JP2015230439A - 照明光学系、顕微鏡装置、及び照明方法 - Google Patents

Abstract

【課題】標本上に形成される干渉縞を調整可能な照明光学系、顕微鏡装置、及び照明方法を提供する。
【解決手段】光源からの光を複数の光束に分岐する分岐部と、複数の光束のうちの第１光束が入射する第１領域、及び複数の光束のうちの第２光束が入射する第２領域を有し、第１領域の屈折率分布および第２領域の屈折率分布のそれぞれを変化可能な位相変調装置２１と、第１光束および第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明する第１光学系２４と、位相変調装置からの第１光束を、第１光学系の後側焦点面に集光し、位相変調装置からの第２光束を後側焦点面において第１光束が集光される位置と異なる位置に集光する第２光学系と、を備え、後側焦点面の第１光束の位置を第１領域の屈折率分布の変化により調整し、後側焦点面の第２光束の位置を第２領域の屈折率分布の変化により調整する照明光学系に関する。
【選択図】図２

Description

本発明は、照明光学系、顕微鏡装置、及び照明方法に関する。

顕微鏡装置において、光学系の分解能を越えた観察を可能とする超解像顕微鏡がある。この超解像顕微鏡の一形態として、空間変調された照明光により標本を照明して変調画像を取得し、その変調画像を復調することにより、標本の超解像画像を生成する構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ：Structured Illumination Microscopy）が知られている（例えば、特許文献１を参照）。この手法においては、光源から射出された光束を回折格子等により複数の光束に分岐し、それらの光束を標本の近傍で互いに干渉させることで形成された干渉縞で標本を照明することにより、標本の変調画像を取得している。

米国再発行特許発明第３８３０７号明細書

上述のような構造化照明顕微鏡は、照明のパターンが変化すると、分解能が変化することがあり得る。例えば、光源からの光の波長を変更すると、回折格子での回折角が変化するため、標本へ入射する光の角度分布が変化する。その結果、干渉縞のピッチが変化し、所望の分解能が得られないことがあり得る。本発明は、上述の事情を鑑みなされたものであり、標本上に形成される干渉縞を調整可能な照明光学系、顕微鏡装置、及び照明方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様に従えば、光源からの光を複数の光束に分岐する分岐部と、前記複数の光束のうちの第１光束が入射する第１領域、及び前記複数の光束のうちの第２光束が入射する第２領域を有し、前記第１領域の屈折率分布および前記第２領域の屈折率分布のそれぞれを変化可能な位相変調装置と、前記第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明する第１光学系と、前記位相変調装置からの前記第１光束を、前記第１光学系の後側焦点面に集光し、前記位相変調装置からの前記第２光束を前記後側焦点面において前記第１光束が集光される位置と異なる位置に集光する第２光学系と、を備え、前記後側焦点面の前記第１光束の位置を前記第１領域の屈折率分布の変化により調整し、前記後側焦点面の前記第２光束の位置を前記第２領域の屈折率分布の変化により調整する照明光学系が提供される。

本発明の第２の態様に従えば、第１の態様の照明光学系と、照明光学系が形成する干渉縞で変調された試料の変調像を撮像する撮像装置と、前記撮像装置が撮像した前記変調像を復調する復調装置と、を備える顕微鏡装置が提供される。

本発明の第３の態様に従えば、光源からの光を複数の光束に分岐することと、前記複数の光束のうちの第１光束が入射する第１領域、及び前記複数の光束のうちの第２光束が入射する第２領域を有し、前記第１領域の屈折率分布および前記第２領域の屈折率分布のそれぞれを変化可能な位相変調装置を配置することと、前記位相変調装置からの前記第１光束を、該第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明させる光学系の後側焦点面に集光し、前記位相変調装置からの前記第２光束を前記後側焦点面において前記第１光束が集光される位置と異なる位置に集光することと、前記後側焦点面の前記第１光束の位置を前記第１領域の屈折率分布の変化により調整し、前記後側焦点面の前記第２光束の位置を前記第２領域の屈折率分布の変化により調整することと、前記光学系により前記第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明することと、を含む照明方法が提供される。

本発明の態様によれば、照明のパターンを調整可能な照明光学系、顕微鏡装置、及び照明方法を提供できる。

本実施形態に係る顕微鏡装置を示す図である。 本実施形態に係る照明光学系を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は分岐部を説明する図である。 集光点の配列方向と干渉縞の方向との関係を示す図である。 （ａ）は、レンズアレイの構成を示す図、（ｂ）は位相変調装置の構成を示す図、（ｃ）は、レンズアレイの構成を示す図である。 本実施形態に係る位相変調器を示す図である。 マスクの構成を説明する図である。 顕微鏡装置の動作を示すフローチャートである。 位相変調器による第１光束の進行方向の変化を示す図である。 位相変調器が第１光束に付与する位相の空間分布を示す図である。 照明光Ｌａの波長の切替に伴う干渉縞のピッチの変化を示す図である。 位相変調器が光束に付与する位相の空間分布と、干渉縞との対応関係を示す表である。

以下、本発明の説明に先立ち、２次元構造化照明顕微鏡装置（２Ｄ−ＳＩＭ：2D-Structured Illumination Microscopy）と、３次元構造化照明顕微鏡装置（３Ｄ−ＳＩＭ：３Ｄ-Structured Illumination Microscopy）とについて説明する。
一般的に、蛍光顕微鏡では、蛍光物質を含む標本の蛍光分布が観察されるが、２Ｄ−ＳＩＭでは、２光束干渉による干渉縞（構造化照明）を用いて標本を照明することにより、標本の蛍光分布と構造化照明の分布によるモアレが形成される。そして、このモアレ像（変調像）を取得し、復調することにより、標本面と水平な方向（光軸と垂直な方向）の標本の構造に対して、解像度の高い標本画像を得ることができる。
一方、３Ｄ−ＳＩＭでは、３光束干渉による干渉縞（構造化照明）を用いて標本を照明することにより、光軸方向にも干渉縞を形成することができるため、光軸方向の標本の構造に対してもモアレを発生させることができる。これにより、光軸方向の標本の構造に対しても解像度の高い標本画像を得ることができる。
以下の実施形態の説明では、２Ｄ−ＳＩＭを例に挙げて説明するが、３Ｄ−ＳＩＭに対しても適用可能である。

図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置１を示す図である。図２は、本実施形態に係る照明光学系を示す図である。顕微鏡装置１は、光源装置２、照明光学系３、結像光学系４、撮像装置５、及び制御装置６を備える。光源装置２および照明光学系３により照明装置が構成される。照明光学系３は、顕微鏡装置１のステージ（図示せず）等に配置された蛍光物質を含む標本Ｓを干渉縞で照明する。結像光学系４は、干渉縞で変調された標本Ｓの蛍光像（変調像）を撮像装置５の撮像面において結像させる。撮像装置５は、結像光学系４により結像された標本Ｓの蛍光像を撮像する。制御装置６は、顕微鏡装置１の各部を制御する。本実施形態において、制御装置６は、撮像装置５により撮像された変調像を復調する復調装置７を含む。以下、図面内においてＸＹＺ座標系を用いて説明する。Ｙ軸は照明光学系３におけるダイクロイックミラー２３による反射前の光軸方向を規定し、Ｚ軸は照明光学系３におけるダイクロイックミラー２３による反射後の光軸方向、光学系２４の光軸方向および結像光学系４における測定光Ｌｂの光軸方向を規定し、Ｙ軸はＸ軸およびＺ軸にそれぞれ直交する方向を規定する。

光源装置２は、レーザユニット１０および光ファイバ１１を含む。レーザユニット１０は、第１レーザ光源１２、第２レーザ光源１３、シャッタ１４、シャッタ１５、ミラー１６、ダイクロイックミラー１７、及びレンズ１８を含む。

第１レーザ光源１２及び第２レーザ光源１３は、それぞれ可干渉光源である。第１レーザ光源１２は、第１波長のレーザ光を射出する。シャッタ１４は、第１レーザ光源１２からのレーザー光の通過と遮断を切替可能である。シャッタ１４を通過したレーザ光は、ミラー１６で反射した後に、ダイクロイックミラー１７で反射する。第２レーザ光源１３は、第１波長よりも短波長の第２波長のレーザ光を射出する。シャッタ１５は、第２レーザ光源１３からのレーザ光の通過と遮断を切替可能である。シャッタ１５を通過したレーザー光は、ダイクロイックミラー１７を通って、第１レーザ光源１２から射出されダイクロイックミラーで反射したレーザ光と同じ光路を進行する。ダイクロイックミラー１７を経由した第１波長のレーザ光と第２波長のレーザ光は、レンズ１８により集光されて、光ファイバ１１の入射端面に入射し、光ファイバ１１の内部を伝播する。光ファイバ１１の内部を伝播した第１波長のレーザ光と第２波長のレーザ光は、照明光学系３へ導かれる。光ファイバ１１の出射端面には、光源像が形成される。

照明光学系３は、光学系２０、位相変調装置２１、光学系２２、励起光フィルタ５７、ダイクロイックミラー２３及び光学系２４を含む。なお、本実施例では、照明光学系３が励起光フィルタ５７およびダイクロイックミラー２３を含む場合を例示するが、励起光フィルタ５７およびダイクロイックミラー２３を含まなくてもよい。以下の説明において、光源装置２から標本Ｓに至る光を、適宜、照明光Ｌａという。

以下、図１、２を参照しつつ、照明光学系３の構成について詳しく説明する。光学系２０は、コリメートレンズ３０、偏光板３１、分岐部３２、集光レンズ３３、及びレンズアレイ３４を含む。なお、図２においては、励起光フィルタ５７の図示を省略している。

コリメートレンズ３０は、光源装置２からの照明光Ｌａを平行光とする。偏光板３１は、コリメートレンズ３０からの照明光Ｌａが入射する位置に配置されている。偏光板３１により光ファイバ１１から出射するレーザ光の偏光を直線方向に変換する。本実施形態において、偏光板３１の透過軸は、光ファイバ１１からのレーザ光の偏光方向とほぼ同じ方向に設定される。また、偏光板３１の透過軸に平行な面は、後述する位相変調装置２１の位相変調器３６（図６参照）において、電界が印加された際に液晶分子４２ａが回転する回転面（以下、所定面と称す）に平行となっている。これにより、所定面内で回転した液晶分子４２ａは、第１光束Ｌ１の屈折率を変化させて該第１光束Ｌ１の進行方向を変化させることが可能とされている。

分岐部３２は、偏光板３１からの照明光Ｌａが入射する位置に配置される。分岐部３２は、光源装置２からの照明光Ｌａを第１光束Ｌ１、第２光束Ｌ２および第３光束Ｌ３を含む複数の光束に分岐する。分岐部３２は、例えば、回折光学素子であり、光源装置２からの照明光Ｌａが回折により分岐される。分岐部３２において、照明光Ｌａが回折され、複数の次数の回折光が生じる。以下、説明のため、分岐部３２から出射した＋１次回折光を第１光束Ｌ１とし、−１次回折光を第２光束Ｌ２とし、０次回折光を第３光束Ｌ３とするが、分岐部３２からは、これらの回折光以外の高次の回折光も出射されていてもよい。各回折光は、次数に応じた方向に伝播する。

本実施形態において、分岐部３２は、図１に示す並進機構３５によって並進移動が可能である。並進機構３５は、ピエゾモータ等のアクチュエータを含む。並進機構３５が分岐部３２を併進移動させると、干渉縞の位相がシフトする。顕微鏡装置１は、分岐部３２を併進移動させて干渉縞の位相をシフトさせながら、復調装置７の復調演算に必要とされる枚数の変調画像を取得する。

また、分岐部３２は、図１に示す回転機構３８によって回転可能に構成されている。回転機構３８は、例えば、回転ステージである。回転機構３８が、分岐部３２を回転させると、干渉縞の方向（波数ベクトル）の向きがそれに応じて変わる。顕微鏡装置１は、回転機構３８により分岐部３２を回転させて、干渉縞の向きを変えて、さらに、分岐部３２を併進移動させて干渉縞の位相をシフトさせながら、復調装置７の復調演算に必要とされる枚数の変調画像を取得する。

つまり、変調画像を復調するには、位相の異なる複数の変調画像のデータが必要であり、そのために、分岐部３２を格子ピッチの方向へシフトさせながら変調像の検出を繰り返す必要がある。さらに、超解像効果を被観察物上の各方向に亘り得るためには、分岐部３２の配置方向を回転させ、各々の回転位置においてこのようなシフトを行う必要がある。したがって、分岐部３２には、シフト用の並進機構３５と回転用の回転機構３８とを組み合わせた機構が必要となる。

ここで、分岐部３２を構成する回折光学素子について詳しく説明する。
図３（ａ）は、分岐部３２を光ファイバ１１側から見た図であり、図３（ｂ）は、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）を撮像装置５側から見た図である。なお、図３（ａ）は模式図であるため、図３（ａ）に示した分岐部３２の構造周期は実際の構造周期と同じとは限らない。なお、本実施形態は２Ｄ−ＳＩＭに関するものであって、０次回折光を遮光している。そのため、図３（ｂ）においては、便宜上、０次回折光はマスク５１に遮光されていないものとし、該０次回折光の集光点１９ａを図示した。しかしながら、０次回折光は、実際には後述のようにマスク５１で遮光されることから、瞳面２４Ａにて集光点を形成することはない（図１参照）。本実施形態において、±１次回折光束は、ダイクロイックミラー２３で反射されて、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）に集光する。そのため、図３（ｂ）において、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）は、ＸＹ平面に平行な面で規定される。

図３（ａ）に示すように分岐部３２は、照明光学系３の光軸ＡＺと垂直な面内（ＸＺ平面内：図２参照）において所定方向に周期構造を有した１方向回折格子である。以下、周期構造の形成方向はＺ軸方向であると仮定する。

この分岐部３２の材質は、例えばガラスである。分岐部３２の周期構造は、濃度（透過率）を利用して形成された濃度型の周期構造、段差（位相差）を利用して形成された位相型の周期構造の何れであってもよいが、位相差型の周期構造の方が＋１次回折光の回折効率が高いという点で好ましい。

このような分岐部３２に入射した平行光束は、周期構造の方向（Ｚ軸方向）にかけて分岐した回折光束群に変換される。

この回折光束群には、０次回折光束及び±１次回折光束が含まれ、このうち互いの次数が共通である±１次回折光束は、光軸ＡＺに関して対称な方向に進行し、０次回折光束は、光軸ＡＺに沿って進行する。

これらの±１次回折光束は、位相変調装置２１及び光学系２２を通過した後、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）の互いに異なる位置に集光する。一方、０次回折光束は、本実施形態ではマスク５１で遮光されるが、遮光されない場合、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）において、±１次回折光束が集光する位置とは異なる位置に集光する。

図３（ｂ）に示すように、上述のように便宜上、マスク５１に遮光されないとした場合の０次回折光束の集光点１９ａは光軸ＡＺ上に位置し、±１次回折光束の集光点１９ｂ、１９ｃは、光軸ＡＺに関して対称である。因みに、図１に示す回転機構３８の後述する回動角θ’がゼロであるときには、集光点１９ａ、１９ｂ、１９ｃは、周期構造の方向（図３（ａ）のＺ軸方向）、すなわち、図３（ｂ）のＹ軸方向に沿って配列される。

なお、ここでいう集光点とは、最大強度の８割以上の強度を有する領域の重心位置のことである。
また、以上の分岐部３２は、上述の並進機構３５によって並進移動が可能である。並進機構３５による分岐部３２の並進移動の方向は、照明光学系３の光軸ＡＺと垂直な方向であって、周期構造の方向（Ｚ軸方向）に対して非垂直な方向である。この方向に分岐部３２が並進移動すると、干渉縞の位相がシフトする。なお、詳細については後述する。以下、本実施例では、分岐部３２が一次元回折格子である場合を例に挙げて説明する。

図４は、集光点１９ａ、１９ｂ、１９ｃの配列方向と干渉縞の方向との関係を示す図である。

先ず、回転機構３８の回動角θが０°であるときにおける集光点１９ｂ、１９ａ、１９ｃの配列方向を、第１方向Ｖ１（Ｙ軸方向）とおく（図４（ａ１）参照）。このとき、標本Ｓに形成される干渉縞の方向は、第１方向Ｖ１に対応した方向となる（図４（ａ２）参照）。

次に、回転機構の回動角θが＋１２０°だけ変化すると、集光点１９ｂ、１９ａ、１９ｃの配列方向は、第１方向Ｖ１から＋１２０°だけ回転した第２方向Ｖ２となる（図４（ｂ１）参照）。このとき、標本Ｓに形成される干渉縞の方向は、第２方向Ｖ２に対応した方向となる（図４（ｂ２）参照）。

次に、回転機構３８の回動角θが更に＋１２０°だけ（すなわち２４０°）変化すると、集光点１９ｂ、１９ａ、１９ｃの配列方向は、第２方向Ｖ２から＋１２０°だけ回転した第３方向Ｖ３となる（図４（ｃ１）参照）。このとき、標本Ｓに形成される干渉縞の方向は、第３方向Ｖ３に対応した方向となる（図４（ｃ２）参照）。

回折光の回折角αは、照明光Ｌａの波長λ、及び分岐部３２の回折パターンのピッチｐを用いて、α＝ｓｉｎ^−１（λ／ｐ）で表される。すなわち、照明光Ｌａの波長λが長いほど、回折角αが大きい。本実施形態においては、上述したように、２Ｄ−ＳＩＭを例に挙げて説明しているため、照明光学系３は、±１次回折光の２光束干渉により干渉縞を形成する。そのため、本実施形態においては、０次回折光、±１次回折光以外の回折光についての説明を省略する。

集光レンズ３３は、分岐部３２からの照明光Ｌａが入射する位置に配置されている。集光レンズ３３は、第１光束Ｌ１、第２光束Ｌ２、及び第３光束Ｌ３のそれぞれを集光する。集光レンズ３３の前側焦点位置近傍に、分岐部３２が配置されていることが望ましい。これは瞳共役面２０aにおいて、光ファイバ１１の像を像側テレセンで形成するためである。これにより、レンズ位置ずれ等による倍率変更に伴う瞳位置ずれを抑制でき、さらに各回折光の分離を確実に行うことができる。集光レンズ３３の後側焦点の位置には、光学系２４（対物レンズ）の後側焦点面（瞳面２４Ａ）と共役な瞳共役面２０ａが形成される。第１光束Ｌ１、第２光束Ｌ２、及び第３光束Ｌ３は、瞳共役面２０ａ上の互いに異なる位置に収束する。瞳共役面２０ａを通った各光束は、レンズアレイ３４に入射する。レンズアレイ３４はレンズアレイ５０との組み合わせにより、両側テレセン系を構成することが望ましく、そのために、レンズアレイ３４の前側焦点位置はレンズ３３の後側焦点位置に一致させることが望ましい。

本実施形態において、レンズアレイ３４は、分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）に応じて構成されている。上述したように、回転機構３８を動作させて分岐部３２を回転させるので、回転機構３８の回転角度に応じて、分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）が変わることになる。したがって、レンズアレイ３４は、回折方向（分岐方向）に応じて設けられたレンズ要素を有する。

図５（ａ）はレンズアレイ３４の構成を示す図である。図５（ａ）に示されるレンズアレイ３４は、図４を参照して説明したように、回転機構３８の回動角θが０°、＋１２０°、２４０°である場合のレンズアレイ３４の構成の一例を示す図である。
図５（ａ）に示すように、レンズアレイ３４は、０次回折光をコリーメートするレンズ要素３４ａと、±１次回折光をコリーメートするレンズ要素３４ａの周囲に配置された６つのレンズ要素３４ｂ〜３４ｇを含む。６つのレンズ要素３４ｂ〜３４ｇのうち、レンズ要素３４ａを挟むように配置される２個１組のレンズ要素３４ｂ、３４ｅは、回転機構３８の回動角θが０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第１方向Ｖ１に対応しており、レンズ要素３４ｄ、３４ｇは、回転機構３８の回動角θが１２０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第２方向Ｖ２に対応しており、レンズ要素３４ｃ、３４ｆは、回転機構３８の回動角θが２４０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第３方向Ｖ３に対応している。
このような２個１組のレンズ要素３４ｂ、３４ｅ、レンズ要素３４ｄ、３４ｇ、及びレンズ要素３４ｃ、３４ｆが３組設けられる。そのため、本実施形態においては、レンズアレイ３４を分岐部３２の回転に同期して回転させる必要が無い。

図２に示したように、位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１と第２光束Ｌ２とが空間的に分離した位置、すなわち第１光束Ｌ１の光路と第２光束Ｌ２の光路とが重複しない位置に配置されている。位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２のそれぞれの進行方向を変化可能である。

図５（ｂ）は位相変調装置２１の構成を示す図である。図５（ｂ）に示される位相変調装置２１は、図４を参照して説明したように、回転機構３８の回動角θが０°、＋１２０°、２４０°である場合の位相変調装置２１の構成の一例を示す図である。
図５（ｂ）に示すように、位相変調装置２１は、回転機構３８の回動角θが０°のときに、レンズ要素３４ｂからの第１光束Ｌ１が入射する第１領域Ａ１と、レンズ要素３４ｅからの第２光束Ｌ２が入射する第２領域Ａ２とを含む。第２領域Ａ２の位置は、照明光学系３の光軸ＡＺに関して、第１領域Ａ１の位置と対称的である。
さらに、位相変調装置２１は、回転機構３８の回動角θが１２０°のときに、レンズ要素３４ｄからの第１光束Ｌ１が入射する第１領域Ａ３と、レンズ要素３４ｇからの第２光束Ｌ２が入射する第２領域Ａ４とを有する。第１領域Ａ３の位置は、照明光学系３の光軸ＡＺに関して、第２領域Ａ４の位置と対称的である。
さらに、位相変調装置２１は、回転機構３８の回動角θが２４０°のとき、レンズ要素３４ｆからの第１光束Ｌ１が入射する第１領域Ａ５と、レンズ要素３４ｃからの第２光束Ｌ２が入射する第２領域Ａ６とを含む。第１領域Ａ５の位置は、照明光学系３の光軸ＡＺに関して、第２領域Ａ６の位置と対称的である。

すなわち、本実施形態において、第１領域Ａ１および第２領域Ａ２は、回転機構３８の回動角θが０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第１方向Ｖ１に対応しており、第１領域Ａ３および第２領域Ａ４は、回転機構３８の回動角θが１２０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第２方向Ｖ２に対応しており、第１領域Ａ５および第２領域Ａ６は、回転機構３８の回動角θが２４０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第３方向Ｖ３に対応している。
このような２個１組の第１領域Ａ１と第２領域Ａ２、第１領域Ａ３と第２領域Ａ４、及び第１領域Ａ５と第２領域Ａ６が３組設けられる。そのため、本実施形態においては、位相変調装置２１を分岐部３２の回転に同期して回転させる必要が無い。

位相変調装置２１は、第１領域Ａ１、Ａ３、Ａ５の屈折率分布を、電界を加えることにより変化させることが可能であり、第１領域Ａ１、Ａ３、Ａ５の屈折率分布により第１光束Ｌ１の進行方向を変化可能である。同様に、位相変調装置２１は、第２領域Ａ２、Ａ４、Ａ６の屈折率分布を、電界を加えることにより変化させることが可能であり、第２領域Ａ２、Ａ４、Ａ６の屈折率分布により第２光束Ｌ２の進行方向を変化可能である。図２には、位相変調装置２１により進行方向が変化した後の第１光束Ｌ１´および第２光束Ｌ２´を点線で示した。

本実施形態において、位相変調装置２１は、図５（ｂ）に示すように、第１領域Ａ１、Ａ３、Ａ５にそれぞれ配置された位相変調器３６、及び第２領域Ａ２、Ａ４、Ａ６にそれぞれ配置された位相変調器３７を含む。すなわち、本実施形態において、位相変調装置２１は、位相変調器３６、３７をそれぞれ３個ずつ含む。
位相変調器３６および位相変調器３７は、それぞれ、いわゆる空間光変調器（SLM；Spatial Light Modulator）である。位相変調器３６は、レンズアレイ３４のレンズ要素３４ｂ、３４ｄ、３４ｆの後側焦点の位置にそれぞれ配置される。位相変調器３７は、レンズアレイ３４のレンズ要素３４ｅ、３４ｇ、３４ｃの後側焦点の位置にそれぞれ配置される。

本実施形態において、位相変調器３７は、位相変調器３６と同様の構成である。以下、位相変調器３６の構成を代表的に説明し、位相変調器３７の説明については簡略化する。
図６は、本実施形態に係る位相変調器３６を示す図である。本実施形態において、位相変調器３６は、いわゆる透過型の液晶パネルを含む。位相変調器３６は、第１基板４０と、第１基板４０に対向する第２基板４１と、第１基板４０と第２基板４１との間に配置された液晶層４２と、液晶層４２に電界を印加する第１電極４３および第２電極４４と、を含む。

第１基板４０及び第２基板４１のそれぞれは、例えばガラス基板であり、第１光束Ｌ１が透過する特性を有する。第１電極４３は、第１基板４０において分割された領域（画素４７）毎に設けられている。第１基板４０には第１電極４３ごとに電圧を印加可能なアクティブマトリクス回路４５が設けられている。第２電極４４は、複数の第１電極４３に対して共通に、第２基板４１に設けられている。液晶層４２は、屈折率異方性を有する液晶分子４２ａを含む。第１電極４３と液晶層４２との間、及び第２電極４４と液晶層４２との間には、それぞれ、配向膜４６が形成されている。配向膜４６は、液晶層４２に含まれる液晶分子４２ａの方位を規制する。

このように、位相変調器３６は、各第１電極４３と第２電極４４との間に電界を印加可能である。電界が印加された画素４７は、屈折率異方性を有する液晶分子４２ａの方位角が変化することにより屈折率が変化し、結果として、この画素４７を通る光に屈折率に応じた位相を付与する。位相変調器３６は、複数の画素４７における屈折率分布を調整することにより、第１光束Ｌ１の位相分布を変化させることができる。

図２の説明に戻り、光学系２２は、位相変調装置２１からの第１光束Ｌ１を、瞳共役面２０ｂに集光する。また、光学系２２は、位相変調装置２１からの第２光束Ｌ２を、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１と異なる位置に集光する。ここで、瞳共役面２０ｂとは、レンズアレイ５０の焦点位置（後側焦点位置）であって、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）の共役面である。
瞳共役面２０ｂに向かった回折光束群は、瞳共役面２０ｂの近傍に配置された後述のマスク５１へ入射する。このマスク５１を通過した回折光束群は、後述の高次光カット部材へ入射する。
本実施形態において、光学系２２と光学系２４との間の光路には、ダイクロイックミラー２３（図１参照）が配置されており、光学系２２からの第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２は、ダイクロイックミラー２３で反射して光学系２４に入射する。

照明光学系３の光学系２２は、レンズアレイ５０と、マスク５１と、高次光カット部材５５と、レンズ２５と、視野絞り２６と、フィールドレンズ２７とを含む。

図５（ｃ）はレンズアレイ５０の構成を示す図である。図５（ｃ）に示されるレンズアレイ５０は、図４を参照して説明したように、回転機構３８の回動角θが０°、＋１２０°、２４０°である場合のレンズアレイ５０の構成の一例を示す図である。
図５（ｃ）に示すように、レンズアレイ５０は、位相変調装置２１を介した第３光束（０次回折光）Ｌ３を集光するレンズ要素５０ａと、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光）を集光するレンズ要素５０ａの周囲に配置された６つのレンズ要素５０ｂ〜５０ｇを含む。６つのレンズ要素５０ｂ〜５０ｇのうち、レンズ要素５０ａを挟むように配置される２個１組のレンズ要素５０ｂ、５０ｅは、回転機構３８の回動角θが０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第１方向Ｖ１に対応しており、レンズ要素５０ｄ、５０ｇは、回転機構３８の回動角θが１２０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第２方向Ｖ２に対応しており、レンズ要素５０ｃ、５０ｆは、回転機構３８の回動角θが２４０°であるときに分岐部３２により回折される光の回折方向（分岐方向）である第３方向Ｖ３に対応している。
このような２個１組のレンズ要素５０ｂ、５０ｅ、レンズ要素５０ｄ、５０ｇ、及びレンズ要素５０ｃ、５０ｆが３組設けられる。そのため、本実施形態においては、レンズアレイ５０を分岐部３２の回転に同期して回転させる必要が無い。

光学系２２は、例えば、両側テレセントリックに構成される。レンズアレイ５０の各レンズ要素５０ｂ〜５０ｇの前側焦点の位置は、レンズアレイ３４の各レンズ要素３４ｂ〜３４ｇの後側焦点と実質的に同じ位置である。すなわち、位相変調器３６は、レンズ要素５０ｂ、５０ｄ、５０ｆの前側焦点の位置に配置される。位相変調器３７は、レンズ要素５０ｃ、５０ｅ、５０ｇの前側焦点の位置に配置される。

光学系２４（対物レンズ）の後側焦点面（瞳面２４Ａ）において、第１光束Ｌ１が入射する位置（図３（ｂ）の集光点１９ｂ）、及び後側焦点面（瞳面２４Ａ）に第２光束Ｌ２が入射する位置（図３（ｂ）の集光点１９ｃ）は、それぞれ、位相変調装置２１から出射する際の各光束の進行方向に依存する。すなわち、位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１の進行方向を変化させて第１光束Ｌ１´とすることにより、瞳共役面２０ｂ上で第１光束Ｌ１（第１光束Ｌ１´）の集光位置（集光点１１９ｂ）を調整可能である（図２参照）。
また、位相変調装置２１は、第２光束Ｌ２の進行方向を変化させて第２光束Ｌ２´とすることにより、瞳共役面２０ｂ上で第２光束Ｌ２（第２光束Ｌ２´）の集光位置（集光点１１９ｃ）を調整可能である（図２参照）。本実施形態において、照明光学系３の光軸ＡＺと瞳共役面２０ｂとの交点である第３光束Ｌ３が集光する集光位置（集光点１１９ａ）から第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂまでの距離は、集光点１１９ａから第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃまでの距離とほぼ同じに調整される。すなわち、±１次回折光束である第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の集光点１１９ｂ、１１９ｃは、それぞれ光軸ＡＺに関して対称の位置に調整される（図２参照）。

マスク５１は、瞳共役面２０ｂに配置される。マスク５１を通った第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２は、光学系２４を通って標本Ｓに入射し、標本Ｓ上で互いに干渉して干渉縞を生じる。

ここで、マスク５１について詳しく説明する。

図７（ａ）は、マスク５１を説明する図である。図７（ａ）に示すとおりマスク５１は、円形の透明基板の一部に円形の遮光部５１ｃを形成してなる空間フィルタである。

マスク５１の遮光部５１ｃは、０次回折光束の光路（集光点１１９ａ）をカバーし、マスク５１の非遮光部（透過部５１ｂ）は、±１次回折光束（第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２）の光路となりうる領域（集光点１１９ｂ、１１９ｃの掃引軌道）をカバーする。

このマスク５１は回動機構５６により、照明光学系３の光軸ＡＺと平行、かつその光軸ＡＺから離れた直線（軸ＡＲ）の周りに回動可能である。

なお、回動機構５６には、例えば、マスク５１を保持し、かつ軸ＡＲの周りに回転可能な不図示の回動軸と、その回動軸へ回転力を与える不図示のモータ（回転モータ）とが備えられる。このモータが駆動されると、回転軸が回転し、マスク５１が軸ＡＲの周りに回転する。

マスク５１の回動角が図７（ａ）に示した基準角度（０°）に設定されると、遮光部５１ｃが第３光束Ｌ３（０次回折光）の光路（集光点１１９ａ）に挿入され、マスク５１の回動位置が基準角度から外れた所定角度（例えば３０°）に設定されると、遮光部５１ｃが第３光束Ｌ３（０次回折光）の光路から外れる。

したがって、マスク５１の回動角を０°と３０°との間で切り換えれば、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光束）をオンしたまま第３光束Ｌ３（０次回折光）のみをオン／オフすることができる。

但し、マスク５１の回動角が基準角度（０°）、所定角度（３０°）の何れである場合にも、マスク５１の遮光部５１ｃは、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光束）の光路となりうる領域（集光点１１９ｂ、１１９ｃの掃引軌道）を遮ることは無いものとする。

なお、ここではマスク５１を回動可能な空間フィルタとしたが、スライド可能な空間フィルタや、固定配置された液晶素子などでマスク５１を構成してもよい。液晶素子の配向を、電界を加えることにより制御すれば、液晶素子の屈折率異方性を制御することができるので、液晶素子をマスク５１として機能させることができる。ただし、この場合は偏光子と組み合わせることが望ましい。

次に、高次光カット部材５５を詳しく説明する。

図７（ｂ）は、高次光カット部材５５を説明する図である。図７（ｂ）に示すとおり高次光カット部材５５は、円形の不透明基板（マスク用基板）に、円形の開口部５５ａと輪帯状の開口部５５ｂとを形成してなる空間フィルタである。

高次光カット部材５５において円形の開口部５５ａは、第３光束Ｌ３（０次回折光）の集光点１１９ａをカバーしており、輪帯状の開口部５５ｂは、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光束）の光路となりうる領域（集光点１１９ｂ、１１９ｃの掃引軌道）をカバーしている。また、高次光カット部材５５において２次以降の高次回折光束の光路となりうる領域は、遮光部（非開口部）となっている。

なお、輪帯状の開口部５５ｂの径方向の長さは、位相変調装置２１よる第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の進行方向の変化に対処できるよう、十分な大きさを有している。

因みに、位相変調装置２１よる第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の進行方向の変化がなかった場合、光源波長をλとおき、分岐部３２の構造周期をＰとおき、レンズアレイ５０の焦点距離をｆｃとおくと、光軸ＡＺから瞳共役面２０ｂにおける集光点１１９ｂ、１１９ｃまでの高さＤは、Ｄ＝ｆｃ×λ／Ｐで表される。

本実施形態において、照明光学系３は、標本Ｓに入射する照明光Ｌａの偏光状態を該標本Ｓの表面に対してＳ偏光に調整する偏光調整部５２を備える。偏光調整部５２は、位相変調装置２１と標本Ｓとの間の光路（図２ではマスク５１と光学系２４との間の光路）に配置された１／２波長板を含む。この波長板は、回転可能に設けられており、分岐部３２の方向に応じて回転駆動される。より具体的には、分岐部３２の縞方向と同じ方向の偏光状態を作るために、１／２波長板は回転駆動される。

偏光調整部５２を通過した第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光束）は、レンズ２５によって視野絞り２６付近で分岐部３２と共役な面を形成する。その後、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の各々は、フィールドレンズ２７により収束光に変換され、励起光フィルタ５７（図１参照）を通り抜けた後にダイクロイックミラー２３で反射し、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上の互いに異なる位置に集光される。励起光フィルタ５７は、照明光Ｌａから標本Ｓの蛍光物質を励起するための励起光のみを透過させるフィルタである。

光学系２４は、後側焦点面（瞳面２４Ａ）上に集光した第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２（±１次回折光束）の各々を分岐部３２と光学的に共役な標本Ｓ上で互いに干渉させ、その干渉縞で、標本Ｓを照明する。本実施形態において、光学系２４は、いわゆる対物レンズである。光学系２４は、例えば、両側テレセントリックに構成される。

このようにして照明光学系３は、標本Ｓ上に干渉縞を形成し、標本Ｓを干渉縞で照明する。以下の説明において、照明光Ｌａで照らされている標本Ｓから撮像装置５に至る光を、適宜、測定光Ｌｂという。

図１の結像光学系４は、標本Ｓを物体面としたときの像面を形成する。結像光学系４は、光学系２４、ダイクロイックミラー２３、励起光カットフィルタ５８および光学系５３を含む。すなわち、光学系２４は、照明光学系３の一部と結像光学系４の一部とを兼ねている。標本Ｓからの測定光Ｌｂは、光学系２４を通ってダイクロイックミラー２３に入射する。ダイクロイックミラー２３は、照明光Ｌａの少なくとも一部が反射し、かつ測定光Ｌｂの少なくとも一部が透過する特性を有する。励起光カットフィルタ５８は、照明光Ｌａをカットし、標本Ｓからの蛍光を透過させるフィルタである。光学系５３は、光学系２４からの測定光Ｌｂがダイクロイックミラー２３および励起光カットフィルタ５８を通って入射する位置に、配置されている。

撮像装置５は、例えばＣＭＯＳセンサー、ＣＣＤセンサーなどのイメージセンサーを含む。このイメージセンサーは、複数の画素を有し、複数の画素のそれぞれに配置された光電変換層を含む。撮像装置５において、光電変換層が配置される面を、適宜、受光面という。撮像装置５は、結像光学系４が形成する像面に撮像装置５の受光面がほぼ一致するように、配置されている。換言すると、結像光学系４は、標本の像を撮像装置５の受光面に形成する。撮像装置５は、照明光学系３により形成された干渉縞で標本Ｓが照明されている状態において、干渉縞で変調された標本Ｓの蛍光像（変調像）を撮像可能である。以下の説明において、干渉縞で変調された標本Ｓを撮像装置５で撮像した像を、適宜、モアレ像（変調画像）という。

復調装置７は、撮像装置５で撮像された変調画像を示す変調画像データを、撮像装置５から取得する。復調装置７は、照明光学系３が標本Ｓに形成する干渉縞のパラメーター（空間周波数、位相）、及び撮像装置５からの変調画像を使って変調標本パターンを復調することにより、標本Ｓのパターンに相当する復調像を生成する。

［干渉縞に基づく画像復調］
以下、復調装置７がモアレ像を復調する方法について説明する。復調方法は、例えば、米国特許番号８１１５８０６に記載の方法が使用できるが、この方法に限られない。以下、復調方法の一例を説明する。まず、簡単のため、２Ｄ−ＳＩＭの復調方法を例に挙げて説明する。

点像強度分布Ｐｒ（ｘ）を持つ光学系において、蛍光密度分布Ｏｒ（ｘ）を有する標本に対し、単一の空間周波数成分Ｋを持つ正弦波状の照明を与えた場合に取得される標本の像は、下記の式（１）で表すことができる。式（１）におけるφは、構造化照明の位相である。

ここで、ｌ＝−１，０，１であり、ｍｌは照明光の変調振幅である。ｌ＝０の成分は、構造化照明によって変調を受けない０次成分であり、ｌ＝−１，１の成分はそれぞれ、変調を受けた±１次成分（モアレ）である。この式（１）において、記号＊は畳み込み積分を表す。以下、実空間における量には添え字ｒを、波数空間における量には添え字ｋをつけて表す。この式（１）をフーリエ変換し、波数空間で表記すると、下記の式（２）が得られる。この式（２）において、Ｐｒ（ｘ）のフーリエ変換Ｐｋ（ｋ）は光学系の伝達関数 （ＯＴＦ； Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を表す。

この式（２）におけるｌ＝−１，１に対応するＯｋ（ｋ−Ｋ），Ｏｋ（ｋ＋Ｋ）は、標本の持つ空間周波数成分を、構造化照明の空間周波数成分Ｋだけずらすことを意味している。すなわち、これはｋという空間周波数成分までしか取得することのできない光学系であっても、標本が持つそれより高い空間周波数成分を取得できることを表している。このために、干渉縞の周期はこの光学系で結像できる範囲でできるだけ短いことが望ましい。

ここで、干渉縞の縞パターンをずらしながら撮像を行うと、同一の空間周波数成分、変調振幅を持ち、位相φのみ異なる画像がＮ枚得られる。このときのｊ番目の画像信号強度
Ｉｋｊ（ｋ）は、ｊ番目の画像の構造化照明位相をφｊと表すと、下記の式（３）で表される。

すなわち、この式（３）によりＮ個の方程式が得られる。ここで、これらの方程式においてＯｋ（ｋ＋ｌＫ），（ｌ＝−１，０，１）が未知数であるため、Ｎ≧３であれば、これらの方程式を解くことができる。

ここで、強度分布を持たない照明を与えた場合の光学系が持つＰｋ（ｋ）が検出可能な範囲は、光波長λ、対物レンズのＮＡに対して、ｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λであるから、上記で得られたＯｋ（ｋ＋ｌＫ）はｌ＝−１，０，１に対して、ｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ−Ｋ、ｋ＝２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λ、ｋ＝−２ＮＡ／λ＋Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋの情報を含む。したがって、Ｏｋ（ｋ＋ｌＫ）全体としてはｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋまでの情報を含むので、これをＯｋ（ｋ）と定義しなおして逆フーリエ変換を行い実空間の情報（標本Ｏｒ（ｘ）の画像）に戻すことにより、高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。すなわち、復調装置７は、上述した演算によって画像復調を行うことにより、超解像効果を得ることができる。

この結果得られた像は、空間変調がなされた１次元方向のみに高い解像度を持つ。さらに、空間変調を施す方向を少なくとも２方向に変化させ、それぞれの方向について１次元と同様の処理を施すことにより、復調装置７は、２次元方向においておよそ等方的に高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。なお、空間変調画像に対して最小自乗法による連立方程式を構成しておき、これを解くことによっても、復調装置７は、高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。

このように、２Ｄ−ＳＩＭでは、１次元方向において、干渉縞の位相を変化させて少なくとも３枚の画像を取得することにより、１次元方向において、高い解像度を持った標本画像を取得することができる。ここでは２Ｄ−ＳＩＭにおける復調方法を説明したが、３Ｄ−ＳＩＭでは、３光束干渉による干渉縞を用いるため、取得画像に混在する成分は、変調を受けていない０次成分、標本面内の１次元方向における超解像成分となる±２次成分、光軸方向の超解像成分となる±１次成分の５成分となる。したがって、３Ｄ−ＳＩＭでは、未知数が５つとなるので、少なくとも５枚の画像を取得することにより、上述した２Ｄ−ＳＩＭと同様に、画像を復元することができる。３Ｄ−ＳＩＭでは面内方向に加えて、光軸方向においても超解像観察を実現できる。

次に、顕微鏡装置１の動作について説明する。図８は、顕微鏡装置１の動作を示すフローチャートである。
図１に示した制御装置６は、並進機構３５を制御し、並進機構３５により分岐部３２を所定の位置にセットする（ステップＳ１）。次に、制御装置６は、光源装置２を制御し、光源装置２からの照明光Ｌａにより標本Ｓ上に干渉縞を形成する（ステップＳ２）。次に、制御装置６は、並進機構３５により分岐部３２を並進移動させる（ステップＳ３）。次に、制御装置６は、並進機構３５により分岐部３２を格子ピッチの方向へシフトさせつつ、撮像装置５を制御して、撮像装置５に変調画像を撮像させる（ステップＳ４）。次に、制御装置６は、変調画像の復調演算に必要とされる枚数の変調画像が撮像されているか否かを判定する（ステップＳ５）。制御装置６は、変調演算に必要な枚数の変調画像が撮像されていない場合（ステップＳ５；Ｎｏ）に、ステップＳ５の処理を適宜繰り返すことによって、変調演算に必要な枚数の変調画像を取得する。一方、制御装置６は、変調演算に必要な枚数の変調画像が撮像されている場合（ステップＳ５；Ｙｅｓ）に、超解像効果を被観察物上の各方向に亘り得るべく干渉縞の向きを変更するか否かを判定する（ステップＳ６）。制御装置６は、干渉縞の向きを変更する場合（ステップＳ６；Ｙｅｓ）に、回転機構３８を制御し、回転機構３８により分岐部３２を回転させる（ステップＳ７）。そして、ステップＳ２〜ステップＳ５の処理を適宜繰り返すことによって、変更後の干渉縞の向きにおいて変調演算に必要な枚数の変調画像を取得する。制御装置６は、干渉縞の向きを変更しない場合（ステップＳ６；Ｎｏ）に、被観察物上の各方向に亘って超解像効果が得られる変調画像を取得したと判定し、復調装置７による復調演算を実行する（ステップＳ８）。このようにして、顕微鏡装置１は、高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。なお、制御装置６は、変調演算に必要な枚数の変調画像が撮像される毎に、復調装置７による復調演算（ステップＳ８）を実行するようにしても構わない。すなわち、ステップＳ５とステップＳ６との間において、ステップＳ８を実行するようにしても良い。

次に、復調像の分解能について説明する。ここで、結像光学系４のカットオフ周波数Ｆｃｕｔｏｆｆとし、照明光学系３（光学系２４）が形成する干渉縞の空間周波数をＦｉとする。また、光強度が空間的に均一な照明光で照明されている状態（以下、非変調時という）の標本の像を、結像光学系４を介して取得した場合の分解能をＤ１とする。また、干渉縞により変調された標本Ｓのパターン（変調標本パターン）の像を、結像光学系４を介して取得した場合（以下、変調時という）の分解能をＤ２とする。分解能Ｄ１および分解能Ｄ２は、解像可能な最小寸法に相当し、その値が小さいほど解像度が高いことを示す。

ここで、結像光学系４のカットオフ周波数をＦｃｕｔｏｆｆ、干渉縞の空間周波数をＦｉとすると、Ｄ１＝1／Ｆｃｕｔｏｆｆであり、Ｄ２＝１／（Ｆｃｕｔｏｆｆ＋Ｆｉ）である。非変調時の分解能Ｄ１に対する変調時の分解能Ｄ２の比（Ｄ２／Ｄ１）は、超解像効果を示す指標であり、その値が大きくなるほど、結像光学系４のカットオフ周波数Ｆｃｕｔｏｆｆで定まる分解能Ｄ１よりも解像度が高い像が得られることを示す。Ｄ２／Ｄ１は、下記の式（４）で表される。
Ｄ２／Ｄ１＝Ｆｃｕｔｏｆｆ／（Ｆｃｕｔｏｆｆ＋Ｆｉ） ・・・（４）

カットオフ周波数Ｆｃｕｔｏｆｆは、結像光学系の開口数ＮＡ、および測定光の波長λを用いて、下記の式（５）で表される。また、干渉縞の空間周波数Ｆｉは、干渉縞の間隔の逆数であり、瞳面２４Ａ上の第１光束Ｌ１の集光点１９ｂから第２光束Ｌ２の集光点１９ｃまでの距離を２ｄとし、光学系２４の焦点距離をｆｏｂｊとすると、ヤングの干渉縞の式から下記の式（６）で近似できる。
Ｆｃｕｔｏｆｆ＝２×ＮＡ／λ ・・・（５）
Ｆｉ＝２ｄ／（ｆｏｂｊ×λ） ・・・（６）

式（５）及び式（６）を式（４）に代入すると、Ｄ２／Ｄ１は下記の式（７）で表される。
Ｄ２／Ｄ１＝２×ｆｏｂｊ×ＮＡ／（２×ｆｏｂｊ×ＮＡ＋２ｄ） ・・・（７）

式（７）によれば、超解像効果を示す指標（Ｄ２／Ｄ１）は、瞳面２４Ａ上の第１光束Ｌ１の集光点１９ｂから第２光束Ｌ２の集光点１９ｃまでの距離２ｄの関数であることがわかる。本実施形態において、位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の進行方向を変化させることにより、瞳面２４Ａ上の第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃの位置をそれぞれ調整可能である。すなわち、位相変調装置２１は、集光点１９ｂから集光点１９ｃまでの距離２ｄを調整可能であり、結果として、超解像効果の程度を調整可能である。

ところで、顕微鏡装置の分野において、照明光の波長選択の自由度が求められる場合がある。照明光の波長を変更すると、例えば回折格子での回折角が変化すること等で、瞳面上の第１光束の位置から第２光束の位置までの距離が変化することがある。その結果、波長の変更前後で顕微鏡の超解像効果が変化することがあり得る。

本実施形態に係る顕微鏡装置１は、瞳共役面２０ｂ上における第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂから第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃまでの距離、すなわち、瞳面２４Ａ上の第１光束Ｌ１の集光点１９ｂから第２光束Ｌ２の集光点１９ｃまでの距離を照明光学系３によって調整可能であるので、例えば、照明光Ｌａの波長の変更前後で超解像効果を揃えることもできる。

次に、位相変調装置２１の動作および光束の進行方向について説明する。本実施形態において、位相変調器３６は、第１光束Ｌ１の進行方向を、照明光学系３の光軸ＡＺに近づく向き、及び光軸ＡＺから離れる向きに変化可能である。また、位相変調器３７は、第２光束Ｌ２の進行方向を、照明光学系３の光軸ＡＺに関して第１光束Ｌ１の進行方向と対称的に変化可能である。ここでは、位相変調器３６の動作および第１光束Ｌ１の進行方向の変化について、代表的に説明する。

図９は、位相変調器３６による第１光束Ｌ１の進行方向の変化を示す図である。図９において、符号Ｌ１´は、位相変調器３６が進行方向を変化させた場合の第１光束Ｌ１を示す。図１０は、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相の空間分布を示す図である。

図９および図１０において、第１光束Ｌ１のビーム断面方向の座標をρとする。ここで、レンズアレイ５０のレンズ要素５０ｂとレンズアレイ３４のレンズ要素３４ｂとは両側テレセントリック光学系を構成する。これは、製造交差等によりレンズ間隔が変化しても倍率(結像位置)を一定にするためである。

図１０に示すように、位相変調器３６は、位置ρに関して線形の空間分布で表される位相Δφを、第１光束Ｌ１に付与する。これにより、位相変調器３６を通った第１光束Ｌ１´の波面を、位相変調器３６を通る前の第１光束Ｌ１の波面に対して傾けることができる（図２参照）。第１光束Ｌ１の進行方向はその波面の法線方向であり、位相変調器３６が第１光束Ｌ１の波面を傾けることによって、第１光束Ｌ１の進行方向が変化する。なお、ここでは、例として、干渉縞のピッチをより細かくするような位相を付与している。

ここで、位相変調器３６を通った第１光束Ｌ１の進行方向が、位相変調器３６を通る前の第１光束Ｌ１の進行方向になす角度をβとする。位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相Δφは、下記の式（８）で表される。このように、位相変調器３６は、第１領域Ａ１の屈折率分布により第１光束Ｌ１に付与される位相を、第１光束Ｌ１の中心光線Ｌｃに交差する方向、すなわち、ビーム半径方向において可変である。
Δφ＝２π／λ×ρｓｉｎβ＋φ_０ ・・・（８）

なお、式（８）中のφ_０は、ρ＝０の位置で位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相であり、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相の、第１光束Ｌ１のビーム径の範囲内での平均値に相当する。本実施形態において、位相変調器３６は、液晶層４２にネマティック液晶が用いられており、位相Δφを高分解能で可変に制御できる。

このように、位相変調器３６が第１光束Ｌ１内で位相差を付与することにより、図２に示した瞳共役面２０ｂ上で第１光束Ｌ１が集光する集光点１１９ｂがシフトする。瞳共役面２０ｂ上で第１光束Ｌ１が集光する集光点１１９ｂが、位相変調器３６が第１光束Ｌ１の進行方向を変えない場合と比較してシフトする量Δｙは、レンズ要素５０ｂの焦点距離ｆと、位相変調器３６によって第１光束Ｌ１の進行方向が曲がる角度βとの間に、下記の式（９）で表される関係が成り立つ。
ｓｉｎβ＝Δｙ／ｆ ・・・（９）

すなわち、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂ（図１、２参照）のシフト量Δｙを設定すると、第１光束Ｌ１の進行方向が変化する角度βが式（９）から求まり、第１光束Ｌ１の進行方向を角度βだけ変化させる上で、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与すべき位相の空間分布を式（８）から求めることができる。

また、位相変調器３７は、照明光学系３の光軸ＡＺに関して、位相変調器３６と対称的な空間分布の位相を第２光束Ｌ２に付与する。例えば、図９のように、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相φ_０が、照明光学系３の光軸ＡＺから離れるにつれて（位置ρが正方向に向かうにつれて）線形的に増加する場合に、位相変調器３７が第２光束Ｌ２に付与する位相は、照明光学系３の光軸ＡＺから離れるにつれて（位置ρの負方向に向かうにつれて）線形的に増加するように設定される。このようにして、位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２が互いに近づくように、あるいは互いに離れるように、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２のそれぞれの進行方向を変化可能である。

次に、上述の照明光学系３に基づいて、本実施形態に係る照明方法について説明する。照明光学系３において、分岐部３２は、光源装置２からの照明光Ｌａを、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２を含む複数の光束に分岐する。位相変調装置２１の位相変調器３６は、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂを、第１領域Ａ１の屈折率分布の変化により調整する。位相変調装置２１の位相変調器３７は、瞳共役面２０ｂ上の第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃを、第２領域Ａ２の屈折率分布の変化により調整する。また、光学系２２は、位相変調装置２１からの第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２を光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上においてそれぞれ異なる位置に集光させる。光学系２４は、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２を互いに干渉させ、その干渉縞で標本Ｓを照明する。

以上のような照明光学系３は、第１光束Ｌ１と第２光束Ｌ２との２光束干渉により干渉縞を形成する。標本Ｓに形成される干渉縞における明暗のピッチΔｐ（周期）は、レイリーの限界より、下記の式（１０）で表される。
Δｐ＝λ／２ＮＡ ・・・（１０）

式（１０）においてＮＡは、光学系２４の実効的な照明系の開口数に相当し、瞳面２４Ａ上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃの位置に比例する。
照明光学系３は、位相変調装置２１によって第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２のそれぞれの進行方向を変化可能であるので、瞳共役面２０ｂ上での第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃ、すなわち、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃを調整可能である。その結果、式（１０）のＮＡが可変となり、標本Ｓに形成される干渉縞のピッチΔｐが可変になる。また、顕微鏡装置１は、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃを照明光学系３によって調整することで、式（７）に示した超解像効果を示すＤ２／Ｄ１を調整可能となる。

ところで、光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃを調整する構成としては、位相変調装置２１を用いる構成の他に、例えば、液体レンズにより光束の進行方向を変化させる構成、光束の光路でプリズムなどの部材を移動するによって光束の進行方向を変化させる構成などが考えられる。本実施形態に係る照明光学系３は、位相変調装置２１によって光束の進行方向を変化させるので、可動部材を減らすことができる。その結果、例えば、部材の移動による振動を減らすこと、部材の移動と比較して高速の応答を実現することなどができる。

ところで、光源装置２は、レーザ光の波長を切替えることにより、照明光Ｌａの波長を変更可能である。照明光Ｌａの波長を変化すると、瞳面２４Ａ上の第１光束Ｌ１の集光点１９ｂの位置および第２光束Ｌ２の集光点１９ｃの位置が変化しうる。

図１１は、照明光Ｌａの波長を切替に伴う干渉縞のピッチの変化を示す図である。図１１（ａ）には、照明光Ｌａに赤色の波長帯のレーザ光を用いた干渉縞を示した。図１１（ｂ）には、照明光Ｌａに青色の波長帯のレーザ光を用いた干渉縞を示した。照明光Ｌａの波長を切替える際に、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２のそれぞれの進行方向を位相変調装置２１によって変化させない場合には、図１１（ａ）及び図１１（ｂ）に示すように、相対的に長波長の照明光Ｌａによる干渉縞のピッチｄ_ｒｅｄは、相対的に短波長の照明光Ｌａによる干渉縞のピッチｄ_ｂｌｕｅよりも広くなる。そのため、照明光Ｌａに波長の違いにより、式（７）に示した超解像効果を示す指標（Ｄ２／Ｄ１）が変化する。しかしながら、本実施形態にかかる照明光学系３は、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃ（光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃ）を、位相変調装置２１によって調整可能であるので、照明光Ｌａの波長を変更しつつ、超解像効果の程度を保持することなどができる。

なお、位相変調装置２１は、第１光束Ｌ１に付与する位相量および第２光束Ｌ２に付与する位相量を調整することによって干渉縞の位相を調整することもできる。図１２は、位相変調器３６、位相変調器３７が第１光束Ｌ１、第２光束Ｌ２に付与する位相の空間分布と、干渉縞との対応関係を示す表である。

図１２に示す第１状態、第２状態、及び第３状態は、例えば、図１に示した並進機構３５による分岐部３２の併進移動で干渉縞を変化させる際の３状態に対応する。位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相Δφの位置ρに対する傾きは、第１状態、第２状態、及び第３状態のいずれも同じである。また、位相変調器３７が第２光束Ｌ２に付与する位相Δφの位置ρに対する傾きは、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相Δφの傾きの正負を反転させた値であり、第１状態、第２状態、及び第３状態のいずれにおいても同じである。そのため、干渉縞の方向は、第１状態、第２状態、及び第３状態のいずれにおいても同じである。なお、ここでは、例として、干渉縞のピッチをより粗くするような位相を付与している。

また、第１状態、第２状態、及び第３状態において、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相Δφは、オフセットが互いに異なる。第１状態はρ＝０においてΔφ＝φ_＋１であり、第２状態はρ＝０においてΔφ＝φ_＋２、第３状態はρ＝０においてΔφ＝φ_＋３である。φ_＋２はφ_＋１よりも大きく、φ_＋３はφ_＋２よりもさらに大きい。位相変調器３７が第２光束Ｌ２に付与する位相Δφは、Δφ＝２πｎ（ｎは自然数）に関して、位相変調器３６が第１光束Ｌ１に付与する位相Δφと対称的である。このように第１状態、第２状態、及び第３状態を切り替えることにより干渉縞の位相がシフトする。そのため、例えば、図１に示した並進機構３５を省くこともでき、可動部材を減らすことができるので、装置の小型化や低コスト化、高速化などの面で有利である。なお、並進機構３５による干渉縞のシフトと、位相変調装置２１による干渉縞のシフトとを併用することもできる。

なお、位相変調装置２１は、標本Ｓにエバネッセント場が形成されるように、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃ（光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃ）を調整してもよい。エバネッセント場が形成される条件は、全反射条件（ＴＩＲＦ条件）などと呼ばれることがある。例えば、位相変調装置２１は、標本Ｓの表面で第１光束Ｌ１と第２光束Ｌ２のそれぞれが全反射するように、瞳共役面２０ｂ上の第１光束Ｌ１の集光点１１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１１９ｃ（光学系２４の後側焦点面（瞳面２４Ａ）上での第１光束Ｌ１の集光点１９ｂおよび第２光束Ｌ２の集光点１９ｃ）を光軸ＡＺから離れる方向にシフトしてもよい。

また、上述の実施形態において、照明光学系３は、２光束干渉により干渉縞を形成しているが、３光束干渉により干渉縞を形成してもよい。例えば、照明光学系３は、分岐部３２で生じる０次回折光、±１次回折光の３光束干渉により干渉縞を形成してもよく、顕微鏡装置１は、このような干渉縞を利用した３Ｄ−ＳＩＭモードを実行可能でもよい。なお、３Ｄ−ＳＩＭモードにおいては、マスク５１において０次回折光を遮光する必要は無い。

なお、上述の実施形態においては、照明光学系３を顕微鏡装置１に適用した例を説明したが、照明光学系３は、干渉縞で対象物を照明する各種光学装置に適用できる。

また、上述の実施形態においては、位相変調装置２１として、位相変調器３６、３７を複数ずつ備えた構成を例に挙げたが、本発明はこれに限定されない。例えば、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２が入射する領域に対応する画素４７を有し、屈折率分布を調整することにより、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２の位相分布を変化させることが可能であれば、１つの位相変調器のみで位相変調装置２１を構成してもよい。

また、上述の実施形態においては、分岐部３２の回転に同期させてレンズアレイ３４、５０、および位相変調装置２１を回転させない構成とする場合を例に挙げたが、本発明はこれに限定されない。例えば、レンズアレイ３４、５０において、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２に対応する１組のレンズ要素を設け、これら１組のレンズ要素を分岐部３２の回転に同期させて回転させるようにしてもよい。また、位相変調装置２１において、第１光束Ｌ１および第２光束Ｌ２に対応する１組の位相変調器を設け、これら１組の位相変調器を分岐部３２の回転に同期させて回転させるようにしてもよい。

なお、本実施形態では、照明光学系３は、顕微鏡装置１のステージ（図示せず）等に配置された蛍光物質を含む標本Ｓを干渉縞で照明する場合を例示したが、顕微鏡装置１のステージ上に標本Ｓが配置されていない状態で、照明光学系３は、所定の照明領域を干渉縞で照明してもよい。

なお、本発明の技術範囲は、上述の実施形態に限定されるものではない。例えば、上述の実施形態で説明した要素の１つ以上は、省略されることがある。上述の実施形態で説明した要素は、適宜組み合わせることができる。法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。

１ 顕微鏡装置、２ 光源装置、３ 照明光学系、４ 結像光学系、５ 撮像装置、６ 制御装置、７ 復調装置、２１ 位相変調装置、３２ 分岐部

Claims (12)

1. 光源からの光を複数の光束に分岐する分岐部と、
   前記複数の光束のうちの第１光束が入射する第１領域、及び前記複数の光束のうちの第２光束が入射する第２領域を有し、前記第１領域の屈折率分布および前記第２領域の屈折率分布のそれぞれを変化可能な位相変調装置と、
   前記第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明する第１光学系と、
   前記位相変調装置からの前記第１光束を、前記第１光学系の後側焦点面に集光し、前記位相変調装置からの前記第２光束を前記後側焦点面において前記第１光束が集光される位置と異なる位置に集光する第２光学系と、
   を備え、
   前記後側焦点面の前記第１光束の位置を前記第１領域の屈折率分布の変化により調整し、前記後側焦点面の前記第２光束の位置を前記第２領域の屈折率分布の変化により調整する
   照明光学系。
2. 前記位相変調装置に入射する前記第１光束および前記第２光束のそれぞれを平行化する第３光学系を備え、
   前記位相変調装置は、前記第１領域の屈折率分布により前記第１光束に付与される位相を、前記第１光束の中心光線に交差する方向において可変であり、前記第２領域の屈折率分布により前記第２光束に付与される位相を、前記第２光束の中心光線に交差する方向において可変である
   請求項１に記載の照明光学系。
3. 前記第３光学系は、前記分岐部からの前記第１光束および前記第２光束のそれぞれを集光する第１集光レンズと、
   前記第１集光レンズからの前記第１光束を平行化するレンズ要素、及び前記第１集光レンズからの前記第２光束を平行化するレンズ要素を有する第２レンズアレイと、を備え、
   前記位相変調装置は、前記第２レンズアレイの後側焦点に配置される
   請求項２に記載の照明光学系。
4. 前記位相変調装置は、前記第１領域上の前記第１光束の中心光線と前記第２領域上の前記第２光束の中心光線とを結ぶ方向の位置に比例する位相を、前記第１光束および前記第２光束のそれぞれに付与する
   請求項２又は３に記載の照明光学系。
5. 前記位相変調装置は、前記第１光束に付与する位相と前記第２光束に付与する位相とを変化させることにより、前記干渉縞の位相を変化させる
   請求項１〜４のいずれか１項に記載の照明光学系。
6. 前記位相変調装置は、前記分岐部により分岐された光束が入射する液晶層と、前記液晶層に電界を印加可能な電極とを含む
   請求項１〜５のいずれか一項に記載の照明光学系。
7. 前記液晶層に入射する光束を直線偏光にする偏光素子を備える
   請求項６記載の照明光学系。
8. 前記第２光学系は、前記第１領域からの前記第１光束を集光するレンズ要素、及び前記第２領域からの前記第２光束を集光するレンズ要素を有する第１レンズアレイを含む
   請求項１〜７のいずれか一項に記載の照明光学系。
9. 前記分岐部は、回折光学素子を含む
   請求項１〜８のいずれか１項に記載の照明光学系。
10. 前記位相変調装置は、前記共役面上の前記第１光束の位置および前記第２光束の位置を、前記干渉縞によってエバネッセント場が形成されるように、調整可能である
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の照明光学系。
11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の照明光学系と、
    前記照明光学系が形成する前記干渉縞で変調された試料の変調像を撮像する撮像装置と、
    前記撮像装置が撮像した前記変調像を復調する復調装置と、を備える顕微鏡装置。
12. 光源からの光を複数の光束に分岐することと、
    前記複数の光束のうちの第１光束が入射する第１領域、及び前記複数の光束のうちの第２光束が入射する第２領域を有し、前記第１領域の屈折率分布および前記第２領域の屈折率分布のそれぞれを変化可能な位相変調装置を配置することと、
    前記位相変調装置からの前記第１光束を、該第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明させる光学系の後側焦点面に集光し、前記位相変調装置からの前記第２光束を前記後側焦点面において前記第１光束が集光される位置と異なる位置に集光することと、
    前記後側焦点面の前記第１光束の位置を前記第１領域の屈折率分布の変化により調整し、前記後側焦点面の前記第２光束の位置を前記第２領域の屈折率分布の変化により調整することと、
    前記光学系により前記第１光束および前記第２光束を互いに干渉させ、その干渉縞で照明領域を照明することと、を含む照明方法。

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