and 323) of the present embodiment has a predetermined lateral chromatic aberration (third stage from the bottom in FIG. 28), as shown in FIG. 29, the longitudinal chromatic aberration is shown. Also have. In FIG. 29, the axial chromatic aberration of the lens 317 in the vicinity of the arrangement surface (pupil conjugate plane) of the light beam selection member 20 and the axial chromatic aberration of the lens 317 in the vicinity of the arrangement surface of the light beam branching section 14 (the direction of ray tracing is shown). Reverse direction).
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment needs to perform two focus adjustments when switching the use wavelength ⁇ .
  • the first focus adjustment is a focus adjustment for adjusting the condensing position (position in the optical axis direction) on the pupil plane 32, and the position of the emission end of the optical fiber 11 in the optical axis direction is adjusted by the position adjusting mechanism 11A. Can be done by adjusting.
  • the actual amount of movement of the exit end of the optical fiber 11 is a value obtained by multiplying the amount of movement described in FIG. 29 by the reciprocal of the vertical magnification of the optical system from the exit end of the optical fiber 11 to the light beam selector 18.
  • the second focus adjustment is a focus adjustment of interference fringes (structured illumination) formed on the specimen 2, and the uniaxial stage 51 on which the light beam splitting unit 14 is mounted is driven to the optical axis direction of the diffraction grating 16. This can be done by adjusting the position.
  • the actual driving amount of the uniaxial stage 51 has the same value as the movement amount described in FIG.
  • the focus adjustment amount for each wavelength is preferably measured in advance by calibration at the time of setup and stored in the control device 43. In this way, focus adjustment at the time of wavelength switching can be speeded up.
  • the chromatic aberration of magnification is applied to the lens 317 of the condensing optical system so that the condensing point stays in the TIRF region regardless of the switching of the use wavelength ⁇ .
  • the TIRF is not necessary (that is, when the structured illumination microscope apparatus 1 is used in the SIM mode instead of the TIRF-SIM mode)
  • the focusing point may not be within the TIRF region. The same as in the first embodiment.
  • structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment can be modified as appropriate, similarly to the structured illumination microscope apparatus 1 of the first embodiment or the second embodiment.
  • the half-wave plate 19 that can be rotated around the optical axis is used.
  • a quarter-wave plate and a quarter-wave plate that can rotate around the optical axis may be used.
  • the rotation position of the quarter-wave plate with the first reference position as a reference is set to be the same as the rotation position of the light beam selection member 20 with the second reference position as a reference.
  • the diffraction grating 16 having the number of directions M of the periodic structure of 2 or more, that is, diffraction that simultaneously generates a plurality of diffraction light beam groups having different branch directions.
  • the grating 16 (see FIG. 2A) is used, a diffraction grating having a periodic structure direction number M of 1, that is, a diffraction grating that generates only one group of diffracted light beams having a common branching direction is used. Also good.
  • the diffraction grating may be rotated around the optical axis in order to switch the direction of the interference fringes.
  • a non-movable zero-order light cut mask may be used instead of the rotatable light beam selection member 20.
  • the 0th-order light cut mask is a mask that transmits ⁇ first-order diffracted light and cuts 0th-order diffracted light and second-order and higher-order diffracted light.
  • the diffractive means (16) may be a diffraction grating having a periodic structure over a single direction perpendicular to the optical axis, in which case the specimen (2)
  • a rotating unit (not shown) that rotates the incident direction of the pair of light fluxes about the optical axis may be further provided.
  • the interference fringes formed on the sample 2 in the TIRF-SIM mode are two-beam interference fringes (that is, the 2D-SIM mode), but the interference fringes formed on the sample 2 are three-beam interference fringes.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 may be equipped with the SIM mode (that is, the 3D-SIM mode).
  • a light beam selection member 20 'as shown in FIG. 23 may be used instead of the light beam selection member 20 shown in FIG.
  • This light beam selection member 20 ' is the same as the light beam selection member 20 shown in FIG. 6, but is provided with an opening 20E for passing the 0th-order diffracted light beam.
  • the opening 20E is formed in the vicinity of the optical axis, and the shape of the opening 20E is, for example, a circle. According to such a light beam selection member 20 ', not only the ⁇ 1st order diffracted light beam but also the 0th order diffracted light beam can contribute to the interference fringes.
  • the interference fringes generated by the interference of the three diffracted light beams are spatially modulated not only in the surface direction of the sample 2 but also in the depth direction of the sample 2. Therefore, according to this interference fringe, it is possible to obtain a super-resolution effect also in the depth direction of the specimen 2.
  • the interference fringes formed on the specimen 2 in the TIRF-SIM mode are two-beam interference fringes
  • the + 1st order diffracted light beam and the ⁇ 1st order diffraction light are used as the diffracted light beams contributing to the structured illumination light.
  • the interference fringes formed on the specimen 2 in the 3D-SIM mode are the three-beam interference fringes
  • the + 1st-order diffracted light beam and the ⁇ 1st-order diffracted light beam are used as the diffracted light beams contributing to the structured illumination light.
  • a combination of a light beam and a zero-order diffracted light beam is used, it goes without saying that other combinations may be used.
  • three-beam interference caused by three diffracted lights having the same diffraction order interval may be generated.
  • zero-order diffracted light, first-order diffracted light, and second-order diffracted light A combination of ⁇ 2nd order diffracted light and 0th order diffracted light, a combination of ⁇ 3rd order diffracted light and 0th order diffracted light, and the like can be used.
  • the illumination optical system 10 of the first to third embodiments is configured by an epi-illumination optical system using the objective lens 31, the present invention is not limited to this, and transmission / reflection illumination using a condenser lens instead of the objective lens 31 is possible. You may comprise with an optical system. In this case, the condensing point is formed on the pupil plane of the condenser lens.
  • the light beam branching unit of the first to third embodiments uses a diffraction grating as means for branching the light beam.
  • a spatial light modulator SLM that functions as a phase diffraction grating (SLM).
  • a combination of a control unit that supplies a drive signal to the spatial light modulator may be used.
  • the controller can switch the structure period (structure period as a diffraction grating) of the spatial light modulator at high speed by switching the drive signal applied to the spatial light modulator.
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment diffracts a light beam emitted from a light source (laser unit 100) that emits light of a plurality of wavelengths simultaneously or sequentially.
  • the optical system (illumination optical system 10) includes a first optical system (objective lens 31) and the plurality of diffracted light beams as pupil surfaces (32) or near the pupil of the first optical system (objective lens 31). And a second optical system (condensing optical systems 17, 21, 23, 317, 321, 323) for condensing light at each position on the surface, and a magnification characteristic dY ( ⁇ of the second optical system for the plurality of wavelengths ) Satisfies the following conditions.
  • the magnification characteristic (chromatic chromatic aberration) of the second optical system (condensing optical systems 17, 21, 23, 317, 321, 323) with respect to the plurality of wavelengths is such that the condensing position of each of the plurality of wavelengths is
  • the predetermined area is a TIRF area for generating an evanescent field due to the interference fringes in the vicinity of the sample plane.
  • the structured illumination microscope apparatus (1) of the embodiment described above can observe an extremely thin layer on the surface of the specimen (2) at each of a plurality of wavelengths.
  • the diffractive portion (diffraction grating 16) can be inserted into and removed from the optical path of the exit optical path, and the second optical system (17A, 21A, 23) is another second optical device having different magnification characteristics. It is possible to replace the system (condensing optical system 17B, 21B, 23).
  • the mode of the structured illumination microscope apparatus 1 of the above-described embodiment can be switched between the TIRF-SIM mode and the TIRF mode.
  • the replacement target of the second optical system (the condensing optical systems 17A, 21A, and 23) is a part of the elements (17A and 21A) of the second optical system. is there.
  • At least the elements (17A, 21A) to be exchanged in the second optical system are configured by cemented lenses. .
  • magnification characteristic of the second optical system can be switched reliably.
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment may further include a control unit that switches the structural period of the diffraction unit (spatial light modulator). .
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment adjusts the condensing position in the optical axis direction of the first optical system (objective lens 31).
  • a position adjustment unit (position adjustment mechanism 11A) for further comprising.
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment has a focus shift between a plurality of wavelengths (a shift caused by axial chromatic aberration of the second optical system). And deviation due to chromatic aberration of the pupil of the objective lens).
  • the illumination optical system 10 further includes a phase shift unit (translation mechanism 15) for shifting the phase of the interference fringes.
  • a phase shift unit for shifting the phase of the interference fringes.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 of the present embodiment can reliably acquire a series of modulated images necessary for demodulation operation.
  • the diffraction section (diffraction grating 16 or spatial light modulator) has a periodic structure in a plurality of different directions in a plane perpendicular to the optical axis of the optical system, and the diffraction section (diffraction grating 16 or A light selection unit (light beam selection member 20) that selects only a pair of diffracted light beams among the plurality of diffracted light beams diffracted by the spatial light modulator) is further provided.
  • the structured illumination microscope apparatus 1 can obtain a super-resolution effect in a plurality of directions.
  • the plurality of wavelengths are within a wavelength range of about 400 nm to about 700 nm.
  • the second optical system (the condensing optical systems 17, 21, and 23) is set so that the height from the optical axis (O) to the condensing point is substantially the same among the plurality of wavelengths. It is possible to adjust the magnification characteristic (see specific examples such as FIG. 11, FIG. 12, FIG. 26 to FIG. 29).
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment has an optical member (with respect to the optical path between the diffraction unit (diffraction grating 16) and the pupil plane).
  • the structured illumination light by the interference fringes and the second light source (fiber light source device 61) different from the light source (laser unit 100) are used as the light for illuminating the specimen surface.
  • a switching unit that switches between the different illumination lights is further provided.
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment can efficiently switch the state of illumination light.
  • the imaging optical system (the first optical system) forms an image of the observation light beam from the sample (2) modulated by the interference fringes on a photodetector (imaging device 42). 2 objective lens 35).
  • the structured illumination microscope apparatus 1 has a calculation unit (image storage / calculation apparatus 44) that calculates a demodulated image of the sample (2) based on an image generated by the photodetector (imaging device 42). ).
  • the structured illumination device (laser unit 100, optical fiber 11, illumination optical system 10) of the above-described embodiment emits a plurality of light beams emitted from a light source (laser unit 100) that emits light of a plurality of wavelengths simultaneously or sequentially.
  • the optical system (illumination optical system 10) includes a first optical system (objective lens 31) and a plurality of diffracted light beams as pupil surfaces (32) of the first optical system (objective lens 31) or A second optical system (condensing optical systems 17, 21, 23, 317, 321, 323) for condensing light to each position in the vicinity of the pupil, and a magnification characteristic dY of the second optical system for the plurality of wavelengths. ( ⁇ ) satisfies the following conditions: It is.
  • lambda is the each of the plurality of wavelengths, dY (lambda), when the reference wavelength of the plurality wavelength is lambda 0, the reference wavelength lambda 0 Is the difference between the image height 2f ⁇ ⁇ 0 / P and the image height 2f ⁇ ⁇ / P of each of the plurality of wavelengths ⁇ , and fo is the reference wavelength ⁇ of the first optical system (objective lens 31).
  • f is the focal length of the reference wavelength ⁇ 0 of the second optical system (condensing optical systems 17, 21, 23, 317, 321, 323)
  • P is the structural period of the diffraction part
  • NA is This is the numerical aperture of the first optical system (objective lens 31).
  • the structured illumination microscope apparatus (1) of the embodiment described above can obtain a desired super-resolution effect at each of the plurality of wavelengths.
  • the coordinate in the modulation direction on the sample is set as x
  • the point image intensity distribution of the imaging optical system is set as P r (x)
  • the structure of the fluorescent region of the sample is set as O r (x)
  • the spatial frequency of the interference fringes (modulation frequency) the K Distant, interference fringes of the phase (modulation phase) phi Distant, amplitude of the interference fringes (modulation amplitude) putting a m l (where, l is the modulation order -1,0,1
  • the interference fringe pattern (modulation waveform) is expressed by m l exp (ilKx + ⁇ )
  • the modulated image I r (x) of the sample is expressed by the following equation.
  • the symbol “*” in the expression represents a convolution integral.
  • the subscript “r” is given to the quantity in the real space
  • the subscript “k” is given to the quantity in the wave number space.
  • O k (k + K) and the ⁇ 1st modulation component (k ⁇ K) the actual spatial frequency component of the sample 15 is shifted by K (to the low frequency side).
  • K the degree of shift
  • P k (k) in this equation is unique to the imaging optical system, it can be measured in advance.
  • a super-resolution image O r (x) of the sample 15 is obtained by inverse Fourier transforming the demodulated image O k (x).
  • This super-resolution image O r (x) has a high super-resolution in the modulation direction of interference fringes (x direction).
  • symbols I r (1,1), I r (2,1),..., I r (3,3) indicate modulated images having different combinations of phases and directions of interference fringes.
  • N of the modulated image I r (N, M) is the phase number of the interference fringes contribute to its modulated image
  • "M" in the modulated image I r (N, M) is the contribution to the modulated image The direction number of the interference fringe.
  • N max 3
  • M max 3
  • Non-Patent Document 1 "Super-Resolution Video Microscopy of Live Cells by Structured Illumination", Peter Kner, Bryant B. Chhun, Eric R. Griffis, Lukman Winoto, and Mats GL Gustafsson, NATURE METHODS Vol.6 NO.5, pp .339-342, (2009) [Others] Note that the requirements of the above-described embodiments can be combined as appropriate. Some components may not be used. In addition, as long as it is permitted by law, the disclosure of all publications and US patents relating to the devices cited in the above embodiments and modifications are incorporated herein by reference.
  • DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Structured illumination microscope apparatus, 100 ... Laser unit, 11 ... Optical fiber, 10 ... Illumination optical system, 30 ... Imaging optical system, 42 ... Imaging device, 43 ... Control apparatus, 44 ... Image storage and calculation apparatus, 45 DESCRIPTION OF SYMBOLS ... Image display apparatus, 12 ... Collector lens, 13 ... Polarizing plate, 14 ... Light beam splitting part, 17 ... Condensing lens, 18 ... Light beam selection part, 21 ... Lens, 22 ... Field stop, 23 ... Field lens, 24 ... Excitation Filter, 33 ... Dichroic mirror, 31 ... Objective lens, 34 ... Absorption filter, 35 ... Second objective lens, 2 ... Sample

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Abstract

　複数波長の各々で所望の超解像効果を得るために、本発明を例示する構造化照明装置は、複数波長の光を同時又は順次に射出する光源からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部と、前記回折部で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系とを備え、前記光学系は、第１の光学系と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系の瞳面又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系とを含み、前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす。　（ｆｏ・ｎｗ－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ －ａｆλ／Ｐ）、ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、ａ＝２（Ｍ＝３の場合）　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数であり、ｎｗは標本の屈折率である。

Description

構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置
　本発明は、構造化照明装置及び構造化照明顕微鏡装置に関する。
　試料（標本）の観察や計測の分野では、対物レンズの性能を超えた解像度を達成するために、空間変調された照明光（構造化照明光）により標本を照明して画像（変調画像）を取得し、その変調画像に含まれる変調成分を除去（復調）することにより、標本の超解像画像（復調画像）を生成する構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）が提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
　特に、下記特許文献１に開示された構造化照明顕微鏡では、光源から射出した光束を回折格子等により複数の光束に分岐し、それらの光束を標本の近傍で干渉させることで干渉縞を形成し、これを構造化照明光としている。
米国再発行特許発明第３８３０７号明細書
　ところで、構造化照明顕微鏡においては、他の顕微鏡と同様、励起波長の異なる複数の色素で染色された標本を観察するために、光源の波長を切り替えたいという要求がある。
　しかし、構造化照明顕微鏡において光源波長を切り替えると、回折格子における回折角度が変化するため、対物レンズの瞳半径に対する照明光のスポット高さが変化し、所望の超解像効果が得られないという課題がある。
　本発明は、このような事情に鑑みてなされたもので、複数波長の各々で所望の超解像効果を得ることの可能な構造化照明装置、構造化照明顕微鏡装置を提供することを目的とする。
　本発明を例示する構造化照明装置の一態様は、複数波長の光を同時又は順次に射出する光源からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部と、前記回折部で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系とを備え、前記光学系は、第１の光学系と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系の瞳面又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系とを含み、前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす。
　（ｆｏ・ｎｗ－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、ａ＝２（Ｍ＝３の場合）
　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数であり、ｎｗは標本の屈折率である。
　なお、ここでいう「倍率特性」とは、第２の光学系を通過した光線の高さ（光軸からの高さ）の波長間のずれのことであって、収差補正した後の第２の光学系に残存した倍率色収差と、第２の光学系に意図的に発生させた倍率色収差との双方を含む。
　また、本発明を例示する構造化照明顕微鏡装置の一態様は、本発明を例示する構造化照明の一態様と、前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系とを備える。
　また、本発明を例示する構造化照明装置の一態様は、複数波長の光を同時又は順次に射出する光源からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部と、前記回折部で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系とを備え、前記光学系は、第１の光学系と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系の瞳面又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系とを含み、前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす。
　（０．７５－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、ａ＝２（Ｍ＝３の場合）。
　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数である。
第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。 光束分岐部１４を説明する図である。 光束選択部１８の１／２波長板１９の機能を説明する図である。 光束選択部１８の光束選択部材２０の機能を説明する図である。 光束選択部１８の機能を説明する図である。 光束選択部１８の回動機構１８Ａを説明する図である。 光束分岐部１４の並進機構１５の動作を説明する図である。 使用波長λの切り替えによる回折角度の変動、及び光軸Ｏから集光点までの高さの変動を説明する図である。 集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の構成図である。 回折格子１６が有する周期構造の方向数Ｍと、ｍ次回折光の回折角度θとの関係を説明する図である。 第１実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）のレンズデータである。 第１実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の条件対応表である。 第１実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の軸上色収差である。 第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図（ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード）である。 第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図（ＴＩＲＦモード）である。 図１６（Ａ）は、第２実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の構成図であり、図１６（Ｂ）は、第２実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の構成図である。 第２実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）のレンズデータである。 第２実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の条件対応表である。 第２実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の軸上色収差である。 第２実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）のレンズデータである。 第２実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の倍率色収差である。 第２実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の軸上色収差である。 ３Ｄ－ＳＩＭモード用の光束選択部材２０’を説明する図である。 第３実施形態の構造化照明顕微鏡装置の構成図である。 第３実施形態のレンズ３１７の構成図である。 レンズ３１７のレンズデータである。 、光束選択部材２０の配置面（瞳共役面）における各波長の光線高さ、レンズ３２１及びフィールドレンズ３２３の各焦点距離、光束選択部材２０の配置面から瞳面３２への投影倍率、対物レンズ３１の瞳面３２における集光点の光軸Ｏからの高さを示す図である。 第３実施形態の集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）の条件対応表である。 光束選択部材２０の配置面（瞳共役面）の近傍におけるレンズ３１７の軸上色収差と、光束分岐部１４の配置面の近傍におけるレンズ３１７の軸上色収差（光線追跡の方向は逆向き）とを示す図である。 位相数Ｎｍａｘ＝３、方向数Ｍｍａｘ＝３である場合の復調演算を説明する図である。
　［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　図１は、構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。以下では構造化照明顕微鏡装置１を全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Total Internal Reflection Fluorescence  Microscopy）として使用する場合、すなわち、構造化照明顕微鏡装置１を「ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード」で使用する場合も適宜併せて説明する。ＴＩＲＦＭ－ＳＩＭモードは、蛍光性を有した試料（標本）２の表面の極めて薄い層を観察するモードである。
　先ず、構造化照明顕微鏡装置１の構成を説明する。
　図１に示すとおり構造化照明顕微鏡装置１には、レーザユニット１００と、光ファイバ１１と、照明光学系１０と、結像光学系３０と、撮像素子４２と、制御装置４３と、画像記憶・演算装置４４と、画像表示装置４５とが備えられる。なお、照明光学系１０は落射型であり、結像光学系３０の対物レンズ３１及びダイクロイックミラー３３を利用して標本２の照明を行う。
　レーザユニット１００には、第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３、１０４、ミラー１０５、ダイクロイックミラー１０６、レンズ１０７が備えられる。第１レーザ光源１０１及び第２レーザ光源１０２の各々は可干渉光源であって、互いの出射波長は異なる。ここでは、第１レーザ光源１０１の波長λ１は、第２レーザ光源１０２の波長λ２よりも長いと仮定する（λ１＞λ２）。これらの第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２、シャッタ１０３、１０４は、それぞれ制御装置４３によって駆動される。
　光ファイバ１１は、レーザユニット１００から射出したレーザ光を導光するために、例えば、偏波面保存型のシングルモードファイバによって構成される。この光ファイバ１１の出射端の光軸Ｏ方向の位置は、位置調節機構１１Ａによって調節可能である。この位置調節機構１１Ａは、制御装置４３によって駆動・制御される。なお、位置調節機構１１Ａとしては、例えば、ピエゾ素子等が用いられる。
　また、光ファイバ１１として偏波面保存型のシングルモードファイバを使用した場合は、光ファイバ１１の前後でレーザ光の偏波面が保存されるので、偏光板１３は非必須であるが、レーザ光の偏光の品質を保つためには有効である。一方、光ファイバ１１としてマルチモードファイバを使用した場合、偏光板１３は必須である。
　照明光学系１０には、光ファイバ１１の出射端側から順に、コレクタレンズ１２と、偏光板１３と、光束分岐部１４と、集光レンズ１７と、光束選択部１８と、レンズ２１と、視野絞り２２と、フィールドレンズ２３と、励起フィルタ２４と、ダイクロイックミラー３３と、対物レンズ３１とが配置される。
　光束分岐部１４には、並進機構１５と、回折光学素子（回折格子）１６とが備えられ、光束選択部１８には、１／２波長板１９と、光束選択部材２０と、回動機構１８Ａとが備えられる。これらの光束分岐部１４、光束選択部１８の各々は、制御装置４３によって駆動される。
　結像光学系３０には、標本２の側から順に、対物レンズ３１と、ダイクロイックミラー３３と、吸収フィルタ３４と、第２対物レンズ３５とが配置される。
　標本２は、例えば、平行平板状のガラス表面に配置された蛍光性の細胞（蛍光色素で染色された細胞）や、シャーレ内に存在する蛍光性の生体細胞（蛍光色素で染色された動く細胞）などの細胞である。この細胞には、波長λ１の光によって励起される第１蛍光領域と、波長λ２の光によって励起される第２蛍光領域との双方が発現している。
　構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ－ＳＩＭモードで使用される場合、対物レンズ３１は、全反射蛍光観察を可能とするために、液浸型（油浸型）の対物レンズとして構成される。つまり、対物レンズ３１と標本２のガラスとの間隙は、浸液（油）で満たされる。
　撮像素子４２は、ＣＣＤやＣＭＯＳ等からなる二次元の撮像素子である。撮像素子４２は、制御装置４３によって駆動されると、その撮像面４１に形成された像を撮像し、画像を生成する。この画像は、制御装置４３を介して画像記憶・演算装置４４へと取り込まれる。撮像素子４２のフレーム周期（撮像の繰り返し周期）は、撮像素子４２の撮像時間（すなわち電荷蓄積及び電荷読出に要する時間）、干渉縞の方向切り換えに要する時間、その他の所要時間のうち、律速によって定められる。
　制御装置４３は、レーザユニット１００、位置調節機構１１Ａ、光束分岐部１４、光束選択部１８、撮像素子４２を駆動制御する。
　画像記憶・演算装置４４は、制御装置４３を介して与えられた画像に対して演算を施し、演算後の画像を不図示の内部メモリに格納すると共に、画像表示装置４５へ送出する。
　次に、構造化照明顕微鏡装置１におけるレーザ光の振る舞いを説明する。
　第１レーザ光源１０１から射出した波長λ１のレーザ光（第１レーザ光）は、シャッタ１０３を介してミラー１０５へ入射すると、ミラー１０５を反射し、ダイクロイックミラー１０６へ入射する。一方、第２レーザ光源１０２から射出した波長λ２のレーザ光（第２レーザ光）は、シャッタ１０４を介してビームスプリッタ１０６へ入射し、第１レーザ光と統合される。ダイクロイックミラー１０６から射出した第１レーザ光及び第２レーザ光は、レンズ１０７を介して光ファイバ１１の入射端に入射する。なお、制御装置４３がレーザユニット１００を制御すると、光ファイバ１１の入射端に入射するレーザ光の波長（＝使用波長λ）は、長い波長λ１と短い波長λ２との間で切り替わる。
　光ファイバ１１の入射端に入射したレーザ光は、光ファイバ１１の内部を伝搬して光ファイバ１１の出射端に点光源を生成する。その点光源から射出したレーザ光は、コレクタレンズ１２によって平行光束に変換され、偏光板１３を介して光束分岐部１４の回折格子１６へ入射すると、各次数の回折光束に分岐される。これら各次数の回折光束（以下、「回折光束群」と称す。）は、集光レンズ１７によって瞳共役面２５の互いに異なる位置に集光される。
　ここで、瞳共役面２５は、レンズ１７の焦点位置（後ろ側焦点位置）であって、対物レンズ３１の瞳３２（±１次回折光が集光する位置）に対してレンズ２３、レンズ２１を介して共役な位置のことである。この瞳共役面２５にレンズ１７の焦点位置（後ろ側焦点位置）が一致するように、レンズ１７は配置されている。なお、「共役な位置」の概念には、当業者がレンズ１７、レンズ２１、２３の収差、ビネッティング等、設計上必要な事項を考慮して決定した位置も含まれる。
　なお、光ファイバ１１から射出したレーザ光は基本的に直線偏光しているので、偏光板１３は、省略することも可能であるが、余分な偏光成分を確実にカットするために有効である。また、レーザ光の利用効率を高めるため、偏光板１３の軸は、光ファイバ１１から射出したレーザ光の偏光方向に一致していることが望ましい。
　瞳共役面２５に向かった各次数の回折光束は、瞳共役面２５の近傍に配置された光束選択部１８へ入射する。
　ここで、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ－ＳＩＭモードで使用される場合、光束選択部１８は、入射した各次数の回折光束のうち、１対の回折光束のみ（ここでは±１次回折光束のみ）を選択的に通過させる。
　光束選択部１８を通過した±１次回折光束は、レンズ２１によって視野絞り２２付近で回折格子１６と共役な面を形成する。その後、±１次回折光束の各々は、フィールドレンズ２３により収束光に変換され、さらに励起フィルタ２４を経てからダイクロイックミラー３３で反射し、対物レンズ３１の瞳面３２上の互いに異なる位置に集光する。
　瞳面３２上に集光した±１次回折光束の各々は、対物レンズ３１の先端から射出される際には平行光束となり、標本２の表面で互いに干渉し、干渉縞を形成する。この干渉縞が、構造化照明光として使用される。
　また、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１がＴＩＲＦＭ－ＳＩＭモードで使用される場合、標本２の表面に入射する際の入射角度は、エバネッセント場の生成条件を満たす。この条件は、全反射条件（ＴＩＲＦ条件）などと呼ばれる。このＴＩＲＦ条件を満たすためには、瞳面３２における±１次回折光束の集光点を、瞳面３２の最外周に位置する所定の輪帯状領域（ＴＩＲＦ領域）に収めればよい（詳細は後述）。この結果、標本２の表面近傍には、構造化照明光によるエバネッセント場が生起する。
　このような構造化照明光により標本２を照明すると、構造化照明光の周期構造と標本２の（蛍光領域の）周期構造との差に相当するモアレ縞が現れるが、このモアレ縞においては、標本２の高周波数の構造が元の周波数より低周波数側にシフトしているため、この構造を示す光（蛍光）は、元の角度よりも小さい角度で対物レンズ３１へ向かうことになる。よって、構造化照明光により標本２を照明すると、標本２の（蛍光領域の）高周波数の構造情報までもが対物レンズ３１によって伝達される。
　標本２で発生した蛍光は、対物レンズ３１に入射すると、対物レンズ３１で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー３３とバリアフィルタ３４を透過し、第２対物レンズ３５を介して撮像素子４２の撮像面４１上に標本２の変調像を形成する。
　この変調像は、撮像素子４２により画像化され、制御装置４３を介して画像記憶・演算装置４４へと取り込まれる。さらに、取り込まれた変調画像には、画像記憶・演算装置４４において公知の復調演算（詳細は後述）が施され、復調画像（超解像画像）が生成される。そして、この超解像画像は、画像記憶・演算装置４４の内部メモリ（図示せず）に記憶されるとともに、画像表示装置４５へと送出される。公知の復調演算としては、例えば、米国特許８１１５８０６号明細書に開示された方法が用いられ、具体的には、後述する。
　次に、光束分岐部１４を詳しく説明する。
　図２は、光束分岐部１４を説明する図であり、図２（Ａ）は、光束分岐部１４の回折格子１６を光軸Ｏ方向から見た図であり、図２（Ｂ）は、±１次回折光束が瞳共役面に形成する集光点の位置関係を示す図である。なお、図２（Ａ）は模式図であるため、図２（Ａ）に示した回折格子１６の構造周期は実際の構造周期と同じとは限らない。
　図２（Ａ）に示すように、回折格子１６は、照明光学系１０の光軸Ｏと直交する面内の互いに異なる複数方向に周期構造を有した回折格子である。回折格子１６の材質は、例えば石英ガラスである。ここでは、回折格子１６は、１２０°ずつ異なる第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々にかけて周期構造を有しており、それら３方向の構造周期は共通であると仮定する。
　なお、回折格子１６の周期構造は、濃度（透過率）を利用して形成された濃度型の周期構造、または段差（位相差）を利用して形成された位相型の周期構造の何れであってもよいが、位相差型の周期構造の方が±１次回折光の回折効率が高いという点で好ましい。
　このような回折格子１６に入射した平行光束は、第１方向Ｖ１にかけて分岐した第１回折光束群と、第２方向Ｖ２にかけて分岐した第２回折光束群と、第３方向Ｖ３にかけて分岐した第３回折光束群とに変換される。
　第１回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
　同様に、第２回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
　同様に、第３回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸Ｏに関して対称な方向に進行する。
　これら第１回折光束群の±１次回折光束、第２回折光束群の±１次回折光束、第３回折光束群の±１次回折光束は、前述した集光レンズ１７により、瞳共役面内の互いに異なる位置に集光される。
　そして、図２（Ｂ）に示すように、第１回折光束群の±１次回折光束の集光点２５ｄ、２５ｇは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点２５ｄ、２５ｇの配列方向は第１方向Ｖ１に対応している。
　ここで、光ファイバ１１から射出されるレーザ光の波長をλ、回折格子１６の構造周期をＰ、レンズ１７の焦点距離をｆｃとすると、光軸Ｏから集光点２５ｄ、２５ｇまでの高さＤは下記の式で表される。
　Ｄ∝ｆｃλ／Ｐ
　したがって、レーザ光の波長λを変更すると、集光点２５ｄ、２５ｇの位置にズレが生じる。
　また、第２回折光束群の±１次回折光束の集光点２５ｃ、２５ｆは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点２５ｃ、２５ｆの配列方向は、第２方向Ｖ２に対応している。なお、波長λが同じであるならば、光軸Ｏから第２回折光束群の集光点２５ｃ、２５ｆまでの高さは、光軸Ｏから第１回折光束群の集光点２５ｄ、２５ｇまでの高さと同じである。
　また、第３回折光束群の±１次回折光束の集光点２５ｂ、２５ｅは、光軸Ｏに関して対称であり、集光点２５ｂ、２５ｅの配列方向は、第３方向Ｖ３に対応している。なお、波長λが同じであるならば、光軸Ｏから第３回折光束群の集光点２５ｂ、２５ｅまでの高さは、光軸Ｏから第１回折光束群の集光点２５ｄ、２５ｇまでの高さと同じである。
　なお、ここでいう集光点とは、最大強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置のことである。そのため、本実施形態の照明光学系１０は、完全な集光点が形成されるまで光束を集光する必要はない。
　以上の光束分岐部１４において、並進機構１５は、ピエゾモータ等からなる。並進機構１５は、照明光学系１０の光軸Ｏと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々に対して非垂直な方向にかけて、回折格子１６を並進移動させる。この方向に回折格子１６を並進移動させると、構造化照明光の縞の位相がシフトする（詳細は後述。）。
　次に、光束選択部１８を詳しく説明する。
　図３、図４は、光束選択部１８を説明する図である。図３に示すとおり、光束選択部１８の１／２波長板１９は、入射した各次数の回折光束の偏光方向を設定し、図４に示すとおり、光束選択部１８の光束選択部材２０は、第１～第３回折光束群のうち何れか１群の±１次回折光束のみを選択的に通過させるマスクである。
　そして、光束選択部１８の回動機構１８Ａは、光束選択部材２０を光軸Ｏの周りに回動させることにより、選択される±１次回折光束を第１～第３回折光束群の間で切り替えると共に、光束選択部材２０に連動して１／２波長板１９を光軸Ｏの周りに回動させることにより、選択された±１次回折光束が標本２に入射するときの偏光方向をＳ偏光に保つ。
　つまり、光束選択部１８は、構造化照明光の縞の状態を保ちつつ、構造化照明光の縞方向を切り替える。
　なお、回動機構１８Ａには、例えば、光束選択部材２０を保持し、かつ光軸Ｏの周りに回転可能な不図示の保持部材と、その保持部材の周りに形成された不図示の第１の歯車と、第１の歯車に噛み合う不図示の第２の歯車と、第２の歯車に連結された不図示のモータ（回転モータ）とが備えられる。このモータが駆動されると第２の歯車が回転し、その回転力が第１の歯車へと伝達され、光束選択部材２０が光軸Ｏの周りに回転する。
　以下、縞の状態を保つための条件を具体的に説明する。
　先ず、１／２波長板１９の進相軸の向きは、選択される±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ１～第３方向Ｖ３のいずれか）に対して、±１次回折光束の偏光方向が垂直となるように設定される必要がある。なお、ここでいう1／２波長板１９の進相軸とは、その軸の方向に偏光した光が１／２波長板１９を通過するときの位相遅延量が最小となるような方向のことである。
　また、光束選択部材２０の開口パターンは、同一の回折光束群に属する±１次回折光束の一方及び他方を個別に通過させる第１の開口部２０A及び第２の開口部２０Bからなり、これら第１の開口部２０Aと第２の開口部２０Bとの各々の光軸Ｏ周りの長さは、前述した方向に直線偏光した回折光束が通過できるような長さに設定されている。よって、第１の開口部２０A及び第２の開口部２０Bの各々の形状は、部分輪帯状に近い形状である。
　ここで、図３（Ａ）に示すように、１／２波長板１９の進相軸の方向が偏光板１３の軸の方向と平行になるときの１／２波長板１９の回転位置を、１／２波長板１９の回転位置の基準とする（以下、「第１の基準位置」と称する。）。
　また、光束選択部材２０の光束選択方向（＝選択される±１次回折光束の分岐方向）が、偏光板１３の軸の方向と垂直になるときの光束選択部材２０の回転位置を、光束選択部材２０の回転位置の基準とする（以下、「第２の基準位置」と称する。）。
　このとき、図３（Ｂ）に示すように、１／２波長板１９の第１基準位置からの回転量は、光束選択部材２０の第２基準位置からの回転量の２分の１に制御されるべきである。
　すなわち、１／２波長板１９の第１基準位置からの回転量がθ／２であるときには、光束選択部材２０の第２基準位置からの回転量は、θに設定される。
　したがって、光束選択部１８の回動機構１８Ａは、第１回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第１方向Ｖ１）を選択するために、図４（Ａ）に示すように、光束選択部材２０の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ１だけ回転させた場合、１／２波長板１９の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ１／２だけ回転させる。
　このとき、１／２波長板１９を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）中に破線両矢印で示すとおり、偏光板１３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１９を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ１だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ａ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ１）に対して垂直となる。
　換言すると、１／２波長板１９の進相軸の方向は、光束選択部材２０により選択される±１次回折光束の分岐方向（第１方向Ｖ１）に応じた方向であって、１／２波長板１９へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（偏光板１３の軸方向）と、１／２波長板１９から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（第１方向Ｖ１に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。
　また、光束選択部１８の回動機構１８Ａは、第２回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第２方向Ｖ２）を選択するために、図４（Ｂ）に示すように、光束選択部材２０の光束選択方向を第２の基準位置から右方に回転角θ２だけ回転させた場合、１／２波長板１９の進相軸の方向を、第１の基準位置から右方に回転角θ２／２だけ回転させる。
このとき、１／２波長板１９を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板１３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１９を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、右方に回転角θ２だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｂ）に実線両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第２方向Ｖ２）に対して垂直となる。
　換言すると、１／２波長板１９の進相軸の方向は、光束選択部材２０により選択される±１次回折光束の分岐方向（第２方向Ｖ２）に応じた方向であって、１／２波長板１９へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（偏光板１３の軸方向）と、１／２波長板１９から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（第２方向Ｖ２に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。
　また、光束選択部１８の回動機構１８Ａは、第３回折光束群の±１次回折光束（分岐方向は第３方向Ｖ３）を選択するために、図４（Ｃ）に示すように、光束選択部材２０の光束選択方向を第２の基準位置から左方（標本側から見て。以下同じ）に回転角θ３だけ回転させた場合、１／２波長板１９の進相軸の方向を、第１の基準位置から左方に回転角θ３／２だけ回転させる。
　このとき、１／２波長板１９を通過する前における各次数の回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）中に破線両矢線で示すとおり、偏光板１３の軸の方向と平行となっているのに対し、１／２波長板１９を通過した後における各次数の回折光束の偏光方向は、左方に回転角θ３だけ回転するので、選択された±１次回折光束の偏光方向は、図４（Ｃ）に実両矢印で示すとおり、それら±１次回折光束の分岐方向（第３方向Ｖ３）に対して垂直となる。
　換言すると、１／２波長板１９の進相軸の方向は、光束選択部材２０により選択される±１次回折光束の分岐方向（第３方向Ｖ３）に応じた方向であって、１／２波長板１９へ入射する±１次回折光束が有していた偏光方向（偏光板１３の軸方向）と、１／２波長板１９から射出する±１次回折光束が有するべき偏光方向（第３方向Ｖ３に垂直）とが成す角度の２等分線方向に、設定される。
　したがって、光束選択部１８の回動機構１８Ａは、１／２波長板１９及び光束選択部材２０をギア比２：１で連動すればよい。
　なお、以上の説明では、標本２に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために回動可能な１／２波長板１９を使用したが、回動可能な１／２波長板１９の代わりに固定配置された液晶素子を使用し、その液晶素子を１／２波長板１９として機能させてもよい。液晶素子の配向を電気的に制御すれば、液晶素子の屈折率異方性を制御することができるので、１／２波長板としての進相軸を光軸Ｏ周りに回転させることができる。因みに、標本２に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つための方法は他にもある（後述）。
　図５は、以上説明した光束選択部１８の機能を説明する図である。なお、図５において円形枠で囲まれた両矢線は、光束の偏光方向を示し、四角枠で囲まれた両矢線は、光学素子の軸方向を示している。
　また、図６に示すように、光束選択部材２０の外周部には、複数の（図６に示す例では６個の）切り欠き２０Ｃが形成されており、回動機構１８Ａには、これらの切り欠き２０Ｃを検出するためのタイミングセンサ２０Ｄが備えられている。これによって、回動機構１８Ａは、光束選択部１８の回動位置、ひいては１／２波長板１９の回動位置を検知することができる。
　次に、光束分岐部１４の並進機構１５を詳しく説明する。
　図７は、光束分岐部１４の並進機構１５の動作を説明する図である。
　先ず、上述した復調演算を可能とするためには、同一の標本２に関する変調画像であって、干渉縞の方向が共通で位相の異なる３枚以上の変調画像が必要である。なぜなら、構造化照明顕微鏡装置１が生成する変調画像には、標本２の構造のうち、構造化照明光により空間周波数の変調された構造情報である０次変調成分、＋１次変調成分、－１次変調成分が含まれており、それら３つの未知パラメータを復調演算（詳細は後述）で既知とするためには、それら未知パラメータの個数以上の枚数の変調画像が必要だからである。
　そこで、光束分岐部１４の並進機構１５は、干渉縞の位相をシフトするために、図７（Ａ）に示すように、照明光学系１０の光軸Ｏと垂直な方向であって、前述した第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の全てに対して非垂直な方向（ｘ方向）にかけて回折格子１６をシフトさせる。
　但し、干渉縞の位相を所望のシフト量φだけシフトさせるのに必要な回折格子１６のシフト量Ｌは、光束選択部１８による光束選択方向が第１方向Ｖ１であるときと、第２方向Ｖ２であるときと、第３方向Ｖ３であるときとでは、同じとは限らない。
　図７（Ｂ）に示すとおり、回折格子１６の第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の各々の構造周期をＰとおき、回折格子１３のシフト方向（ｘ方向）と第１方向Ｖ１とのなす角をθ１とおき、回折格子１６のシフト方向（ｘ方向）と第２方向Ｖ２とのなす角をθ２とおき、回折格子１６のシフト方向（ｘ方向）と第３方向Ｖ３とのなす角をθ３とおくと、光束選択方向が第１方向Ｖ１であるときに必要な回折格子１６のｘ方向のシフト量Ｌ１は、Ｌ１＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ１｜）で表され、光束選択方向が第２方向Ｖ２であるときに必要な回折格子１６のｘ方向のシフト量Ｌ２は、Ｌ２＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ２｜）で表され、光束選択方向が第３方向Ｖ３であるときに必要な回折格子１６のｘ方向のシフト量Ｌ３は、Ｌ３＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ３｜）で表される。
　すなわち、干渉縞の位相シフト量を所望の値φとするために必要な回折格子１６のｘ方向のシフト量Ｌは、波長選択方向（第１方向Ｖ１、第２方向Ｖ２、第３方向Ｖ３の何れか）とｘ方向とのなす角θにより式（１）のとおり表される。
　Ｌ＝φ×Ｐ／（ａ×４π×｜ｃｏｓθ｜）　…（１）
　因みに、干渉縞の位相シフト量φを２πとするために必要な回折格子１６のｘ方向のシフト量Ｌは、Ｐ／（ａ×２×｜ｃｏｓθ｜）となる。これは、回折格子１６の半周期に相当する量である。つまり、回折格子１６を半周期分シフトさせるだけで、構造化照明光の位相を１周期分シフトできる（なぜなら、±１次回折光からなる干渉縞の縞周期は、回折格子１６の構造周期の２倍に相当する。）。
　次に、全反射条件（ＴＩＲＦ条件）を満たすための本実施形態の構成を詳しく説明する。
　本実施形態では、前述したとおり使用波長λがλ１とλ２との間で切り替え可能である。このように使用波長λが切り替わると、回折格子１６で発生する±１次回折光の回折角度も、例えば図８（Ａ）に点線及び実線で示したとおりに変動する。この場合、照明光学系１０が仮に無収差であったならば、瞳面３２における光軸Ｏから±１次回折光の集光点までの高さは、例えば図８（Ｂ）に白点及び黒点で示したごとく変動する。これでは、使用波長λの切り替えによって±１次回折光の集光点がＴＩＲＦ領域から外れる虞がある。
　そこで、本実施形態では、照明光学系１０のうち回折格子１６と対物レンズ３１との間に位置するレンズ１７、２１、２３（以下、「集光光学系」と称す。）に対して、所定の倍率色収差を付与する。この倍率色収差は、使用波長λの切り替えに依らず±１次回折光の集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続けるように設定される。以下、詳しく説明する。
　図９は、集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の構成図である。
　図９に示すとおりレンズ１７、２１、２３の各々は、凸レンズと凹レンズとを接合してなる単一の接合レンズであって、集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の全体は、使用波長λの切り替えに依らず下記の条件式を満たす。
　（ｆｏ・ｎｗ－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、
　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）　…（２）
　但し、ｄＹ（λ）は、使用波長λの基準波長をλ０としたときに、像高２ｆ・λ０／Ｐにおける集光光学系の波長λでの倍率色収差である。また、ｆｏは対物レンズ３１の焦点距離、ｆは集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の全系の焦点距離、Ｐは回折格子１６の構造周期、ＮＡは対物レンズ３１の開口数、Ｍは回折格子１６が有する周期構造の方向数、ｎｗは標本２の屈折率である。
　因みに、本実施形態では細胞を標本２としたので、ｎｗは水の屈折率にほぼ等しい。また、本実施形態では回折格子１６の周期構造の方向数を３としたので、Ｍ＝３である。
　以下、条件式（２）の意義を説明する。
　先ず、回折格子１６の構造周期がＰ、周期構造の方向数がＭである場合、使用波長λのレーザ光に応じて回折格子１６で発生する１次回折光の回折角度θは、図１０に示すとおり表される。すなわち、１次回折光の回折角度θは、下記の式で表される。
　ここで、θは極めて小さいので、ｓｉｎθ＝θで近似する。
　θ＝ａλ／Ｐ、
　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）　…（３）
　また、集光光学系（レンズ１７、２１、２３）が仮に無収差であって、集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の焦点距離がｆであった場合、回折格子１６から回折角度θで射出した１次回折光は、瞳面３２上で光軸Ｏからの高さがＹである位置に集光する。この高さＹは、下記の式で表される。
　ここで、θは極めて小さいので、ｔａｎθ＝θで近似する。
　Ｙ＝ｆθ　…（４）
　また、対物レンズ３１の焦点距離がｆｏ、対物レンズ３１の開口数がＮＡである場合、対物レンズ３１の瞳半径ｒは下記の式で表される。
　ｒ＝ｆｏＮＡ　…（５）
　よって、使用波長λの切り替えに依らず（Ｙ＋ｄＹ（λ））が下記の条件式を満たしていれば、使用波長λの切り替えに依らず１次回折光の集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続ける。つまり、ＴＩＲＦ条件が維持される。
　ｎｗｆｏ≦Ｙ＋ｄＹ（λ）≦ｒ　…（６）
　この式（６）に式（３）（４）（５）を代入し、ｄＹについて解くと、条件式（２）が得られる。
　以上の結果、条件式（２）は、使用波長λの切り替えに依らず±１次回折光の集光点をＴＩＲＦ領域に収め続けるため（ＴＩＲＦ条件を維持するため）の条件式であることがわかる。
　図１１は、本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）のレンズデータであり、図１２は、本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の条件対応表である。
　なお、ここでは基準波長λ０を５８８ｎｍとした。図１２の下から３段目は、４０５ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（４０５）、４３６ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（４３６）、４８６ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（４８６）、５８８ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（５８８）、６５６ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（６５６）を示している。
　図１２の下から１段目、２段目に示すとおり、これらの倍率色収差ｄＹ（４０５）、ｄＹ（４３６）、ｄＹ（４８６）、ｄＹ（５８８）、ｄＹ（６５６）の各々は、条件式（２）を満たしている。
　したがって、本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）は、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間で切り替わったとしても、±１次回折光の集光点をＴＩＲＦ領域に収め続けること（ＴＩＲＦ条件を維持すること）が可能である。
　ここで、瞳面３２における光軸Ｏから集光点までの高さを波長毎に示すと、以下のとおりである。
　波長４０５ｎｍでは高さは２．９５ｍｍ、波長４３６ｎｍでは高さは２．７９ｍｍ、波長４８６ｎｍでは高さは２．７０ｍｍ、波長５８８ｎｍでは高さは２．８２ｍｍ、波長６５６ｎｍでは高さは２．９８ｍｍである。
　よって、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間（約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲）で切り替わったとしても、光軸Ｏから集光点までの高さは、所定値以上（２．７０ｍｍ以上）に維持され、その高さは所定範囲内（２．７０ｍｍ～２．９８ｍｍの範囲内）に収まる。
　つまり、本実施形態では、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲において、光軸Ｏから集光点までの高さが所定値以上（２．７０ｍｍ以上）に維持され、その高さの波長間のズレが所定値以下（約０．５ｍｍ以下）に収まるように、集光光学系の倍率色収差が調整されている。
　よって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、レーザユニット１００が出射する２つの波長λ１、λ２を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中の何れか２つに選定すればよい。
　また、上述したとおり本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）は、使用波長λの切り替えに依らずＴＩＲＦ条件を維持するために所定の倍率色収差（図１２の下から３段目）を有しているが、その一方で、本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の軸上色収差は、図１３に示すとおり－０．１１９ｍｍから＋０．５８６ｍｍの範囲（約０．８ｍｍ）に収まっている。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、使用波長λの切り替え時における集光光学系（レンズ１７、２１、２３）のフォーカス調整を省略することも可能である。
　但し、集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の軸上色収差が無視できない場合は、使用波長λの切り替え時にフォーカス調整を行えばよい。
　このフォーカス調整は、光ファイバ１１の出射端の光軸Ｏ方向の位置を位置調節機構１１Ａによって調節するか、レンズ１７、２１、２３の少なくとも１つの光軸Ｏ方向の位置を調整することによって行うことができる。
　なお、フォーカス調整をレンズの光軸Ｏ方向の位置調整によって行う場合は、回折格子１６の光軸Ｏ方向の位置調整も必要に応じて行うとよい。
　なお、本実施形態では、レーザユニット１００が出射可能なレーザ光の波長数を２としたが、３以上としてもよい。その場合、レーザユニット１００が出射する３つの波長を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中の何れか３つに選定すればよい。
　また、本実施形態では、レーザユニット１００が出射可能なレーザ光の波長を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中から選定したが、４０５ｎｍ～６５６ｎｍの範囲内の任意の波長に選定してもよい。なぜなら、本実施形態の集光光学系（レンズ１７、２１、２３）は、４０５ｎｍ～６５６ｎｍの範囲内の任意の使用波長について条件式（２）を満たす。
　また、本実施形態では、全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ）を行うために、使用波長λの切り替えに依らず集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続けるような倍率色収差を集光光学系（レンズ１７、２１、２３）へ付与したが、ＴＩＲＦの必要が無い場合（すなわち、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ－ＳＩＭモードではなくＳＩＭモードで使用する場合）は、集光点がＴＩＲＦ領域に収まっていなくても構わない。
　但し、使用波長λの切り替えに依って光軸Ｏから集光点までの高さが変動すると、使用波長λの切り替えによって超解像効果が変動するという問題が発生するため、ＴＩＲＦの必要が無かったとしても、使用波長λの切り替えに依らず光軸Ｏから集光点までの高さが維持されるような倍率色収差を集光光学系（レンズ１７、２１、２３）へ付与しておくことが望ましい。
　また、光軸Ｏから集光点までの高さを、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードに適した高さと、ＳＩＭモードに適した高さとの間で切り替えるためには、光路に挿入される回折格子１６を、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用の回折格子と、ＳＩＭモード用の回折格子との間で切り替えればよい。ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用の回折格子と、ＳＩＭモード用の回折格子との間では、互いの構造周期が異なる。
　なお、ここでいう超解像効果ＳＲとは、標本の非変調時における構造化照明顕微鏡装置の解像度Ｒと、標本５の変調時における構造化照明顕微鏡装置の解像度（Ｒ＋Ｋ）との比ＳＲ=（Ｒ＋Ｋ）／Ｒである。
　このうち、非変調時の解像度Ｒは、対物レンズの開口数ＮＡ、使用波長λに対して、Ｒ＝２ＮＡ／λで表される。
　一方、変調による解像度の増加分Ｋは、標本の変調周波数（＝干渉縞の空間周波数）に一致する。
　具体的には、対物レンズの焦点距離ｆｏに対して、Ｋは、Ｋ＝２ｄ/ （ｆｏ×λ）で表される。
　したがって、ＳＲ＝（Ｒ＋Ｋ）／Ｒ＝｛（２×ＮＡ／λ）＋（２×ｄ）／（ｆｏ×λ）｝／（２×ＮＡ／λ）となり、
　ＳＲ＝（ｆｏ×ＮＡ＋ｄ）／（ｆｏ×ＮＡ）…（１０）である。
　ここで、θ＝(ａ×λ)／Ｐ、ｄ＝ｆ×θより、ｄ＝（ａ×ｆ×λ）／Ｐであるから、式（１０）は、
　ＳＲ＝｛ｆｏ×ＮＡ＋（ａ×ｆ／Ｐ）×λ｝／（ｆｏ×ＮＡ）
　と書き換えられ、超解像効果ＳＲにλ依存性が残ることがわかる。このため、従来の構造化照明顕微鏡装置では、使用波長λが切り替わると、超解像効果ＳＲ=（Ｒ＋Ｋ）／Ｒが変化していた。
　しかし、本実施形態のように使用波長λの切り替えに依らず光軸Ｏから集光点までの高さを維持、すなわち式（１０）におけるｄをλに依存しない固定値としたならば、超解像効果（Ｒ＋Ｋ）／Ｒは、維持される。
　また、本実施形態では、波長の異なる複数の光を標本へ順次に照射する（複数種類の蛍光領域を順次に励起する）ことを想定したが、波長の異なる複数の光を標本へ同時に照射しても（複数種類の蛍光領域を同時に励起しても）よい。この場合は、波長の異なる複数の蛍光を分離して検出する機能を構造化照明顕微鏡装置１へ搭載することが望ましい。
　［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　本実施形態の構造化照明顕微鏡装置は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置の変形例であるので、ここでは第１実施形態との相違点を説明する。
　第１実施形態では、構造化照明顕微鏡装置１を構造化照明による全反射照明蛍光観察モード（ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード）で使用したが、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、構造化照明による全反射照明蛍光観察モード（ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード）と、非構造化照明による全反射照明蛍光観察モード（ＴＩＲＦモード）との間で切り替えが可能である。
　因みに、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードでは、標本２を高い解像度で観察できるものの、１フレームの超解像画像を得るために複数フレーム分の撮像を行う必要があるので、時間が掛かるというデメリットがある。また、回折格子１６の周期構造の方向数Ｍを２以上とすれば（同時に複数対の回折光を生成すれば）、一連の変調画像を取得する際のフレームレートを高くすることができるものの、個々の変調画像に寄与するのは１対の回折光のみなので、レーザ光の利用効率が悪い。
　一方、ＴＩＲＦモードでは、標本２を高い解像度で観察することはできないものの、１フレームの観察画像を得るために複数フレーム分の撮像を行う必要が無いので、時間が掛からないというメリットがある。また、回折格子１６を介さずにレーザ光を標本２へ導光するので、レーザ光の利用効率が高い。
　このため、構造化照明顕微鏡装置１のモードとしてＴＩＲＦ－ＳＩＭモードとＴＩＲＦモードとの双方を搭載することの意義は大きい。
　図１４、図１５は、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。図１４は、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードを示しており、図１５は、ＴＩＲＦモードを示している。
　図１４、図１５に示すとおり、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、光束分岐部１４（回折格子１６）が照明光学系１０の光路に対して挿脱可能である。
　また、本実施形態の照明光学系１０では、集光レンズ１７として、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用の集光レンズ１７Ａと、ＴＩＲＦモード用の集光レンズ１７Ｂとが交換可能に配置されている。
　また、本実施形態の照明光学系１０では、レンズ２１として、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用のレンズ２１Ａと、ＴＩＲＦモード用のレンズ２１Ｂとが交換可能に配置されている。
　つまり、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード（図１４）における集光光学系は、集光レンズ１７Ａ、レンズ２１Ａ、フィールドレンズ２３によって構成され、ＴＩＲＦモード（図１５）における集光光学系は、集光レンズ１７Ｂ、レンズ２１Ｂ、フィールドレンズ２３によって構成される（フィールドレンズ２３は両モードの集光光学系に共用される。）。
　先ず、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードでは、図１４に示すとおり、回折格子１６で生成された±１次回折光は、第１実施形態におけるそれと同様に振る舞うので、瞳面３２上に±１次回折光が形成する集光点は、ＴＩＲＦ領域（図８（Ｂ））内に収まる。
　一方、ＴＩＲＦモードでは、図１５に示すとおり、光ファイバ１１の出射端（レーザ光の二次光源）が光軸Ｏから外され、光軸Ｏから二次光源までの高さは、二次光源から射出したレーザ光がＴＩＲＦ領域（図８（Ｂ））に集光点を形成するように調節される。但し、ＴＩＲＦモードにおける光束選択部材２０の回動位置は、ＴＩＲＦ領域（図８（Ｂ））に向かうレーザ光の光路を妨げないような位置に設定されるものとする。
　図１６（Ａ）は、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の構成図であり、図１６（Ｂ）は、ＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の構成図である。
　図１６（Ａ）に示すとおり、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおけるレンズ１７Ａ、２１Ａの各々は、３つの接合レンズから構成され、図１６（Ｂ）に示すとおり、ＴＩＲＦモードにおけるレンズ１７Ｂ、２１Ｂの各々は、単一の接合レンズから構成される。
　ここで、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードでは、回折格子１６が使用されるので、集光光学系が仮に無収差であるならば、図８に示した現象（波長切り替えによる回折角度の変動）が発生する。このため、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の全体には、使用波長λの切り替えに依らず条件式（２）を満たすような倍率色収差が付与される。
　一方、ＴＩＲＦモードでは、回折格子１６が使用されないので、集光光学系が仮に無収差であるならば、図８に示した現象（波長切り替えによる回折角度の変動）は発生しない。このため、ＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の全体の倍率色収差は、なるべく小さく抑えられる。
　その結果、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードとＴＩＲＦモードとの間の切り替え、各モードにおける使用波長λの切り替えに依らず、ＴＩＲＦ条件を維持することができる。
　図１７は、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）のレンズデータであり、図１８は、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の条件対応表である。
　図１８の下から１段目、２段目、３段目に示すとおり、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける倍率色収差ｄＹ（４０５）、ｄＹ（４３６）、ｄＹ（４８６）、ｄＹ（５８８）、ｄＹ（６５６）の各々は、条件式（２）を満たしている。
　したがって、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）は、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間で切り替わったとしても、ＴＩＲＦ条件を維持することが可能である。
　ここで、瞳面３２における光軸Ｏから集光点までの高さを波長毎に示すと、以下のとおりである。
　波長４０５ｎｍでは高さは２．９７ｍｍ、波長４３６ｎｍでは高さは２．８０ｍｍ、波長４８６ｎｍでは高さは２．７１ｍｍ、波長５８８ｎｍでは高さは２．８２ｍｍ、波長６５６ｎｍでは高さは２．９８ｍｍである。
　よって、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間（約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲）で切り替わったとしても、光軸Ｏから集光点までの高さは、所定値以上（２．７１ｍｍ以上）に維持され、その高さは所定範囲内（２．７１ｍｍ～２．９８ｍｍの範囲内）に収まる。
　つまり、本実施形態では、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲において、光軸Ｏから集光点までの高さが所定値以上（２．７１ｍｍ以上）に維持され、その高さの波長間のズレが所定値以下（約０．５ｍｍ以下）に収まるように、集光光学系の倍率色収差が調整されている。
　よって、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードでは、レーザユニット１００が出射する２つの波長λ１、λ２を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中の何れか２つに選定すればよい。
　また、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）は、使用波長λの切り替えに依らずＴＩＲＦ条件を維持するために所定の倍率色収差（図１８の下から３段目）を有しているが、その一方で、この集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の軸上色収差は、図１９に示すとおり－０．１０５ｍｍから＋０．０１９ｍｍの範囲（約０．１５ｍｍ）に収まっている。
　したがって、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける構造化照明顕微鏡装置１は、使用波長λの切り替え時における集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）のフォーカス調整を省略することが可能である。
　但し、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）の軸上色収差が無視できない場合は、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける使用波長λの切り替え時にフォーカス調整を行えばよい。
　このフォーカス調整は、光ファイバ１１の出射端の光軸Ｏ方向の位置を位置調節機構１１Ａによって調節するか、レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３の少なくとも１つの光軸Ｏ方向の位置を調整することによって行うことができる。
　なお、フォーカス調整をレンズの光軸Ｏ方向の位置調整によって行う場合は、回折格子１６の光軸Ｏ方向の位置調整も必要に応じて行うとよい。
　図２０は、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）のレンズデータであり、図２１は、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の倍率色収差である。
　図２１に示すとおり、ＴＩＲＦモードにおける倍率色収差ｄＹ（４０５）、ｄＹ（４３６）、ｄＹ（４８６）、ｄＹ（５８８）、ｄＹ（６５６）の各々は、－０．００１２ｍｍから＋０．００３１ｍｍの極めて狭い範囲に収まっている。つまり、ＴＩＲＦモードにおける倍率色収差は、ゼロ近傍に抑えられている。
　したがって、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）は、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間で切り替わったとしても、ＴＩＲＦ条件を維持することが可能である。
　ここで、使用波長λが５６１ｎｍであるときに瞳面３２における光軸Ｏから集光点までの高さが２．７ｍｍとなるように光ファイバの位置を調整したと仮定する。このとき、光軸Ｏから集光点までの高さを波長毎に示すと、以下のとおりである。
　波長４０５ｎｍでは高さは２．７０３１ｍｍ、波長４３６ｎｍでは高さは２．７００２ｍｍ、波長４８６ｎｍでは高さは２．６９８８ｍｍ、波長５８８ｎｍでは高さは２．７ｍｍ、波長６５６ｎｍでは高さは２．７０１４ｍｍである。
　よって、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの間（約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲）で切り替わったとしても、光軸Ｏから集光点までの高さは、所定値以上（２．６９８８ｍｍ以上）に維持され、その高さは所定範囲内（２．６９８８～２．７０３１ｍｍの範囲内、すなわち、２．７＋０．００３１ｍｍ～２．７－０．００１２ｍｍの範囲内）に収まる。
　つまり、本実施形態では、約４００ｎｍ～約７００ｎｍの波長範囲において、光軸Ｏから集光点までの高さが所定以上（２．６９８８ｍｍ以上）に維持され、その高さの波長間のズレが所定値以下（約０．０１ｍｍ以内）に収まるように、集光光学系の倍率色収差が調整されている。
　よって、本実施形態のＴＩＲＦモードでは、レーザユニット１００が出射する２つの波長λ１、λ２を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中の何れか２つに選定すればよい。
　また、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の軸上色収差は、図２２に示すとおり－０．１９２ｍｍから＋０．１８４ｍｍの範囲（約０．４ｍｍ）に収まっている。
　したがって、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける構造化照明顕微鏡装置１は、使用波長λの切り替え時における集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）のフォーカス調整を省略することが可能である。
　但し、ＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）の軸上色収差が無視できない場合は、ＴＩＲＦモードにおける使用波長λの切り替え時にフォーカス調整を行えばよい。
　このフォーカス調整は、光ファイバ１１の出射端の光軸Ｏ方向の位置を位置調節機構１１Ａによって調節するか、レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３の少なくとも１つの光軸Ｏ方向の位置を調整することによって行うことができる。
　なお、フォーカス調整をレンズの光軸Ｏ方向の位置調整によって行う場合は、回折格子１６の光軸方向の位置調整も必要に応じて行うとよい。
　なお、本実施形態では、レーザユニット１００が出射可能なレーザ光の波長数を２としたが、３以上としてもよい。その場合、レーザユニット１００が出射する３つの波長を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中の何れか３つに選定すればよい。
　また、本実施形態では、レーザユニット１００が出射可能なレーザ光の波長を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍ、５８８ｎｍ、６５６ｎｍの中から選定したが、４０５ｎｍ～６５６ｎｍの範囲内の任意の波長に選定してもよい。なぜなら、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおける集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）は、４０５ｎｍ～６５６ｎｍの範囲内の任意の使用波長について条件式（２）を満たし、本実施形態のＴＩＲＦモードにおける集光光学系（レンズ１７Ｂ、２１Ｂ、２３）は、４０５ｎｍ～６５６ｎｍの波長範囲に対して倍率色収差が抑えられている。
　また、本実施形態のＴＩＲＦ－ＳＩＭモードでは、全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ）を行うために、使用波長λの切り替えに依らず集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続けるような倍率色収差を集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）へ付与したが、ＴＩＲＦの必要が無い場合（すなわち、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ－ＳＩＭモードではなくＳＩＭモードで使用する場合）は、集光点がＴＩＲＦ領域に収まっていなくても構わない。
　但し、ＳＩＭモードでは、使用波長λの切り替えに依って光軸Ｏから集光点までの高さが変動すると、使用波長λの切り替えによって超解像効果が変動するという問題が発生するため、ＴＩＲＦの必要が無かったとしても、使用波長λの切り替えに依らず光軸Ｏから集光点までの高さが維持されるような倍率色収差を集光光学系（レンズ１７Ａ、２１Ａ、２３）へ付与しておくことが望ましい。
　この場合の条件式は、下記のようになる。
（０．７５ -ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆo ・ＮＡ  - ａｆλ／Ｐ）、
　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）
　但し、Ｍは回折格子１６が有する周期構造の方向数であり、λは使用波長であり、ｄＹ（λ）は、使用波長λの基準波長をλ０としたときに、像高２ｆ・λ０／Ｐにおける集光光学系の波長λでの倍率色収差である。また、ｆｏは対物レンズ３１の焦点距離、ｆは集光光学系の全系の焦点距離、Ｐは回折格子１６の構造周期、ＮＡは対物レンズ３１の開口数である。
　この条件式を満たすことにより、超解像効果を１．７５以上とすることができる。但し、この条件式によると、各波長の超解像効果は１．７５～２の間でばらつくので、このばらつきを抑えるには、条件式の下限を（０．８ －ａｆλ／Ｐ）とすることが更に好ましい。
　また、光軸Ｏから集光点までの高さを、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードに適した高さと、ＳＩＭモードに適した高さとの間で切り替えるためには、光路に挿入される回折格子１６を、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用の回折格子と、ＳＩＭモード用の回折格子との間で切り替えてもよい。ＴＩＲＦ－ＳＩＭモード用の回折格子と、ＳＩＭモード用の回折格子との間では、互いの構造周期が異なる。
　また、本実施形態では、波長の異なる複数の光を標本へ順次に照射する（複数種類の蛍光領域を順次に励起する）ことを想定したが、波長の異なる複数の光を標本へ同時に照射しても（複数種類の蛍光領域を同時に励起しても）よい。この場合は、波長の異なる複数の蛍光を分離して検出する機能を構造化照明顕微鏡装置１へ搭載することが望ましい。
　［第3実施形態］
　以下、本発明の第３実施形態として構造化照明顕微鏡装置を説明する。
　本実施形態の構造化照明顕微鏡装置は、第１実施形態の構造化照明顕微鏡装置の変形例であるので、ここでは第１実施形態との相違点を主に説明する。
　第１実施形態では、集光光学系に倍率色収差を発生させることにより、対物レンズの瞳面における光軸Ｏから集光点までの高さの波長間のズレ（回折角度差に起因したズレ）を抑制したが、本実施形態では、対物レンズの瞳共役面における光軸Ｏから集光点までの高さの波長間のズレ（回折角度差に起因したズレ）、すなわち、光路選択部材の配置面における光軸Ｏから集光点までの高さの波長間のズレ（回折角度差に起因じたズレ）を抑制する。
　そうすると、光路選択部材以降のレンズ群を、通常通り収差補正された一般的なレンズで構成することができるため、構造化照明顕微鏡の照明装置を、構造化照明装置と、他の照明装置（例えば通常の落射照明装置）との間で切り換えることが可能であり、しかも他の照明装置（例えば通常の落射照明装置）が構造化照明装置の一部を共用できる、というシステム構成上の利点も生まれる。
　図２４は、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１の構成図である。図２４において、図１に示した要素と同じ機能の要素には同じ番号を付してある。
　図２４に示すとおり本実施形態では、光束分岐部１４の回折格子１６及び並進機構１５は、光軸Ｏ方向に位置調整可能な一軸ステージ５１上に配置されている。この一軸ステージ５１による回折格子１６及び並進機構１５の光軸Ｏ上の移動量は、制御装置４３によって制御される。
　また、本実施形態では、光路選択部１８とレンズ３２１との間の光路中にミラー５２が挿入され、このミラー５２は光路に対して挿脱可能に構成されている。このミラー５２が光路に挿入されたとき、構造化照明顕微鏡１の照明装置は、構造化照明装置ではなく通常の落射蛍光照明装置として機能する。
　また、図２４に示したレンズ３１７、レンズ３２１、フィールドレンズ３２３の働きは、それぞれ、第１実施形態におけるレンズ１７、レンズ２１、フィールドレンズ２３の働きに相当するが、本実施形態における倍率色収差の補正状態は、第１実施形態における倍率色収差の補正状態とは異なるため、異なる番号を付した。
　図２４に示す落射蛍光照明装置６０には、水銀ランプを光源としたファイバ光源装置６１と、第２の光ファイバ６２と、コレクタレンズ６３と、リレーレンズ６４と、ＮＤフィルタ６５と、開口絞り６６とが配置される。
　ファイバ光源装置６１からの光は、第２の光ファイバ６２を介して落射蛍光照明装置６０の光軸Ｏ’上に照明光として導入される。その照明光は、コレクタレンズ６３で平行光に変換され、リレーレンズ６４の作用を受けて開口絞り６６の位置に光源像を形成する。なお、落射蛍光照明装置６０のＮＤフィルタ６５は、落射蛍光照明装置６０の明るさ調整のために用いられる。
　落射蛍光照明装置６０からの照明光は、ミラー５２で反射したあと、レンズ３２１と視野絞り２２と、フィールドレンズ３２３とを経由し、さらに励起フィルタ２４を経てからダイクロイックミラー３３で反射し、対物レンズ３１の瞳面３２上に、光源像（第２の光ファイバ６２の出射端の像）を形成し、対物レンズ３１を介して標本２を一様に照明する。つまり、落射蛍光照明装置６０は、構造化照明装置（照明光学系１０）のレンズ３２１、フィールドレンズ３２３を利用して標本２を一様照明する。
　標本２が一様照明されると、標本２の蛍光領域から蛍光が発生する。その蛍光領域で発生した蛍光は、第１実施形態と同様に対物レンズ３１で平行光に変換された後、ダイクロイックミラー３３及びバリアフィルタ３４を透過し、第２対物レンズ３５を介して撮像素子４２の撮像面４１に標本２の蛍光像を形成する。
　ここで、照明光学系１０で用いられる第１レーザ光源１０１、第２レーザ光源１０２の波長と、落射蛍光照明装置６０で用いられるファイバ光源装置６１の波長とが異なる場合は、次のようにすればよい。
　励起フィルタ２４とダイクロイックミラー３３とバリアフィルタ３４とを一体化してなる蛍光キューブ７２を用意すると共に、その蛍光キューブ７２とは分離波長の異なる蛍光キューブ７３を用意し、それらの蛍光キューブ７２、７３を蛍光キューブターレット７０へ装着する。蛍光キューブターレット７０は、所定の軸７１の周りに回転可能であり、キューブターレット７０が軸７１の周りに所定角度だけ回転すると、対物レンズ３１の光軸Ｏ上に配置される蛍光キューブが蛍光キューブ７２、７３の間で切り換わる。
　また、落射蛍光照明装置６０のコレクタレンズ６３及びリレーレンズ６４のレンズ部材としては、倒立顕微鏡の落射蛍光照明装置において一般に用いられるレンズと同様、収差補正されたものが使用される。これに伴い、落射蛍光照明装置６０の落射照明に利用されるレンズ３２１及びフィールドレンズ３２３のレンズ部材としても、倒立顕微鏡の落射蛍光照明装置において一般に用いられるレンズと同様、収差補正されたもの（倍率色収差は略０に補正されている）が使用される。
　したがって、第１実施形態では「複数波長間の回折角度差に起因する瞳面上の集光位置ズレを倍率色収差によって補正する機能」を集光光学系（レンズ１７、２１、２３）の全体に付与したのに対して、本実施形態では集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）の全体ではなくレンズ３１７のみに付与する必要がある。以下、詳しく説明する。
　本実施形態においても、ＴＩＲＦ条件を維持するための式は、第１の実施形態と同様、下記の式（２）となる。
　（ｆｏ・ｎｗ－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、
　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）　…（２）
　但し、ｄＹ（λ）は、使用波長λの基準波長をλ０としたときに、像高２ｆ・λ０／Ｐにおける集光光学系の波長λでの倍率色収差である。また、ｆｏは対物レンズ３１の焦点距離、ｆは集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）の全系の焦点距離、Ｐは回折格子１６の構造周期、ＮＡは対物レンズ３１の開口数、Ｍは回折格子１６が有する周期構造の方向数、ｎｗは標本２の屈折率である。
　図２５は、本実施形態のレンズ３１７の構成図である。図２５に示すとおり本実施形態のレンズ３１７の構成は、３群６枚構成である。光学面ｒ１、ｒ２は、回折格子１６の光学面を示しており、平行平板のｒ１面に回折格子となる段差が刻印されていると仮定する。前述した第１実施形態又は第２実施形態とは異なり本実施形態においてレンズ３１７の構成を３群構成としたのは、集光光学系にとって必要な倍率色収差をレンズ３１７の単体に付与するためである。
　図２６は、レンズ３１７のレンズデータであり、図２７には、光束選択部材２０の配置面（瞳共役面）における各波長の光線高さ（この高さはレンズ３１７のパワーによって決まる）、レンズ３２１及びフィールドレンズ３２３の各焦点距離、光束選択部材２０の配置面から瞳面３２への投影倍率、対物レンズ３１の瞳面３２における集光点の光軸Ｏからの高さを示した。
　なお、光束選択部１８は対物レンズ３１の瞳面３２と共役であり、光束選択部材２０の配置面から瞳面３２への投影倍率は、レンズ３２１とフィールドレンズ３２３とのパワーの比である。
　図２８は、本実施形態の集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）の条件対応表である。
　本実施形態では、第１レーザ光源１０１の波長を４８６ｎｍとし、第２レーザ光源１０２として波長４０５ｎｍのレーザ光源及び波長４３６ｎｍのレーザ光源を搭載可能とする。
　よって、ここでは基準波長λ０を４８６ｎｍとし、使用波長λとして４０５ｎｍ及び４３６ｎｍを想定した。図２８の下から３段目は、４０５ｎｍ、４３６ｎｍに関する倍率色収差ｄＹ（４０５）、ｄＹ（４３６）を示している。
　図２８の下から１段目、２段目に示すとおり、これらの倍率色収差ｄＹ（４０５）、ｄＹ（４３６）は、条件式（２）を満たしている。
　したがって、本実施形態の集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）は、使用波長λが４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍの間で切り替わったとしても、回折格子１６で発生した±１次回折光が対物レンズ３１の瞳面３２に形成する集光点をＴＩＲＦ領域に収め続けること（ＴＩＲＦ条件を維持すること）が可能である。
　図２７に示すとおり、瞳面３２における集光点の光軸からの高さは、波長間で略一致している（高さは２．８５ｍｍ～２．８８ｍｍである。）。つまり、集光点の高さの波長間のズレは、約０．５ｍｍ以内の範囲に充分収まっており、そのズレが略ゼロとなるように倍率色収差が調整されているといえる。
　よって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１では、レーザユニット１００が出射する２つの波長λ１、λ２を、４０５ｎｍ、４３６ｎｍ、４８６ｎｍの中の何れか２つに選定すればよい。
　なお、本実施形態の集光光学系（レンズ３１７、３２１、３２３）は、所定の倍率色収差（図２８の下から３段目）を有しているがゆえに、図２９に示すとおり軸上色収差も有している。図２９には、光束選択部材２０の配置面（瞳共役面）の近傍におけるレンズ３１７の軸上色収差と、光束分岐部１４の配置面の近傍におけるレンズ３１７の軸上色収差（光線追跡の方向は逆向き）とを示した。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、使用波長λの切り替え時に、２つのフォーカス調整を行う必要がある。
　第１のフォーカス調整は、瞳面３２上の集光位置（光軸方向の位置）を調整するためのフォーカス調整であり、光ファイバ１１の出射端の光軸方向の位置を位置調節機構１１Ａによって調節することによって行うことができる。光ファイバ１１の出射端の実際の移動量は、図２９に記載された移動量に、光ファイバ１１の出射端から光束選択部１８までの光学系の縦倍率の逆数を乗算した値となる。
　第２のフォーカス調整は、標本２上に形成される干渉縞（構造化照明）のフォーカス調整であり、光束分岐部１４が搭載されている一軸ステージ５１を駆動して回折格子１６の光軸方向の位置を調節することによって行うことができる。一軸ステージ５１の実際の駆動量は、図２９に記載された移動量と同じ値となる。
　なお、波長毎のフォーカス調整量は、セットアップ時のキャリブレーションで予め測定し、制御装置４３に記憶させておくことが望ましい。このようにすれば、波長の切り替え時におけるフォーカス調整を高速化することができる。
　また、本実施形態では全反射蛍光観察（ＴＩＲＦ）を行うために、使用波長λの切り替えに依らず集光点がＴＩＲＦ領域に収まり続けるような倍率色収差を集光光学系のレンズ３１７に付与したが、ＴＩＲＦの必要がない場合（すなわち、構造化照明顕微鏡装置１をＴＩＲＦ－ＳＩＭモードではなくＳＩＭモードで使用する場合）は、集光点がＴＩＲＦ領域に収まっていなくても構わないことは、第1実施形態と同様である。
　なお、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１も、第１実施形態又は第２実施形態の構造化照明顕微鏡装置１と同様、適宜に変形することが可能である。
　［各実施形態の変形例］
　なお、上述した実施形態では、標本２に入射する±１次回折光束をＳ偏光に保つために、光軸の周りを回動可能な１／２波長板１９を使用したが、固定配置された１／４波長板と光軸の周りを回動可能な１／４波長板とを使用してもよい。但し、その場合は、第１の基準位置を基準とした１／４波長板の回転位置は、第２の基準位置を基準とした光束選択部材２０の回転位置と同じに設定される。
　また、上述した実施形態では、光源からの射出光束を分岐する手段として、周期構造の方向数Ｍが２以上である回折格子１６、すなわち、分岐方向の異なる複数の回折光束群を同時に生成する回折格子１６（図２（Ａ）参照）を使用したが、周期構造の方向数Ｍが１である回折格子、すなわち、分岐方向が共通の回折光束群を１群のみ生成する回折格子を使用してもよい。
　但し、その場合は、干渉縞の方向を切り替えるために、回折格子を光軸の周りに回動可能とすればよい。また、その場合は、回動可能な光束選択部材２０の代わりに、非可動の０次光カットマスクを使用すればよい。０次光カットマスクは、±１次回折光を透過し、かつ０次回折光及び２次以降の高次回折光をカットするマスクである。
　言い換えると、上述した照明光学系１０において、回折手段（１６）は、光軸に垂直な単一方向に亘って周期構造を有した回折格子であってもよく、その場合は、標本（２）に対する１対の光束の入射方向を光軸周りに回転させる回転部（不図示）を更に備えてもよい。
　また、上述した実施形態では、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードにおいて標本２へ形成する干渉縞を２光束干渉縞とした（つまり２Ｄ－ＳＩＭモードとした）が、標本２へ形成する干渉縞を３光束干渉縞としたＳＩＭモード（つまり３Ｄ－ＳＩＭモード）を構造化照明顕微鏡装置１へ搭載してもよい。
　３Ｄ－ＳＩＭモードでは、図６に示した光束選択部材２０の代わりに、図２３に示すような光束選択部材２０’を使用すればよい。この光束選択部材２０’は、図６に示した光束選択部材２０において、０次回折光束を通過するための開口部２０Ｅを設けたものである。なお、この開口部２０Ｅの形成先は、光軸の近傍であって、この開口部２０Ｅの形状は、例えば円形である。このような光束選択部材２０’によると、±１次回折光束だけでなく０次回折光束をも干渉縞に寄与させることができる。
　このように、３つの回折光束の干渉（３光束干渉）によって生成される干渉縞は、標本２の表面方向だけでなく、標本２の深さ方向にも空間変調されている。よって、この干渉縞によると、標本２の深さ方向にも超解像効果を得ることが可能となる。
　また、上述した実施形態では、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードで標本２へ形成する干渉縞を２光束干渉縞とするために、構造化照明光に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と－１次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
　また、上述した実施形態では、３Ｄ－ＳＩＭモードで標本２へ形成する干渉縞を３光束干渉縞とするために、構造化照明光に寄与する回折光束として、＋１次回折光束と－１次回折光束と０次回折光束との組み合わせを使用したが、他の組み合わせを使用してもよいことは言うまでもない。
　因みに、３光束干渉縞を形成するためには、回折次数の間隔が等間隔な３つの回折光による３光束干渉を生起させればよいので、例えば、０次回折光、１次回折光、２次回折光の組み合わせ、±２次回折光及び０次回折光の組み合わせ、±３次回折光及び０次回折光の組み合わせ、などを用いることが可能である。
　なお、第１実施形態～第３実施形態の照明光学系１０は、対物レンズ３１よる落射照明光学系で構成されたが、これに限られず、対物レンズ３１に代えてコンデサレンズによる透過・反射照明光学系で構成されてもよい。その場合、集光点が形成されるのは、コンデサレンズの瞳面である。
　また、第１実施形態～第３実施形態の光束分岐部は、光束を分岐する手段として回折格子を用いたが、例えば、位相型回折格子として機能する空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial light modulator）と、空間光変調器に対して駆動信号を与える制御部との組み合わせを用いてもよい。制御部は、空間光変調器に与える駆動信号を切り換えることにより、空間光変調器の構造周期（回折格子としての構造周期）を高速に切り換えることができる。
　［実施形態の作用効果］
　上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、複数波長の光を同時又は順次に射出する光源（レーザユニット１００）からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部（回折格子１６）と、前記回折部（回折格子１６）で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系（照明光学系１０）とを備え、前記光学系（照明光学系１０）は、第１の光学系（対物レンズ３１）と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系（対物レンズ３１）の瞳面（３２）又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系（集光光学系１７、２１、２３、３１７、３２１、３２３）とを含み、前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす。
　（ｆｏ・ｎｗ－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、ａ＝２（Ｍ＝３の場合）
　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数であり、ｎｗは標本の屈折率である。
　すなわち、前記複数波長に対する前記第２の光学系（集光光学系１７、２１、２３、３１７、３２１、３２３）の倍率特性（倍率色収差）は、前記複数波長の各々の前記集光位置が前記瞳面の所定領域に収まるように調整されており、前記所定領域は、前記標本面近傍に前記干渉縞によるエバネッセント場を生成するためのＴＩＲＦ領域である。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、標本（２）の表面の極めて薄い層を複数波長の各々で観察することが可能である。
　また、前記回折部（回折格子１６）は、射出光路の光路に対して挿脱可能であり、第２の光学系（１７Ａ、２１Ａ、２３）は、前記倍率特性の異なる別の第２の光学系（集光光学系１７Ｂ、２１Ｂ、２３）へと交換可能である。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置１のモードは、ＴＩＲＦ－ＳＩＭモードとＴＩＲＦモードとの間で切り替え可能である。
　また、上述した実施形態の照明光学系１０において、第２の光学系（集光光学系１７Ａ、２１Ａ、２３）の交換対象は、第２の光学系の一部の要素（１７Ａ、２１Ａ）である。
　このように、交換対象となる要素の数を抑えれば、交換に要される機構が大掛かりになることを避けることができる。
　また、上述した実施形態の照明光学系１０において、第２の光学系（集光光学系１７Ａ、２１Ａ、２３）のうち少なくとも交換対象となる要素（１７Ａ、２１Ａ）は、接合レンズによって構成される。
　このように、倍率特性の制御に有効な接合レンズを交換対象としたならば、第２の光学系の倍率特性の切り替えを確実に行うことができる。
　また、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、前記回折部（空間光変調器）の前記構造周期を切り替える制御部を更に備えてもよい。
　また、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、前記第１の光学系（対物レンズ３１）の光軸方向における前記集光位置を調整するための位置調整部（位置調節機構１１Ａ）を更に備える。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、複数波長間のフォーカスズレ（第２の光学系の軸上色収差に起因して発生するズレや対物レンズが持つ瞳の色収差によるズレ）にも対処することができる。
　また、上述した実施形態の照明光学系１０は、干渉縞の位相をシフトさせるための位相シフト部（並進機構１５）を更に備える。
　したがって、本実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、復調演算に必要な一連の変調画像を確実に取得することができる。
　また、前記回折部（回折格子１６又は空間光変調器）は、前記光学系の光軸に垂直な面内の互いに異なる複数方向に亘って周期構造を有し、前記回折部（回折格子１６又は空間光変調器）で回折された前記複数の回折光束のうち１対の回折光束のみを選択する光選択部（光束選択部材２０）を更に備える。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、複数方向に亘って超解像効果を得ることができる。
　また、前記複数波長は、約４００ｎｍから約７００ｎｍの波長範囲内に収められる。
　この範囲内の波長であれば、光軸（Ｏ）から集光点までの高さが複数波長の間で略一致するように第２の光学系（集光光学系１７、２１、２３）の倍率特性を調整することが可能である（図１１、図１２、図２６～図２９などの具体例を参照）。
　また、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、前記回折部（回折格子１６）と前記瞳面との間の光路に対して光学部材（ミラー５２）を挿脱することにより、前記標本面を照明する光を、前記干渉縞による構造化照明光と、前記光源（レーザユニット１００）とは異なる第２光源（ファイバ光源装置６１）を利用した別の照明光との間で切り換える切換部を更に備える。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、照明光の状態の切換を効率的に行うことができる。
　また、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、前記干渉縞で変調された前記標本（２）からの観察光束を光検出器（撮像素子４２）に結像する結像光学系（第２対物レンズ３５）とを備える。
　また、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置１は、前記光検出器（撮像素子４２）が生成した画像に基づき前記標本（２）の復調像を演算する演算部（画像記憶・演算装置４４）を更に備える。
　また、上述した実施形態の構造化照明装置（レーザユニット１００、光ファイバ１１、照明光学系１０）は、複数波長の光を同時又は順次に射出する光源（レーザユニット１００）からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部（回折格子１６）と、前記回折部（回折格子１６）で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系（照明光学系１０）とを備え、前記光学系（照明光学系１０）は、第１の光学系（対物レンズ３１）と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系（対物レンズ３１）の瞳面（３２）又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系（集光光学系１７、２１、２３、３１７、３２１、３２３）とを含み、前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす。
　（０．７５－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、ａ＝２（Ｍ＝３の場合）。
　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系（対物レンズ３１）の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系（集光光学系１７、２１、２３、３１７、３２１、３２３）の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系（対物レンズ３１）の開口数である。
　したがって、上述した実施形態の構造化照明顕微鏡装置（１）は、前記複数波長の各々で所望の超解像効果を得ることが可能である。
　［復調演算の説明］
　以下、復調演算の例を説明する。
　ここでは、２Ｄ－ＳＩＭモードを想定し、先ずは、干渉縞の方向数Ｍｍａｘを１、位相数Ｎｍａｘを３と仮定する。
　標本上の変調方向の座標をｘとおき、結像光学系の点像強度分布をＰｒ（ｘ）とおき、標本の蛍光領域の構造をＯｒ（ｘ）とおき、干渉縞の空間周波数（変調周波数）をＫとおき、干渉縞の位相（変調位相）をφとおき、干渉縞の振幅（変調振幅）をｍｌとおくと（但し、ｌは変調次数－１，０，１である。）、干渉縞のパターン（変調波形）はｍｌｅｘｐ（ｉｌＫｘ＋φ）で表されるので、標本の変調画像Ｉｒ（ｘ）は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　但し、式中の記号「＊」は、畳み込み積分を表す。以下、実空間における量と波数空間における量とを区別するために、実空間における量には添え字「ｒ」を付与し、波数空間における量には添え字「ｋ」を付与する。
　よって、変調画像Ｉｒ（ｘ）をフーリエ変換したもの（＝Ｉｋ（ｋ））は、以下の式のとおり表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　なお、結像光学系の点像強度分布Ｐｒ（ｘ）をフーリエ変換したもの（＝Ｐｋ（ｋ））は、結像光学系の伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）に相当する。
　ここで、式におけるＯｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝－１、０、１）は、変調画像Ｉｋ（ｋ）に重畳された各次数の変調成分である。１次変調成分Ｏｋ（ｋ＋Ｋ）、－１次変調成分（ｋ－Ｋ）においては、標本１５の実際の空間周波数成分がＫだけ（低周波数側へ）シフトしている。このシフトの量が大きいほど、超解像効果は大きくなる。このため、干渉縞の空間周波数は、結像光学系が結像できる範囲内でなるべく高い値に設定されることが望ましい。
　さて、一連の変調画像、すなわち（Ｎｍａｘ×Ｍｍａｘ）フレームの変調画像のうち、干渉縞の位相が互いに異なる３フレームの変調画像の間では、φのみが異なり、ｍｌ及びＫは共通である。よって、それら３フレームのうち第ｊフレームの変調画像に反映されている干渉縞の位相をφjとおくと、第ｊフレームの変調画像Ｉｋｊ（ｋ）は、以下の式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　よって、復調演算では、３フレームの変調画像を上式へ当てはめると共に、それによって得られる３つの方程式を連立させて解くことで、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝－１，０，１）の各々を既知とする（互いに分離する）。因みに、この式におけるＰｋ（ｋ）は、結像光学系に固有なので、予め測定しておくことが可能である。
　なお、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝－１，０，１）を互いに分離する際には、 Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）Ｐｋ（ｋ）（ｌ＝－１，０，１）の各々を既知としてから、それらをＰｋ（ｋ）の値で除算してもよいが、単なる除算を行う代わりに、ウィナーフィルタなどノイズの影響を受けにくい公知の手法を利用してもよい。
　そして、復調演算では、±１次変調成分Ｏｋ（ｋ＋Ｋ）、Ｏｋ（ｋ－Ｋ）を、変調周波数Ｋの分だけｘ方向にかけてシフト（再配置）してから、各次数の変調成分Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）（ｌ＝－１，０，１）を波数空間上で重み付け合成することで、周波数範囲の広い復調画像Ｏｋ（ｘ）を生成する。
　この復調画像Ｏｋ（ｘ）を逆フーリエ変換したものが、標本１５の超解像画像Ｏｒ（ｘ）である。この超解像画像Ｏｒ（ｘ）は、干渉縞の変調方向（ｘ方向）にかけて高い超解度を有している。
　次に、干渉縞の方向数Ｍｍａｘを３、各方向の位相数Ｎｍａｘを３と仮定した場合を説明する。
　図３０は、位相数Ｎｍａｘ＝３、方向数Ｍｍａｘ＝３である場合の復調演算を説明する図である。図３０において符号Ｉｒ（１，１）、Ｉｒ（２，１）、…、Ｉｒ（３，３）で示すのは、干渉縞の位相及び方向の組み合わせが互いに異なる変調画像であって、変調画像Ｉｒ（Ｎ、Ｍ）の「Ｎ」は、その変調画像に寄与した干渉縞の位相番号であり、変調画像Ｉｒ（Ｎ、Ｍ）の「Ｍ」は、その変調画像に寄与した干渉縞の方向番号である。
　図３０に示すとおり、位相数Ｎｍａｘ＝３、方向数Ｍｍａｘ＝３である場合の復調演算では、３×３＝９フレームの変調画像を個別にフーリエ変換し（図３０（ａ））、干渉縞の方向が共通である変調画像同士で変調成分の分離を行い（図３０（ｂ））、それによって得られた合計９つの変調成分の各々を再配置してから（図３０（ｃ））、同一の波数空間上で重み付け合成し（図３０（ｄ））、３方向にかけて周波数範囲の広がった復調画像Ｏｋを生成する。この復調画像Ｏｋを逆フーリエ変換したものが、標本１５の超解像画像Ｏｒである。この超解像画像Ｏｒは、３方向の各々にかけて高い解像度を有している。
　図３０に明らかなとおり、Ｎｍａｘ＝３、Ｍｍａｘ＝３の場合、Ｎｍａｘ×Ｎｍａｘ＝９フレームの変調画像から１フレームの超解像画像Ｏｒが生成される。
　なお、ここでは、位相数Ｎｍａｘを３と仮定したので、変調成分の分離を、連立方程式を解くことによって行ったが、位相数Ｎｍａｘが３より大きい場合は、以下の特許文献２に開示された方法で行ってもよい。
　特許文献２：国際公開第２００６／１０９４４８号パンフレット
　また、ここでは、２Ｄ－ＳＩＭモードについて説明したが、３Ｄ－ＳＩＭモードにおいては、変調画像に重畳される変調成分が、－２次変調成分、－１次変調成分、０次変調成分、＋１次変調成分、＋２次変調成分の５種類になるので（すなわち、ｌ＝－２、－１、０、＋１、＋２となるので）、これらの変調成分を互いに分離すればよい。よって、３Ｄ－ＳＩＭモードでは、例えば、位相数Ｎｍａｘを５以上として、一連の変調画像のフレーム数を増やせばよい。
　また、ここでは、復調演算における再配置（図３０（ｃ））及び合成（図３０（ｄ））の処理を順次に行ったが、一括の演算式で行うことも可能である。その演算式としては、以下の非特許文献１のOnline Methodsにおける数式（１）などが適用可能である。
　非特許文献１："Super-Resolution Video Microscopy of Live Cells by Structured Illumination", Peter Kner, Bryant B. Chhun, Eric R. Griffis, Lukman Winoto, and Mats G. L. Gustafsson, NATURE METHODS Vol.6 NO.5, pp.339-342, (2009)
　［その他］
　なお、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
　１…構造化照明顕微鏡装置、１００…レーザユニット、１１…光ファイバ、１０…照明光学系、３０…結像光学系、４２…撮像素子、４３…制御装置、４４…画像記憶・演算装置、４５…画像表示装置、１２…コレクタレンズ、１３…偏光板、１４…光束分岐部、１７…集光レンズ、１８…光束選択部、２１…レンズ、２２…視野絞り、２３…フィールドレンズ、２４…励起フィルタ、３３…ダイクロイックミラー、３１…対物レンズ、３４…吸収フィルタ、３５…第２対物レンズ、２…標本
 

Claims (14)

  1. 　複数波長の光を同時又は順次に射出する光源からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部と、
    　前記回折部で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系とを備え、
    　前記光学系は、第１の光学系と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系の瞳面又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系とを含み、
    　前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす
    　（ｆｏ・ｎｗ-ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ -ａｆλ／Ｐ）、
    　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
    　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
    　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数であり、ｎｗは標本の屈折率である。
  2. 　請求項１に記載の構造化照明装置において、
    　前記回折部は、前記射出光束の光路に対して挿脱可能であり、
    　前記第２の光学系は、前記倍率特性の異なる別の第２の光学系へと交換可能である
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  3. 　請求項２に記載の構造化照明装置において、
    　前記第２の光学系の交換対象は、前記第２の光学系の一部の要素である
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  4. 　請求項２又は請求項３に記載の構造化照明装置において、
    　前記第２の光学系のうち少なくとも交換対象となる要素は、接合レンズによって構成される
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  5. 　請求項１～請求項４の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記回折部の前記構造周期を切り替える制御部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  6. 　請求項１～請求項５の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記第１の光学系の光軸方向における前記集光位置を調整するための位置調整部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  7. 　請求項１～請求項６の何れか一項に記載の照明装置において、
    　前記干渉縞の位相をシフトさせるための位相シフト部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  8. 　請求項１～請求項７の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記回折部は、前記光学系の光軸に垂直な面内の互いに異なる複数方向に亘って周期構造を有し、
    　前記回折部で回折された前記複数の回折光束のうち１対の回折光束のみを選択する光選択部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  9. 　請求項１～請求項７の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記回折部は、前記光学系の光軸に垂直な面内の単一方向に亘って周期構造を有し、
    　前記標本面に対する前記複数の回折光束の入射方向を前記光軸の周りに回転させる回転部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  10. 　請求項１～請求項９の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記複数波長は、４００ｎｍから７００ｎｍの波長範囲内に収められる
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  11. 　請求項１～請求項１０の何れか一項に記載の構造化照明装置において、
    　前記回折部と前記瞳面との間の光路に対して光学部材を挿脱することにより、前記標本面を照明する光を、前記干渉縞による構造化照明光と、前記光源とは異なる第２光源を利用した別の照明光との間で切り換える切換部を更に備える
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
  12. 　請求項１～請求項１１の何れか一項に記載の構造化照明装置と、
    　前記干渉縞で変調された前記標本からの観察光束を光検出器に結像する結像光学系と、
    　を備えたことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
  13. 　請求項１２に記載の構造化照明顕微鏡装置において、
    　前記光検出器が生成した画像に基づき前記標本の復調像を演算する演算部を更に備えた
    　ことを特徴とする構造化照明顕微鏡装置。
  14. 　複数波長の光を同時又は順次に射出する光源からの射出光束を複数の回折光束に回折する回折部と、
    　前記回折部で回折された前記複数の回折光束による干渉縞を標本面に形成する光学系と、
    　を備えた構造化照明装置であって、
    　前記光学系は、第１の光学系と、前記複数の回折光束を前記第１の光学系の瞳面又は瞳近傍面の各位置へ集光させる第２の光学系とを含み、
    　前記複数波長に対する前記第２の光学系の倍率特性ｄＹ（λ）は、以下の条件を満たす
    　（０．７５－ａｆλ／Ｐ） ≦ ｄＹ（λ） ≦ （ｆｏ・ＮＡ－ａｆλ／Ｐ）、
    　ａ＝１（Ｍ＝１、２の場合）、
    　ａ＝２（Ｍ＝３の場合）
    　ことを特徴とする構造化照明装置。
    　但し、Ｍは前記回折部が有する周期構造の方向数であり、λは前記複数波長の各々であり、ｄＹ（λ）は、前記複数波長の基準波長をλ０としたとき、基準波長λ０の像高２ｆ・λ０／Ｐと、前記複数波長の各々の波長λの像高２ｆ・λ／Ｐとの差であり、ｆｏは前記第１の光学系の基準波長λ０の焦点距離、ｆは前記第２の光学系の基準波長λ０の焦点距離、Ｐは前記回折部の構造周期、ＮＡは前記第１の光学系の開口数である。
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